Electrochemical Method for Sulfamethazine Detection Based on CRISPR/Cas12a Coupled with Spherical Nucleic Acid with the Core of Gold Nanoparticle
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摘要: 磺胺二甲嘧啶在畜禽养殖、水产养殖等农业生产中被广泛用于预防或治疗细菌性疾病。然而，不合理用药会导致其在动物性食品中残留量超标，进而危害人体健康。因此，开展磺胺二甲嘧啶的快速、高灵敏检测对于保障食品安全和人体健康具有重要意义。本工作基于CRISPR/Cas12a偶联金核球形核酸构建了一种新型磺胺二甲嘧啶电化学检测方法，以实现对磺胺二甲嘧啶的快速、高灵敏和高特异性检测。以目标物磺胺二甲嘧啶的适体序列为CRISPR/Cas12a的激活链，磺胺二甲嘧啶与其适体序列的特异性结合会抑制CRISPR/Cas12a的反式切割活性，从而使得预修饰于金电极表面的底物探针得以保留，进而引入金核球形核酸以触发杂交链式反应，最终产生显著的电化学信号放大。为了获得最佳检测性能，对靶标磺胺二甲嘧啶与适体的孵育时间、CRISPR/Cas12a的浓度和作用时间、发夹探针的浓度和反应时间进行了优化，结果分别为30 min、120 nmol/L、30 min、1 µmol/L、100 min。所构建的电化学检测方法对磺胺二甲嘧啶的线性检测范围为0.006~600 ng/mL，检测限低至6 pg/mL，同时对目标抗生素与其他干扰抗生素表现出较好的区分能力。此外，本方法成功应用于对实际食品样本中磺胺二甲嘧啶的检测，测得回收率在98.07%~106.90%之间，展现出潜在的食品安全检测应用价值。
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关键词:
- CRISPR/Cas12a /
- 金纳米颗粒 /
- 球形核酸 /
- 磺胺二甲嘧啶 /
- 电化学检测
Abstract: Sulfamethazine was widely used to prevent or treat bacterial diseases in agricultural production such as livestock breeding and aquaculture. However, irrational use of sulfamethazine would lead to excessive residual amount in animal food, which would harm human health. Therefore, rapid and sensitive detection of sulfamethazine was of great significance for food safety and human health. In this work, a novel electrochemical method for the detection of sulfamethazine was constructed based on CRISPR/Cas12a coupled with spherical nucleic acid of gold nanoparticle core to realize rapid, highly sensitive and specific detection of sulfamethazine. The aptamer sequence of the target sulfamethazine was designed as the activator of CRISPR/Cas12a, and the specific binding of sulfamethazine to its aptamer sequence would inhibit the trans-cleavage activity of CRISPR/Cas12a, so that the substrate probe pre-modified on the surface of the gold electrode could be retained, and then the spherical nucleic acid could be introduced to trigger the hybridization chain reaction, producing significantly amplified electrochemical signal. To obtain the best analytical performance, several key