Quality Evaluation of Whole Wheat Sourdough Fermented at Different Temperatures and Diversity Analysis and Breeding Selection of Lactic Acid Bacteria
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摘要: 为探究发酵温度对全麦酸面团质量及乳酸菌多样性的影响，利用全长高通量测序技术系统解析不同温度发酵的全麦酸面团在成熟过程中细菌群落结构及其演替规律，通过理化分析评价酸面团质量，采用传统培养法分离优势菌种并从中筛选特异菌株。结果表明，发酵温度对酸面团的质量特征存在显著影响，随发酵温度升高，酸面团成熟时的pH从4.18降低到3.87，总滴定酸度（Total titratable acidity，TTA）从15.0 mL增加到24.0 mL，发酵温度≥30 ℃时，成熟酸面团总抗氧化活性、类黄酮和氨基酸含量显著增加，高温发酵可赋予全麦酸面团更好的质量特征。不同温度发酵成熟的全麦酸面团中优势乳酸菌存在显著物种差异，20 ℃和25 ℃以弯曲乳杆菌为主，30 ℃以弯曲乳杆菌和乳酸片球菌为主，37 ℃以桥粘液乳杆菌为主。通过酶活力筛选，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）LAB 31弯曲乳杆菌的纤维素酶活最高，为77.92±2.26 U/L，LAB 22乳酸片球菌的淀粉酶活最高为42.19±4.12 U/L。该研究为全麦发酵食品发酵剂的开发提供了一定的理论依据与菌种资源。Abstract: To investigate the impact of fermentation temperature on the quality and biodiversity of lactic acid bacteria (LAB) in whole wheat sourdough, full-length high-throughput sequencing technology was applied to systematically analyze the community structure and succession patterns of bacterial communities in sourdough samples fermented at different temperatures during the maturation process. Sourdough quality was assessed by physicochemical analysis, and dominant bacterial strains were isolated using traditional cultivation methods and then screened for unique characteristics. The results indicated that high temperature fermentation could impart better quality characteristics to whole wheat sourdough. There was a significant effect of fermentation temperature on sourdough quality characteristics. The pH of the matured sourdough decreased from 4.18 to 3.87 and the total titratable acidity (TTA) increased from 15.0 mL to 24.0 mL with increasing fermentation temperature. The total antioxidant activity, flavonoids and amino acid content of ripened sourdough increased significantly when the fermentation temperature was not lower than 30 ℃. There were significant differences in the dominant lactic acid bacteria between ripened whole wheat sourdough fermented at different temperatures. The Latilactobacillus curvatus predominated at 20 ℃ and 25 ℃, and both Latilactobacillus curvatus and Pediococcus acidilactici were prevalent at 30 ℃. The Limosilactobacillus pontis became the dominant strain when the fermentation temperature was increased to 37 ℃. Enzyme activity