Optimization of High-density Culture Process of Lacticaseibacillus paracasei Lp.R3
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摘要: 副干酪乳杆菌Lp.R3（Lacticaseibacillus paracasei Lp.R3）是一株具有优良功能的益生菌，为实现其产业化应用对其进行高密度培养以提高活菌数。本研究通过单因素实验和正交试验优化，考察了培养基成分、静态培养条件以及发酵罐工艺对Lp.R3活菌数的影响。确定了优化后的最佳培养基配方为葡萄糖30 g/L、酵母浸粉50 g/L、无水乙酸钠10 g/L、硫酸锰0.1 g/L、吐温80 1 g/L；最佳培养条件为温度35 ℃、初始pH7、接种量为1%，此时活菌数为4.75×109 CFU/mL，是MRS培养基的2.91倍；在5 L发酵罐中的最佳发酵工艺为：不通气搅拌、发酵过程恒定pH为5、25%的氨水作中和剂、补料液为75 g/L的葡萄糖、采用连续变速补料，活菌数提高到了2.63×1010 CFU/mL，是基础的MRS培养下的16.28倍。该研究建立了Lp.R3的高密度生产方法，为Lp.R3的工业化生产提供了技术支持。Abstract: Lacticaseibacillus paracasei Lp.R3 is a probiotic strain with excellent functions. In order to realize its industrial application, high-density cultivation was carried out to increase the number of viable bacteria, the effects of medium composition, static culture conditions, and fermentation tank processes on the number of viable Lp.R3 bacteria were investigated by single factor experiments and orthogonal experiments optimization. The best result (4.75×109 CFU/mL of viable bacteria number) was achieved when Lp.R3 cultured in the medium supplemented with 30 g/L glucose, 50 g/L yeast extract, 10 g/L anhydrous sodium acetate, 0.1 g/L manganese sulfate, and 1 g/L Tween80 under the culture conditions of 1% inoculation level, pH7 and 35 ℃, which was 2.91 times greater than that cultured in MRS medium. In terms of the production in 5 L fermentation tanks, the best result (2.63×1010 CFU/mL of viable bacteria number) was given when L.p R3 fermented under constant pH of 5 neutralized by 25% ammonia, continuous variable feed of 75 g/L glucose, and agitation without aeration, which was 16.28 times greater than that cultured in MRS medium. In summary, the high-density production protocol of Lp.R3 was optimized in present study, providing a promising guide to accomplish large-scale production of Lp.R3.
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副干酪乳杆菌是公认的具有一定益生特性的同型发酵乳酸菌，广泛分布于人体肠道[1]以及口腔中[2]，常被用做于食品发酵剂[3]以及生物制药或益生菌菌粉补充剂[4]，同时也有研究用副干酪乳杆菌来合成高值有机酸，如L-乳酸[5]等。不同的副干酪乳杆菌菌株表现出活性和功能性的差异，导致其生产及应用的不同。副干酪乳杆菌Lp.R3（Lacticaseibacillus paracasei Lp.R3）经前期研究证明具有改善肠道炎症反应[6]、提高免疫力、抗肿瘤[7]等作用，有潜力成为新的活体生物药物。目前Lp.R3作为抗肿瘤的一类创新药已经获得了NMPA药物临床试验批准[8]，为了进一步提高临床试验的药物生产率以及商业价值，高密度培养Lp.R3的工艺开发至关重要。
