Mechanism of Litchi Semen Extract in Preventing Exercise-induced Muscle Damage based on Network Pharmacology and In Vitro and In Vivo Experiments
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摘要: 目的：基于网络药理学联合GEO数据库挖掘及体内、外实验探讨荔枝核提取物（Litchi Semen Extract，LZH）预防运动诱发的肌肉损伤（Exercise-Induced Muscle Damage, EIMD）的潜在作用机制。方法：苏木素/伊红（Hematoxylin-Eosin Staining, HE）染色和血清中骨骼肌损伤指标物含量检测荔枝核提取物预防EIMD的效果。中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology, TCMSP）及文献搜寻荔枝核提取物的主要活性成分，找到有效成分对应的靶点，与从GEO数据库中得到的EIMD靶点取交集。交集后的靶点通过STRING数据库进行筛选，最后进行富集分析。采用离心运动诱导的EIMD小鼠模型和过氧化氢诱导的C2C12细胞模型对预测结果进行体内外实验验证。结果：体内实验表明荔枝核提取物干预后骨骼肌肌纤维横截面积（P<0.05）、肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）（P<0.001）和乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）（P<0.01）显著降低。网络药理学结果表明荔枝核提取物主要有14种活性成分，对应367个靶点；GEO数据库得到有关EIMD的1015个靶点；两者交集得到37个交集靶点；富集分析得出p53介导的细胞周期阻滞为主要验证对象。体内实验表明荔枝核提取物干预后p53（P<0.01）、p21（P<0.001）、BCL2-Associated X蛋白质（BCL2-Associated X, Bax）（P<0.05）表达显著降低，Cyclin D1（P<0.05）、B淋巴细胞瘤-2基因（B-Cell Lymphoma-2, Bcl-2）（P<0.05）表达显著增加；体外实验表明荔枝核提取物低、高剂量预处理显著降低C2C12细胞凋亡（P<0.001）、p53（P<0.05）、p21（P<0.01，0.001）的表达，提高Cyclin D1（P<0.05，0.001）的蛋白表达。结论：荔枝核提取物可以减轻EIMD，其作用机制与激活骨骼肌细胞G1期停滞和减轻细胞凋亡密切相关。该结果提示荔枝核提取物可以作为一种预防EIMD的营养补剂。Abstract: Objective: Based on network pharmacology combined with the GEO database and in vivo and in vitro experiments to explore the potential mechanisms of Litchi Semen Extract (LZH) for preventing Exercise-Induced Muscle Damage (EIMD). Methods: Hematoxylin-Eosin (HE) staining and comparison of the levels of indicators of skeletal muscle damage in serum were performed to detect the effectiveness of LZH in preventing EIMD. The main active ingredients of LZH were searched through the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) database in conjunction with the published literature, and the targets corresponding to the active ingredients were found through the relevant websites, which were intersected with the EIMD-related targets obtained from the GEO database. The STRING database screened the intersected targets and finally enriched them for analysis. The results of the network pharmacology predictions were validated in vivo using the centrifugal exercise-induced EIMD mouse model and in vitro using the H2O2-induced C2C12 cell model. Results: In vivo experiments showed that skeletal muscle fiber cross-sectional area (P<0.05), Creatine Kinase (CK) (P<0.001) and Lactate Dehydrogenase (LDH) (P<0.01) were significantly reduced after the intervention of LZH. The results of network pharmacology showed that LZH had 14 active ingredients, corresponding to 367 targets. The GEO database obtained 1015 targets related to EIMD. The intersection of the two yielded 37 intersecting targets. The enrichment analysis demonstrated p53-mediated cell cycle arrest as the primary target for validation. In vivo experiments showed that LZH significantly reduced the expression of p53 (P<0.01), p21 (P<0.001), BCL2-Associated X (Bax) (P<0.05), and the expression of Cyclin D1 (P<0.05), B-Cell Lymphoma-2 (Bcl-2) (P<0.05) expression was significantly increased. In vitro experiments showed that low and high dose pretreatment of LZH significantly decreased the expression of apoptosis (P<0.001), p53 (P<0.05), p21 (P<0.01, 0.001) and increased the expression of Cyclin D1 (P<0.05, 0.001). Conclusion: LZH attenuates EIMD, and its mechanism is closely related to the activation of G1 phase arrest and attenuation of apoptosis in skeletal muscle cells. The results suggest that LZH can be used as a nutritional supplement to prevent EIMD.
