Preparation and Flavor Characteristics of Maillard Peptides from Sunflower Seed Protein
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摘要: 为制备鲜味较高的葵花籽蛋白美拉德肽，以葵花籽蛋白为原料，电子舌评分、感官评分、可溶性氮、水解度为指标，对葵花籽蛋白的酶解条件进行优化；褐变度、色差、氨基氮、电子舌评分和感官评分为指标，采用单因素试验和正交试验对葵花籽蛋白鲜味肽的制备工艺条件进行优化。结果表明，采用碱性蛋白酶与风味蛋白酶双酶分步组合酶解，在底物浓度8%，酶添加量5000 U/g，碱性蛋白酶和风味蛋白酶复配比例1:2（酶活比），加入碱性蛋白酶在40 ℃酶解3 h，再加入风味酶于50 ℃继续酶解1 h，制备的酶解液电子舌评分和感官评分较高；在木糖添加量为1.0%，初始pH7.0，120 ℃条件下，美拉德反应60 min，所制备的葵花籽蛋白鲜味肽电子舌评分和鲜味氨基酸含量最高；然后通过分析美拉德反应前后体系中肽段的分子量分布，发现500~1000 Da组分可能为美拉德反应的主要活性肽段。Abstract: In order to prepare the Maillard peptides of the sunflower seed protein with higher umami, the enzymatic hydrolysis conditions of sunflower seed protein were optimized using the sunflower seed protein as raw material, and electronic tongue, sensory score, soluble nitrogen and hydrolysis degree as indicators, while the single factor experiment and orthogonal experiment were used to optimize the process conditions for preparing the umami peptides of sunflower seed protein using brown degree, color difference, amino nitrogen, electronic tongue and sensory score as indicators. The results showed that the electronic tongue score and sensory score of hydrolysate prepared was high using alkaline protease and flavor protease step-by-step enzymolysis, at 8% of substrate concentration, 5000 U/g of the amount of enzyme addition, and 1:2 of alkaline protease and flavor protease (enzyme activity ratio), with the enzymolysis of alkaline protease at 40 ℃ for 3 h, and the enzymolysis of flavor enzyme at 50 ℃ for 1 h. The prepared sunflower seed protein had the highest electronic tongue score and umami amino acid content with 1.0% of xylose addition, initial pH7.0, at the Maillard reaction of 120 ℃ for 60 min. And then the molecular weight distribution in the umami peptides of sunflower seed protein before and after Maillard reaction was measured, which found that 500~1000 Da might be the main active peptides segment in the Maillard reaction.
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Keywords:
- sunflower seed protein /
- enzymolysis /
- Maillard reaction /
- umami peptide
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葵花籽是继大豆、油菜籽和花生之后的第四大油料作物，近五年来其产量基本稳定在5500万吨左右。葵花籽粕营养物质丰富，含有大量的蛋白质、膳食纤维、矿物质等，其中蛋白质含量高达30%~50%[1]。葵花籽蛋白是一种重要的植物蛋白资源，蛋白质含量高，脂肪含量低，是生产蛋白质水解物和风味增强剂的潜在原料之一[2−3]。研究表明超过6000 Da的蛋白质分子，由于体积庞大，不易与味觉细胞直接发生相互作用，但经酶解后，转化的小分子肽和氨基酸能够更容易地渗透至味蕾细胞内部，使蛋白质酶解物呈现出丰富的味感[4]。因此，利用葵花籽粕，大规模开发成本低廉且具有良好风味的葵花籽呈味肽具有重要意义。
肽具有抗氧化、降血压和免疫调节等多种重要的生物功能而受到广泛关注，目前大多数关于肽的研究主要集中在其生物学功能上，而在食品加工的过程中，部分肽尤其是小分子肽除了赋予食品生物学功能特性外，还为食品提供了呈味成分。除了氨基酸类、核苷酸类和有机酸类，这些已知的鲜味物质外，研究发现动植物蛋白的水解液中同样蕴藏着具有鲜味的物质，如焦谷酰胺肽和一些小肽[5]。当前，动物源性鲜味肽的主要来源包括但不限于鸡肉、牛肉以及其他各种海鲜特别是贝类；而在植物界中，鲜味肽的重要来源主要集中于花生、大豆、葵花籽以及若干种类的藻类等生物质中。但鉴于动物蛋白的生产成本高，且长期摄入可能增加心血管疾病的风险，引发健康问题，因此植物蛋白资源的开发逐渐受到人们的青睐[6]。鲜味肽作为一种新型的天然鲜味增强剂，在提升食品口感、增强食品整体鲜美特性和丰富醇厚感方面具有显著效果。酶解法是制备鲜味肽最常用的方法，通过酶水解获得的肽具有较强的活性和多样性，但通常有苦味。研究表明，使用内切酶和外切酶连续酶解蛋白质，如碱性蛋白酶和风味蛋白酶，则可以减少蛋白水解物的苦味，制备风味、口感较佳的多肽[7−8]。罗鹏等[9]采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对葵花籽蛋白进行水解，发现双酶协同作用下所得的酶解液的苦味降低。Wei等[8]发现碱性蛋白酶与风味蛋白酶连续水解的结合可以减少肽的苦味和水解时间。
