Analysis of Key Aroma Presenting Substances in Yak Milk Lala from Different Regions of Tibet Based on HS-SPME-GC-MS and OAV
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摘要: 以西藏四个地区牦牛乳拉拉为研究对象，采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱（Headspace-Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术，通过香气活度值（Odor Activity Value，OAV）找出关键呈香物质，并运用偏最小二乘判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA），探究不同地区拉拉的关键香气和差异成分，旨在解析西藏地区牦牛乳拉拉的关键呈香物质。结果表明：四个地区牦牛乳拉拉共检测出88种挥发性成分，主要为酸类、醇类、醛类、酯类和酮类以及芳香族化合物；利用阈值筛选出29种OAV≥1的挥发性成分；结合OAV≥1且投影变量影响分析（Impact Analysis of Projection Variables，VIP）>1进一步筛选出9种特征挥发性物质为四个地区牦牛乳拉拉风味的差异性标志物，分别为2R,3R-丁二醇、壬酮、丁二醇、异戊酸、N-甲基-2-吡咯甲醛、乙酸、异丁酸、麦芽酚和肉豆蔻酸。通过OAV、聚类热图、OPLS-DA表明：不同海拔高度的牦牛乳拉拉关键香气成分存在差异，根据VIP筛选出的9种特征挥发性物质较好的区分了四个地区拉拉的特征风味；9种风味物质中2R,3R-丁二醇、壬酮、丁二醇、N-甲基-2-吡咯甲醛、乙酸分别赋予DXLL香甜、青草、烤坚果和淡淡的酸甜味；异戊酸、乙酸、麦芽酚和肉豆蔻酸分别赋予DLLL特殊酸味、焦奶油和椰子香味；异戊酸、异丁酸赋予BGLL酸味。本研究揭示了牦牛乳拉拉关键呈香物质组成，为牦牛乳拉拉特征香气形成机理提供数据支撑，同时也为牦牛乳拉拉的工业化生产提供理论指导。Abstract: The yak milk Lala (YMLL) from four regions of Tibet were used as the research object, and the Headspace-Solid Phase Microextraction combined with Gas Chromatography-Mass Spectrometry (HS-SPME-GC-MS) and Odor Activity Value (OAV) were used to identify the key aromatic substances. Additionally, partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) was utilized to explore the key aroma and different components of Lala at different regions, which aimed to analyze the key aroma substances of YMLL in Tibet. The results revealed that 88 volatile components were detected in YMLL at the four regions, which were primarily acids, alcohols, aldehydes, esters, ketones and aromatic compounds. 29 volatile components with OAV≥1 by threshold value were screened. Furthermore, through a combination of OAV≥1 and impact analysis of projection variables (VIP)>1, 9 characteristic volatile substances as the difference markers of YMLL flavor in the four regions were further identified, that included 2R,3R-butanediol, nonone, butanediol, isovaleric acid, n-methyl-2-pyrrolidine, acetic acid, isobutyric acid, maltol and myristic acid, respectively. The OAV, cluster heat map and OPLS-DA was used to indicate differences in key aroma components of YMLL at different altitudes. The characteristic flavors of Lala in four regions were well distinguished according to these 9 characteristic volatile substances selected by VIP, 2R,3R-butanediol, nonone, butanediol, n-methyl-2-pyrrole formaldehyde and acetic acid give DXLL sweet taste with grassy notes along with roasted nuts and light sweet-and-sour taste respectively. Isovaleric acid, acetic acid, maltol and myristic acid give DLLL special sour taste, burnt cream and coco nut aroma respectively. Isovaleric acid and isobutyric acid give BGLL sour taste. This study had unveiled the key aroma composition of YMLL, and provided data support for the formation mechanism of YMLL characteristic aroma, meanwhile, it also offered the oretical guidance for the industrial production of YMLL.