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近年来，体育运动作为一种预防和干预慢性疾病的重要手段，已获得广泛的认可。但是不适当的运动容易对机体造成损伤，其中运动诱发的肌肉损伤（Exercise-Induced Muscle Damage, EIMD）是由于长时间运动，特别是运动过程中涉及大量离心运动（如阻力训练、间歇性高强度运动等），产生过多的活性氧和活性氮，导致肌肉氧化应激和收缩能力受损而引起的[1−3]。主要表现为肌肉力量下降、酸痛和肿胀加剧、肌肉微结构紊乱、肌肉蛋白质降解和炎症[4−7]。EIMD的内在机制十分复杂[2]，现有研究表明，损伤过程主要包括两个阶段：第一阶段是运动对肌肉造成的直接损伤，如肌纤维断裂，而第二阶段是与氧化应激和其他因素有关的继发性损伤，如钙离子导致的细胞结构蛋白降解[8]。因此，预防和减轻EIMD的症状并有效促进肌肉功能的恢复至关重要。
对于EIMD，许多营养素和功能性食品的治疗潜力已得到肯定[2,9]，例如，支链氨基酸[10−11]、姜黄素[12]、绿茶提取物[13]和咖啡因[6]已被证明可有效缓解EIMD的症状。荔枝作为一种常见的亚热带水果，其种子具有强大的药用价值，是众所周知的重要中药材。研究表明，荔枝核提取物（Litchi Semen Extract，LZH）中富含多酚和黄酮类化合物[14]，具有抗氧化、抗炎等多种生物活性[15]，但荔枝核提取物的生物活性是否能预防EIMD尚未见报道。
网络药理学是一个前景广阔的领域，是通过构建药物-靶点-疾病相互作用网络来发现活性物质和揭示药理机制的先进方法，而多组分、多靶点、多途径协同调控是中药对疾病发挥治疗作用的主要特征[16]。因此，网络药理学是探索中药作用机制的重要工具之一，能够深入分析中药的有效成分，为中药的相关靶点和潜在的抗病机制提供有力的证据[17]。本研究将荔枝核提取物用于预防EIMD，通过体内、体外实验验证，辅以网络药理学，探讨荔枝核提取物预防EIMD的作用靶点和作用途径，为后续相关基础和临床研究提供思路和参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
荔枝核提取物 购自陕西慧科植物开发有限公司，经质检后表明该提取物满足《Q/SXHK 9999S-2022》标准；小鼠成肌细胞C2C12 购自中国科学院细胞库；蛋白酶抑制剂、CCK-8试剂盒 购自Apexbio公司；RIPA裂解缓冲液、脱脂奶粉 购自Solarbio公司；BCA蛋白检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 购自Beyotime公司；PVDF膜、二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO） 购自Sigma公司；p21（RAC1）激活激酶1（Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1, p21）抗体、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗体、细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）抗体、p53抗体、BCL2-Associated X蛋白质（BCL2-Associated X, Bax）抗体、B淋巴细胞瘤-2基因（B-Cell Lymphoma-2, Bcl-2）抗体 购自Affinity Biosciences公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH）抗体 购自Abmart公司；辣根过氧化物酶-HRP标记的二抗 购自Proteintech公司；IumiQ Universal ECL发光试剂盒 购自ShareBio公司；肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）测定试剂盒、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）试剂盒 购自南京建成公司；4%多聚甲醛 购自Biosharp公司；苏木素/伊红（Hematoxylin-Eosin Staining, HE）染液 购自Servicebio公司；DMEM培养基、胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）、青霉素-链霉素 购自Gibco公司。
DP28奥林巴斯显微数码相机 日本东京奥林巴斯光学技术公司；SA101动物跑步机 江苏赛昂斯生物科技有限公司；ATP700（ST）自动组织脱水处理机 常州市郝思林医用仪器有限公司；YD-6D生物组织包埋机、YD-A生物组织摊片机、YD-6L生物组织冷冻台、YD-B生物组织烤片机 金华市益迪医疗设备有限公司；149MULTI0C1石蜡切片机 上海徕卡显微系统有限公司；LDO-101-3电热恒温干燥箱 上海龙跃仪器设备有限公司；SWE-FP组织研磨仪 武汉Servicebio生物科技有限公司；FLUOstar Omega荧光酶标仪 德国BMG LABTECH公司；BIO-RAD电泳转印装置、BIO-RAD Molecular Imager ChemiDocTM XRS+显影仪 美国BIO-RAD公司；AttuneTM NxT流式细胞仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物的选择