美拉德反应在食品加工和储存过程中对食品中风味的形成起着重要作用[10]。大量的研究表明，由蛋白质水解物和碳水化合物通过美拉德反应制备的美拉德肽，是风味增强肽的关键成分，能显著增强食品的鲜味、醇厚味和持续感，同时也是一些酱油及豆酱类制备的呈味核心物质[11−12]。Ogasawara等[13]发现木糖和大豆肽（1000~5000 Da）制备的美拉德肽没有强烈的味道，但当添加到鲜味溶液中时，会显著增加溶液的鲜味、连续性和口感。Liu等[14]发现大豆蛋白酶解物经美拉德反应后，苦味比底物弱得多，这可能是由于美拉德反应中苦味氨基酸的减少和美拉德肽的形成掩盖了苦味。
为此，本研究以葵花籽蛋白为原料，以水解度、可溶性氮含量和鲜味强度值作为指标，通过单因素试验对胰蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶三种酶的酶解工艺进行优化，筛选出合适的酶进行复合酶连续酶解，并对复合酶连续酶解工艺和美拉德反应条件进行优化，确定葵花籽蛋白美拉德肽的制备工艺。通过电子舌、感官评分、可溶性氮、水解度、褐变度、鲜味氨基酸含量和分子量分布等指标和评价手段，明析美拉德反应对葵花籽蛋白美拉德肽呈味特性的影响，不仅能实现葵花籽优质蛋白资源高效利用，还能促进新型高品质鲜味调味剂的开发，这对于推动经济发展和调味品市场具有深远意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
葵花籽蛋白（蛋白含量80%） 西安永屹生物技术有限公司；碱性蛋白酶（250000 U/g）、风味蛋白酶（200000 U/g）、胰蛋白酶（20000 U/g）、D-木糖 上海源叶生物技术有限公司；37%甲醛溶液 上海麦克林生化科技股份有限公司。
K375全自动凯氏定氮仪 瑞士步骑有限公司；L-8900氨基酸分析仪 日本HITACHI公司；Smar Tongue电子舌 上海瑞玢智能科技有限公司；NS-800分光测色仪 深圳市三恩时科技有限公司；UV300紫外可见分光光度计 上海仪迈仪器科技有限公司；MARS6微波消解仪 美国CEM公司；ACQUITY凝胶渗透色谱系统 美国Waters公司。
1.2 实验方法
1.2.1 葵花籽蛋白酶解液制备工艺
准确称取葵花籽蛋白与去离子水混合，混合均匀后于95 ℃的水浴中加热15 min。冷却至室温，在蛋白酶的最适pH和温度下，加入蛋白酶酶解2~6 h后于95 ℃的水浴中灭酶15 min，冷却至室温，4000 r/min离心20 min后取上清液，即为葵花籽蛋白酶解液。以水解度、可溶性氮、电子舌、感官评分为指标，分别采用风味蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶对葵花籽蛋白进行酶解，对酶的添加量（2000、3000、4000、5000、6000 U/g）、酶解时间（2、3、4、5、6 h）和底物浓度（2%、4%、6%、8%、10%）进行单因素实验优化，每组3次平行。不同蛋白酶的特性和最适酶解条件如表1所示。
表 1 不同蛋白酶酶解的特性和最适酶解条件Table 1. Characteristics and optimal enzymatic hydrolysis conditions of different proteases蛋白酶 主要酶切位点 活力（U/g） pH 温度（℃） 胰蛋白酶 多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断 250000 7.8 37 碱性蛋白酶 羧基侧为疏水性芳香族（酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸） 200000 10.5 40 风味蛋白酶 氨肽酶，羧肽酶的复合物 20000 7.5 50 在底物浓度8%，复合酶的添加量5000 U/g，酶添加比例1:1，酶解时间4 h，先添加碱性蛋白酶酶解2 h，再添加风味蛋白酶酶解2 h后，于95 ℃的水浴中灭酶15 min，冷却至室温，25 ℃ 4000 r/min离心20 min后取上清液。以水解度、可溶性氮、电子舌、感官评分为指标，采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合对葵花籽蛋白进行酶解，对酶添加比例（3:1、2:1、1:1、1:2、1:3）和酶解时间比（碱性蛋白酶与风味蛋白酶的时间比1:3、2:2和3:1进行优化，每组实验平行3次。
1.2.2 葵花籽蛋白美拉德鲜味肽的制备
美拉德反应中风味化合物的形成受糖和氨基酸的种类，以及反应温度、时间和初始pH的影响[15]。取葵花籽蛋白酶解液10 mL，添加1.5%木糖，用 NaOH或 HCl溶液调节pH至7.5，120 ℃下加热90 min，然后将溶液立即冷却，在25 ℃ 4000 r/min离心15 min。以电子舌、感官评分、氨基氮、褐变度、色差为指标，对木糖添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、初始pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、反应时间（30、60、90、120、150 min）、反应温度（100、110、120、130、140 ℃）进行优化，每组平行3次。
1.2.3 葵花籽蛋白酶解液水解度（Hydrolysis degree，DH）的测定
采用甲醛滴定法测定上清液氨基氮含量[16]，凯氏定氮法测定葵花籽蛋白总氮量，按下式计算水解度。
式中：V1为滴定样品时消耗标准NaOH溶液体积，mL；V2为滴定空白时消耗标准NaOH溶液体积，mL；C为滴定时标准NaOH溶液浓度，mol/L；N为总氮含量，g。
1.2.4 氮的2种存在形式的测定分析
氨基态氮含量的测定：酶解物上清液中游离氨基酸含氮量占样品中总氮量的百分比，采用甲醛电位滴定法测定[16]；可溶性氮含量（Soluble nitrogen content，NS）的测定：酶解产物上清液中总氮量占样品中总氮量的百分比，采用凯氏定氮法测定可溶性氮含量[17]。
1.2.5 电子舌评分