conditions including the incubation time of sulfamethazine with aptamer, the concentration and cleavage time of CRISPR/Cas12a, the concentration and reaction time of hairpin probes were optimized, and the results were 30 min、120 nmol/L、30 min、1 µmol/L、100 min, respectively. Under the optimal conditions, the proposed electrochemical method exhibits prominent quantitative detection performance with the linear detection range of 0.006~600 ng/mL and the detection limit as low as 6 pg/mL. Meanwhile, the method shows good distinguishing ability between target antibiotic and other interfering antibiotics. In addition, the method was successfully applied to the detection of sulfamethazine in actual food samples with the recoveries ranging from 98.07%~106.90%, showing potential application value for food safety detection. -
作为一种典型的磺胺类抗生素药物，磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SMZ）被广泛用作饲料添加剂或兽药以预防或治疗细菌性疾病[1−2]。然而，过度使用甚至滥用会导致其在动物性食品中残留量超标，进而通过食物链富集效应对人体产生如严重毒性反应等多种不良影响[3−4]。目前，用于检测SMZ残留的分析技术主要有高效液相色谱法、质谱法、毛细管电泳法、免疫法等[5−8]。但是常规的检测手段通常对仪器要求较高，操作步骤繁琐，或检测灵敏度较低。因此，亟需建立新型检测方法以实现SMZ的简便快捷和灵敏检测。
由规律成簇的间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）及其相关蛋白（CRISPR-associated，Cas）组成的CRISPR/Cas系统作为基因组编辑的突破性工具而闻名[9]。近年来，因Cas蛋白具有顺式切割活性或反式切割活性等独特特性，CRISPR/Cas成为构建生物传感器的理想选择[10−11]。其中，高度进化的CRISPR/Cas12a作为RNA引导的核酸内切酶，可由特定双链DNA或单链DNA触发反式切割活性，非特异性裂解单链DNA[12−13]。可利用CRISPR/Cas12a的反式切割活性，结合相应的信号转化方案，将识别事件转化为可检测信号，从而构建生物传感策略[14−15]。鉴于其温和的反应条件、灵活性以及便捷性，CRISPR/Cas12a逐渐成为生物传感检测的有力工具。然而，在没有其他放大步骤的情况下，CRISPR/Cas12a介导的直接检测的灵敏度往往不够，因此，研究人员致力于将CRISPR/Cas12a系统结合核酸信号放大策略来提高传感器的检测灵敏度。
球形核酸（Spherical Nucleic Acid，SNA）是以有机或无机材料为核，定向排列的核酸为壳的一种具有3D纳米结构的新型生物分析工具[16−17]。与线性核酸相比，SNA因其表面偶联的寡核苷酸密度大且高度有序，受核酸酶降解影响较小，因而稳定性较好，SNA对游离互补核酸的结合能力也比线性核酸高[18−19]。此外，利用核酸之间的自组装，可以实现对SNA的尺寸、结构和表面性质的调控。球形核酸优异的特性为其在生物传感中的应用提供了有利条件。其中以金纳米颗粒（AuNPs）为核心构建的金核球形核酸引起了研究人员的广泛关注。金核球形核酸具有稳定性优异、可编程性强、比表面积大、导电性好、合成简单等优点，可用于构建电化学生物传感器以负载信号物质、加速电子传递或增加电活性表面积，从而提升检测性能[20−23]。另一方面，鉴于核酸探针严格的序列识别性能和灵活的可编程性[24−25]，基于核酸的信号放大技术得到了长足的发展。凭借灵活的设计和无酶高效的等温扩增效果，基于引发链诱发DNA指数扩增的杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction，HCR）已成为一种广泛采用的核酸信号放大策略。Miao等[26]设计了一种哑铃状DNA探针用于引发HCR，这种新型的HCR产生具有紧密构象的DNA纳米结构，有助于增强电化学响应，成功应用于细胞和人血清样本的分析。典型的HCR方法是线性反应，近年来研究人员不断开发一些改进类型的非线性HCR，以产生支链、树突状或网状DNA超结构实现信号放大[27]。Dong等[28]通过巧妙的设计触发链和两个发夹式探针，可以进行类网状杂HCR，与逆转录滚环扩增结合，从而实现双倍的信号放大，所构建的荧光传感平台可用于检测环状RNA，具有高灵敏性、抗干扰性和低背景信号等优点。