实验动物为C57BL/6J小鼠（SPF级，雄性，8周龄，体重18~22 g），由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号为SCXK（辽）2020-0001。所有小鼠均被饲养在标准动物笼中，并在适宜的环境中（20~25 ℃、12 h昼夜交替光照、50%~70%最佳湿度）自由进食、饮水和活动。本研究严格遵守动物实验的3R原则，并经沈阳体育学院动物伦理委员会批准。小鼠在笼中饲养3天，适应跑步机和实验室环境后开始实验。
1.2.2 动物分组及干预方案
对20只小鼠进行标记、称重并随机分为4组，每组5只，包括氯化钠空白对照组、氯化钠离心运动组、荔枝核提取物低剂量离心运动组和荔枝核提取物高剂量离心运动组。氯化钠空白对照组和氯化钠离心运动组小鼠口服0.9%氯化钠溶液，荔枝核提取物低剂量离心运动组和荔枝核提取物高剂量离心运动组小鼠口服溶于0.9%氯化钠的40 mg/kg和80 mg/kg的荔枝核提取物。各组小鼠均以0.1 mL/10 g的剂量每天灌胃一次，连续灌胃4周[18−19]。最后一次灌胃给药24 h后，氯化钠离心运动组、荔枝核提取物低剂量离心运动组和荔枝核提取物高剂量离心运动组小鼠在跑步机上进行离心运动（速度16 m/min，坡度为-16°，持续90 min）[20]。离心运动结束24 h后，采取颈椎脱位的方式处死小鼠，并采集右后肢腓肠肌复合体保存在-80 ℃的冰箱中，左后肢腓肠肌复合体保存在4%多聚甲醛中。动物实验干预方案如图1所示。
1.2.3 HE染色
将腓肠肌复合体在4%多聚甲醛中固定48 h，脱水、透明并石蜡包埋。切取5 μm薄切片，用HE染色液染色。使用光学显微镜拍摄图像（200×），并使用Image-Pro Plus 6.0版软件进行分析测量肌肉纤维的横截面积（Cross-Sectional Area, CSA）[21]。每组随机选择3个样本，每个样本至少测量100根肌纤维，并对图像结果进行量化，评估人员对图像分析进行盲测。
1.2.4 血清指标检测
离心运动干预24 h后进行小鼠取材，取每组5只小鼠的眼眶血后进行3000×g离心15 min获得血清，按照试剂盒的要求检测血清中骨骼肌损伤标志物CK、LDH的含量。检测时，每个样本重复三次实验后取平均值作为该样本的最终结果。
1.2.5 蛋白印迹（Western Blot, WB）检测
采集骨骼肌组织样本，使用裂解液充分裂解组织后，在4 ℃下以14000 r/min离心15 min收集上清液。根据试剂说明，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测和量化蛋白质浓度。等量蛋白质（30 μg）经10% SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h，并用TBS缓冲液和0.1% Tween® 20配置的TBST洗涤液进行洗涤。将膜与相对应的抗体在4 ℃下孵育过夜。第二天，用TBST洗三次，每次10 min，然后用辣根过氧化物酶-HRP标记的二抗在室温下孵育1 h。使用发光试剂盒进行发光。最后，以GAPDH为对照，用Image J软件分析印迹的强度。
1.2.6 荔枝核提取物活性成分和靶基因的检索
从中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology, TCMSP） （https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[22]中收集荔枝核提取物的有效成分和靶标信息，并从已发表的文章中补充荔枝核提取物的成分[23−27]，按照口服生物利用度（Oral Bioavailability, OB）≥30%和类药性（Drug Likeness, DL）≥0.18的标准进行筛选，得到荔枝核提取物的有效活性成分。活性成分的结构通过PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[28]获得，并通过Swiss Target Prediction （http://www.swisstarget prediction.ch/）[29]、PharmMapper （https://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）[30]和ChEMBL （https://www.ebi.ac.uk/chembl/）[31]数据库对荔枝核提取物有效成分的靶点进行预测。
1.2.7 基于GEO数据库筛选EIMD靶基因
从GEO数据库[32]中选取GSE5413小鼠基因数据集（GPL81平台，Affymetrix Murine Genome U74A Version 2 Array）挖掘EIMD相关靶点，利用GEO2R在线分析工具筛选基因组中差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），采用Benjamini & Hochberg检验调整P值，以limma精度权重、P<0.05、|Log FC|>1为筛选标准。GSE5413涉及骨骼肌损伤后4个时间点（6、24、72 h、7 d）的25个样本，包括3个对照组、11个离心收缩诱导骨骼肌损伤组和11个冷冻诱导骨骼肌损伤组[33]。考虑到骨骼肌损伤后24 h的组织学数据和动物实验芯片中基因的数量，本项研究选择骨骼肌损伤后6、24和72 h的DEGs作为EIMD目标结果。