本实验使用Smar Tongue电子舌系统在常温下进行数据采集。为确保采集数据的可靠性和稳定性，电子舌在数据采集前需完成一系列的自检、检测和校准等程序。在25 ℃的环境中，取30 mmol/L氯化钾、0.3 mmol/L酒石酸作唾液参比液，取25 mL样品测试120 s，清洗时间为30 s。每个样品检测4次，剔除首次检测数据，取后3次检测数据的平均值进行味觉属性分析。
1.2.6 感官评价
在适宜的实验室环境下，选择10名（6女4男，年龄23~37岁）接受过专门训练的感官评价员进行评分。感官评价的方法参考刘冰等[18]，稍作修改。采用谷氨酸钠溶液作为鲜味参比溶液，浓度梯度为0、2、4、6、8、10 mg/mL，对应的鲜味分数为2、4、6、8、10分。评价前评定人员需用蒸馏水漱口，随后取1~2 mL待测样品置于口中，10 s后吐出并用水漱口。之后品尝参比溶液，根据感官评定表进行评分（表2），结果取10人评分值的平均值。为避免评价人员之间产生主观影响，评价过程采取分开评定的方式。
表 2 感官评判标准Table 2. The sensory evaluation standard评价标准 分值（分） 鲜味浓郁，无咸味或苦涩味 9~10 鲜味突出，无明显的咸味或苦涩味 7~8 鲜味明显，微有咸味或苦涩味 5~6 鲜味较淡，有咸味或苦涩味 3~4 鲜味不明显，咸味或苦涩味突出 1~2 1.2.7 褐变度测定
依据1.2.2所述的步骤，制备样品。294 nm处的吸光度表示美拉德反应产物（Maillard reaction products，MRPs）的中间产物的含量；420 nm处的吸光度表示反应过程中最终产物的量，例如类黑素[19]。用蒸馏水稀释10倍和100倍，分别在420 nm处和294 nm处测定吸光度值，重复3次取平均值。
1.2.8 色差测定
取2 mL样品到直径3 cm的培养皿中，以蒸馏水为标准，采用色差仪测定ΔL*（亮度），Δa*（绿色，红色）和Δb*（蓝色，黄色）等参数。总色差ΔE根据ΔE=（ΔL*2+Δa*2+Δb*2）1/2计算得出[20]。
1.2.9 正交试验
在单因素实验基础上，确定正交试验中各因素范围，设计四因素三水平正交优化试验，以电子舌评分为指标，确定美拉德反应的最优工艺参数，筛选出在美拉德反应体系中鲜味较高的葵花籽蛋白酶解液。因素水平表见表3，实验重复3次。
表 3 正交试验因素与水平表Table 3. Orthogonal experimental factors and level table水平 因素 A木糖添加量（%） B反应时间（min） C反应温度（℃） D初始pH 1 0.5 30 100 7.0 2 1.0 60 110 7.5 3 1.5 90 120 8.0 1.2.10 游离氨基酸的测定
参考王国英等[21]的方法，稍作修改。称取0.2 g的粉碎样品置于消化管中，加入6 mol/L的盐酸（优级纯）5 mL，180 ℃微波消解30 min后取出，定容于50 mL容量瓶混匀。吸取2 mL上述溶液，振荡中加入等体积0.5 mol/L NaOH溶液后定容至10 mL。用0.22 μm滤膜过滤，取滤液于氨基酸分析仪进行测定。为了减少褐变对实验结果的影响，将样品稀释15倍进行测定。
1.2.11 分子量测定
将制备的葵花籽蛋白美拉德鲜味肽冷冻干燥后溶解，用0.45 µm滤膜过滤，取滤液进行上机测定。通过凝胶渗透色谱法（Gel permeation chromatography，GPC）测定，高效液相色谱仪配G1362A示差折光检测器，以及Waters Ultrahydrogel TM凝胶色谱柱（30 cm×7.8 mm）。设定柱温40 ℃，流速1.0 mL/min；流动相：0.1 mol/L NaNO3水溶液，进样量40 µL，运行时间35 min。样品前处理：称0.060 g样品，加入4 mL的流动相，常温溶解10 min，过0.45 μm滤膜，上机测试。
1.3 数据处理
实验结果以平均值±标准差表示，使用Origin 2015软件绘制图表，SPSS Statistics 26进行ANOVA分析。
2. 结果与分析
2.1 单酶酶解工艺对葵花籽蛋白酶解产物的影响
2.1.1 底物浓度对葵花籽蛋白酶解液鲜味强度的影响
DH表示肽键的裂解，会直接影响到水解产物的产率、蛋白质回收率、功能性质和感官质量[22]。在酶添加量4000 U/g和水解4 h下，随着底物浓度的增加，三种酶的DH先上升后趋于平稳：风味蛋白酶>胰蛋白酶>碱性蛋白酶（图1A）；NS的变化趋势和DH基本相同（图1B）。底物浓度为6%时，DH和NS显著上升（P<0.05）；而底物浓度为8%和10%时, 其DH和NS上升趋势变缓。低底物浓度下，酶与底物充分接触水解更彻底，但也会增加后续浓缩的成本[14]；高底物浓度下，酶解液的粘稠度上升，阻碍了酶和底物的充分接触，导致水解不充分。三种酶的电子舌鲜味评分随底物浓度增加都呈现上升的趋势（图1C）。在感官评分中发现（图1D），三种酶随底物浓度升高酶解液的鲜味显著增加（P<0.05），但在底物浓度8%后鲜味变化不显著。综上所述，三种酶均选择底物8%（w/v）作为最佳底物浓度。
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2.1.2 酶添加量对葵花籽蛋白酶解液鲜味强度的影响
在8%（w/v）的底物浓度下水解4 h，随着酶添加量的增加，三种酶的DH都显著增加（P<0.05），与Wei等[8]对亚麻籽蛋白水解研究结果一致；但当三种酶的添加量为5000 U/g和6000 U/g，DH变化不显著（图2A）。如图2B所示，NS随酶添加量的增加先升高后下降，其中胰蛋白酶在添加量4000 U/g之后NS变化不显著；碱性蛋白酶和风味蛋白酶分别在添加量4000 U/g和5000 U/g时NS达到最高，这可能是由于当酶的量达到一定值后，酶之间出现竞争性抑制，导致自溶现象发生使蛋白酶活力下降，尽管增加酶添加量，DH和NS的变化仍不显著[23]。从三种酶的电子舌评分（图2C）和感官评分（图2D）也可以看出，随酶浓度升高，鲜味呈现先升后降的趋势，胰蛋白酶和风味蛋白酶在酶添加量5000 U/g时鲜味最佳，碱性蛋白酶在4000 U/g时鲜味最佳，之后继续加酶，鲜味显著下降（P<0.05）。综合考虑，胰蛋白酶和风味蛋白酶选择添加量5000 U/g，碱性蛋白酶选择添加量4000 U/g进行后续实验。
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图 2 酶添加量对DH、NS和感官特性的影响Figure 2. Effects of enzyme addition on DH, NS, and sensory characteristics2.1.3 酶解时间对葵花籽蛋白酶解液鲜味强度值的影响