screening revealed that LAB 31, identified as Latilactobacillus curvatus, had the highest cellulase activity of 77.92±2.26 U/L and LAB 22, identified as Pediococcus acidilactici, had the highest amylase activity of 42.19±4.12 U/L. This study is expected to provide a theoretical basis and bacterial resources for the development of starter cultures for whole wheat fermentation foods.
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酸面团发酵是谷物食品生产中最古老的生物工艺技术之一，其对全麦发酵食品的感官品质、营养价值、货架期等所产生积极影响已成为共识[1−3]。面团发酵过程中形成了以乳酸菌和酵母菌为主的独特的微生物生态系统，它们进行着复杂的生命活动和代谢相互作用，影响着酸面团的发酵性能。但由于谷物和发酵温度的多样性，在世界各地的酸面团中发现的乳酸菌群各不相相同，刘同杰[4]分析对比了我国15个地区的传统酸面团（小麦粉为发酵基质）优势菌株，发现旧金山乳杆菌和酿酒酵母分别是优势乳酸菌和酵母菌。Elif等[5]研究发现无壳大麦酸面团中的优势乳酸菌为乳酸片球菌。L. Ruiz Rodríguez等[6]研究发现，苋菜籽粉酸面团中的优势乳酸菌为植物乳杆菌。此外，发酵温度也会影响酸面团中乳酸菌/酵母菌的比例及同型发酵乳酸菌与异型发酵乳酸菌之间的平衡[7]，进而对酸面团的发酵性能产生影响。Hilal等[8]报道，在初始菌落数无显著差异情况下，30 ℃发酵的酸面团显示出比25 ℃更高的乳酸菌计数水平，更快的酸化速率，但酵母菌的数量并无显著差异。
全长高通量测序技术是基于PacBio测序平台，利用单分子实时测序的方法对marker基因进行测序，具有长读长、高通量、快速等优点[9]。孙蒙等[10]利用高通量测序解析了契达奶酪在加工过程中菌群结构多样性变化。孙洁等[11]对锡林郭勒的鲜奶样品进行宏基因组测序分析，从6份鲜奶样品共分离出47株菌，鉴定出优势菌种为乳酸乳球菌。但利用高通量测序技术探究发酵温度对全麦酸面团中优势乳酸菌的影响鲜有报道。通过物种注释及丰度分析，可揭示全麦酸面团中的微生物构成；通过微生物多样性分析、显著物种差异分析和相关性分析等，可挖掘不同温度发酵成熟的全麦酸面团间的微生物差异。利用此技术可实现全麦酸面团乳酸菌群多样性组成谱的“高分辨率”解析。
本文通过传统培养法和全长高通量测序技术系统解析全麦酸面团成熟过程中细菌群落结构及其演替规律。分析不同发酵温度对全麦酸面团中优势乳酸菌种类及酸面团质量特征的影响，筛选并鉴定具有高纤维素酶活、淀粉酶活等关键功能的乳酸菌株，以期选育出适用于全麦发酵食品的乳酸菌，研发发酵性能优良的全麦酸面团，推动全麦发酵食品主食化发展。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
全麦高筋面粉 鲍勃红磨坊；细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302） 天根生化科技（北京）有限公司；纤维素酶（CL）活性检测试剂盒（BC2540-50T/24S）、α-淀粉酶（α-AL）活性检测试剂盒（BC0610-100T/48S）、总抗氧化能力检测试剂盒（BC1315）、植物总酚（TP）含量检测试剂盒（BC1345）、氨基酸（AA）含量检测试剂盒（BC1575）、还原糖含量检测试剂盒（BC0235）、植物类黄酮含量检测试剂盒（BC1330）、游离脂肪酸含量检测试剂盒（BC0595）、植酸含量检测试剂盒（BC5845）、MRS肉汤培养基 北京索莱宝科技有限公司；其它试剂来源于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。
VS-1300L无菌操作台 苏州安泰空气技术有限公司；PYL-125恒温培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；多功能读板仪（酶标仪） 美国伯腾仪器有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 全麦酸面团的制备
称取50 g全麦粉于无菌烧杯中，加入50 g自来水，用无菌玻璃棒充分搅拌混匀，获得面团得率（Dough Yield，DY=100×（水+面粉）/面粉）为200的面团。将此面团在20、25、30、37 ℃下发酵24 h，即为第1代酸面团D1，分别记为T20D1、T25D1、T30D1和T37D1；取10 g D1于无菌烧杯中并加入45 mL自来水和45 g全麦粉，充分混匀，再次发酵24 h，即为第2代酸面团D2，分别记为T20D2、T25D2、T30D2和T37D2。依次类推，取10 g D（n）于无菌烧杯中，加入45 mL自来水和45 g全麦粉，充分混匀，发酵24 h，得到D（n+1），连续多次传代后，酸面团的pH保持稳定即为成熟酸面团，分别记为T20、T25、T30和T37。本实验制备的酸面团共传30代，每代发酵24 h，共发酵30 d。