1.2.8 构建荔枝核提取物活性成分与EIMD的PPI网络
将荔枝核提取物和EIMD靶点导入Uniport数据库[34]进行归一化处理，并绘制维恩图（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）以获得荔枝核提取物预防EIMD的潜在靶点。将荔枝核提取物和EIMD交集靶标导入STRING （https://string-db.org/）数据库[35]，获得蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，并通过Cytoscape 3.8.0软件建立相关网络图。
1.2.9 GO和KEGG通路富集分析
利用DAVID （https://david.ncifcrf.gov/）数据库[36]分析荔枝核提取物预防EIMD核心基因所涉及的基因组百科全书通路功能（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）和基因本体功能（Gene Ontology, GO）。生物信息学平台（http://www.bioinformatics.com.cn）对富集分析结果进行了可视化处理。此外，还使用了R软件包"pathview"来绘制详细的通路信息[37]。
1.2.10 细胞培养及分组
C2C12细胞用含10% FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。设置对照组、模型组和荔枝核提取物低剂量组、荔枝核提取物高剂量组，各给药组在模型组的基础上，分别给予120，240 μg/mL 荔枝核提取物处理。
1.2.11 细胞活力检测
将细胞作为悬浮液（100 μL/孔）接种在96孔板中。在细胞培养箱中24 h后，使细胞粘附在孔底，除去旧培养基，并按照实验设计处理细胞。在指定的孵育期后，向每个孔中加入10 μL CCK-8试剂。孵育3 h后，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度（Absorbance, A）以计算细胞活力。
1.2.12 凋亡流式细胞术
将C2C12细胞接种在密度为2×105的6孔板中。当细胞密度达到70%~80%时，将细胞分为对照组、模型组和荔枝核提取物低剂量组、荔枝核提取物高剂量组。对照组正常培养，无任何处理，模型组给与900 μmol/L的过氧化氢处理2 h。荔枝核提取物低剂量组和荔枝核提取物高剂量组分别接受120 μg/mL和240 μg/mL的荔枝核提取物预处理后在进行过氧化氢造模。处理结束后，按照试剂说明书要求进行实验检测各组细胞凋亡表达水平。
1.2.13 WB检测
收集细胞样本，按照“1.2.5”步骤进行操作。
1.3 数据处理
使用SPSS 26.0软件分析实验数据，数据以Mean±SD表示。进行正态分布和方差齐性检验，多组之间的数据差异采用单因素方差分析进行分析。此外，还使用Graphpad prism 9.4.0软件对统计数据进行可视化处理，P<0.05认为有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 荔枝核提取物减轻小鼠EIMD
2.1.1 HE染色
为了验证荔枝核提取物是否可以改善小鼠EIMD，本项研究对此进行了HE染色（图2A）。HE染色结果证明氯化钠空白对照组的骨骼肌纤维为正常的不规则多边形形状，且排列整齐，大小均匀，肌筋膜和肌内膜结构完整。氯化钠离心运动组的肌纤维排列紊乱，形状变为椭圆形，肌筋膜和肌内膜结构被破坏，并伴有血管破裂。而在荔枝核提取物低剂量离心运动组中，肌纤维形状多为正常的不规则多边形形状，且排列相对整齐，肌筋膜和肌内膜结构相对清晰。而在荔枝核提取物高剂量离心运动组中，骨骼肌细胞的形状部分发生了变化，部分肌纤维由不规则的多边形变成了椭圆形，且部分肌纤维存在破裂现象。CSA是用于评估肌纤维横截面积的变化，是量化HE染色结果的一种方法。如图2B，CSA结果表明，与氯化钠空白对照组相比，氯化钠离心运动组中骨骼肌平均横截面积增加（P<0.05），而经过荔枝核提取物低剂量干预后，骨骼肌平均横截面积降低（P<0.05）。而与氯化钠离心运动组相比，荔枝核提取物高剂量干预后骨骼肌平均横截面积也降低（P<0.05）。但是经过HE染色结果对比后发现，荔枝核提取物低剂量对于离心运动导致的骨骼肌损伤的恢复效果要优于荔枝核提取物高剂量。因此，后续的实验中，本研究选择用荔枝核提取物低剂量进行干预实验。
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图 2 小鼠骨骼肌HE染色注：（A） 腓肠肌石蜡切片的HE染色。（B） 腓肠肌CSA柱状图；与氯化钠空白对照组相比，*P<0.05；与氯化钠离心运动组相比，#P<0.05，n=3。Figure 2. HE staining of mouse skeletal muscle2.1.2 骨骼肌损伤指标检测
血清中CK和LDH的水平反映了小鼠骨骼肌损伤的程度。该项结果表明与氯化钠空白对照组相比，氯化钠离心运动组小鼠血清中CK（P<0.001）显著升高（图3A），且LDH（P<0.05）的表达水平也增加（图3B）。而与氯化钠离心运动组相比，荔枝核提取物低剂量离心运动组小鼠血清中CK（P<0.001）的表达显著降低（图3A），而LDH（P<0.01）的表达也降低（图3B）。通过比对各组小鼠血清中骨骼肌损伤标志物的表达变化表明了低剂量荔枝核提取物可以有效的减轻小鼠EIMD。