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牦牛是青藏高原特有优势物种，生存在高海拔高寒地带，被誉为青藏高原的“生命之舟”[1−2]。牦牛乳蕴含丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、干物质等营养元素，有“天然浓缩奶”的美誉。牦牛乳主要制品有酥油、拉拉、曲拉等。拉拉是众多干酪制品中的一员，具有营养价值高，便于运输保存等优点[3]，作为我国西藏地区特色传统乳制品，其独特的风味与极高的营养价值深受农牧民喜爱。拉拉中的蛋白质在凝乳酶的作用下分解成胨、肽、氨基酸等可溶性物质，易被人体吸收。拉拉成熟过程中，大部分乳糖随乳清一起排出，残留的乳糖在发酵剂和微生物的作用下代谢成乳酸，进而代谢成乙醇、乙酸、乙醛和二氧化碳等[4]，组成了牦牛乳拉拉的特有风味。
HS-SPME-GC-MS技术被广泛应用于水果[5−6]、茶类[7−8]和乳制品[9−10]的风味分析。其在乳制品中的应用主要为区分风味差异及特征风味，陈臣等[11]研究发现5种中式酸凝奶酪具有显著风味差异，同时还找出了5种奶酪风味的主要贡献物质。牛婕等[12]采用SPME-GC-MS对不同成熟时期牦牛乳软质干酪挥发性风味物质进行分离鉴定，共检测出45种挥发性化合物，其中酸类物质构成了牦牛乳软质干酪的主体特征风味，乙酸、丁酸、己酸成为干酪中的优势风味物质。巨玉佳等[13]通过电子鼻技术辅助GC-MS对比了牦牛乳硬质干酪与软质干酪中的挥发性风味物质。结果表明，牦牛乳硬质干酪中的主要挥发性风味物质为己酸和2-丁醇；软质干酪的主要挥发性风味物质为丁酸和己酸。郑晓吉等[14]对来自新疆哈萨克族不同地区20种奶酪样品中挥发性风味组分进行研究，共检测出52种主要挥发性化合物，并运用主成分分析对不同地区奶酪进行了归类划分。卢灏泽等[15]对西藏不同地区牦牛奶酪中挥发性物质进行了测定，发现西藏牦牛奶酪中有43种挥发性成分，其中主要风味物质为己醛、辛醛、壬醛、癸醛、2-壬酮、辛酸乙酯、1-庚醇、2, 3-丁二醇等，另外发现风味物质构成与微生物群落具有一定的相关性。
目前，关于西藏牦牛乳拉拉挥发性成分的研究相对较少，本研究采用HS-SPME-GC-MS结合OAV和OPLS-DA对西藏四个地区牦牛乳拉拉中挥发性风味物质进行阐述，详细剖析了各个地区的关键香气成分和差异性风味物质，为揭示了不同地区牦牛乳拉拉的关键香气物质及其质量体系构建和产业开发提供数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
采集西藏林芝市巴宜区（BYLL；海拔2900 m）、拉萨市当雄县（DXLL；海拔4300 m）、拉萨市堆龙德庆区（DLLL；海拔4500 m）、那曲市班戈县（BGLL；海拔4877 m）四个不同海拔高度的牦牛乳拉拉。拉拉采样情况：分别取3户农牧民自制、成熟期为15 d左右的拉拉，各取2 kg样品运输至实验室，称取相同质量的拉拉粉碎混匀后进行检测。C7~C30正构烷烃标准品 色谱纯、2-甲基-3-庚酮 色谱纯，美国sigma公司；氯化钠 分析纯，广州化学试剂厂。
08-2T恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；57330-U固相微萃取装置、57348-U固相微萃取针、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 美国Supelco公司；Agilent 7890A-5975C GC-MS气相色谱质谱联用仪、HP-INNOWax气相色谱柱Polyethylene Glyco （50 m×200 μm×0.2 μm） 美国安捷伦公司。
1.2 实验方法
1.2.1 萃取条件
准确称取5.00 g粉碎后的样品置于20 mL萃取瓶中，加入100 μg苯乙酸异戊酯（溶于正己烷，5 mg/mL，取20 μL加入），密封，置于60 ℃水浴中，平衡20 min后，插入萃取针萃取30 min。萃取针使用前，在气质进样口活化20 min（250 ℃）。
1.2.2 GC-MS的分析
1.2.2.1 GC条件
根据Urgeghe等[16]方法，稍作修改。进样口温度250 ℃，气质接口温度250 ℃，载气流速1.5 mL/min。不分流进样。进样：萃取针在进样口解析附5 min；升温程序：初始50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温到100 ℃保持5 min；4 ℃/min升温到140 ℃保持4 min；4 ℃/min升温到180 ℃保持2 min；10 ℃/min升温到250 ℃保持10 min。
1.2.2.2 MS条件
离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ，EI电离70 eV，全扫描50~550 da。1.2.2.3 定性定量分析 挥发性物质定性基于NIST 17质谱数据库，使用AMDIS软件进行双向检索，并结合保留指数值进行定性。挥发性物质定量用苯乙酸异戊酯作为内标化合物，采用内标半定量法计算拉拉中挥发性化合物的含量，单位为μg/g。
1.2.3 关键香气成分分析
根据内标法定量分析得到的结果和各挥发性成分在水中的嗅觉阈值[17]来确定关键香气成分。气味活度值（OAV，OAV≥1.0为关键风味物质，0.1≤OAV<1.0为修饰性风味物质，OAV<0.1为潜在修饰风味物质）[18]，计算见式（1）：
$$\rm OAV=\frac{c}{OT} $$ (1) 式中：c表示挥发性化合物的绝对含量，mg/kg；OT表示该化合物在水中的嗅觉阈值，mg/kg。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2010处理数据，数值以“平均值±标准差”表示，以SPSS 21.0进行显著性分析（P<0.05），同时用Origin 2021和SIMCA 14.1进行绘图，每组实验测定3次。
2. 结果与分析
2.1 四个地区牦牛乳拉拉挥发性成分分析