在8%（w/v）底物浓度，胰蛋白酶和风味蛋白酶酶浓度5000 U/g，碱性蛋白酶酶浓度4000 U/g下，随着时间的延长，三种酶的DH（图3A）和NS（图3B）的变化趋势为先上升后下降，这主要是因为在反应初期，由于底物充足，蛋白被酶充分酶解，DH和NS增加；当酶解时间超过3 h以后，由于底物的消耗且酶活性的逐渐降低，反应速率减慢，DH和NS的增加也逐渐放缓。三种酶解液的鲜味也呈先升后降的趋势，胰蛋白酶和碱性蛋白酶的鲜味在4 h达到最佳，风味蛋白酶在3 h达到最佳（图3C和D）。随着时间的延长，鲜味下降可能是因为苦味氨基酸和咸味氨基酸的不断溶出，影响甚至掩盖了鲜味，因此鲜味评价逐渐降低[16]。综上所述，选择胰蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解时间为4 h，风味蛋白酶的酶解时间为3 h。
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图 3 酶解时间对DH、NS和感官特性的影响Figure 3. Effects of enzymatic hydrolysis time on DH, NS, and sensory characteristics2.2 复合酶连续酶解对葵花籽蛋白酶解产物的影响
单一酶进行酶解可以带来特定的优势，但其酶解作用效果有限，无法同时达到滋味提升和酶解效率最优。研究表明[9]，连续使用内切蛋白酶与外切蛋白酶进行水解对产物有显著的优化作用。碱性蛋白酶属于内切酶，可以将大分子蛋白质的特异性肽键切断形成小分子的多肽；而风味蛋白酶为外切酶，可将小分子多肽支链上的肽键切断，水解为游离的氨基酸或短肽。鉴于单酶酶解的局限性，依据单酶酶解效果，选择碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合，并研究其对葵花籽蛋白的酶解效果。单酶酶解结果显示，在底物浓度为8%，碱性蛋白酶和风味酶的最适加酶量为4000 U/g和5000 U/g，酶解时间为4 h和3 h。在不增加总体加酶量和酶解时间的情况下，为了简化酶解工艺，故将复合酶的酶添加量确定为5000 U/g，酶解时间确定为4 h。研究证实，采用分步酶解比同步酶解水解效果更好[24]。因此，为节约生产成本，同时达到很好的酶解效果，采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶的双酶分步酶解法对葵花籽蛋白进行酶解，并探究双酶的添加比例和酶解时间。
2.2.1 不同的酶添加比例对葵花籽蛋白酶解效果的影响
在8%（w/v）底物浓度下，先添加碱性蛋白酶酶解2 h，再添加风味蛋白酶酶解2 h。为了节约成本，探究双酶酶添加比例（酶活比）对葵花籽蛋白酶解效果的影响。图4A和B可以看出，随着风味酶酶活比例的升高，DH、NS和鲜味评价均呈现先升高后下降或趋于平稳的趋势；当碱性蛋白酶和风味酶的酶活比例为1:2时，DH、NS和鲜味评价最高。这可能是因为当风味蛋白酶比例较高时，外切作用更为显著，能有效提高酶解液中呈味氨基酸和小分子多肽的含量，进而增强酶解液的风味[25]。随着风味蛋白酶的比例继续增加，DH变化不显著，NS降低，呈味氨基酸和小分子肽的含量降低，从而减弱了酶解液的风味。因此，选择碱性蛋白酶和风味酶酶活比例为1:2进行后续实验。
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图 4 连续酶解DH，NS和感官特性随酶添加比例和酶解时间比例的变化Figure 4. Changes in continuous enzymatic hydrolysis of DH, NS and sensory characteristics with enzyme addition ratio and enzymatic hydrolysis time ratio2.2.2 双酶的酶解时间比对葵花籽蛋白酶解效果的影响
为了提高双酶的酶解效率，在8%（w/v）底物浓度，碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶活比为1:2条件下，探究双酶不同酶解时间对葵花籽蛋白酶解效果的影响。图4C和D可以看出，随着碱性蛋白酶酶解时间的增加，DH、NS和鲜味均显著升高（P<0.05）；当碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解时间比2:2后，DH、NS和鲜味值增长变缓，到3:1时基本达到最大值，这可能是因为蛋白酶具有专一性，随着水解时间延长，碱性蛋白酶可水解的肽键逐渐减少，继续加入风味蛋白酶进行酶解，能显著提高酶解液中呈味氨基酸和小分子多肽的含量，从而增强酶解液的鲜味强度[9]。因此，确定先加碱性蛋白酶酶解3 h后，再加入风味蛋白酶继续酶解1 h，对葵花籽蛋白进行酶解。
2.3 美拉德反应工艺参数的优化
2.3.1 木糖添加量对美拉德反应的影响
木糖和葵花籽蛋白水解产物的MRPs比葡萄糖、果糖和麦芽糖的MRPs感官评分高[26]，具有更高的鲜味氨基酸含量，鲜味更强[27]，因此选择用木糖作为美拉德反应原料。通过吸光度（A294和A420）和颜色参数（ΔL*，Δa*，Δb*和ΔE）的变化来监测不同反应条件引起的美拉德褐变的变化。如表4所示，MRPs的褐变度（A294和A420）随着木糖添加量增加显著升高（P<0.05）。ΔL*值和/或ΔE越高，颜色越浅[28]。木糖添加量2.0%和2.5%的MRPs的ΔL*和ΔE较低，体系中MRPs颜色较深。氨基态氮主要由蛋白质水解产生，其含量越高说明氨基酸含量越高，食品味道越鲜[29]。氨基氮随木糖添加量增加显著下降（P<0.05），在木糖添加量0.5%时最高。图5A所示，随着木糖添加量的增多，MRPs的鲜味先增加后下降，同时苦味也在积累，在添加量为1.0%时，鲜味较高，苦味和咸味开始变得明显；2.0%时苦味和咸味十分明显，掩盖了鲜味。因此，选择木糖添加量0.5%、1.0%和1.5%进行正交试验。
表 4 木糖添加量对MRPs的影响Table 4. Effect of xylose addition on MRPs木糖