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图 3 小鼠血清中骨骼肌损伤标志物表达情况注：（A） 血清中CK的水平，（B） 血清中LDH的水平；与氯化钠空白对照组相比，*P< 0.05，***P< 0.001；与氯化钠离心运动组相比，##P< 0.01，###P< 0.001，n=5。Figure 3. Expression of skeletal muscle injury markers in mouse serum2.2 网络药理学分析
2.2.1 荔枝核提取物有效成分及靶基因的筛选
从TCMSP数据库中共检索到72种荔枝核提取物成分，并从公开发表的文章中补充了31种成分。在OB≥30%、DL≥0.18的条件下，经筛选共获得14种荔枝核提取物活性成分。其中8种有效成分来自TCMSP数据库，6种有效成分来自已发表的论文。表1列出了14种荔枝核提取物活性成分的详细信息。其中有研究报道槲皮素能够显著提高肌肉的抗氧化和抗疲劳能力[38]，显著预防离心运动引起的肌肉损伤[5]。山奈酚能够减少肌肉氧化损伤，增强运动功能表现[39]。总之，荔枝核提取物主要通过14种活性成分对EIMD产生保护作用。根据药物靶标数据库对这14种活性成分进行筛选，在去除重复成分后，共获得367个靶基因。
表 1 荔枝核提取物活性成分Table 1. Active ingredients of LZHID Mol ID 活性成分名称 口服生物
利用度（%）类药性 来源 LZH-1 MOL010690 Uniflex BYO 30.13 0.25 TCMSP LZH-2 MOL001494 Mandenol 42.00 0.19 TCMSP LZH-3 MOL002883 Ethyl oleate （NF） 32.40 0.19 TCMSP LZH-4 MOL000358 Beta-sitosterol 36.91 0.75 TCMSP LZH-5 MOL000359 Sitosterol 36.91 0.75 TCMSP LZH-6 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76 TCMSP LZH-7 MOL000073 ent-Epicatechin 48.96 0.24 TCMSP LZH-8 MOL000098 Quercetin 46.43 0.28 TCMSP LZH-9 MOL000492 Catechin 54.83 0.24 Ref. [23−25] LZH-10 MOL011061 Ginkgolide B 46.14 0.73 Ref. [23] LZH-11 MOL000422 Kaempferol 41.88 0.24 Ref. [26] LZH-12 MOL000006 Luteolin 36.16 0.25 Ref. [23] LZH-13 MOL000737 Morin 46.23 0.27 Ref. [23] LZH-14 MOL004328 Naringenin 59.29 0.28 Ref. [27] 2.2.2 EIMD靶基因筛选与PPI网络构建
从GEO数据库中选取基因组数据集进行分析共得到1015个疾病靶点（图4A-C）。将367个荔枝核提取物靶点与1015个EIMD靶点取交集后，得到42个共性靶点，将其作为荔枝核提取物抗EIMD的潜在靶点。将上述42个靶点导入STRING数据库，得到初始PPI网络，剔除相对独立的靶点后，最终得到一个有37个点和170条边的PPI网络，如图4D。此外，药物-化合物-疾病-靶点网络的建立表明，荔枝核提取物中的14种活性成分均可作用于37个潜在治疗靶点（图4E）。
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图 4 EIMD目标基因筛选和PPI网络构建注：（A-C） 分别代表6 h、24 h和72 h EIMD中差异表达基因的火山图;（D） 交集靶点Venn图和PPI网络筛选图;（E） 药物-化合物-疾病-靶点网络; 点的大小代表度值的大小，度值越高代表相互连接越多。Figure 4. EIMD target gene screening and PPI network construction2.2.3 GO和KEGG富集分析
GO分析结果显示，共有141个条目（P<0.05）与生物过程（Biological Process, BP）、细胞组分（Cellular Component, CC）和分子功能（Molecular Function, MF）相关，并分别选取了前10个条目进行可视化分析（图5B）。结果显示，与核心靶标相关的前5个BP包括对药物的反应、细胞增殖、基因表达负调控、细胞周期和蛋白磷酸化。而前5个CC包括细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外空间和细胞外区域。而前5个MF包括蛋白结合、酶结合、大分子复合物结合、蛋白同源二聚体活性和肽酶活性。通过KEGG富集得到53条通路（P< 0.05），选取前20条通路绘制气泡图（图5A），其中前5条通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、细胞周期、细胞衰老、p53信号通路、脂质与动脉粥样硬化。如图5C所示，绘制了药物-化合物-靶点-通路关系图。