由表1和图1可知，西藏四个地区牦牛乳拉拉中共鉴定出88种挥发性风味物质，主要为酸类24种、醛类15种、酯类15种、醇类12种、酮类7种、酚类4种及其他类11种。由此可知牦牛乳拉拉的挥发性物质的种类以酸类、醛类和酯类为主，其中乳酸菌代谢是形成拉拉酸类风味物质的主要原因，由此可知拉拉中可能蕴含较多种类和数量的乳酸菌；醛类和酯类化合物的种类较多可能是由于拉拉中所含酶类的活性较高所致。另外张兰俊等[19]研发新品种牦牛乳干酪时，发现关键风味物质主要为酸类、醇类，与本研究结果类似。BGLL共检测出64种挥发性风味物质，香气总量最高为401.96 μg/g，其次是DXLL共检测出58种挥发性风味物质，香气总量为354.07 μg/g和DLLL共检测出49种挥发性风味物质，香气总量为283.31 μg/g，最后是BYLL共检测出37种挥发性风味物质，香气总量为65.75 μg/g。因拉拉的制作原料为牦牛乳，而四个地区牦牛乳的营养成分区别较大，导致四个地区牦牛乳拉拉的挥发性化合物相差较大；另外也可能于拉拉的传统制作工艺，开放式晾晒贮存方式有关。
表 1 四个地区牦牛乳拉拉中挥发性成分及含量Table 1. Volatile components and contents in yak milk lala from four regions序号 化合物名称 CAS号 含量（μg/g） BYLL DLLL DXLL BGLL 醇类化合物 1 己醇 111-27-3 − − 0.47±0.06a 0.32±0.09b 2 戊醇 71-41-0 − 0.84±0.07a − − 3 异戊醇 123-51-3 − − − 1.87±0.12a 4 丁二醇 513-85-9 1.19±0.02d 21.97±0.82b 70.09±0.16a 3.97±0.12c 5 2R,3R-丁二醇 024347-58-8 1.86±0.06d 16.69±0.33b 27.84±0.35a 5.15±0.14c 6 正辛醇 111-87-5 0.30±0.01c 2.10±0.03a 0.40±0.02b 0.40±0.01b 7 糠醇 98-00-0 15.86±0.16a 7.16±0.02c 12.98±0.49b 1.99±0.02d 8 苯甲醇 100-51-6 − − 0.06±0.01b 1.08±0.41a 9 苯乙醇 60-12-8 − 0.35±0.00b − 0.83±0.09a 10 柏木油醇 77-53-2 − − − 0.27±0.11a 11 丙二醇PG 57-55-6 − − 0.87±0.06a − 12 5-甲基-2-呋喃甲醇 3857-25-8 − 0.14±0.08b 0.26±0.01a − 醛类化合物 1 庚醛 111-71-7 0.37±0.02c 4.85±0.11a − 1.39±0.12b 2 壬醛 124-19-6 2.76±0.02c 8.04±0.12a 0.78±0.15d 3.12±0.29b 3 己醛 66-25-1 0.10±0.01b 3.23±0.20a − − 4 辛醛 124-13-0 0.62±0.01b − 0.86±0.00a − 5 癸醛 112-31-2 − 0.26±0.00a − − 6 糠醛 98-01-1 0.35±0.00b 0.39±0.01b 0.77±0.07a 0.28±0.09b 7 苯甲醛 100-52-7 0.11±0.01d 1.62±0.04a 0.32±0.02c 0.65±0.15b 8 十一烯醛 1337-83-3 0.46±0.01b 3.17±0.07a 0.05±0.02d 0.14±0.01c 9 月桂醛 112-54-9 − 0.32±0.02a − − 10 肉豆蔻醛 124-25-4 − 1.02±0.09a − − 11 2-十二烯醛 4826-62-4 0.21±0.01b 2.46±0.05a 0.06±0.01d 0.14±0.00c 12 5-甲基糠醛 620-02-0 − − 0.07±0.03a − 13 5-羟甲基糠醛 67-47-0 − 0.10±0.01a − − 14 N-甲基-2-吡咯甲醛 1192-58-1 − − 0.11±0.02a − 15 反,反-2,4-癸二烯醛 25152-84-5 − 1.08±0.03a − − 酸类化合物 1 乙酸 64-19-7 21.29±0.39d 112.08±0.53b 129.97±0.09a 24.80±1.27c 2 甲酸 64-18-6 1.33±0.05b 0.82±0.02c 6.70±0.05a 0.82±0.01c 3 丙酸 79-09-4 0.21±0.01d 4.09±0.04a 3.50±0.03b 0.61±0.04c 4 丁酸 107-92-6 0.59±0.03c 1.17±0.03c 3.61±0.09b 14.66±0.64a 5 异丁酸 79-31-2 0.14±0.01c 0.60±0.01b 0.50±0.00b 0.81±0.12a 6 戊酸 109-52-4 − − − 0.13±0.03a 7 异戊酸 503-74-2 − 0.57±0.01a 0.49±0.01a 0.53±0.12a 8 己酸 142-62-1 0.81±0.02c 2.30±0.56b 2.38±0.02b 29.89±0.38a 9 庚酸 111-14-8 − 0.33±0.00b 0.06±0.01c 0.68±0.03a 10 辛酸 124-07-2 1.34±0.02c 2.54±0.01b 3.38±0.02b 65.47±1.22a 11 壬酸 112-05-0 0.47±0.03c 1.50±0.11b 0.62±0.15b 2.12±0.22a 12 乳酸 79-33-4 − 27.62±0.25b 30.02±0.22a 10.69±0.41c 13 癸酸 334-48-5 4.21±0.02d 5.98±0.08c 9.51±0.04b 138.91±1.45a 14 9-癸烯酸 14436-32-9 0.21±0.01c 0.44±0.03b 0.41±0.02bc 4.25±0.22a 15 十一酸 112-37-8 − − 0.13±0.00b 0.72±0.03a 16 苯甲酸 65-85-0 1.20±0.01d 4.81±0.01c 7.85±0.04b 14.59±0.51a 17 月桂酸 143-07-7 1.04±0.04c 2.56±0.02b 3.47±0.10b 35.78±1.04a 18 十三酸 638-53-9 − − 0.32±0.00b 0.43±0.00a 19 十五酸 1002-84-2 − − 1.86±0.01a 0.52±0.06b 20 棕榈酸 57-10-3 0.60±0.02d 1.14±0.02c 5.00±0.00a 3.12±0.11b 21 苯乙酸 