添加量0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% A294 0.22±0.00e 0.42±0.00d 0.54±0.00c 0.79±0.00b 0.95±0.00a A420 0.26±0.00e 0.42±0.00d 0.64±0.00c 0.90±0.00b 1.11±0.00a ΔL* 13.65±0.15a 12.05±0.84b 13.46±0.83a 10.96±0.20bc 10.57±0.48c Δa* -1.00±0.59c 2.90±0.81b 2.59±0.55b 3.48±0.55ab 4.22±0.32a Δb* 5.58±0.55b 9.30±1.52a 7.45±0.68ab 7.40±1.36ab 6.47±0.23b ΔE 14.79±0.37ab 15.52±1.68a 15.61±1.09a 13.71±0.66ab 13.10±0.44b 氨基氮 1.04±0.01a 0.99±0.02b 0.97±0.01bc 0.95±0.02c 0.90±0.01d 注：ΔL*、Δa*、Δb*为样品的L*、a*、b*减去蒸馏水的L*、a*、b*；其中数据为平均值±标准差；同行中数据的不同上标字母代表有显著差异（P<0.05）（n=3）；表5~表7同。 ![]()
图 5 木糖添加量（A）、初始pH（B）、加热时间（C）和加热温度（D）对感官特性的影响Figure 5. Effects of xylose addition (A), initial pH (B), reaction time (C), and reaction temperature (D) on sensory characteristics2.3.2 反应初始pH对美拉德反应的影响
美拉德反应涉及多个途径，其中大多都依赖于酸的催化作用，因此，反应的初始pH对于整个反应过程具有至关重要的影响。如表5所示，初始pH为6.5~7.5的MRPs相较于pH为8.0~8.5的MRPs，显示出较低的褐变度（A420），这可能是因为在酸性环境下，氨基酸和多肽中的氨基大多以-NH3+的形式存在，不利于糖基胺的形成，从而导致褐变程度降低；pH超过8.0时，美拉德反应的强度激增而难以控制，使褐变程度明显提高。随着pH变化，反应体系中氨基氮的含量降低。图5B所示，在初始pH6.5时，鲜味评分较低，这可能是由于在酸性环境下，较高比例的氨基被质子化，其亲核性较低，不利于美拉德反应进行，使得风味不足[30]；在碱性环境时，氨以负离子的形式存在，有助于美拉德反应的进行，使得鲜味增强；但超过8.0时，美拉德反应的强度激增而难以控制，导致褐变程度加剧和焦糖化现象增强，导致感官品质变差。因此，选择初始pH7.0、7.5、8.0进行正交试验。
表 5 初始pH对MRPs的影响Table 5. Effect of initial pH on MRPs初始pH 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 A294 0.73±0.00d 0.67±0.00e 0.74±0.00c 0.76±0.00b 0.79±0.00a A420 0.70±0.00d 0.68±0.00e 0.72±0.00c 0.74±0.00b 0.76±0.00a ΔL* 8.35±0.60c 13.46±0.83a 10.20±0.51b 8.55±0.60c 7.85±0.55c Δa* 6.76±0.48a 2.59±0.55c 4.02±0.71b 6.23±0.34a 3.94±1.12bc Δb* 6.12±0.96b 7.45±0.68b 10.51±2.12a 6.20±1.32b 5.96±0.84b ΔE 12.37±1.04b 15.61±1.09a 15.23±1.82a 12.29±1.14b 10.68±0.42b 氨基氮 1.02±0.02a 0.96±0.02bc 0.97±0.01bc 1.00±0.01ab 0.93±0.02c 2.3.3 反应时间对美拉德反应的影响
美拉德反应时间对形成呈味肽具有重要作用，它不仅影响肽的交联程度，还会显著影响产物的色泽、风味和褐变程度[31]。由表6可知，随着反应时间的延长，MRPs的褐变度（A294和A420）显著升高（P<0.05）。同时，在90 min过后，MRPs的氨基氮和色差值（ΔL*和ΔE）急剧下降，颜色趋近于黑色，与褐变度的结果一致。美拉德反应时间不同，MRPs的呈味效果存在显著差异（P<0.05）。图5C所示，比较不同反应时间体系的感官特性，发现短时间（0~60 min）生成MRPs的呈味效果明显，鲜味增强；但在更长的加热时间下，感官评分迅速降低；120 min后，咸味和苦味明显影响整体感官评分，甚至掩盖了鲜味。Wei等[28]也发现在120 ℃和更长的加热时间下，MRPs的褐变度增大且感官评分（鲜味、满口感、连续性等）迅速下降，这与本文研究结果一致。因此选择30、60、90 min进行正交试验。
表 6 反应时间对MRPs的影响Table 6. Effect of reaction time on MRPs时间（min） 30 60 90 120 150 A294 0.18±0.00e 0.41±0.00d 0.67±0.00c 0.79±0.00b 0.96±0.00a A420 0.09±0.00e 0.35±0.00d 0.64±0.00c 0.92±0.00b 1.15±0.00a ΔL* 14.54±0.14a 12.21±0.85b 13.46±0.83a 8.35±0.16c 7.19±0.16d Δa* -0.60±0.21c 2.63±0.56b 2.59±0.55b 6.60±0.61a 6.96±0.22a Δb* 6.45±0.17b 8.52±0.78a 7.45±0.68ab 7.96±1.07a 4.53±0.14c ΔE 15.92±0.19a 15.12±1.19a 15.61±1.09a 13.32±0.52b 10.98±0.30c 氨基氮 1.07±0.02a 1.04±0.01ab 1.01±0.01bc 0.98±0.01c 0.92±0.02d 2.3.4 反应温度对美拉德反应的影响
在一定温度范围内，提高温度可以增加MRPs的风味化合物，但温度过高，会发生焦糖化反应形成黑褐色物质，可能对MRPs的风味和色泽产生不利影响[30]。如表7所示，反应温度110 ℃之后的MRPs的褐变度（A294和A420）随着温度升高而显著升高（P<0.05）。随着反应温度升高，氨基氮呈下降的趋势。在较高的加热温度下，色差值（ΔL*和ΔE）呈下降趋势。温度是触发美拉德反应的主要因素，Eric等[26]证明了MRPs的颜色形成随温度的升高而加深，这与本文的研究一致。如图5D所示，在100~110 ℃时，鲜味的电子舌和感官评分呈上升趋势；然而温度达到120 ℃以上时，电子舌和感官评分显著降低（P<0.05）。此外，在温度达到130 ℃和140 ℃时，MRPs的苦味和咸味急剧增加，这是导致总体感官评分接受性低的主要原因。Liu等[32]也发现过高的加热温度会形成不良的风味成分。综上考虑，选择反应温度100、110、120 ℃进行正交试验。