CRISPR/Cas12a偶联金核球形核酸在抗生素尤其是SMZ残留电化学检测中的应用还鲜有报道，本工作创新性设计CRISPR/Cas12a偶联金核球形核酸传感策略，构建了一种新型磺胺二甲嘧啶电化学检测方法，检测原理如图1所示。以靶标SMZ的适体链（Aptamer）作为CRISPR/Cas12a反式切割活性的激活链，当靶标SMZ存在时，SMZ与其适体序列特异性结合，导致适体链无法与Cas12a/crRNA二元复合物结合，Cas12a的反式切割活性被抑制，不能切割修饰于金电极表面的底物P2探针。被完整保留的P2探针通过与P1互补杂交在电极表面引入金核球形核酸（P1@AuNPs）。P1@AuNPs随后触发发夹探针H1和H2发生HCR反应，在AuNPs表面生成双链DNA纳米线，最终结合电化学活性物质亚甲基蓝（MB），产生显著的与SMZ浓度呈正相关的电化学信号。反之，在SMZ不存在的情况下，适体链与Cas12a/crRNA结合形成三元复合物，从而激发了Cas12a的反式切割活性，以催化切割修饰在电极表面的P2探针，导致无法引入P1@AuNPs及后续的HCR，故无电化学信号响应产生。本方法可实现对SMZ的快速、高灵敏和高特异性检测。本文将首先进行金核球形核酸（P1@AuNPs）的制备及表征，随后对CRISPR/Cas12a偶联金核球形核酸的SMZ检测体系进行原理验证，并优化关键检测条件，测定检测范围及检测限，考察灵敏度、特异性等检测性能，最后对检测方法在实际食品样本分析中的检测可靠性进行研究，阐明其潜在应用价值。
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图 1 基于CRISPR/Cas12a偶联金核球形核酸的磺胺二甲嘧啶检测原理示意图Figure 1. Schematic representation of the principle of SMZ detection based on CRISPR/Cas12a coupled with spherical nucleic acid with core of gold nanoparticle1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
柠檬酸钠（质量分数99%）、巯基己醇（MCH，体积分数97%）、氯化镁（MgCl2，质量分数98%）、三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP，质量分数98%）、亚铁氰化钾（质量分数99%）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris，质量分数99.5%） 北京百灵威科技有限公司；Fn Cas12a（Cpf1）、氯化钠（NaCl）、四氯金酸·三水合物（HAuCl4·3H2O，质量分数99.9%）、过硫酸铵（电泳级，≥98%）、氯化钾（KCl，质量分数99.5%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；SMZ（标准品）、10×TBE预混合粉末、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺（Acryl/Bis Solution，体积分数30%）、Parafilm膜 上海生工生物工程股份有限公司；RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor，10 kU）、DNA/RNA非变性上样缓冲液（DNA/RNA native loading buffer，10×）、TEMED、Gel red（10000×，1 mL） 上海碧云天生物技术股份有限公司；过氧化氢（H2O2，质量分数30%） 南京化学试剂股份有限公司；浓硫酸（质量分数98%）、无水乙醇（C2H5OH）、硫酸锌（ZnSO4） 分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；0.3、1.0 μm氧化铝粉 武汉高仕睿联科技有限公司；超纯水（>18.0 MΩ） 由Milli-Q纯化装置（Millipore公司，美国）制备；牛奶样品 购自当地超市；核酸探针 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体核酸序列如表1所示。