103-82-2 − − 0.31±0.04a − 22 肉豆蔻酸 544-63-8 1.26±0.10d 2.98±0.11c 6.38±0.02b 12.68±0.28a 23 肉豆蔻油酸 544-64-9 − − 0.29±0.02a − 24 油酸 112-80-1 − − 1.11±0.14a − 酮类化合物 1 壬酮 821-55-6 − − 0.24±0.02a 0.11±0.00b 2 呋喃酮 3658-77-3 0.22±0.02c 0.29±0.02b 0.48±0.03a 0.31±0.01b 3 羟基丙酮 116-09-6 0.75±0.04b − 1.75±0.14a 0.94±0.20b 4 甲基辛基酮 693-54-9 0.11±0.01a − − − 5 2-（5H）-呋喃酮 497-23-4 0.20±0.01c 0.74±0.03a 0.77±0.02a 0.42±0.02b 6 3-羟基丁酮-2 513-86-0 1.45±0.11c 14.95±0.60a 1.89±0.21c 5.45±0.34b 7 反,反-3,5-辛二烯酮 30086-02-3 − − − 0.19±0.02a 酯类化合物 1 乙酸仲丁酯 105-46-4 − − − 0.70±0.06a 2 辛酸乙酯 106-32-1 − − − 0.17±0.01a 3 丁二醇二乙酸酯 1114-92-7 − − − 0.13±0.01a 4 γ-丁内酯 96-48-0 0.11±0.00d 0.54±0.02a 0.39±0.02b 0.18±0.01c 5 癸酸乙酯 110-38-3 − − − 0.49±0.01a 6 乙酸苯乙酯 103-45-7 − − − 0.99±0.02a 7 2-糠酸甲酯 611-13-2 0.32±0.02b − 1.07±0.07a 0.17±0.01c 8 马来酸二丁酯 105-76-0 − − − 0.10±0.00a 9 丁位癸内酯 705-86-2 − 0.26±0.02a 0.07±0.00c 0.18±0.01b 10 二氢茉莉酮酸甲酯 24851-98-7 − − − 0.27±0.03a 11 丁位十二内酯 713-95-1 0.14±0.01c 0.60±0.02b 0.52±0.02b 1.10±0.09a 12 月桂酸乙酯 106-33-2 − 0.35±0.03a − − 13 丙位十一内酯 104-67-6 0.06±0.01a − − − 14 （+/-）-β-羟基-γ-丁内酯 5469-16-9 0.91±0.01b 2.09±0.08a 0.69±0.01c − 15 对甲氧基桂酸-2-乙基己酯 5466-77-3 − − − 0.39±0.10a 芳香族和杂环类化合物 1 萘 91-20-3 − 0.18±0.02b 0.08±0.03c 0.34±0.06a 2 1-甲基萘 90-12-0 − − 0.10±0.03b 0.40±0.09a 3 2-甲基萘 91-57-6 − − − 0.21±0.01a 4 麦芽酚 118-71-8 2.60±0.02c 10.95±0.83a 10.07±0.18b 2.50±0.11c 5 苯酚 108-95-2 − − − 0.16±0.01a 6 对甲酚 106-44-5 − − − 0.38±0.02a 7 BHT/2,6-二叔丁基对甲酚 128-37-0 − − 0.89±0.01a − 8 2-戊基呋喃 3777-69-3 − 2.06±0.00a 0.49±0.11b − 9 2-乙酰基呋喃 1192-62-7 − 1.51±0.01a − − 10 2-甲酰吡咯 1003-29-8 − 1.45±0.05a 0.08±0.04b − 11 2,3,5,6-四甲基吡嗪 1124-11-4 − − − 0.39±0.02a 12 罗汉柏烯 470-40-6 − − − 0.41±0.06a 13 二甲基砜 67-71-0 − − 0.32±0.04b 0.60±0.03a 14 甘油 56-81-5 − − 0.23±0.01b 0.49±0.07a 15 乙酰胺 60-35-5 − − 0.08±0.03a − 注：“−”表示未检出；同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 ![]()
图 1 四个地区牦牛乳拉拉中挥发性风味物质含量及分布Figure 1. Content and distribution of volatile flavor substances in yak milk lala in four regions总的来说，四个地区牦牛乳拉拉中酸类化合物含量最高[13]。其次是醇类化合物，醛类和酮类化合物含量大致相同。牦牛乳干酪中乙酸、丁酸、己酸等为干酪中特殊的优势风味物质[20]，乙酸在拉拉发酵过程中产生，是牦牛乳拉拉具有酸味的原因，BYLL、DLLL和DXLL中酸类化合物含量最高的均为乙酸，与牛婕等[12]报道的牦牛乳软质干酪中的优势风味物质结果相似，而BGLL含量最高的酸类化合物为癸酸，在酸类风味上有别于另外三个地区；醛类物质的风味阈值一般最低，己醛、庚醛、壬醛等是奶酪中常见的醛类化合物，其中壬醛为奶酪贡献花香和柑橘类水果香气[20]，卢灏泽等[15]在研究西藏牦牛乳奶酪风味物质时发现壬醛含量较高。同样，本研究中BYLL、DLLL和BGLL中醛类化合物含量最高的为壬醛，而DXLL含量最高的醛类化合物为辛醛，辛醛可能是形成DXLL拉拉独特风味的原因；3-羟基丁酮-2呈现奶油、黄油味[21]，是发酵乳制品中典型的风味物质，四个地区含量最高的酮类化合物均为3-羟基丁酮-2；醇类化合物中DLLL和DXLL含量最高的为丁二醇，BGLL为2R,3R-丁二醇，BYLL为糠醇，糠醇具有甜香、焦糖香，可能是形成BYLL拉拉独特风味的原因。
如图2所示，四个地区共有成分19种，BYLL中特有成分2种，DLLL中特有成分有8种，DXLL特有成分11种，BGLL特有成分20种。牦牛乳经过发酵、凝乳、热烫拉伸后形成拉拉，叶丹[22]探究了西藏三个不同海拔高度牦牛乳中的挥发性风味物质，其中那曲市班戈县牦牛乳中的种类和含量最多，林芝市巴宜区和拉萨市堆龙德庆牦牛乳中的种类和含量无显著差异。所以总体风味物质的种类和数量还是取决于牦牛乳本身，发酵、凝乳等步骤可能改变了拉拉的风味组成。另外这些共有成分可能是鉴别拉拉与其他干酪制品具有不同风味的原因，而特有成分可能是区分四个地区牦牛乳拉拉的关键挥发性风味物质。