1.2.2 全麦酸面团pH和总滴定酸度变化
取10 g自然发酵的全麦酸面团，加入90 mL无CO2蒸馏水，充分搅拌30 min后静置10 min，使用pH计测定稀释液的pH。随后用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定稀释液至pH8.3，记录消耗的NaOH溶液总体积（mL），即为全麦酸面团的总滴定酸度（Total titratable acidity，TTA）[12]。
1.2.3 成熟全麦酸面团中乳酸菌与酵母菌计数
采用平板计数法对成熟酸面团中的乳酸菌和酵母菌计数。将90 mL 0.85%无菌盐水（w/v）与10 g成熟酸面团充分混合。取1 mL悬浮液按照10倍等梯度稀释至10−9，取10−7~10−9倍系列稀释液1 mL于无菌培养皿中，倒入灭菌的MRS和YPD培养基，迅速混匀，凝固后分别于37 ℃和28 ℃下倒置培养72 h，对乳酸菌和酵母菌进行计数。
1.2.4 成熟全麦酸面团营养价值测定
使用索莱宝试剂盒测定酸面团的总抗氧化活性（Total antioxidant activity，T-AOC）、总酚、氨基酸、还原糖、类黄酮、游离脂肪酸的含量以及发酵前后的植酸降解率。其中T-AOC的测定是在酸性环境下，通过检测Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）被还原产生蓝色的Fe2+-TPTZ的含量以反映总抗氧化能力；总酚含量是通过测定碱性条件下，酚类物质将钨钼酸还原所产生的蓝色化合物在760 nm 处的吸光值确定。具体的检测方法可参照官方网站https://www.solarbio.com/。
1.2.5 全麦酸面团的微生物多样性分析
将成熟酸面团样品在超净工作台中分装，用无菌采样杯密封后送至生物技术公司进行高通量测序分析。具体步骤为：提取全麦酸面团样品总DNA后，根据全长引物序列合成带有Barcode的特异引物，进行PCR扩增并对其产物纯化、定量和均一化，形成测序文库（SMRT Bell），基于PacBio测序平台，利用单分子实时测序（Single Molecule Real-Time Sequencing）方法对marker基因进行测序，然后对CCS（Circular Consensus Sequencing）序列进行过滤、聚类或去噪，进行全麦酸面团进行全长微生物多样性OUT分析、全长微生物多样性指数分析、多样性物种注释及分类学分析等。
1.2.6 全麦酸面团中乳酸菌的鉴定和筛选
1.2.6.1 优势菌株的鉴定
利用十倍梯度浓度稀释法对成熟酸面团样品进行稀释，选择合适的稀释梯度平板涂布培养，挑单克隆菌落于摇菌管中培养12~24 h；使用天根生化科技（北京）有限公司的“细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）”按说明书提取发酵液DNA，利用通用引物扩增并送检测公司测序；在NCBI BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）网站上比对分析，找到与待鉴定菌株同源性最高的模式菌株，对菌株进行鉴定。
1.2.6.2 特异菌株的筛选
纤维素酶发酵液制备[13]：将分离鉴定的菌体在PYC培养基中活化2代，再按10%的接种量接种，37 ℃、200 r/min摇瓶连续培养3 d。发酵结束后于10000 r/min、4 ℃下离心10 min，取上清液进行纤维素酶活的测定。（PYC培养基中包括 羧甲基纤维素钠10 g，5 g蛋白胨，5 g酵母浸粉，磷酸氢二钾1 g ，七水硫酸镁0.2 g，氯化钠5 g ，水1000mL，pH6.0。）
淀粉酶发酵液制备[14]：将分离鉴定的菌体在产淀粉酶液体培养基中活化2代，再按10%的接种量接种，37 ℃、200 r/min摇瓶连续培养24 h。发酵结束后于10000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液进行淀粉酶活的测定。（液体培养基中包括淀粉10 g，硫酸铵2 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、水1000 mL，pH7.0。）
纤维素酶和淀粉酶活的测定按索莱宝纤维素酶（CL）活性检测试剂盒（BC2540-50T/24S）和α-淀粉酶（α-AL）活性检测试剂盒（BC0610-100T/48S）说明书进行。
1.3 数据处理
采用Excel 2016和SAS 9.2对数据进行统计分析，运用方差分析方法（ANOVA）进行显著性分析（P<0.05）。所有试验重复3次，数据表示为平均值±标准偏差。
2. 结果与分析
2.1 全麦酸面团的质量特征
2.1.1 pH和TTA
酸面团的酸度是其发挥发酵性能、提升全麦发酵食品风味、延长货架期的关键[15]，快速酸化更利于抑制酸面团中杂菌的生长。由图1可知，在不同发酵温度下，全麦酸面团的pH均先下降后保持稳定，相应地TTA先增加后趋于稳定，当发酵温度高于等于25 ℃时，其pH在发酵1~2 d迅速下降，TTA快速增加；而20 ℃发酵时，面团的酸化速率较慢，其pH在发酵2~3 d才开始迅速下降，可能是由于低温发酵时乳酸菌生长繁殖较慢，延滞期略有延长；但所有酸面团达到稳定pH所需发酵时间并无显著区别，均在10 d左右，TTA达到稳定天数与pH基本相同，Hilal等[8]也报道了相似的结果。