表 7 反应温度对MRPs的影响Table 7. Effect of reaction temperature on MRPs温度（℃） 100 110 120 130 140 A294 0.10±0.00e 0.30±0.00d 0.68±0.00c 0.92±0.00b 1.04±0.00a A420 0.11±0.00e 0.35±0.00d 0.64±0.00c 0.94±0.00b 1.16±0.00a ΔL* 14.59±0.08a 15.27±0.49a 13.46±0.83b 8.13±0.50c 2.69±0.07d Δa* -2.25±0.28e -0.71±0.08d 2.59±0.55c 5.10±0.39a 3.34±0.34b Δb* 1.32±0.21d 4.07±0.49c 7.45±0.68a 5.08±0.21b 1.92±0.28d ΔE 14.83±0.11a 15.82±0.61a 15.61±1.09a 10.87±0.14b 4.71±0.25c 氨基氮 1.02±0.02a 1.00±0.01ab 0.98±0.01b 0.91±0.01c 0.88±0.01c 2.4 正交试验优化美拉德反应
根据以上的单因素分析，以木糖添加量（A）、反应时间（B）、反应温度（C）、初始pH（D）为因素，进行正交试验。氨基酸作为蛋白质的基本单元，其种类和含量与食品的营养价值和感官呈味特性密切相关[33]。与人工感官评价相比，电子舌可以避免主观影响。因此以电子舌评分为指标，确定碱性蛋白酶和风味蛋白酶连续酶解制备葵花籽蛋白鲜味肽的工艺条件。通过电子舌评分进行极差分析（表8）和方差分析（表9），发现各因素影响程度依次为反应温度>初始pH>反应时间>木糖添加量，最佳组合为A1B2C3D1。以电子舌评分为指标，由正交实验所得的最佳组合A2B2C3D1。通过A1B2C3D1和A2B2C3D1验证，确定制备葵花籽蛋白美拉德鲜味肽的最佳工艺组合为A2B2C3D1，即木糖添加量1.0%，初始pH7.0，120 ℃下反应60 min，电子舌评分为3.93±0.05，鲜味氨基酸含量21.47±0.86 mg/mL。
表 8 正交试验结果Table 8. Results of orthogonal experiment试验号 A B C D 电子舌评分 1 1 1 1 1 3.57 2 1 2 2 2 3.66 3 1 3 3 3 3.64 4 2 1 2 3 3.42 5 2 2 3 1 3.90 6 2 3 1 2 3.37 7 3 1 3 2 3.72 8 3 2 1 3 3.31 9 3 3 2 1 3.61 电子舌评分K1 3.623 3.570 3.417 3.693 电子舌评分K2 3.563 3.623 3.563 3.583 电子舌评分K3 3.547 3.540 3.753 3.457 R 0.07 0.08 0.34 0.24 表 9 电子舌评分方差分析表Table 9. Analysis of variance for electronic tongue score方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 A 0.027 2 0.014 29.107 0.000 ** B 0.034 2 0.017 36.175 0.000 ** C 0.513 2 0.257 546.099 0.000 ** D 0.248 2 0.124 264.161 0.000 ** 误差 0.008 18 0.000 注：**表示显著水平为0.01。 2.5 美拉德反应对葵花籽蛋白肽分子量分布的影响
为了探索参与美拉德反应的肽具体结构组成，许多科研工作者尝试对参与美拉德反应的组分进行分析。Lan等[34]研究温度对木糖和大豆肽体系美拉德反应产物的影响，发现1000 Da以下的肽，是美拉德反应中最活跃的成分。而朱新武[4]研究发现，鸡肉蛋白美拉德肽中起主要呈味作用的是3000 Da以下的小分子的氨基酸以及多肽。在本研究中采用GPC法测定美拉德反应前后，体系中肽段的分子量分布，如图6所示。在美拉德反应前后的体系中，相对分子质量<500 Da的短肽均是体系中肽的主要组分。美拉德反应后，<500 Da组分含量上升，500~1000 Da组分含量明显下降，说明分子量较大的肽被降解成分子量较小的组分，因此推测500~1000 Da组分是进行美拉德反应的重要组分。
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图 6 葵花籽蛋白肽（A）与美拉德肽（B）分子量分布情况Figure 6. Molecular weight distribution of peptides (A) and Maillard reacted peptides (B) from sunflower seed2.6 PCA分析
采用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）进一步分析美拉德反应前后，不同指标对葵花籽蛋白美拉德肽的影响，如图7所示。由图7可知，在PCA分析中总贡献率达84.14%，说明前两个主成分之间独立性较强，能够反映样品的整体信息。分子量<500 Da和2000~3000 Da的样品分布位于第一主成分的正半轴，500~1000 Da、1000~2000 Da和>3000 Da的样品分布位于第一主成分的负半轴。分子量1000~2000 Da、2000~3000 Da和>3000 Da的样品分布位于第二主成分的正半轴，<500 Da和500~1000 Da的样品分布位于第二主成分的负半轴。感官评分、鲜味氨基酸含量、电子舌评分、<500 Da和2000~3000 Da都位于第一主成分的正半轴，表明感官评分、电子舌评分和鲜味氨基酸含量对葵花籽蛋白美拉德肽的评价具有良好的一致性；其中感官评分、鲜味氨基酸含量和<500 Da的肽呈现显著的正相关，表明<500 Da的葵花籽蛋白美拉德鲜味肽其感官评分和鲜味氨基酸的含量较高。
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图 7 葵花籽蛋白肽和美拉德肽不同指标的主成分分析图Figure 7. Principal component analysis plot of different indicators for peptides and Maillard reacted peptides from sunflower seed3. 结论