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图 5 GO和KEGG富集分析注：（A） 前20个KEGG通路的气泡图；（B） 前10个GO可视化分析；黄色模块代表生物过程，蓝色模块代表细胞成分，绿色模块代表分子功能；（C） 药物-化合物-靶点-通路图。黄色表示荔枝核提取物，红色代表荔枝核提取物的14种主要化合物，绿色代表37个核心交集基因（重点基因用深蓝色标注），粉色表示20个KEGG pathway （p53信号通路用深蓝色标注）；（D） p53介导的细胞周期信号通路图。Figure 5. GO and KEGG enrichment analysis而经分析可知细胞周期、细胞衰老和p53信号通路在P值和富集的目标基因数量上占优势，并且现有研究报道称p53与细胞周期停滞密切相关联[40]。p53/p21信号通路是典型的衰老通路，激活的p53诱导p21的高表达导致细胞周期蛋白Cyclin D1被抑制进而使得细胞周期G1期停滞，同时p53也可以抑制Cyclin B1蛋白进而导致细胞周期G2期被阻滞，这都促进了细胞衰老[41]。如图5D所示，绘制了p53/p21介导的细胞周期信号通路图，并且将其中的某些因子作为本项研究中主要验证的靶标。
2.3 荔枝核提取物抑制p53信号通路来减轻细胞周期阻滞和凋亡改善EIMD
骨骼肌组织周期相关WB结果如图6A、6C所示，与氯化钠空白对照组相比，氯化钠离心运动组中表现为p53（P<0.01）表达显著增加，p21（P<0.001）的表达也显著增加，而经过荔枝核提取物低剂量干预后p53（P<0.01）表达显著降低，且p21（P<0.001）表达也显著降低。而与氯化钠空白对照组相比，Cyclin D1表达在氯化钠离心运动组中降低（P<0.05），且经过荔枝核提取物低剂量干预后增加（P<0.05），而Cyclin B1在各个组中无差异。因此，结合结果得出荔枝核提取物可以调节p53/p21/Cyclin D1信号通路，从而激活EIMD诱导的骨骼肌细胞周期G1期停滞，来恢复骨骼肌细胞的正常周期变化，进而来改善骨骼肌损伤。同时，现有的研究表明p53与细胞凋亡也密切相关，因此本研究检测了各组骨骼肌组织中凋亡相关蛋白的表达情况（图6B-C）。结果表明，与氯化钠空白对照组相比，氯化钠离心运动组中Bax表达增加（P<0.05），而Bcl-2表达显著降低（P<0.001）。而经过荔枝核提取物低剂量干预后Bax蛋白表达降低（P<0.05），而Bcl-2蛋白表达增加（P<0.05）。
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图 6 荔枝核提取物调节p53及其下游介导的细胞周期阻滞和细胞凋亡改善EIMD注：（A） p53及其下游细胞周期相关蛋白代表性图像；（B） 细胞凋亡相关蛋白代表图像；（C） 各个蛋白质相对表达柱状图；与氯化钠空白对照组相比，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；与氯化钠离心运动组相比，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001；ns表示各组之间没有统计学差异，n=3。Figure 6. LZH regulates p53 and its downstream mediated cell cycle arrest and apoptosis to improve EIMD2.4 荔枝核提取物对过氧化氢诱导的C2C12细胞活力的影响
为了进一步探索荔枝核提取物对离心运动诱导的骨骼肌损伤的影响，本研究进行了体外实验验证。如图7A，结果表示，不同剂量（0、10、20、40、60、80、120、160、200、240、280、320 μg/mL）的荔枝核提取物对C2C12细胞无毒性影响。在干预方式的选择上，本研究选择用过氧化氢干预C2C12细胞2 h来模拟离心运动诱导的骨骼肌损伤。如图7B，结果表明，随着过氧化氢浓度的增加，C2C12细胞活力发生明显变化，而IC50=875.1 μmol/L。因此，将900 μmol/L过氧化氢干预C2C12细胞2 h作为本项研究的造模条件。荔枝核提取物预处理浓度的摸索实验结果如图7C所示，60-320 μg/mL 荔枝核提取物预处理24 h都可以减轻过氧化氢造成的C2C12细胞活力的降低，而240 μg/mL 荔枝核提取物预处理24 h最为明显。因此，将240 μg/mL作为荔枝核提取物的干预高剂量，并按照其1/2作为荔枝核提取物干预低剂量。图7D表示各组C2C12细胞形态学。对照组细胞无明显形态学改变，而900 μmol/L过氧化氢干预2 h后，C2C12细胞形态发生明显的改变，而120 μg/mL和240 μg/mL 荔枝核提取物预处理显著逆转了过氧化氢造成的细胞形态学变化。
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图 7 荔枝核提取物对过氧化氢诱导的C2C12细胞活力影响注：（A） 不同剂量的荔枝核提取物对C2C12细胞的毒性影响；（B） 不同剂量的过氧化氢对C2C12细胞活力的影响；（C） 荔枝核提取物预处理剂量的选择；（D） 各个组C2C12细胞形态学变化；与对照组相比，***P< 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001；ns表示各组之间没有统计学差异，n=3。Figure 7. Effect of LZH on H2O2-induced C2C12 cell viability2.5 荔枝核提取物对过氧化氢诱导的C2C12细胞p53信号通路的影响