表 1 核酸序列Table 1. Sequences of nucleic acid名称 序列（5′→3′） Aptamer[5] TTAGCTTATGCGTTGGCCGGGATAAGGATCCAGCCGTTGTAGATTTGCGTTCTAACTCTC P1（本研究设计） SH-（CH2）6-GGAAGAGATGTAATCTTTCT P2（本研究设计） SH-（CH2）6-AGAAAGATTACATCTCT CrRNA（本研究设计） UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGAGUUAGAACGCAAAUCU H1（本研究设计） GATGTAATCTCTTTGGCTTTAGAAAGATTACATCTCTTCC H2（本研究设计） AAAGCCAAAGAGATTACATCGGAAGAGATGTAATCT TGL-18MS台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪实验室仪器有限公司；CHI 660E电化学工作站 上海辰华仪器有限公司；Bio-Rad凝胶电泳仪 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；FC-12DTD-22.5L超声波清洗机 南京禾创科学仪器有限公司；Shimadzu UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津制作所；MiniB-100金属浴、XWY涡旋仪 杭州米欧仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 金电极的预处理和修饰
金电极的预处理和修饰参考文献[29]的方法进行。将食人鱼溶液（:=3:1）滴于金电极表面5 min以去除电极表面的有机物，随后用超纯水重复洗涤多次。将金电极在氧化铝匀浆（1.0 µm和0.3 µm）中进行多次抛光，并用超纯水充分冲洗干净，使得金电极表面呈镜面状态。再依次将电极放入乙醇和超纯水中各超声清洗10 min，确保去除粘附在电极表面的氧化铝匀浆。再次在金电极表面滴水虎鱼溶液，滴泡5 min之后，用超纯水清洗。将金电极、饱和甘汞电极、铂电极均置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，构成三电极系统并采用循环伏安法扫描，进行电化学清洁。用超纯水冲洗电极，并用氮气吹干备用。
将预处理过的金电极浸入1 µmol/L P2探针溶液中（10 mmol/L Tris-HCl，含10 mmol/L TCEP，用于防止P2之间形成二硫键）并于37 ℃下孵育1 h。用超纯水冲洗电极以去除未结合的P2探针。将电极浸入0.1 mmol/L MCH溶液中于25 ℃下静置15 min，以防止非特异性吸附并促进电极表面DNA自组装单层的形成，最后用超纯水冲洗电极。
1.2.2 金核球形核酸（P1@AuNPs）的制备
AuNPs的合成和修饰参考文献[30]的方法并稍作修改。将40 mL HAuCl4（0.5 mmol/L）溶液加热煮沸，快速加入4 mL柠檬酸钠（19.4 mmol/L）并剧烈搅拌，1 min内溶液的颜色由浅黄色变为紫色，最后变成酒红色。继续加热并搅拌30 min，缓慢冷却至室温，即可获得AuNPs。将制备好的AuNPs溶液保存于4 ℃下，以备后续实验使用。
将100 µmol/L P1探针溶液（10 mmol/L Tris-HCl，含10 mmol/L TCEP）与制备好的AuNPs溶液于37 ℃下孵育2 h。向溶液中加入1% BSA并孵育30 min，以提高稳定性并降低非特异性吸附。分6次加入1 mol/L NaCl溶液进行老化处理。以10000 r/min的转速离心20 min，以去除游离的P1探针，收集沉淀并用10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（含100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，pH7.4）重悬，储存于4 ℃备用。
1.2.3 SMZ检测
将20 μL不同浓度的靶标SMZ与20 μL适体序列（1 μmol/L）于37 ℃孵育30 min，同时将120 nmol/L Cas12a与150 nmol/L crRNA、40 U RNA酶抑制剂混合孵育20 min以形成Cas12a/crRNA二元复合物，随后将上述两种溶液混合后于37 ℃下反应15 min，然后将修饰有P2探针的电极浸入上述混合溶液孵育30 min。用超纯水冲洗电极后，再将电极浸入50 μL P1@AuNPs于37 ℃孵育30 min。将500 nmol/L H1与500 nmol/L H2分别加热至95 ℃并保持5 min，然后逐渐冷却至室温1 h以形成发夹结构。将电极浸入H1和H2的混合溶液中，并于37 ℃反应100 min，以形成双链DNA纳米线。将电极浸入0.5 mmol/L MB溶液（50 μL）中孵育30 min，以引入信号分子MB输出电化学信号。