本文以葵花籽蛋白为原料，通过优化酶解和美拉德反应条件，确定制备葵花籽蛋白美拉德鲜味肽的最优工艺。其结果显示：以酶解产物鲜味值、DH和NS等指标，分别对胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶的酶解工艺进行优化，筛选出碱性蛋白酶和风味蛋白酶为复合酶，进行连续酶解；对复合酶连续酶解工艺的酶添加比例和酶解时间进行优化，确定在底物浓度为8%（w/v），总酶量5000 U/g，碱性蛋白酶和风味酶酶活比为1:2的条件下，用碱性蛋白酶在40 ℃下先处理3 h和风味蛋白酶在50 ℃下继续处理1 h，所得酶解物的DH、NS和鲜味强度较高；以电子舌、感官评分、褐变度和色差等指标，通过单因素实验与正交试验对美拉德反应条件进行优化，确定在木糖添加量为1.0%，反应温度120 ℃，反应时间60 min，pH为7.0的条件下，制备的葵花籽蛋白美拉德鲜味肽具有良好的感官特性，鲜味强度较高，整体风味协调且颜色呈红褐色，鲜味氨基酸的含量为21.47 mg/mL；电子舌评分、感官评分和鲜味氨基酸含量呈正相关，在葵花籽蛋白肽的评价中互为补充。本研究以期为葵花籽蛋白的加工利用及深入研究提供理论基础和技术指导。
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图 2 酶添加量对DH、NS和感官特性的影响
Figure 2. Effects of enzyme addition on DH, NS, and sensory characteristics
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图 3 酶解时间对DH、NS和感官特性的影响
Figure 3. Effects of enzymatic hydrolysis time on DH, NS, and sensory characteristics
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图 4 连续酶解DH，NS和感官特性随酶添加比例和酶解时间比例的变化
Figure 4. Changes in continuous enzymatic hydrolysis of DH, NS and sensory characteristics with enzyme addition ratio and enzymatic hydrolysis time ratio
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图 5 木糖添加量（A）、初始pH（B）、加热时间（C）和加热温度（D）对感官特性的影响
Figure 5. Effects of xylose addition (A), initial pH (B), reaction time (C), and reaction temperature (D) on sensory characteristics
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图 6 葵花籽蛋白肽（A）与美拉德肽（B）分子量分布情况
Figure 6. Molecular weight distribution of peptides (A) and Maillard reacted peptides (B) from sunflower seed
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图 7 葵花籽蛋白肽和美拉德肽不同指标的主成分分析图
Figure 7. Principal component analysis plot of different indicators for peptides and Maillard reacted peptides from sunflower seed
表 1 不同蛋白酶酶解的特性和最适酶解条件
Table 1 Characteristics and optimal enzymatic hydrolysis conditions of different proteases
蛋白酶 主要酶切位点 活力（U/g） pH 温度（℃） 胰蛋白酶 多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断 250000 7.8 37 碱性蛋白酶 羧基侧为疏水性芳香族（酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸） 200000 10.5 40 风味蛋白酶 氨肽酶，羧肽酶的复合物 20000 7.5 50 
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表 2 感官评判标准
Table 2 The sensory evaluation standard
评价标准 分值（分） 鲜味浓郁，无咸味或苦涩味 9~10 鲜味突出，无明显的咸味或苦涩味 7~8 鲜味明显，微有咸味或苦涩味 5~6 鲜味较淡，有咸味或苦涩味 3~4 鲜味不明显，咸味或苦涩味突出 1~2
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表 3 正交试验因素与水平表
Table 3 Orthogonal experimental factors and level table
水平 因素 A木糖添加量（%） B反应时间（min） C反应温度（℃） D初始pH 1 0.5 30 100 7.0 2 1.0 60 110 7.5 3 1.5 90 120 8.0
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表 4 木糖添加量对MRPs的影响
Table 4 Effect of xylose addition on MRPs
木糖
添加量0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% A294 0.22±0.00e 0.42±0.00d 0.54±0.00c 0.79±0.00b 0.95±0.00a A420 0.26±0.00e 0.42±0.00d 0.64±0.00c 0.90±0.00b 1.11±0.00a ΔL* 13.65±0.15a 12.05±0.84b 13.46±0.83a 10.96±0.20bc 10.57±0.48c Δa* -1.00±0.59c 2.90±0.81b 2.59±0.55b 3.48±0.55ab 4.22±0.32a Δb* 5.58±0.55b 9.30±1.52a 7.45±0.68ab 7.40±1.36ab 6.47±0.23b ΔE 14.79±0.37ab 15.52±1.68a 15.61±1.09a 13.71±0.66ab 13.10±0.44b 氨基氮 1.04±0.01a 0.99±0.02b 0.97±0.01bc 0.95±0.02c 0.90±0.01d 注：ΔL*、Δa*、Δb*为样品的L*、a*、b*减去蒸馏水的L*、a*、b*；其中数据为平均值±标准差；同行中数据的不同上标字母代表有显著差异（P<0.05）（n=3）；表5~表7同。