高密度培养技术主要指通过对培养基成分、静态培养条件和发酵罐工艺进行优化，使乳酸菌细胞群体密度超过常规培养10倍以上的培养技术。在培养基成分方面，主要是在基础MRS培养基上优化，如李盼盼等[9]优化的培养基配方为酵母提取物16 g/L、蛋白胨13 g/L、葡萄糖30 g/L、牛肉膏5 g/L、CH3COONa 4 g/L、吐温80 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、柠檬酸二胺2.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MnSO4 0.2 g/L。在此优化培养基下，鼠李糖乳杆菌LP216的活菌数是MRS活菌数的2.71倍。此外还有研究采用了复杂的半成品谷物豆类[10]或工业加工废物[11]作为碳和氮的来源，减少了生产成本。关于静态培养条件，对乳酸菌活菌数影响最大的因素主要是温度、初始pH以及接种量。王英等[12]通过正交试验考察了培养温度、接种量、初始pH三个主要因素对副干酪乳杆菌FM-LP-4菌株生长发育的影响，发现其主要影响因素是培养温度，其次是初始pH。关于发酵罐工艺优化，常见的有补料分批培养法[13]、化学中和法以及离子交换法等。吴迪[14]结合化学中和法、离子交换法和补料分批法，将产香型干酪乳杆菌TCS活菌数提高到了10.01 lgCFU/mL，是优化前的9.3倍。说明通过优化培养基组成、静态培养条件和发酵罐工艺相结合的方式可以显著提高乳酸菌的活菌数。
本实验主要通过单因素实验和正交试验确定了Lp.R3最佳的培养基配方和最佳静态培养条件，再以优化后的培养基和静态培养条件为基础，运用全自动5 L玻璃发酵罐进行工艺优化，获得高密度发酵Lp.R3的最佳工艺，以期提高Lp.R3在生产时的活菌数，降低生产成本。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
副干酪乳杆菌Lp.R3（Lacticaseibacillus paracasei Lp.R3） 从健康婴儿粪便中分离得到，保藏编号为CGMCCNo.22008；葡萄糖、蔗糖、吐温80、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、麦芽糖、可溶性淀粉 阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾 上海麦克林生化科技股份有限公司；蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨 北京Solarbio科技有限公司；酵母浸粉、牛肉浸粉、低聚果糖 生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸镁、硫酸锰，硫酸锌 西陇科学股份有限公司；番茄汁 市售。
GL-21M离心机 湘仪离心机仪器有限公司；MB-820培养箱 浙江美壁仪器有限公司；SW-CJ-2D超净工作台 科凯特（广州）净化设备科技有限公司；UV-1100紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；Bioscreen C全自动生长曲线测定仪 Oy Growthcurves Ab Ltd；BLBIO-5GJ-6玻璃发酵罐 百仑生物科技有限公司；FD100A灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种活化以及生长曲线测定
将于−80 ℃甘油保存的菌液划线接种到固体MRS培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h后挑取单菌落到MRS液体培养基中37 ℃静置培养24 h，活化两次即得发酵种子液。将种子液以2%（v/v）的接种量接种到液体MRS培养基中，37 ℃下静置培养48 h，每隔2 h用分光光度计测定菌体在600 nm处的光密度。
1.2.2 培养基配制以及活菌数的测定
MRS液体培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉8 g，乙酸钠5 g，酵母浸粉4 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二钾2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.04 g，吐温80 1 mL，加蒸馏水至1000 mL，于118 ℃下灭菌15 min。
MRS固体培养基：向MRS液体培养基中加入1.5%～2.0%（w /v）琼脂粉。
活菌计数采用GB4789.35-2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》方法进行。
1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 碳源、氮源、无机盐和微量元素种类筛选