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图 1 不同温度发酵的全麦酸面团pH和TTA随发酵时间的变化注：图中相同指标的不同字母表示样品间差异显著（P<0.05）。Figure 1. Changes in pH and TTA of whole wheat sourdough with fermentation time at different fermentation temperatures酸面团发酵成熟时的pH≤4.5[16]。由图1可知，随着发酵温度的升高，酸面团成熟时的pH分别为4.18、4.04、3.96和3.87，TTA分别为15.0 mL、16.6 mL、21.0 mL和24.0 mL。明显地，酸面团成熟时的pH值与其发酵温度成反比、TTA成正比，不同温度发酵成熟的全麦酸面团的pH和TTA差异显著（P<0.05）。在酸面团发酵过程中，乳酸菌对全麦粉中碳水化合物的利用并产生乳酸是引起面团酸化的主要原因，但过多的乳酸会导致面团中的面筋蛋白溶胀、水解，破坏全麦发酵食品的质构[1]。因此，具有良好产酸能力的乳酸菌的选育显得尤为重要，在实际生产中，也可根据产品需要，调整发酵温度，使酸面团快速达到产品所需的pH和TTA，以发挥其最佳发酵性能。
2.1.2 菌落总数
乳酸菌和酵母菌的协同发酵对酸面团发酵性能的改善、腐败微生物生长的抑制及全麦发酵食品货架期的延长、营养价值的提高、风味挥发和风味辅助物质的形成等方面起到了积极的作用[17−19]。在酸面团发酵前期，体系的pH相对较高，乳酸菌尚未大量繁殖，酵母菌为优势菌株，其产生的大量CO2气体使酸面团的体积迅速增加，如图2所示，所有酸面团的体积在发酵第2 d达到最大，且最大发酵体积与发酵温度成正比；随着发酵的进行，乳酸菌大量繁殖，体系的pH迅速下降，抑制了酵母菌的生长，产生的CO2减少，发酵体积随之减小，与2.1.1的变化趋势一致。
全麦酸面团逐渐成熟，体系的pH和发酵体积趋于稳定，酵母菌与乳酸菌的数量保持平衡，根据工业和信息化部颁发的轻工标准QB/T 5756-2022《酸面团》，成熟活性酸面团中乳酸菌总数≥1×106 CFU/g，酵母菌总数≥1×105 CFU/g。不同温度发酵成熟的酸面团菌落总数如图3所示，所有全麦酸面团的菌落总数均符合标准，乳酸菌的菌落总数总是大于酵母菌，其中，30 ℃发酵的酸面团中乳酸菌与酵母菌的数量差异极为显著（P<0.01）。发酵温度对酸面团中酵母菌的菌落总数无显著影响（P>0.05），与以往的报道一致[8]，25 ℃发酵时，酵母菌菌落总数最高，为1.09×107 CFU/g。但30 ℃和20 ℃发酵的酸面团中乳酸菌菌落总数显著高于其余两组（P<0.05），其中30 ℃发酵时，乳酸菌菌落总数最高，为1.21×108 CFU/g；在发酵成熟的酸面团中，乳酸菌与酵母菌典型的数量比为乳酸菌:酵母菌=100:1或10:1，因此，可通过调控酸面团中乳酸菌与酵母菌的比例，使全麦发酵食品达到理想的品质。
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图 3 发酵温度对成熟全麦酸面团菌落总数的影响注：图中小写字母表示各组样品间乳酸菌数量差异显著（P<0.05），大写字母表示各组样品间酵母菌数量差异显著（P<0.05），**表示组间差异极显著（P<0.01）。Figure 3. The effect of fermentation temperature on the total number of bacterial colonies in mature whole wheat sourdough2.1.3 全麦酸面团的营养价值
与精制小麦粉相比，全麦粉因保留了小麦中的麸皮和胚芽等成分，营养素密度更高，但对于全麦食品生产来说，麸皮和胚芽的存在增加产品出现氧化酸败、感官缺陷等质量风险，而酸面团发酵可有效改善全麦粉在生产中的弊端。由表1可知，全麦粉经自然发酵后，T-AOC和总酚含量显著增高（P<0.05），类黄酮的含量升高，尤其是30 ℃和37 ℃发酵成熟的全麦酸面团中类黄酮的含量显著增加（P<0.05），酚类、类黄酮等活性物质的增加，可增强酸面团及其发酵食品的抗氧化性、降低淀粉老化速度，更好地维持全麦食品的质地与口感，延长货架期。发酵后，体系内还原糖的含量显著增加（P<0.05），但发酵温度越高，成熟酸面团中的还原糖含量越低，可能是由于温度升高，微生物的代谢活动增强、具有较强糖代谢水平的乳酸菌成为优势菌种，消耗了大量的还原糖。全麦粉发酵后，游离脂肪酸（25 ℃除外）、氨基酸含量的显著增加（P<0.05）有利于酯类、羰基化合物和有机酸等可提高全麦食品滋气味的挥发性化合物的形成，其中30 ℃和37 ℃发酵成熟的酸面团中氨基酸的含量是全麦粉的4倍以上。此外，全麦粉经发酵后，植酸降解率均在92%以上，植酸含量的大幅降低，减少了其与Ca、K、Mg、Fe和Zn等阳离子的螯合，增加了矿物质和小麦蛋白的生物利用率。综上，全麦酸面团的营养和应用价值明显优于未经发酵的全麦粉，适当地提高发酵温度（≥30 ℃）可赋予全麦酸面团更好的质量特征。