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表 5 初始pH对MRPs的影响
Table 5 Effect of initial pH on MRPs
初始pH 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 A294 0.73±0.00d 0.67±0.00e 0.74±0.00c 0.76±0.00b 0.79±0.00a A420 0.70±0.00d 0.68±0.00e 0.72±0.00c 0.74±0.00b 0.76±0.00a ΔL* 8.35±0.60c 13.46±0.83a 10.20±0.51b 8.55±0.60c 7.85±0.55c Δa* 6.76±0.48a 2.59±0.55c 4.02±0.71b 6.23±0.34a 3.94±1.12bc Δb* 6.12±0.96b 7.45±0.68b 10.51±2.12a 6.20±1.32b 5.96±0.84b ΔE 12.37±1.04b 15.61±1.09a 15.23±1.82a 12.29±1.14b 10.68±0.42b 氨基氮 1.02±0.02a 0.96±0.02bc 0.97±0.01bc 1.00±0.01ab 0.93±0.02c
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表 6 反应时间对MRPs的影响
Table 6 Effect of reaction time on MRPs
时间（min） 30 60 90 120 150 A294 0.18±0.00e 0.41±0.00d 0.67±0.00c 0.79±0.00b 0.96±0.00a A420 0.09±0.00e 0.35±0.00d 0.64±0.00c 0.92±0.00b 1.15±0.00a ΔL* 14.54±0.14a 12.21±0.85b 13.46±0.83a 8.35±0.16c 7.19±0.16d Δa* -0.60±0.21c 2.63±0.56b 2.59±0.55b 6.60±0.61a 6.96±0.22a Δb* 6.45±0.17b 8.52±0.78a 7.45±0.68ab 7.96±1.07a 4.53±0.14c ΔE 15.92±0.19a 15.12±1.19a 15.61±1.09a 13.32±0.52b 10.98±0.30c 氨基氮 1.07±0.02a 1.04±0.01ab 1.01±0.01bc 0.98±0.01c 0.92±0.02d
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表 7 反应温度对MRPs的影响
Table 7 Effect of reaction temperature on MRPs
温度（℃） 100 110 120 130 140 A294 0.10±0.00e 0.30±0.00d 0.68±0.00c 0.92±0.00b 1.04±0.00a A420 0.11±0.00e 0.35±0.00d 0.64±0.00c 0.94±0.00b 1.16±0.00a ΔL* 14.59±0.08a 15.27±0.49a 13.46±0.83b 8.13±0.50c 2.69±0.07d Δa* -2.25±0.28e -0.71±0.08d 2.59±0.55c 5.10±0.39a 3.34±0.34b Δb* 1.32±0.21d 4.07±0.49c 7.45±0.68a 5.08±0.21b 1.92±0.28d ΔE 14.83±0.11a 15.82±0.61a 15.61±1.09a 10.87±0.14b 4.71±0.25c 氨基氮 1.02±0.02a 1.00±0.01ab 0.98±0.01b 0.91±0.01c 0.88±0.01c
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表 8 正交试验结果
Table 8 Results of orthogonal experiment
试验号 A B C D 电子舌评分 1 1 1 1 1 3.57 2 1 2 2 2 3.66 3 1 3 3 3 3.64 4 2 1 2 3 3.42 5 2 2 3 1 3.90 6 2 3 1 2 3.37 7 3 1 3 2 3.72 8 3 2 1 3 3.31 9 3 3 2 1 3.61 电子舌评分K1 3.623 3.570 3.417 3.693 电子舌评分K2 3.563 3.623 3.563 3.583 电子舌评分K3 3.547 3.540 3.753 3.457 R 0.07 0.08 0.34 0.24
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表 9 电子舌评分方差分析表
Table 9 Analysis of variance for electronic tongue score
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 A 0.027 2 0.014 29.107 0.000 ** B 0.034 2 0.017 36.175 0.000 ** C 0.513 2 0.257 546.099 0.000 ** D 0.248 2 0.124 264.161 0.000 ** 误差 0.008 18 0.000 注：**表示显著水平为0.01。
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期刊类型引用(1)
1. 周晓倩，李晓贝，张艳梅，周昌艳，任佳丽，赵晓燕. 基于GC-IMS和GC×GC-To F-MS技术分析产地对羊肚菌挥发性风味成分的影响. 中国农业科学. 2024(22): 4553-4567 . 
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