1.2.4 凝胶电泳分析
12% PAGE凝胶配制如下：6 mL Acryl/Bis（30%），110 μL 10%过硫酸铵，10 μL TEMED，3 mL 5×TBE，5.9 mL H2O，混合均匀。20 μL样品与2 μL loading buffer混合均匀。电泳在1×TBE缓冲液中进行，电压为120 V，电泳时间为50 min。电泳结束后用1×GelRed染色，最后通过凝胶成像系统成像。
1.2.5 牛奶样品预处理
牛奶样品预处理参考文献[31]的方法并适当改进。将5 mL牛奶于10 ℃下以10000 r/min转速离心10 min去除上层脂肪，随后添加亚铁氰化钾（150 µL，17.2%）和硫酸锌（150 µL，53.5%）沉淀蛋白质，并在15 ℃下以10000 r/min转速离心10 min，收集上清液，用0.22 μm滤膜过滤后用10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.4）稀释。将不同浓度的SMZ溶液加入处理好的牛奶样品中，采用所构建的电化学检测方法对SMZ进行测定。
1.2.6 电化学测量
所有电化学测量均使用电化学工作站在室温下进行，采用经典三电极系统，即工作电极为金电极，参比电极为饱和甘汞电极（SCE），对电极为铂电极。本工作采用的电化学分析方法有电化学阻抗法、循环伏安法（CV）、方波伏安法（SWV）和差分脉冲伏安法（DPV）。电化学阻抗法和CV测量在含1 mol/L KCl的5 mmol/L [Fe（CN）6]3−/4−溶液中进行，电化学阻抗测量的频率范围为0.1 Hz~10 kHz，偏置电位为0.265 V，振幅为5 mV；CV测量的扫描速率为100 mV s−1，扫描范围为−0.2~0.7 V。SWV和DPV测量在10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.4）中进行，SWV的扫描范围为−0.6~0 V，振幅为25 mV，频率为15 Hz；DPV的扫描范围为−0.45~−0.1 V，振幅为50 mV，脉宽为50 ms。
1.3 数据处理
每组实验平行测定3次，数据以平均值±标准差表示，采用Origin 2021软件绘图，采用Statistix 9.0进行显著性分析，LSD法检验组间差异显著性，显著性水平设置为P<0.01。
2. 结果与分析
2.1 AuNPs的修饰及表征
采用透射电子显微镜（TEM）和紫外-可见吸收光谱（UV-vis）对AuNPs的合成及修饰进行了表征。如图2A~图2C所示，AuNPs、P1@AuNPs和HCR-P1@AuNPs均显示出均一的球形形态，且分散性良好。紫外-可见吸收光谱测量结果如图2D所示，AuNPs在520 nm处显示出特征吸收峰，在修饰P1探针和发生HCR后，紫外-可见吸收光谱发生轻微红移，且在260 nm处出现核酸的特征吸收峰。以上结果证明了AuNPs的成功合成和修饰，以及HCR产物在AuNPs表面的生成。
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图 2 AuNPs的合成和修饰表征注：（A）~（C）TEM图像，（D）紫外-可见吸收光谱。Figure 2. Characterization of the synthesis and modification of AuNPs2.2 原理验证
首先，采用电化学交流阻抗法和循环伏安法（CV）考察电极表面电子传递特性变化。在靶标SMZ存在的情况下，测得电极经过逐步处理之后的电化学交流阻抗谱（EIS）如图3A所示。裸电极的EIS几乎呈现为一条直线（曲线a），仅代表扩散限制过程。经P2探针修饰后，EIS出现了一个明显的半圆（曲线b），表明电极表面DNA自组装单层的形成增加了电子传输阻力。MCH占位后，半圆直径进一步增大（曲线c）。与Cas12a/crRNA二元复合物孵育之后，半圆直径几乎没发生变化（曲线d），这是因为靶标与适体的特异性结合抑制了CRISPR/Cas12a的反式切割活性，使得电极表面的底物P2探针得以完整保留，电极表面电子转移阻力未发生明显变化。与P1@AuNPs反应后，半圆直径明显增大（曲线e），表明P1@AuNPs成功引入到电极表面，导致电子转移阻力增大。HCR发生后半圆直径显著增大（曲线f），表明大量DNA纳米线的产生。与EIS对应，电极经过逐步处理之后的CV测量结果如图3B所示。裸电极呈现出较高的氧化还原峰（曲线a），修饰P2后，自组装单层限制了电子转移，故氧化还原峰降低（曲线b），MCH占位后，氧化还原峰进一步降低（曲线c）。