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图 2 四个地区牦牛乳拉拉中挥发性物质韦恩图Figure 2. Venn diagram of volatiles in yak milk lala from four regions对四个地区检测出的88种挥发性化合物进行相关性分析，如图3所示，BGLL中挥发性成分与其他三个地区相关性较低，因BG海拔较高，同时BG牦牛乳中挥发性成分与BY和DL的种类和含量差异显著[22]，是相关性低的主要原因。BYLL与DLLL和DXLL的皮尔逊相关系数分别为0.74和0.79，同时DLLL和DXLL挥发性风味化合物种类最为相似，呈现正相关，皮尔逊相关系数高达0.94，BY与DL和DX的海拔相差1000米左右，同时BY和DL牦牛乳中挥发性化合物种类和含量差异不显著[22]，是BYLL和DLLL相关性较高的主要原因。此外，同海拔地区牦牛乳中挥发性成分的种类和含量相似，DL与DX海拔相差不大，牦牛乳挥发性化合物成分相似，另外DL和DX地区牧民制作拉拉的工艺相似。所以DLLL与DXLL中的挥发性化合物具有极高的相关性。
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图 3 四个地区牦牛乳拉拉中挥发性物质相关性热图Figure 3. Thermogram of volatiles correlation in yak milk lala in four regions2.2 四个地区牦牛乳拉拉中关键香气成分分析
OAV能够体现挥发性风味物质对整体风味的贡献，通常认为OAV>1的化合物是该样品的特征风味物质，若OAV>10，则认为该香气化合物对牦牛乳拉拉整体香气产生了显著影响[23−24]。根据气味阈值得到OAV≥1的29种关键香气成分，OAV>10的14种关键香气成分，赋予了牦牛乳拉拉典型的干酪香气。结果见表2，所列化合物均至少有一个样品的OAV>1。
表 2 不同地区牦牛乳拉拉特征香气成分OAV及其阈值Table 2. Characteristic aroma components of yak milk lala OAV and their thresholds in different regions序号 化合物名称 香气阈值（mg/kg） 气味活度值（OAV） BGLL DXLL DLLL BYLL 1 异戊酸 0.49 1.08 1.00 1.16 − 2 异戊醇 0.004 468.55 − − − 3 异丁酸 0.3 2.71 1.66 1.99 <1 4 乙酸仲丁酯 0.006 115.96 − − − 5 乙酸 22 1.13 5.91 5.09 <1 6 辛酸乙酯 0.0193 8.81 − − − 7 辛酸 3 21.82 1.13 <1 <1 8 辛醛 0.0008 − 1080.28 − 770.75 9 十二醛 0.01 − − 32.40 − 10 肉豆蔻酸 10 1.27 <1 <1 <1 11 肉豆蔻醛 0.11 − − 9.23 − 12 壬酮 0.2 <1 1.20 − − 13 壬醛 0.0011 2839.11 707.54 7311.68 2508.09 14 麦芽酚 1.24 2.02 8.12 8.83 2.10 15 糠醇 4.5005 <1 2.88 1.59 3.52 16 己酸 3 9.96 <1 <1 <1 17 己醛 0.0615 − − 52.54 1.58 18 癸酸 10 13.89 <1 <1 <1 19 癸醛 0.003 − − 86.83 − 20 庚醛 0.003 461.71 − 1616.87 121.83 21 对甲酚 0.0039 96.81 − − − 22 丁二醇 70 <1 1.00 <1 <1 23 苯乙醇 0.56423 1.47 − <1 − 24 苯甲醛 0.75 <1 <1 2.16 <1 25 N-甲基-2-吡咯甲醛 0.037 − 2.92 − − 26 3-羟基丁酮-2 0.04 136.20 47.14 373.76 36.29 27 2-正戊基呋喃 0.0058 − − 355.75 − 28 2-十二烯醛 0.0014 102.03 45.07 1759.93 147.64 29 2R,3R-丁二醇 20 <1 1.39 <1 <1 注：“−”表示未检测出。 醛类主要由Strecker降解反应过程中脂肪和氨基酸的氧化产生[25]，壬醛有甜奶油、黄油味，主要是油酸氧化所致；辛醛有类似甜橙的香气[26]；这两种化合物通常都具有较高的OAV，是牦牛乳拉拉中重要的风味化合物，辛醛是DXLL和BYLL样品特有的风味物质，而四个地区拉拉中的壬醛OAV均较高，是拉拉的特征风味物质。庚醛具有强烈、不愉快的油脂刺鼻气味[27]，是DLLL、BGLL的特征风味物质。己醛呈现出青草香味[28]，是DLLL和BYLL的特征风味物质。苯甲醛相对含量较低但具有令人愉快的杏仁香，是DLLL特有的风味物质。这些醛类对牦牛乳拉拉的整体风味起着积极作用。
醇类一般具有较高的气味阈值，由多不饱和脂肪酸氧化形成，在乳制品的风味中起着关键作用。苯乙醇赋予牦牛乳拉拉玫瑰香味[29]；糠醇具有甜香、焦糖香，除BGLL以外，糠醇是其他三个地区拉拉的特有风味物质；异戊醇具有香蕉和醇香[12]，是BGLL独特的风味物质；2R,3R-丁二醇有苦杏仁甜八角的味道[21]，是DXLL独特的风味物质。这些醇类能够更好的修饰牦牛乳拉拉的风味。酮类物质阈值低、气味贡献较大且风味独特，主要在脂肪酸的β-氧化过程产生，赋予拉拉花香、果香和奶香味[30]，通常是干酪中风味物质的重要组成部分。3-羟基丁酮-2呈现奶油、黄油味[21]，在四个地区拉拉中OAV均大于10，是干酪典型的风味物质。壬酮具有乳酪、奶香味[12]，是DXLL所具有的独特风味物质。
酸类化合物是牦牛乳拉拉中的重要挥发性风味化合物之一，也是酮类、醛类和酯类等化合物的重要前体物质[31]。酸类对发酵乳制品风味具有重要影响，己酸呈现出奶酪香和脂肪香味[32]，是BGLL独有的特征气味物质，拉拉与乳扇制作方式相似，马艳丽等[10]同样检测出云南乳扇中己酸是乳扇中重要的特征风味组分；异戊酸和乙酸分别呈现酒香和淡淡的酸甜味[22]，是BGLL、DXLL和DLLL的特征风味物质；辛酸呈现汗臭味，是BGLL和DXLL的特征风味物质，对干酪整体香气起着积极促进作用[33]。
酯类物质是由乳脂肪降解产生的脂肪酸与发酵过程中乳糖代谢产生的醇类发生酯化反应产生[30]。酯类是奶酪中的重要风味成分，具有花香、果香且阈值低，可调节由酸类浓度过高而引起的刺激性气味，使风味更加柔和，对整体风味起着修饰作用[34−35]。四个地区牦牛乳拉拉中仅有两种酯类物质，即乙酸仲丁酯、辛酸乙酯为特征风味物质；对甲酚和麦芽酚分别呈现出烟熏香味和甜味、棉花糖香气，对甲酚是BGLL独有的特征风味物质，而麦芽酚是四个地区共同的特征风味物质。酚类、呋喃以及杂环聚合物对牦牛乳拉拉的风味均具有良好的修饰作用。