参考魏敏[15]的方法并修改，以MRS培养基为基础，将其中的碳源分别替换成浓度为20 g/L的（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、低聚果糖），将其中的氮源（酵母浸粉、蛋白胨、牛肉浸粉）分别替换成浓度为20 g/L的（酵母浸粉、蛋白胨、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨），将其中的缓冲盐（无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾）分别替换成浓度为10 g/L的（无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾），将其中的微量元素（硫酸锰、硫酸镁）分别替换成浓度为0.2 g/L的（硫酸锰、硫酸镁、硫酸锌、硫酸锰：硫酸镁（1:1）），保持其他成分不变，接种量为1%，初始pH为6，在37 ℃下静置培养20 h后根据1.2.2的方法计算活菌数。
1.2.3.2 碳源、氮源、无机盐和微量元素添加量单因素优化
参考马精阳[16]的方法并修改，根据1.2.3.1的实验结果，固定培养基成分为葡萄糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、无水乙酸钠10 g/L、硫酸锰0.2 g/L。将葡萄糖按照（10、20、30、40、50 g/L）的浓度，酵母浸粉按照（10、20、30、40、50 g/L）的浓度，无水乙酸钠按照（5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5 g/L）的浓度，硫酸锰按照（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 g/L）的浓度进行优化。接种量为1%，初始pH为6，在37 ℃下静置培养20 h后根据1.2.2的方法计算活菌数。
1.2.4 正交试验
根据上述四个主要成分的添加量单因素优化结果，选取碳源、氮源、缓冲盐和微量元素四个因素的最适添加量范围进行四因素三水平的正交试验，其他条件不变，以活菌数为指标进行正交试验，试验因素表如表1所示。
表 1 正交试验表Table 1. Orthogonal experimental table水平 葡萄糖（g/L） 酵母浸粉（g/L） 无水乙酸钠（g/L） 硫酸锰（g/L） 1 10 30 10 0.05 2 20 40 12.5 0.1 3 30 50 15 0.2 1.2.5 静态培养条件研究
在优化后的培养基基础上，固定初始培养条件为温度37 ℃、接种量1%、初始pH6。保持其他条件不变，逐步探究在不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、不同初始pH（5.5、6、6.5、7、7.5）、不同温度（30、32、35、37、39 ℃）下静置培养20 h后的活菌数，将每步的结果应用于下一步。
1.2.6 发酵罐工艺优化
1.2.6.1 通气和搅拌
在上一步优化的培养基和培养条件的基础上，运用5 L的发酵罐（装液量为2 L）分别探究不通入无菌空气搅拌、通入无菌空气搅拌、静置三种培养方式对Lp.R3活菌数的影响，向发酵罐通入无菌空气时罐压恒定为0.04 MPa，搅拌转速为100 r/min，其他条件保持一致，恒定pH为5.5，中和剂均为5 mol/L NaOH，发酵开始时一次性补入为70 g/L的葡萄糖，发酵20、24和36 h时后进行取样测定活菌数，将此步最优的结果应用于下一步试验中，后续的每一步同理。
1.2.6.2 恒pH培养
恒pH培养也叫化学中和法，通过BLBIO-5GJ-6发酵罐的自动在线检测反馈流加中和剂维持pH恒定。对菌株分别采用恒定pH（5、5.5、6、6.5、7）培养，其他条件保持一致，中和剂均为5 mol/L NaOH，发酵开始时一次性补入为70 g/L的葡萄糖，并在发酵20、24和36 h时进行取样测定活菌数。
1.2.6.3 中和剂种类选择
中和剂的种类在恒pH培养时是关键性因素，在恒pH培养下，分别探究了25%氨水、5 mol/L NaOH、5 mol/L KOH为中和剂时Lp.R3活菌数的变化，保持其他条件不变，发酵开始时一次性补入为70 g/L的葡萄糖，并在发酵20、24和36 h时进行取样测定活菌数来选择合适的中和剂种类。
1.2.6.4 补料液种类和添加量优化
参考陈百莹等[17]的方法并进行修改，测定Lp.R3在发酵罐上恒pH培养，不补料时的生长曲线，每隔4 h取样后分别测定活菌数、OD600值以及残糖浓度，并绘制成生长曲线图。在对数生长末期时向发酵液中以每小时3.4 g/L的恒定速率补加以下四种浓度相同的补料液G1：葡萄糖、G2：葡萄糖+番茄汁、G3：葡萄糖+酵母浸粉（4:1）、G4：优化后的全培养基，并在发酵20、24和36 h时进行取样测定活菌数。再根据试验结果对最优的补料液种类进行添加量的优化，补料液的添加量分别设置为75、60、45 g/L。
1.2.6.5 补料方式优化
补料方式优化参考靳志强等[18]的方法并进行修改。采用不通气搅拌的方式恒pH培养Lp.R3，补料液为75 g/L的葡萄糖。分别比较连续恒速流加补料（B1）、分批恒速流加补料（B2）、连续变速流加补料（B3）、分批一次性补料（B4）四种不同的补料方式对发酵20、24和36 h时Lp.R3活菌数的影响。分批补料培养是指将发酵过程分两个阶段进行，第一个阶段是分批培养，即不进行补料操作正常培养至对数生长末期，第二个阶段是进行补料操作；连续培养则只有一个阶段。