与Cas12a/crRNA二元复合物孵育之后，氧化还原峰几乎没发生变化（曲线d）。随后P1@AuNPs的引入导致峰值显著降低（曲线e），后续HCR产生的大量DNA双链纳米线使得氧化还原峰进一步降低（曲线f）。CV测量结果与EIS一致，表明靶标SMZ的存在抑制了CRISPR/Cas12a的切割活性，进而引入球形核酸和HCR信号放大。在靶标SMZ不存在的情况下，同样进行了EIS和CV测量。如图3C所示，裸电极的EIS为一条直线（曲线a），经P2探针修饰后，EIS呈半圆形曲线（曲线b），MCH占位后，半圆直径进一步增大（曲线c）。与Cas12a/crRNA孵育后，EIS的半圆半径明显变小（曲线d），这是因为适体链作为CRISPR/Cas12a的激活链，与Cas12a/crRNA形成Cas12a/crRNA/激活DNA三元复合物，发挥反式切割活性裂解电极表面修饰的P2探针，从而导致电极表面电子转移阻力变小。由于大量P2探针被裂解，与P1@AuNPs和发夹探针孵育后，半圆直径仅有略微增大（曲线e和f）。CV测量结果（图3D）与EIS保持一致，表明靶标SMZ不存在时，适体序列能够成功激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性，导致无法产生电化学信号响应。
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图 3 EIS和CV测量验证检测原理注：（A）靶标SMZ浓度为600 ng/mL时测得的EIS；（B）靶标SMZ浓度为600 ng/mL时测得的CV结果；（C）不存在靶标SMZ时测得的EIS；（D）不存在靶标SMZ时测得的CV结果；（a）裸电极；（b）P2探针修饰的电极；（c）MCH占位后的电极；（d）与Cas12a/crRNA孵育后的电极；（e）与P1@AuNPs孵育后的电极；（f）HCR反应后的电极。Figure 3. EIS and CV measurements to validate the detection principle其次，采用差分脉冲伏安法（DPV）和方波伏安法（SWV）验证了检测体系对靶标SMZ的响应。DPV测量结果如图4A所示，SMZ存在时产生的电流值相对于无SMZ时显著增大，这是因为SMZ与其适体的特异性结合抑制了CRISPR/Cas12a的活性，进而引入金核球形核酸及HCR产生信号放大；SWV的测量结果（图4B）与DPV测量结果高度一致，表明检测体系对靶标SMZ显示出良好的响应性。最后，为了进一步评估检测方法的可行性，进行了12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析。如图4C所示，Marker为20 bp DNA Ladder，泳道1显示出两条分别与适体链、底物P2探针相对应的特征条带，证实了在有靶标SMZ的情况下，SMZ与适体链的结合抑制了CRISPR/Cas12a对底物P2探针的切割。在泳道2中，底物P2探针对应的条带消失了，表明在无靶标SMZ存在的情况下，适体链与CRISPR/Cas12a结合并激活了其反式切割活性，进而对底物P2探针进行有效切割。在泳道3中，可以观察到长度大于500 bp的DNA产生的高亮条带，对应HCR产物—大量的DNA双链，证明P1探针成功触发了HCR的进行。
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图 4 检测方法的可行性验证结果注：（A）DPV验证检测体系对靶标SMZ的响应（实线：无SMZ，虚线：存在600 ng/mL SMZ）；（B）SWV验证检测体系对靶标SMZ的响应（实线：无SMZ，虚线：存在600 ng/mL SMZ）；（C）PAGE凝胶电泳验证检测方法的可行性，泳道1：SMZ+适体+Cas12a/crRNA+P2，泳道2：适体+Cas12a/crRNA+P2，泳道3：P1+H1+H2，M：Marker。Figure 4. Feasibility verification2.3 关键检测条件优化
为了获得最优检测性能，采用SWV对实验中的关键条件进行了优化。首先研究了靶标SMZ与适体的孵育时间对信号输出的影响。如图5A所示，电流峰值随孵育时间增加而增加，并在30 min基本达到平衡，故选择30 min作为最佳孵育时间。其次，由于CRISPR/Cas12a的作用与球形核酸和HCR的引入密切相关，因此优化了CRISPR/Cas12a的浓度和作用时间。如图5B所示，电流峰值在CRISPR/Cas12a浓度为120 nmol/L时达到最低值，因此选择120 nmol/L作为CRISPR/Cas12a发挥作用的最佳浓度。图5C显示了电流值随CRISPR/Cas12a切割时间的变化。随着切割时间的增加，电流值不断下降，在30 min时电流峰值最低，再延长时间电流值基本保持不变，表明30 min足够CRISPR/Cas12a完全切割电极表面的P2探针，故选择30 min作为CRISPR/Cas12a的最佳切割时间。最后，为了保证核酸探针H1和H2发生充分的互补杂交，考察了发夹探针H1和H2的浓度以及HCR反应时间对电化学信号输出的影响。如图5D所示，随着发夹探针的浓度从0.2 µmol/L增加至1.2 µmol/L，电流峰值不断增大，在1 µmol/L时达到平衡，因此选用1 µmol/L作为H1和H2的最佳浓度；随着反应时间从40 min延长至120 min，电流峰值不断增大，并在100 min时达到最大值，故选择100 min作为HCR的最佳反应时间。