为了更加直观的比较不同地区关键香气成分的差异，基于热图可视化层次聚类分析29种特征挥发性物质（图4），颜色从深蓝到深红代表含量由低到高。结果表明，BGLL和DLLL的关键香气成分要比DXLL和BYLL高，其中BYLL的关键香气成分最少；其中BGLL的关键香气物质主要由酸类和酯类组成，DLLL的关键香气物质主要由醛类组成，DXLL和BYLL的关键香气物质主要为醇、醛类。四个地区的牦牛乳拉拉可以聚为3类，其中BYLL和DXLL可以聚为一类，BGLL和DLLL分别单独聚为一类，说明BYLL和DXLL的关键香气成分相似，而BGLL、DLLL与BYLL和DXLL差别较大，另外BGLL和DLLL的关键香气物质组成差异明显，可能与原料乳品质、海拔和成熟环境有关。异戊酸、异戊醇、异丁酸、乙酸仲丁酯、辛酸乙酯、对甲酚、辛酸、己酸、肉豆蔻酸、苯乙醇和癸酸组成了BGLL的关键香气；壬酮、丁二醇、2R,3R-丁二醇和N-甲基-2-吡咯甲醛香气成分能区分出DXLL；糠醇能识别出BYLL；肉豆蔻醛、癸醛、2-正戊基呋喃、己醛、2-十二烯醛、庚醛、3-羟基丁酮-2、苯甲醛和壬醛香气成分能够更好地辨别DLLL。
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图 4 四个地区牦牛乳拉拉关键香气成分聚类热图Figure 4. Clustering heat map of key aroma components of yak milk lala in four regions2.3 四个地区牦牛乳拉拉关键香气成分差异分析
采用OPLS-DA和VIP结合OAV来探究不同地区间拉拉的差异性并确定出各个地区牦牛乳拉拉特色风味成分。其中OPLS-DA作为一种监督的多元判别分析统计方法，能有效筛选关键标志性差异物质[36−37]。
以OAV≥1的29种香气成分作为因变量，以西藏四个地区牦牛乳拉拉作为自变量。四个地区牦牛乳拉拉关键香气OPLS-DA得分图，如图5所示。本次分析中的自变量拟合指数（R2x）为0.995，因变量拟合指数（R2y）为0.998，模型预测指数（Q2）为0.998，R2和Q2超过0.5表示模型拟合结果可接受[38]。四个地区分别经过200次置换检验，进行模型验。由图6可知，四个地区模型中Q2回归线与纵轴的相交点均小于0，说明模型不存在过拟合，模型验证有效，认为该结果用于分析不同地区牦牛乳拉拉香气特征具有良好的预测性和可行性，可以用于各个地区牦牛乳拉拉的判别分析。
VIP是OPLS-DA模型变量的权重值，可用于衡量各组分积累差异对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，VIP值越大，贡献率越大，通常VIP>1为常见的差异代谢物筛选标准[39]。结合表2和图7，进一步筛选出OAV≥1且VIP>1的挥发性物质共9种，认定为四个样品的差异性标志物，可作为区分四个地区拉拉的重要指标。包括4种酸类、2种醇类、1种酮类、1种醛类和1种酚类，分别为2R,3R-丁二醇、壬酮、丁二醇、异戊酸、N-甲基-2-吡咯甲醛、乙酸、异丁酸、麦芽酚和肉豆蔻酸。在9个差异性标志物中2R,3R-丁二醇、壬酮、丁二醇、N-甲基-2-吡咯甲醛、乙酸赋予DXLL香甜、青草、烤坚果[40]以及淡淡的酸甜味[21]；异戊酸、乙酸、麦芽酚和肉豆蔻酸赋予DLLL刺激酸味、焦奶油硬糖[41]和椰子香味；异戊酸、异丁酸赋予BGLL刺激性酸败味。
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图 6 四个地区牦牛乳拉拉OAV的OPLS-DA模型交叉验证Figure 6. Cross validation of OPLS-DA model for yak milk lala OAV in four districts 注：A-BGLL，B-DXLL，C-DLLL，D-BYLL3. 结论
为解析西藏地区牦牛乳拉拉的关键呈香物质，通过HS-SPME-GC-MS、OAV及OPLS-DA研究西藏不同地区拉拉中挥发性化合物组成以及关键呈香物质。四个地区拉拉中共检测出88种挥发性化合物，包括酸类24种、醛类15种、酯类15种、醇类12种、酮类7种、酚类4种及其他类11种，其中酸类、醛类和酯类在拉拉呈香方面发挥重要作用。运用OAV分析确定了29种拉拉关键香气成分，其中BGLL和DLLL中的关键香气成分最多，说明两个地区拉拉的特征风味更明显。基于VIP值建立不同地区牦牛乳拉拉的OPLS-DA分析模型，筛选出9种差异性标志物，包括2R,3R-丁二醇、壬酮、丁二醇、异戊酸、N-甲基-2-吡咯甲醛、乙酸、异丁酸、麦芽酚和肉豆蔻酸，这些物质赋予拉拉特殊风味的同时也较好的区分四个地区牦牛乳拉拉。
目前，西藏不同地区牦牛乳拉拉的特性风味解析、关键香气物质和差异性标志化合物的研究未见报道，本研究为牦牛乳拉拉工艺研制和香气形成机制提供理论依据。由于牦牛乳拉拉的风味形成机制尚不明确，导致拉拉工艺不成熟，后续可以运用组学技术进一步探究牦牛乳拉拉来优化拉拉生产工艺。
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图 1 四个地区牦牛乳拉拉中挥发性风味物质含量及分布
Figure 1. Content and distribution of volatile flavor substances in yak milk lala in four regions
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图 2 四个地区牦牛乳拉拉中挥发性物质韦恩图
Figure 2. Venn diagram of volatiles in yak milk lala from four regions
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图 3 四个地区牦牛乳拉拉中挥发性物质相关性热图
Figure 3. Thermogram of volatiles correlation in yak milk lala in four regions
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图 4 四个地区牦牛乳拉拉关键香气成分聚类热图
Figure 4. Clustering heat map of key aroma components of yak milk lala in four regions