连续恒速流加补料B1：发酵开始就以每小时3.4 g/L的恒定速率将补料液加到发酵罐中。
分批恒速流加补料B2：分批培养结束后以每小时3.4 g/L的恒定速率将补料液加到发酵罐中。
连续变速流加补料B3：发酵开始就逐渐增加补料速率将补料液加到发酵罐中，类似指数流加，但由于流速的自动连续变化难于操作，采用逐步增加流速的方法进行补料，达到分批培养的对数期之前采用每小时1.5 g/L的较低补料速率，在分批培养对数生长末期后开始增加补料速率至每小时4.5 g/L。
连续一次性补料B4：发酵开始就将补料液一次性加到发酵罐中。
1.3 数据处理
数据使用Graphpad Prism 9绘图，SPSS 27进行单因素方差分析（Duncan Test，P<0.05），为保证实验的准确性，每实验进行三次重复，每次重复三个平行，结果用“平均值±标准差”表示。
2. 结果与分析
2.1 生长曲线
Lp.R3在MRS培养基中37 ℃培养48 h，根据全自动生长曲线次测定仪的测定结果绘制生长曲线图如图1，R3在0~2 h处于迟滞期，2~20 h处于对数生长期，20 h后进入到稳定期，48 h内未见衰退期，稳定期较长，适合工业化生产。
2.2 单因素实验
对乳酸菌培养有较强普适性的MRS培养基，因为成分复杂营养丰富可培养大部分的乳酸菌，但是其成本也较高，且在针对特定菌株进行富集培养时有效成分并不明确。而对基础培养基中的主要营养物质进行筛选一直都是提高乳酸菌活菌数的有效手段[19]。
2.2.1 碳源、氮源、无机盐和微量元素种类筛选
碳源是微生物生长和繁殖的重要能量来源，不同碳源对不同菌株的促生长作用不同，由图2A可知葡萄糖和海藻糖可以显著提升Lp.R3的活菌数（P<0.05），而蔗糖、麦芽糖、低聚果糖等多糖对Lp.R3无明显促进作用，从工业化角度考虑选择成本更低的葡萄糖为唯一碳源。而姚国强等[20]发现L.reuteri IMAU10240对麦芽糖的利用效果最好，证明不同乳酸菌对碳源的利用偏好不一样。
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图 2 碳源（A）、氮源（B）、无机盐（C）和微量元素（D）种类对Lp.R3活菌数的影响注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下同。Figure 2. Effect of carbon source (A), nitrogen source (B), inorganic salt (C), and trace element (D) species on viable Lp.R3 bacteria number氮源分为有机氮源和无机氮源。副干酪乳杆菌由于自身酶系简单，缺少多种氨基酸合成途径，只能从外界摄取，而酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨这类有机氮源富含氨基酸、多肽类，能满足菌种生长所需营养的多方面需求[21]。由图2B可知相同浓度的酵母浸粉和MRS培养基中的复合氮源（酵母浸粉、蛋白胨和牛肉浸粉）对Lp.R3活菌数的影响显著，从简化生产配方以及成本考虑选用非动物氮源酵母浸粉为唯一氮源。
由图2C可知无水乙酸钠对Lp.R3活菌数具有显著的促进作用，与基础的MRS相比并无显著性差异，可以判断在MRS培养基中的缓冲盐主要是无水乙酸钠起主要作用，MRS里面的其他成分如磷酸氢二钾和柠檬酸氢二铵对Lp.R3活菌数并无显著促进作用。Parecha等[22]也发现基础的MRS培养基中存在的大多数盐通常不会影响菌体的生物量。其他两种常见的缓冲盐，磷酸二氢钾和磷酸氢二钠也对活菌数无显著促进作用。因此可以选用无水乙酸钠为唯一的缓冲盐。
由图2D可知与未添加任何微量元素的组别相比，向培养基中加入MnSO4或MgSO4时都对Lp.R3的活菌数有显著性促进作用（P<0.05），而ZnSO4与不加微量元素的对照组相比无显著性差异。MnSO4与MgSO4之间无显著性差异，与二者1:1和1:5（MRS）的复配组合也没有显著性差异。锰被证明是一种必需的生长因子，它是乳酸脱氢酶的组成成分，是糖酵解途径关键代谢酶的激活剂[23]。Poddar等[24]也有发现L. paracasei在MRS培养基（含锰）和MRS培养基（不添加锰）中培养18 h后，细胞浓度分别达到9.26±0.21和8.70±0.19 log CFU/mL。说明锰离子对副干酪乳杆菌的生长有显著的促进作用，故选择硫酸锰为唯一的微量元素。
2.2.2 葡萄糖、酵母浸粉、无水乙酸钠和硫酸锰添加量单因素优化
培养基中各组分的添加量对于乳酸菌的生长繁殖至关重要，当添加量过低时，营养物质消耗快，限制了乳酸菌的生长繁殖。但当添加量增加时，培养基中的渗透压也会随之升高，影响细胞内水分活度、细胞膜通透性、蛋白质分子结构与细胞生理功能，从而影响最终的活菌数[25]。基于上述对培养基成分种类的筛选分别探究添加不同浓度的葡萄糖、酵母浸粉、无水乙酸钠和硫酸锰对Lp.R3活菌数的影响。