表 1 发酵温度对全麦酸面团理化特性的影响Table 1. Effect of fermentation temperature on the physicochemical properties of whole wheat sourdough指标 全麦粉 自然发酵全麦酸面团发酵温度（℃） 20 25 30 37 植酸降解率（%） − 95.88a 92.75b 97.25a 96.23a T-AOC（μmol/g） 0.16±0.01d 0.25±0.02b 0.25±0.01b 0.35±0.01a 0.20±0.01c 总酚（mg/g） 2.30±0.1c 2.92±0.03b 3.39±0.04a 3.04±0.07b 3.46±0.1a 类黄酮（μmol/g） 2.13±0.04b 2.24±0.08b 2.29±0.15b 2.52±0.09a 2.51±0.12a 还原糖（mg/g） 12.08±0.52e 104.03±0.35a 56.23±1.09b 21.71±0.99c 14.17±0.4d 氨基酸（μmol/g） 177.14±48.68d 521.54±26.76c 677.79±23.26b 717.01±35.74b 784.88±25.77a 游离脂肪酸（μmol/g） 1.22±0.09c 1.46±0.08ab 1.34±0.09bc 1.48±0.1ab 1.51±0.07a 注：数据表示为平均值±标准差。同一行中不同小写字母表示各组样品间差异显著（P<0.05）。 2.2 全麦酸面团中的微生物多样性
2.2.1 细菌多样性数据评估及OTU分析
由全麦酸面团中细菌高通量测序结果（表2）可知，各组序列有效率均在99%以上，发酵组的有效序列数均高于未发酵组（8254条），说明发酵后，全麦酸面团中的细菌生物量显著增加（P<0.05）。
表 2 全麦酸面团细菌高通量测序结果Table 2. High throughput sequencing results of bacteria in whole wheat sourdough样品编号 温度（℃） 天数（d） 测序数据评估 有效序列（条） 序列有效率（%） C 常温 0 8254 99.17 T20D2 20 2 14301 99.98 T20D4 4 13557 99.00 T20D10 10 13240 99.87 T25D2 25 2 12459 98.34 T25D4 4 13676 99.94 T25D10 10 13154 99.98 T30D2 30 2 12295 99.55 T30D4 4 12841 99.89 T30D10 10 13677 99.56 T37D2 37 2 13110 99.19 T37D4 4 12763 99.96 T37D0 10 13704 99.99 注：C-对照组，未发酵的全麦面团。 为了更直观地表征不同全麦酸面团中细菌的相似性及差异性，利用Usearch软件在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得OTU信息，并用VENN图统计其共有、特有的OTU数目[20−21]。图4a为不同酸面团OTUs个数分布情况，发酵组OTUs数量均显著低于未发酵的对照组，且随发酵时间的延长，OUTs数量逐渐减少，说明发酵后全麦酸面团中的细菌种类明显减少，优势乳酸菌株凸显并保持稳定，其中20 ℃发酵的全麦酸面团OTUs数量下降最为迅速且成熟后OTUs数量最低，可能是因为低温发酵时，大部分细菌生长受限制，只有少部分适低温菌得以快速生长。由图4b可知，20、25、30、37 ℃发酵成熟的全麦酸面团特有OTUs分别为4、11、10和7个，占各自OTUs总数的21.05%、39.29%、33.33%和29.17%；共有的OTUs 8个，只占OTUs总数7.92%。因此，不同温度发酵成熟的全麦酸面团细菌菌群结构差异显著。
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图 4 微生物多样性OTU分析注：（a）酸面团成熟过程中OUTs变化（b）成熟酸面团OUTs差异性。Figure 4. OTU analysis of microbial diversity2.2.2 细菌多样性注释及菌群结构分析
如图5所示，未发酵的全麦面团与发酵后存在显著的菌群结构差异，成为一个单独分支。发酵进行到第4 d和第10 d时，从1个主支上又分化出2个单独分支，说明全麦酸面团的发酵可划分为前（0~2 d）、中（2～4 d）和后（4～10 d）3个阶段，其发酵过程的细菌菌落在门、属和种水平上的丰度变化如图6所示。由图6a可知全麦面团未发酵时（Control），门水平相对丰度大于1%的菌群共3个，分别为变形菌门（Proteobacteria，89.58%）、厚壁菌门（Firmicutes，4.68%）和拟杆菌门（Bacteroidota，1.48%），优势菌门为变形菌门。发酵前期，其优势菌门依然为变形菌门，但相对丰度下降到53.40%~69.43%；发酵中期，优势菌门转变为厚壁菌门，相对丰度达到了93.87%（20 ℃）、98.11%（25 ℃）、98.41%（30 ℃）和98.62%（37 ℃），发酵温度越高，其相对丰度越高，优势越明显；发酵后期，厚壁菌门逐渐占据优势，相对丰度达到了96.27%~99.60%，而变形菌门相对丰度下降到了0.37%~3.66%。在全麦酸面团发酵成熟的过程中，优势菌门由变形菌门演替为厚壁菌门的趋势与以往的研究结果一致[22]。