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图 6 四个地区牦牛乳拉拉OAV的OPLS-DA模型交叉验证
Figure 6. Cross validation of OPLS-DA model for yak milk lala OAV in four districts 注：A-BGLL，B-DXLL，C-DLLL，D-BYLL
表 1 四个地区牦牛乳拉拉中挥发性成分及含量
Table 1 Volatile components and contents in yak milk lala from four regions
序号 化合物名称 CAS号 含量（μg/g） BYLL DLLL DXLL BGLL 醇类化合物 1 己醇 111-27-3 − − 0.47±0.06a 0.32±0.09b 2 戊醇 71-41-0 − 0.84±0.07a − − 3 异戊醇 123-51-3 − − − 1.87±0.12a 4 丁二醇 513-85-9 1.19±0.02d 21.97±0.82b 70.09±0.16a 3.97±0.12c 5 2R,3R-丁二醇 024347-58-8 1.86±0.06d 16.69±0.33b 27.84±0.35a 5.15±0.14c 6 正辛醇 111-87-5 0.30±0.01c 2.10±0.03a 0.40±0.02b 0.40±0.01b 7 糠醇 98-00-0 15.86±0.16a 7.16±0.02c 12.98±0.49b 1.99±0.02d 8 苯甲醇 100-51-6 − − 0.06±0.01b 1.08±0.41a 9 苯乙醇 60-12-8 − 0.35±0.00b − 0.83±0.09a 10 柏木油醇 77-53-2 − − − 0.27±0.11a 11 丙二醇PG 57-55-6 − − 0.87±0.06a − 12 5-甲基-2-呋喃甲醇 3857-25-8 − 0.14±0.08b 0.26±0.01a − 醛类化合物 1 庚醛 111-71-7 0.37±0.02c 4.85±0.11a − 1.39±0.12b 2 壬醛 124-19-6 2.76±0.02c 8.04±0.12a 0.78±0.15d 3.12±0.29b 3 己醛 66-25-1 0.10±0.01b 3.23±0.20a − − 4 辛醛 124-13-0 0.62±0.01b − 0.86±0.00a − 5 癸醛 112-31-2 − 0.26±0.00a − − 6 糠醛 98-01-1 0.35±0.00b 0.39±0.01b 0.77±0.07a 0.28±0.09b 7 苯甲醛 100-52-7 0.11±0.01d 1.62±0.04a 0.32±0.02c 0.65±0.15b 8 十一烯醛 1337-83-3 0.46±0.01b 3.17±0.07a 0.05±0.02d 0.14±0.01c 9 月桂醛 112-54-9 − 0.32±0.02a − − 10 肉豆蔻醛 124-25-4 − 1.02±0.09a − − 11 2-十二烯醛 4826-62-4 0.21±0.01b 2.46±0.05a 0.06±0.01d 0.14±0.00c 12 5-甲基糠醛 620-02-0 − − 0.07±0.03a − 13 5-羟甲基糠醛 67-47-0 − 0.10±0.01a − − 14 N-甲基-2-吡咯甲醛 1192-58-1 − − 0.11±0.02a − 15 反,反-2,4-癸二烯醛 25152-84-5 − 1.08±0.03a − − 酸类化合物 1 乙酸 64-19-7 21.29±0.39d 112.08±0.53b 129.97±0.09a 24.80±1.27c 2 甲酸 64-18-6 1.33±0.05b 0.82±0.02c 6.70±0.05a 0.82±0.01c 3 丙酸 79-09-4 0.21±0.01d 4.09±0.04a 3.50±0.03b 0.61±0.04c 4 丁酸 107-92-6 0.59±0.03c 1.17±0.03c 3.61±0.09b 14.66±0.64a 5 异丁酸 79-31-2 0.14±0.01c 0.60±0.01b 0.50±0.00b 0.81±0.12a 6 戊酸 109-52-4 − − − 0.13±0.03a 7 异戊酸 503-74-2 − 0.57±0.01a 0.49±0.01a 0.53±0.12a 8 己酸 142-62-1 0.81±0.02c 2.30±0.56b 2.38±0.02b 29.89±0.38a 9 庚酸 111-14-8 − 0.33±0.00b 0.06±0.01c 0.68±0.03a 10 辛酸 124-07-2 1.34±0.02c 2.54±0.01b 3.38±0.02b 65.47±1.22a 11 壬酸 112-05-0 0.47±0.03c 1.50±0.11b 0.62±0.15b 2.12±0.22a 12 乳酸 79-33-4 − 27.62±0.25b 30.02±0.22a 10.69±0.41c 13 癸酸 334-48-5 4.21±0.02d 5.98±0.08c 9.51±0.04b 138.91±1.45a 14 9-癸烯酸 14436-32-9 0.21±0.01c 0.44±0.03b 0.41±0.02bc 4.25±0.22a 15 十一酸 112-37-8 − − 0.13±0.00b 0.72±0.03a 16 苯甲酸 65-85-0 1.20±0.01d 4.81±0.01c 7.85±0.04b 14.59±0.51a 17 月桂酸 143-07-7 1.04±0.04c 2.56±0.02b 3.47±0.10b 35.78±1.04a 18 十三酸 638-53-9 − − 0.32±0.00b 0.43±0.00a 19 十五酸 1002-84-2 − − 1.86±0.01a 0.52±0.06b 20 棕榈酸 57-10-3 0.60±0.02d 1.14±0.02c 5.00±0.00a 3.12±0.11b 21 苯乙酸 103-82-2 − − 0.31±0.04a − 22 肉豆蔻酸 544-63-8 1.26±0.10d 2.98±0.11c 6.38±0.02b 12.68±0.28a 23 肉豆蔻油酸 544-64-9 − − 0.29±0.02a − 24 油酸 112-80-1 − − 