由图3A可知，虽然随着葡萄糖浓度增加Lp.R3活菌数出现先升高后降低的趋势，但在10-50 g/L范围内没有显著性差异，从成本角度考虑选择最佳的添加量范围为10~30 g/L。由图3B可知，随时酵母浸粉浓度的增加，Lp.R3活菌数先上升后下降，在40 g/L时最高。由图3C可得，Lp.R3的活菌数随着无水乙酸钠浓度的增加先上升后下降，浓度增加到10~20 g/L对活菌数的影响无显著性差异，当浓度大于20 g/L时，活菌数显著降低，田佳雪[26]也发现虽然在培养基中添加缓冲盐可以在一定程度上降低酸对菌体的抑制作用，但过高的浓度可能使得pH调节机制失衡，导致活菌数降低。由图3D可得，随着MnSO4浓度的增加，活菌数出现先上升后下降的趋势，当MnSO4添加量为0.1 g/L时，Lp.R3活菌数最高。综上葡萄糖、酵母浸粉、无水乙酸钠和硫酸锰的最适添加量范围分别为10~30 g/L、30~50 g/L、10~15 g/L、0.05~0.2 g/L。
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图 3 葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）、无水乙酸钠（C）和硫酸锰（D）不同添加浓度对Lp.R3活菌数的影响Figure 3. The effect of different added concentrations of glucose (A), yeast immersion powder (B), anhydrous sodium acetate (C) and manganese sulfate (D) on the number of Lp.R3 viable bacteria2.3 正交试验
根据上述单因素实验结果，选取培养基中的主要成分葡萄糖、酵母浸粉、无水乙酸钠和硫酸锰进行四因素三水平的正交试验，其他条件不变，得到活菌数最高的组合。试验结果与分析如表2。
表 2 正交试验结果与分析Table 2. Results and analysis of the orthogonal experiments试验号 A（葡萄糖） B（酵母浸粉） C（无水乙酸钠） D（硫酸锰） 活菌数（×109 CFU/mL） 1 3 2 3 1 4.00 2 3 3 1 2 4.57 3 2 1 3 2 3.26 4 2 3 2 1 4.11 5 2 2 1 3 3.77 6 1 3 3 3 2.63 7 1 1 1 1 2.06 8 3 1 2 3 3.12 9 1 2 2 2 2.36 K1 7.052 8.442 10.400 10.175 K2 11.143 10.127 9.591 10.194 K3 11.689 11.315 9.893 9.514 k1 2.351 2.814 3.467 3.392 k2 3.714 3.376 3.197 3.398 k3 3.896 3.772 3.298 3.171 R 1.546 0.958 0.270 0.227 较优水平 A3 B3 C1 D2 因素主次 A>B>C>D 根据正交试验结果显示，最优的组合为A3B3C1D2，即葡萄糖30 g/L、酵母浸粉50 g/L、无水乙酸钠10 g/L、MnSO4 0.1 g/L。在此组合下活菌数达到了4.57×109 CFU/mL。由此确定最终的优化培养基成分和配比为：葡萄糖30 g/L、酵母浸粉50 g/L、无水乙酸钠10 g/L、MnSO4 0.1 g/L、吐温80 1 g/L。
2.4 Lp.R3静态培养条件优化
在静态培养时，初始pH、温度和接种量都对菌株的生长和生理活性具有重要作用。接种量过高时，菌体大量生长，营养物质消耗较快，同时产生乳酸会抑制菌株的生长[27]。合适的初始pH对于乳酸菌生长十分关键，当pH过低，需要消耗更多的能量来维持渗透压的平衡，菌株的酶活性受到抑制，pH过高时，会导致细胞膜的破裂，从而影响乳酸菌的生长和代谢[28]。培养温度主要通过影响乳酸菌关键酶的活性发挥作用，在较高的生长温度下，可观察到能量代谢途径受到抑制，而在较低的温度下其代谢缓慢，生长也会受到抑制[29]。以正交试验结果得到的优化培养基为基础，分别探究不同接种量、初始pH和温度对Lp.R3活菌数的影响。根据图4A可得，当接种量为1%时活菌数最高，随着接种量的增加活菌数呈现减少的趋势，1%与5%相比可以显著提高活菌数（P<0.05）。图4B可知，当初始pH为7时活菌数最高，但在6~7.5范围内无显著性差异。图4C可以看出当温度为35 ℃时对Lp.R3的生长具有显著促进作用，当温度大于和小于35 ℃时活菌数都出现了明显的降低，证明温度对Lp.R3的生长影响很大。综上Lp.R3最佳的培养条件是接种量为1%、初始pH为7，温度为35 ℃，在此条件下Lp.R3活菌数最高为4.75×109 CFU/mL，是MRS培养的2.91倍。
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图 4 接种量（A）、初始pH（B）和温度（C）对Lp.R3活菌数的影响Figure 4. Effect of inoculum, initial pH and temperature on viable Lp.R3 count2.5 发酵罐工艺优化
2.5.1 通气与搅拌对Lp.R3活菌数的影响