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图 6 全麦酸面团在门（a）、属（b）、种（c）水平上细菌菌落结构Figure 6. Microbial community composition in whole wheat sourdough at phylum (a), genus (b) and species (c) levels由图6b可知全麦面团未发酵时，属水平相对丰度大于1%的菌群共4个，分别为芽孢杆菌属（52.48%）、黄单胞杆菌属（28.16%）和泛菌属（4.39%）。发酵前期，全麦酸面团中的优势菌属均以泛菌属、科萨克氏菌属和乳球菌属为主；从发酵中期开始，不同温度发酵的全麦酸面团优势菌属及其丰度出现差异，20 ℃发酵的优势菌属从乳球菌属（90.77%）演替为后期的乳杆菌属（94.33%），而25 ℃优势菌属始终为乳杆菌属（中期95.16%，末期96.91%）；30 ℃和37 ℃发酵中期的优势菌属均为乳杆菌属，30 ℃发酵后期转变为乳杆菌属（53.76%）和片球菌属（42.7%）共存，37 ℃发酵后期的优势菌属为粘液乳杆菌属（99.58%）。在全麦酸面团发酵成熟过程中，其优势菌属的演替规律与Ercolini等[23]的报道具有一定的相似性。
不同发酵基质和发酵条件的酸面团中优势酵母菌大多以酿酒酵母为主，但优势乳酸菌差异较大，包括植物乳杆菌、戊糖片球菌、旧金山乳杆菌、食窦魏斯氏菌以及瑞士乳杆菌等[24−26]。由图6c可知全麦面团未发酵时，种水平相对丰度大于1%的菌种共3个，分别为解淀粉芽孢杆菌（52.48%）、黄单胞杆菌（28.15%）和成团泛菌（4.39%）。发酵前期，优势菌种为成团泛菌、考氏科萨克菌、乳酸乳球菌、弯曲乳杆菌和产气荚膜梭菌；发酵中期，其优势菌种转变为乳酸乳球菌和弯曲乳杆菌；发酵后期，温度对酸面团中优势菌种的影响开始显现，20 ℃和25 ℃发酵的优势均属为弯曲乳杆菌（20 ℃，94.33%；25 ℃，96.91%），30 ℃发酵时，弯曲乳杆菌（53.76%）与乳酸片球菌（42.7%）共存作为优势菌属，37 ℃发酵的优势菌属为桥粘液乳杆菌（99.58%）。
2.2.3 Alpha多样性指数分析
利用QIIME2 2020.6软件对成熟全麦酸面团中细菌Alpha多样性指数进行评估[27]。所有酸面团样品的覆盖度（Coverage）均不小于0.999，表明测序数据覆盖了样品中几乎所有细菌种类，能够真实地表征全麦酸面团细菌丰富度和多样性，数据有效性高，可用于后续分析。
Simpson指数和Shannon指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度，用来衡量样本物种菌群多样性，其越大，说明该样本物种多样性越高；Chao1指数和ACE指数常用来估计物种总数，用来衡量样本物种菌群丰富度，其越大，说明该样本物种数越多。全麦酸面团细菌群落多样性和物种丰富度如图7所示。由图7a、7b可知，不同温度发酵成熟的全麦酸面团细菌菌群多样性间差异显著（P<0.05），30 ℃发酵成熟的全麦酸面团Simpson指数和Shannon指数最大，该酸面团的物种多样性最高，优势乳酸菌的种类也更为丰富。由图7c、7d可知，全麦酸面团的Chao1指数和ACE指数随发酵温度升高逐渐减小，即酸面团物种丰富度随发酵温度升高逐渐下降，其中20 ℃发酵成熟的全麦酸面团细菌菌种丰富度与30 ℃和37 ℃的差异显著（P<0.05），表明发酵温度越高，其优势菌种也越明显。
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图 7 成熟全麦酸面团细菌群落Alpha多样性分析Figure 7. Alpha diversity analysis of bacterial communities in mature whole wheat sourdough2.2.4 Beta多样性指数分析
使用QIIME软件进行Beta多样性分析，以比较不同温度发酵成熟全麦酸面团细菌群落多样性。基于Binary jaccard算法的PCoA分析显示（图8a），T30和T37的置信椭圆区域相互靠近并有部分重叠，与T20、T25距离较远，表明30 ℃、37 ℃发酵成熟的全麦酸面团细菌群落组成和丰富度具有一定的相似性。再经偏最小二乘法判别分析（Partial Least Squares Discrimination Analysis，PLS-DA）（图8b），T20和T25不与任何样品处于同一象限中，表明20 ℃和25 ℃发酵成熟的全麦酸面团中的细菌菌落组成和丰富度与其他全麦酸面团差异显著；而T30和T37在同一象限且有重叠区域，说明30 ℃和37 ℃发酵成熟的全麦酸面团细菌菌落和丰富度无显著差异，与PCoA分析法结论相一致。
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图 8 成熟全麦酸面团细菌菌落Beta多样性分析Figure 8. Beta diversity analysis of bacterial colonies in mature whole wheat sourdough2.3 成熟全麦酸面团中优势乳酸菌株的鉴定及筛选
2.3.1 乳酸菌的鉴定