1.11±0.14a − 酮类化合物 1 壬酮 821-55-6 − − 0.24±0.02a 0.11±0.00b 2 呋喃酮 3658-77-3 0.22±0.02c 0.29±0.02b 0.48±0.03a 0.31±0.01b 3 羟基丙酮 116-09-6 0.75±0.04b − 1.75±0.14a 0.94±0.20b 4 甲基辛基酮 693-54-9 0.11±0.01a − − − 5 2-（5H）-呋喃酮 497-23-4 0.20±0.01c 0.74±0.03a 0.77±0.02a 0.42±0.02b 6 3-羟基丁酮-2 513-86-0 1.45±0.11c 14.95±0.60a 1.89±0.21c 5.45±0.34b 7 反,反-3,5-辛二烯酮 30086-02-3 − − − 0.19±0.02a 酯类化合物 1 乙酸仲丁酯 105-46-4 − − − 0.70±0.06a 2 辛酸乙酯 106-32-1 − − − 0.17±0.01a 3 丁二醇二乙酸酯 1114-92-7 − − − 0.13±0.01a 4 γ-丁内酯 96-48-0 0.11±0.00d 0.54±0.02a 0.39±0.02b 0.18±0.01c 5 癸酸乙酯 110-38-3 − − − 0.49±0.01a 6 乙酸苯乙酯 103-45-7 − − − 0.99±0.02a 7 2-糠酸甲酯 611-13-2 0.32±0.02b − 1.07±0.07a 0.17±0.01c 8 马来酸二丁酯 105-76-0 − − − 0.10±0.00a 9 丁位癸内酯 705-86-2 − 0.26±0.02a 0.07±0.00c 0.18±0.01b 10 二氢茉莉酮酸甲酯 24851-98-7 − − − 0.27±0.03a 11 丁位十二内酯 713-95-1 0.14±0.01c 0.60±0.02b 0.52±0.02b 1.10±0.09a 12 月桂酸乙酯 106-33-2 − 0.35±0.03a − − 13 丙位十一内酯 104-67-6 0.06±0.01a − − − 14 （+/-）-β-羟基-γ-丁内酯 5469-16-9 0.91±0.01b 2.09±0.08a 0.69±0.01c − 15 对甲氧基桂酸-2-乙基己酯 5466-77-3 − − − 0.39±0.10a 芳香族和杂环类化合物 1 萘 91-20-3 − 0.18±0.02b 0.08±0.03c 0.34±0.06a 2 1-甲基萘 90-12-0 − − 0.10±0.03b 0.40±0.09a 3 2-甲基萘 91-57-6 − − − 0.21±0.01a 4 麦芽酚 118-71-8 2.60±0.02c 10.95±0.83a 10.07±0.18b 2.50±0.11c 5 苯酚 108-95-2 − − − 0.16±0.01a 6 对甲酚 106-44-5 − − − 0.38±0.02a 7 BHT/2,6-二叔丁基对甲酚 128-37-0 − − 0.89±0.01a − 8 2-戊基呋喃 3777-69-3 − 2.06±0.00a 0.49±0.11b − 9 2-乙酰基呋喃 1192-62-7 − 1.51±0.01a − − 10 2-甲酰吡咯 1003-29-8 − 1.45±0.05a 0.08±0.04b − 11 2,3,5,6-四甲基吡嗪 1124-11-4 − − − 0.39±0.02a 12 罗汉柏烯 470-40-6 − − − 0.41±0.06a 13 二甲基砜 67-71-0 − − 0.32±0.04b 0.60±0.03a 14 甘油 56-81-5 − − 0.23±0.01b 0.49±0.07a 15 乙酰胺 60-35-5 − − 0.08±0.03a − 注：“−”表示未检出；同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 
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表 2 不同地区牦牛乳拉拉特征香气成分OAV及其阈值
Table 2 Characteristic aroma components of yak milk lala OAV and their thresholds in different regions
序号 化合物名称 香气阈值（mg/kg） 气味活度值（OAV） BGLL DXLL DLLL BYLL 1 异戊酸 0.49 1.08 1.00 1.16 − 2 异戊醇 0.004 468.55 − − − 3 异丁酸 0.3 2.71 1.66 1.99 <1 4 乙酸仲丁酯 0.006 115.96 − − − 5 乙酸 22 1.13 5.91 5.09 <1 6 辛酸乙酯 0.0193 8.81 − − − 7 辛酸 3 21.82 1.13 <1 <1 8 辛醛 0.0008 − 1080.28 − 770.75 9 十二醛 0.01 − − 32.40 − 10 肉豆蔻酸 10 1.27 <1 <1 <1 11 肉豆蔻醛 0.11 − − 9.23 − 12 壬酮 0.2 <1 1.20 − − 13 壬醛 0.0011 2839.11 707.54 7311.68 2508.09 14 麦芽酚 1.24 2.02 8.12 8.83 2.10 15 糠醇 4.5005 <1 2.88 1.59 3.52 16 己酸 3 9.96 <1 <1 <1 17 己醛 0.0615 − − 52.54 1.58 18 癸酸 10 13.89 <1 <1 <1 19 癸醛 0.003 − − 86.83 − 20 庚醛 0.003 461.71 − 1616.87 121.83 21 对甲酚 0.0039 96.81 − − − 22 丁二醇 70 <1 1.00 <1 <1 23 苯乙醇 0.56423 1.47 − <1 − 24 苯甲醛 0.75 <1 <1 2.16 <1 25 N-甲基-2-吡咯甲醛 0.037 − 2.92 − − 26 3-羟基丁酮-2 0.04 136.20 47.14 373.76 36.29 27 2-正戊基呋喃 0.0058 − − 355.75 − 28 2-十二烯醛 0.0014 102.03 45.07 1759.93 147.64 29 2R,3R-丁二醇 20 <1 1.39 <1 <1 注：“−”表示未检测出。
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