体外实验WB结果如图8A-C所示，与对照组相比，p53（P<0.01）及其下游p21（P<0.001）在模型组中升高，而经过荔枝核提取物低剂量预处理后，p53（P<0.05）和p21（P<0.01）表达降低，而荔枝核提取物高剂量预处理后p53（P<0.05）和p21（P<0.001）也得到了类似的结果。
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图 8 荔枝核提取物对过氧化氢诱导的C2C12细胞p53信号通路影响注：（A） p53信号通路相关蛋白表达情况；（B~C） 各个蛋白统计柱状图；与对照组相比，**P< 0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，n=3。Figure 8. Effect of LZH on H2O2-induced p53 signaling pathway in C2C12 cells2.6 荔枝核提取物对过氧化氢诱导的C2C12细胞凋亡和细胞周期的影响
各组凋亡流式结果如图9A所示，与对照组相比，模型组中早期凋亡和晚期凋亡细胞数目之和显著增加，且经过荔枝核提取物低剂量和高剂量干预后早晚期凋亡细胞数目降低。统计结果如图9C所示。各组细胞的周期蛋白检测。如图9B、9D、9E所示，与对照组相比，模型组中Cyclin D1蛋白表达降低（P<0.05），而经过荔枝核提取物低剂量（P<0.05）和高剂量（P<0.001）干预后显著增加。而Cyclin B1在各组中无统计学差异。
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图 9 荔枝核提取物对过氧化氢诱导的C2C12细胞凋亡和细胞周期的影响注：（A） 各组C2C12细胞凋亡流式细胞计数检测；（B）各组C2C12细胞周期蛋白表达情况；（C）凋亡流式细胞统计柱状图；（D~E）各组C2C12细胞周期蛋白统计柱状图；与对照组相比，*P< 0.05，***P< 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，###P< 0.001，ns表示各组之间无统计学差异，n=3。Figure 9. Effect of LZH on H2O2-induced apoptosis and cell cycle of C2C12 cells3. 结论
本研究首先通过动物实验证明了荔枝核提取物可以改善EIMD，然后通过网络药理学的方法探究了荔枝核提取物的14种活性成分，并得到了367个靶点。并通过GEO数据库得到了与EIMD相关的1015个靶点。经筛选后共得到37个交集基因，即荔枝核提取物改善EIMD的核心基因。富集分析后得出多条信号通路，其中p53介导的细胞周期停滞是最为主要的信号通路。动物实验对此进行了验证。结果表明荔枝核提取物可以通过改善骨骼肌细胞G1期细胞周期阻滞和细胞凋亡从而缓解EIMD。体外使用C2C12细胞进一步验证了以上结果。鉴于现有的证据还未见有关荔枝核提取物改善EIMD的报道，因此本研究的提出为EIMD的治疗和干预提供了新的理论和思路，同时也为药食同源物荔枝核提取物的应用研究拓宽了方向。然而，本项研究仍然存在一定的局限性。本研究只验证了荔枝核提取物预防EIMD的核心靶点和通路，而通过富集分析得到的其他通路需要在未来的实验中进行进一步的验证。其次，本研究仅限于动物模型，而为了使的实验更具有临床贴合性，人源性骨骼肌细胞的应用是非常有必要的。
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图 2 小鼠骨骼肌HE染色
注：（A） 腓肠肌石蜡切片的HE染色。（B） 腓肠肌CSA柱状图；与氯化钠空白对照组相比，*P<0.05；与氯化钠离心运动组相比，#P<0.05，n=3。
Figure 2. HE staining of mouse skeletal muscle
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图 3 小鼠血清中骨骼肌损伤标志物表达情况
注：（A） 血清中CK的水平，（B） 血清中LDH的水平；与氯化钠空白对照组相比，*P< 0.05，***P< 0.001；与氯化钠离心运动组相比，##P< 0.01，###P< 0.001，n=5。
Figure 3. Expression of skeletal muscle injury markers in mouse serum
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图 4 EIMD目标基因筛选和PPI网络构建
注：（A-C） 分别代表6 h、24 h和72 h EIMD中差异表达基因的火山图;（D） 交集靶点Venn图和PPI网络筛选图;（E） 药物-化合物-疾病-靶点网络; 点的大小代表度值的大小，度值越高代表相互连接越多。
Figure 4. EIMD target gene screening and PPI network construction
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图 5 GO和KEGG富集分析