将成熟全麦酸面团样品中分离出的菌株16S rRNA基因序列与NCBI数据库中已有菌株的16S rRNA序列进行同源性比对后，共鉴定出微生物菌种125个，主要菌株为弯曲乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌等。
2.3.2 特异性乳酸菌株的筛选
淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶等酶类单独或协同作用会使全麦面团的软化度、耐搅拌指数、粘性和延展性增加[28]，将发酵和酶处理相结合改善麸皮对全麦发酵食品品质的消极影响已成为了一种新型的生物技术[29]，因此，筛选高酶活菌株对改善全麦发酵食品品质具有重要意义。从2.3.1已鉴定出的乳酸菌中筛选60株作为候选菌，其纤维素酶活和淀粉酶活测定结果见表3（表中仅展示有代表性的10株乳酸菌酶活数据）。不同乳酸菌菌株的纤维素酶和淀粉酶活相差较大，其中LAB 31菌株的纤维素酶活最高为77.92±2.26 U/L，经DNA鉴定为弯曲乳杆菌。纤维素酶可促进全麦粉中麸皮的水解，释放出与纤维素紧密结合的酚类物质、维生素和阿拉伯木聚糖等，增加可溶性膳食纤维的含量，对全麦粉中麸皮结构改善和营养素生物利用率的提高起到了积极的作用[30]。而乳酸菌发酵过程中产生的淀粉酶可提高全麦发酵食品的感官风味且有益于延缓淀粉的老化；高淀粉酶活还可以增强菌株的发酵能力，减弱面团发酵过程中与酵母菌对全麦粉中可溶性碳水化合物的竞争利用[31]。经酶活测定，LAB 22菌株的淀粉酶活最高，为42.19±4.12 U/L，DNA鉴定为乳酸片球菌，是酶活最低的LAB 36菌株（9.36±4.65 U/L）的4.5倍。因此，LAB 31和LAB 22菌株具有较大的生物技术潜力开发高发酵性能的全麦酸面团发酵剂。
表 3 乳酸菌的纤维素酶活和淀粉酶活Table 3. The cellulase activity and amylase activity of lactic acid bacteria菌株编号 纤维素酶活（U/L） 淀粉酶活（U/L） LAB1 77.47±2.34 16.78±8.67 LAB2 48.02±5.46 40.68±8.82 LAB31 77.92±2.26 19.90±2.5 LAB4 44.69±5.61 31.31±3.67 LAB5 65.88±4.48 40.09±7.9 LAB22 46.66±4.7 42.19±4.12 LAB7 43.44±4.77 11.4±2.68 LAB8 69.71±2.28 21.71±3.1 LAB9 68.62±5.85 38.96±6.1 LAB36 69.45±3.64 9.36±4.65 3. 结论
发酵温度对全麦酸面团的质量特性和乳酸菌多样性具有显著影响。适当地提高发酵温度（≥30 ℃）可加快酸面团的酸化速率，获得较低pH的成熟酸面团，其T-AOC、总酚、类黄酮、氨基酸、游离脂肪酸的含量和植酸降解率均处于较高水平，赋予全麦酸面团更好的质量特征。全麦酸面团在不同温度发酵成熟过程中，优势菌门都由变形菌门演替为厚壁菌门，与Boreczek等[22]报道的一致，但优势乳酸菌属和菌种并不相同，其中20 ℃和25 ℃发酵成熟的全麦酸面团中优势菌属为乳杆菌属（94.33%和96.91%），30 ℃为乳杆菌属（53.76%）和片球菌属（42.7%）共存，37 ℃为粘液乳杆菌属（99.58%）；20 ℃和25 ℃发酵成熟的全麦酸面团中优势乳酸菌是弯曲乳杆菌（94.33%和96.91%），30 ℃发酵成熟的全麦酸面团中优势乳酸菌为弯曲乳杆菌（53.76%）和乳酸片球菌（42.7%），37 ℃发酵成熟的全麦酸面团的中优势乳酸菌是桥粘液乳杆菌（99.58%）。通过系统解析全麦酸面团中乳酸菌的组成，从中选育出的高纤维素酶活LAB 31弯曲乳杆菌（77.92±2.26 U/L）和高淀粉酶活LAB 22乳酸片球菌（42.19±4.12 U/L）具有较大的潜力开发高发酵性能的全麦酸面团发酵剂。该研究可为全麦酸面团发酵剂的研发、发酵性能的标准化、安全使用和质量管理等方面提供积极引导。本研究只探讨了发酵温度对全麦酸面团中乳酸菌的影响及其演替规律，而酸面团中的酵母菌对其发酵性能的发挥同样具有至关重要的作用，有待进一步解析。
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图 1 不同温度发酵的全麦酸面团pH和TTA随发酵时间的变化
注：图中相同指标的不同字母表示样品间差异显著（P<0.05）。
Figure 1. Changes in pH and TTA of whole wheat sourdough with fermentation time at different fermentation temperatures
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图 3 发酵温度对成熟全麦酸面团菌落总数的影响
注：图中小写字母表示各组样品间乳酸菌数量差异显著（P<0.05），大写字母表示各组样品间酵母菌数量差异显著（P<0.05），**表示组间差异极显著（P<0.01）。
Figure 3. The effect of fermentation temperature on the total number of bacterial colonies in mature whole wheat sourdough