乳酸菌为厌氧或兼性厌氧微生物，厌氧环境利于大部分乳酸菌的生长，但是部分菌株具有一定的氧耐受能力，所以改变气体环境可能会影响乳酸菌的生长；而搅拌也可以使菌体与培养液中的营养物质与气体充分接触，影响菌体的生长。由于Lp.R3是兼性厌氧的微生物，在有氧和无氧条件下都能生长，因此对是否通入无菌空气和搅拌这两个条件进行考察。由图5可得在5 L的生物反应器中发酵20 h时，在都搅拌的情况下，通气与不通气相比Lp.R3活菌数显著降低（P<0.05），说明向发酵罐中以恒定的压力（0.04 MPa）通入无菌空气会显著降低Lp.R3的活菌数，在36 h不通气搅拌与静置组相比Lp.R3活菌数具有显著提升（P<0.05），说明搅拌可以提高Lp.R3的活菌数，故后续试验都采用不通气搅拌的方式。
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图 5 培养方式对 Lp.R3活菌数的影响Figure 5. Effect of the culture mode on the number of viable Lp.R3 bacteria2.5.2 恒pH培养对Lp.R3活菌数的影响
随着发酵的进行乳酸菌产生的有机酸和H+会对菌体生长产生抑制作用[30]。恒pH培养（化学中和法）就是通过流加碱液中和剂维持发酵液恒定的pH，来缓解酸抑制，但是当pH过高也会对菌体的生长产生不利影响。Wang等[31]发现pH控制在4.2~5.7之间时，L. rhamnosus LS-8的最大细胞密度显著增加且当pH维持在4.7时，细胞密度最高。但周宁萍等[32]发现维持发酵罐pH为7时，植物乳杆菌L. plantarum NCU001929的活菌数最高，此现象说明不同细菌的最佳生长pH不同，这是由细菌的属或种决定的。图6显示副干酪乳杆菌Lp.R3在生物反应器中发酵20 h后，随着时间的增加，当pH>5时，活菌数逐渐减少，且pH越高，现象越明显。通过镜检发现当pH越高菌体逐渐衰退裂解（可观察到菌体变长变细）现象越明显，说明该菌不适用较高的pH培养，如果pH维持在过高的值，细胞会迅速进入衰退期，这将缩短活菌收集的可用操作时间范围，无法满足发酵工业的要求。但当pH<5时，Lp.R3的生长受到抑制，如CK（不控制pH发酵20 h后pH为4.0~4.5）虽然在发酵24 h和36 h时的活菌数稳定，但最高活菌数仅为9.8×109 CFU/mL。而当pH恒定为5发酵24 h时，Lp.R3活菌数达到最大值1.46×1010 CFU/mL，故培养Lp.R3的最佳恒定pH为5，在后续试验中pH都控制在5。
2.5.3 中和剂种类对Lp.R3活菌数的影响
NaOH、KOH和NH3·H2O都是工业发酵中常用的中和剂，此外还有NaHCO3、Na2CO3、Ca（OH）2等。赖长龙等[33]发现氨水作为中和剂能显著提高植物乳杆菌的菌体密度，而彭奎耀[34]的结果显示NaHCO3对嗜热链球菌937的增殖效果较好。针对不同的微生物或不同培养基质，不同的中和剂所能达到的效果也不尽相同[35]。本试验主要比较KOH、NaOH和NH3·H2O这三种中和剂对副干酪乳杆菌Lp.R3活菌数的影响。由图7可知，在发酵20 h和24 h时三种中和剂对Lp.R3活菌数的影响无显著性差异，但到了36 h时氨水对Lp.R3生长的促进作用显著高于其他两种中和剂（P<0.05）。采用氨水作为中和剂不仅可以调节 pH，还可以在发酵后期补充氮源，NH3·H2O与发酵液中的有机酸形成的有机酸铵盐可以重新被副干酪乳杆菌R3利用。因此后续试验都选用25%的氨水作为中和剂。
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图 7 中和剂对Lp.R3活菌数的影响Figure 7. Effect of the neutralizing agent on the viable Lp.R3 bacteria count2.5.4 补料液种类以及添加量对Lp.R3活菌数的影响
补料培养首先要确定培养末期限制细胞增殖的底物，即要确定补料液的组分。Lp.R3在发酵罐上恒pH培养的动力学显示（图8）,到16 h时细胞生长开始进入稳定期，OD（2.36）和活菌数（1.02×1010 CFU/mL）均达到最大值，同时培养基中葡萄糖剩余（4.57 g/L）也降到最低，但此时较大群体的活菌数对碳源的需求也是最高的，初步判断是底物碳源的消耗限制了乳酸菌的生长，故在16 h时补充碳源十分有必要。
为了确定碳源是否为唯一限制性底物，选择培养基中不同的组分与碳源混合后进行补料。结果如图9所示，与不补料的对照组CK相比，补充G1（碳源）、G2（碳源混合生长因子番茄汁）、G3（碳源混合氮源）都能显著延长生长对数期，但是补充G4（浓缩过的优化培养基）并不能促进Lp.R3的生长。在发酵36 h时，G3的效果不如G1和G2，说明氮源的加入对菌株生长没有促进作用，而靳志强等[18]在补料培养时发现葡萄糖和氮源混合物是德氏乳杆菌保加利亚亚种LDB S- 1必要的补加营养素，分析可能是其培养基初始氮源含量太低为30 g/L，而本试验的初始氮源经优化后含量较高为50 g/L，所以氮源不是限制性底物。G1和G2之间无显著性差异，说明生长因子也不是限制性底物，故后续选择葡萄糖作为唯一补料液。