注：（A） 前20个KEGG通路的气泡图；（B） 前10个GO可视化分析；黄色模块代表生物过程，蓝色模块代表细胞成分，绿色模块代表分子功能；（C） 药物-化合物-靶点-通路图。黄色表示荔枝核提取物，红色代表荔枝核提取物的14种主要化合物，绿色代表37个核心交集基因（重点基因用深蓝色标注），粉色表示20个KEGG pathway （p53信号通路用深蓝色标注）；（D） p53介导的细胞周期信号通路图。
Figure 5. GO and KEGG enrichment analysis
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图 6 荔枝核提取物调节p53及其下游介导的细胞周期阻滞和细胞凋亡改善EIMD
注：（A） p53及其下游细胞周期相关蛋白代表性图像；（B） 细胞凋亡相关蛋白代表图像；（C） 各个蛋白质相对表达柱状图；与氯化钠空白对照组相比，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；与氯化钠离心运动组相比，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001；ns表示各组之间没有统计学差异，n=3。
Figure 6. LZH regulates p53 and its downstream mediated cell cycle arrest and apoptosis to improve EIMD
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图 7 荔枝核提取物对过氧化氢诱导的C2C12细胞活力影响
注：（A） 不同剂量的荔枝核提取物对C2C12细胞的毒性影响；（B） 不同剂量的过氧化氢对C2C12细胞活力的影响；（C） 荔枝核提取物预处理剂量的选择；（D） 各个组C2C12细胞形态学变化；与对照组相比，***P< 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001；ns表示各组之间没有统计学差异，n=3。
Figure 7. Effect of LZH on H2O2-induced C2C12 cell viability
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图 8 荔枝核提取物对过氧化氢诱导的C2C12细胞p53信号通路影响
注：（A） p53信号通路相关蛋白表达情况；（B~C） 各个蛋白统计柱状图；与对照组相比，**P< 0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，n=3。
Figure 8. Effect of LZH on H2O2-induced p53 signaling pathway in C2C12 cells
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图 9 荔枝核提取物对过氧化氢诱导的C2C12细胞凋亡和细胞周期的影响
注：（A） 各组C2C12细胞凋亡流式细胞计数检测；（B）各组C2C12细胞周期蛋白表达情况；（C）凋亡流式细胞统计柱状图；（D~E）各组C2C12细胞周期蛋白统计柱状图；与对照组相比，*P< 0.05，***P< 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，###P< 0.001，ns表示各组之间无统计学差异，n=3。
Figure 9. Effect of LZH on H2O2-induced apoptosis and cell cycle of C2C12 cells
表 1 荔枝核提取物活性成分
Table 1 Active ingredients of LZH
ID Mol ID 活性成分名称 口服生物
利用度（%）类药性 来源 LZH-1 MOL010690 Uniflex BYO 30.13 0.25 TCMSP LZH-2 MOL001494 Mandenol 42.00 0.19 TCMSP LZH-3 MOL002883 Ethyl oleate （NF） 32.40 0.19 TCMSP LZH-4 MOL000358 Beta-sitosterol 36.91 0.75 TCMSP LZH-5 MOL000359 Sitosterol 36.91 0.75 TCMSP LZH-6 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76 TCMSP LZH-7 MOL000073 ent-Epicatechin 48.96 0.24 TCMSP LZH-8 MOL000098 Quercetin 46.43 0.28 TCMSP LZH-9 MOL000492 Catechin 54.83 0.24 Ref. [23−25] LZH-10 MOL011061 Ginkgolide B 46.14 0.73 Ref. [23] LZH-11 MOL000422 Kaempferol 41.88 0.24 Ref. [26] LZH-12 MOL000006 Luteolin 36.16 0.25 Ref. [23] LZH-13 MOL000737 Morin 46.23 0.27 Ref. [23] LZH-14 MOL004328 Naringenin 59.29 0.28 Ref. [27] 
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