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图 4 微生物多样性OTU分析
注：（a）酸面团成熟过程中OUTs变化（b）成熟酸面团OUTs差异性。
Figure 4. OTU analysis of microbial diversity
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图 6 全麦酸面团在门（a）、属（b）、种（c）水平上细菌菌落结构
Figure 6. Microbial community composition in whole wheat sourdough at phylum (a), genus (b) and species (c) levels
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图 7 成熟全麦酸面团细菌群落Alpha多样性分析
Figure 7. Alpha diversity analysis of bacterial communities in mature whole wheat sourdough
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图 8 成熟全麦酸面团细菌菌落Beta多样性分析
Figure 8. Beta diversity analysis of bacterial colonies in mature whole wheat sourdough
表 1 发酵温度对全麦酸面团理化特性的影响
Table 1 Effect of fermentation temperature on the physicochemical properties of whole wheat sourdough
指标 全麦粉 自然发酵全麦酸面团发酵温度（℃） 20 25 30 37 植酸降解率（%） − 95.88a 92.75b 97.25a 96.23a T-AOC（μmol/g） 0.16±0.01d 0.25±0.02b 0.25±0.01b 0.35±0.01a 0.20±0.01c 总酚（mg/g） 2.30±0.1c 2.92±0.03b 3.39±0.04a 3.04±0.07b 3.46±0.1a 类黄酮（μmol/g） 2.13±0.04b 2.24±0.08b 2.29±0.15b 2.52±0.09a 2.51±0.12a 还原糖（mg/g） 12.08±0.52e 104.03±0.35a 56.23±1.09b 21.71±0.99c 14.17±0.4d 氨基酸（μmol/g） 177.14±48.68d 521.54±26.76c 677.79±23.26b 717.01±35.74b 784.88±25.77a 游离脂肪酸（μmol/g） 1.22±0.09c 1.46±0.08ab 1.34±0.09bc 1.48±0.1ab 1.51±0.07a 注：数据表示为平均值±标准差。同一行中不同小写字母表示各组样品间差异显著（P<0.05）。 
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表 2 全麦酸面团细菌高通量测序结果
Table 2 High throughput sequencing results of bacteria in whole wheat sourdough
样品编号 温度（℃） 天数（d） 测序数据评估 有效序列（条） 序列有效率（%） C 常温 0 8254 99.17 T20D2 20 2 14301 99.98 T20D4 4 13557 99.00 T20D10 10 13240 99.87 T25D2 25 2 12459 98.34 T25D4 4 13676 99.94 T25D10 10 13154 99.98 T30D2 30 2 12295 99.55 T30D4 4 12841 99.89 T30D10 10 13677 99.56 T37D2 37 2 13110 99.19 T37D4 4 12763 99.96 T37D0 10 13704 99.99 注：C-对照组，未发酵的全麦面团。
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表 3 乳酸菌的纤维素酶活和淀粉酶活
Table 3 The cellulase activity and amylase activity of lactic acid bacteria
菌株编号 纤维素酶活（U/L） 淀粉酶活（U/L） LAB1 77.47±2.34 16.78±8.67 LAB2 48.02±5.46 40.68±8.82 LAB31 77.92±2.26 19.90±2.5 LAB4 44.69±5.61 31.31±3.67 LAB5 65.88±4.48 40.09±7.9 LAB22 46.66±4.7 42.19±4.12 LAB7 43.44±4.77 11.4±2.68 LAB8 69.71±2.28 21.71±3.1 LAB9 68.62±5.85 38.96±6.1 LAB36 69.45±3.64 9.36±4.65
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