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图 9 补料液对Lp.R3活菌数的影响Figure 9. Effect of the filling solution on the number of Lp.R3 viable bacteria补料液种类确定后进一步对补料量进行优化，设置三组不同的葡萄糖总量，分别为75、60、45 g/L，图10可知，随着补料总量的增加，活菌数也增加，在发酵36 h时，75 g/L和45 g/L的活菌数具有显著性差异（P<0.05），葡萄糖浓度过低会对菌株生长有限制性作用，故后续试验选取75 g/L的葡萄糖进行补料。
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图 10 补料量对Lp.R3 活菌数的影响Figure 10. Effect of fed quantity on Lp.R3 viable bacteria count2.5.5 补料方式对Lp.R3活菌数的影响
补料方式对高密度培养来说至关重要，合适的补料方式可以更好地降低底物抑制作用。由图11可得，B1、B2、B3、B4的活菌数都随着发酵时间的增加而增加，在发酵20 h时B1、B2、B3、B4的活菌数分别为1.685×1010、2.04×1010、1.855×1010、1.56×1010 CFU/mL，B2（分批恒速流加）和B3（连续变速补料）都显著高于B1（连续恒速补料）和B4（连续一次性补料）（P<0.05），在发酵36 h时B1、B2、B3、B4的活菌数分别为2.15×1010、2.35×1010、2.63×1010、2.0×1010 CFU/mL，B3的活菌数显著高于B2（P<0.05）。说明发酵一开始加入高浓度的葡萄糖导致渗透压升高，会对菌体产生一定的抑制作用，不适合用于高密度生产。而恒速流加补料因为补料速率与菌体的生长速率不对应，当菌体处于指数生长时对葡萄糖的需求远大于葡萄糖的补料速率，而导致菌体生长受限，当迟滞期菌体生长缓慢时，恒速补料速率太快，导致葡萄糖浓度升高，渗透压也升高，抑制了菌体的生长繁殖。当采用16 h前后进行连续变速补料后，随着培养时间的增加变速补料与其他三种补料方式的差异性就越显著，故后续试验选用B3连续的变速补料方式对Lp.R3进行高密度培养。
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图 11 补料方式对Lp.R3活菌数的影响Figure 11. Effect of feeding mode on the number of Lp.R3 viable bacteria2.6 Lp.R3培养工艺优化前后生长曲线对比
由图12A可看出，在生物反应器中进行化学中和法与补料培养相结合的发酵方式使 Lp.R3的对数期延长至36 h，最高OD值可达到14.67，显著高于摇瓶培养基础培养基（5.31）和优化后的培养基（7.78）。图12B可知在发酵36 h时发酵罐培养的最高活菌数可达2.56×1010 CFU/mL，是基础培养基（1.65×109 CFU/mL）的15.51倍，是优化后的培养基（4.29×109 CFU/mL）的5.97倍，说明通过合适的发酵罐培养模式可显著提升Lp.R3的生物量和活菌数。36 h后OD值基本不变，活菌数出现下降，说明发酵达到终点。
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图 12 Lp.R3培养工艺优化前后的生长曲线（A）与活菌数（B）Figure 12. Lp.R3 Growth curve (A) and number of viable bacteria (B) before and after optimization of culture process3. 结论
本研究通过单因素和正交试验，对培养基成分、静态培养条件和发酵罐工艺进行优化。优化后的培养基较基础MRS组成成分减少了一半，活菌数提高了两倍。根据试验结果，最佳的培养基成分为葡萄糖30 g/L、酵母浸粉50 g/L、无水乙酸钠10 g/L、MnSO4 0.1 g/L、吐温80 1 g/L，最佳的静态培养条件为：接种量1%、温度35 ℃、初始pH为7，在此条件下Lp.R3的活菌数为4.75×109 CFU/mL，在优化后的培养基基础上对发酵罐工艺进行优化，确定了不通气搅拌的培养方式，发酵罐恒定pH为5，以25%的氨水为中和剂，补料液为75 g/L的葡萄糖，补料方式选择连续变速补料，综上得到了一种可以高密度培养Lp.R3的工艺，使得最高活菌数可达2.63×1010 CFU/mL，是MRS培养基的16.28倍。简化的培养基成分以及高密度的发酵方式为Lp.R3的临床和市场应用提供了更多的可能性，也为实现Lp.R3在食品以及医药行业的工业化生产奠定了基础。
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图 2 碳源（A）、氮源（B）、无机盐（C）和微量元素（D）种类对Lp.R3活菌数的影响
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下同。
Figure 2. Effect of carbon source (A), nitrogen source (B), inorganic salt (C), and trace element (D) species on viable Lp.R3 bacteria number
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图 3 葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）、无水乙酸钠（C）和硫酸锰（D）不同添加浓度对Lp.R3活菌数的影响
Figure 3. The effect of different added concentrations of glucose (A), yeast immersion powder (B), anhydrous sodium acetate (C) and manganese sulfate (D) on the number of Lp.R3 viable bacteria
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图 4 接种量（A）、初始pH（B）和温度（C）对Lp.R3活菌数的影响
Figure 4. Effect of inoculum, initial pH and temperature on viable Lp.R3 count
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图 5 培养方式对 Lp.R3活菌数的影响
Figure 5. Effect of the culture mode on the number of viable Lp.R3 bacteria
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图 7 中和剂对Lp.R3活菌数的影响
Figure 7. Effect of the neutralizing agent on the viable Lp.R3 bacteria count
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图 9 补料液对Lp.R3活菌数的影响
Figure 9. Effect of the filling solution on the number of Lp.R3 viable bacteria
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图 10 补料量对Lp.R3 活菌数的影响
Figure 10. Effect of fed quantity on Lp.R3 viable bacteria count
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图 11 补料方式对Lp.R3活菌数的影响
Figure 11. Effect of feeding mode on the number of Lp.R3 viable bacteria
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图 12 Lp.R3培养工艺优化前后的生长曲线（A）与活菌数（B）
Figure 12. Lp.R3 Growth curve (A) and number of viable bacteria (B) before and after optimization of culture process
表 1 正交试验表
Table 1 Orthogonal experimental table
水平 葡萄糖（g/L） 酵母浸粉（g/L） 无水乙酸钠（g/L） 硫酸锰（g/L） 1 10 30 10 0.05 2 20 40 12.5 0.1 3 30 50 15 0.2 
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表 2 正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of the orthogonal experiments
试验号 A（葡萄糖） B（酵母浸粉） C（无水乙酸钠） D（硫酸锰） 活菌数（×109 CFU/mL） 1 3 2 3 1 4.00 2 3 3 1 2 4.57 3 2 1 3 2 3.26 4 2 3 2 1 4.11 5 2 2 1 3 3.77 6 1 3 3 3 2.63 7 1 1 1 1 2.06 8 3 1 2 3 3.12 9 1 2 2 2 2.36 K1 7.052 8.442 10.400 10.175 K2 11.143 10.127 9.591 10.194 K3 11.689 11.315 9.893 9.514 k1 2.351 2.814 3.467 3.392 k2 3.714 3.376 3.197 3.398 k3 3.896 3.772 3.298 3.171 R 1.546 0.958 0.270 0.227 较优水平 A3 B3 C1 D2 因素主次 A>B>C>D
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