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图 5 实验条件优化注：（A）电流峰值随靶标SMZ孵育时间的变化；（B）电流峰值随CRISPR/Cas12a浓度的变化；（C）电流峰值随CRISPR/Cas12a裂解时间的变化；（D）电流峰值随发夹探针浓度和反应时间的变化。Figure 5. Optimization of experimental conditions2.4 检测性能研究
在最佳实验条件下，对不同浓度的SMZ进行了定量检测。如图6所示，随着SMZ浓度的增加，电流峰值逐渐增大，在0.006~600 ng/mL范围内电流峰值与SMZ浓度对数呈线性关系，线性回归方程为I（μA）=4.619+1.460lgC（ng/mL），r2=0.997，检测限（Limit of Detection，LOD）低至6 pg/mL，显示出较高的灵敏度。将所构建的电化学检测方法与已报道的一些SMZ检测方法[32−38]进行比较，如表2所示，本方法显示出较低的LOD和较宽的线性范围，这归因于CRISPR/Cas12a协同金核球形核酸-HCR信号放大传感策略。此外，相较于高效液相色谱法、毛细管电泳法、免疫法等传统检测方法，本方法不需要复杂的样品前处理，使用化学试剂较少且不依赖昂贵仪器，成本低，简便高效。
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图 6 检测方法对SMZ的定量检测注：（A）不同浓度的靶标SMZ对应的SWV曲线，a~h：0、0.006、0.06、0.6、6、60、600、900 ng/mL；（B）电流峰值与SMZ浓度之间的关系，插图显示电流峰值与SMZ浓度对数的线性关系。Figure 6. Quantitative detection of target SMZ by the proposed method表 2 所建立的电化学检测方法与已报道的SMZ检测方法之间的比较Table 2. Comparison of the developed method and other reported methods for SMZ detection此外，为了研究所提出的电化学检测方法的特异性，进行了对照实验，比较在相同的实验条件下检测方法对不同抗生素产生的电化学信号。如图7所示，存在靶标SMZ时产生的电流峰值远高于存在其他抗生素时产生的电流峰值，且混合物中存在的干扰抗生素也不会影响检测体系对靶标SMZ的信号响应。这是因为SMZ与其适体的特异性结合能够抑制CRISPR/Cas12a的酶活性，进而引入金核球形核酸及HCR导致电化学信号的显著变化，而其他干扰抗生素不能与SMZ适体特异性结合，CRISPR/Cas12a酶活性的发挥导致无法引入金核球形核酸和后续的HCR，只产生类似背景信号的电流值。以上结果表明，所提出的检测方法能够准确区分SMZ和干扰物，对SMZ检测显示出高特异性。
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图 7 测量不同抗生素产生的电流值以考察检测方法的特异性注：空白：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.4），TET：四环素，KANA：卡那霉素，AMP：氨苄西林，CM：氯霉素，SDZ：磺胺嘧啶，SMZ：磺胺二甲嘧啶，混合物：TET，KANA，AMP，CM，SDZ和SMZ的混合溶液；所有抗生素的浓度均为600 ng/mL。Figure 7. Specificity investigation by measuring the electrochemical responses of the proposed method to different antibioticsSMZ作为一种广谱抗生素药物，广泛应用于动物疾病的预防和治疗。由于过量或滥用等不恰当的使用，致使食品样本中SMZ残留量较高，对人类健康造成潜在风险，因此检测食品中SMZ残留具有重要意义。使用所提出的检测方法测量了牛奶样品中的SMZ含量，以检验其在实际样品分析中的应用潜能。将SMZ标准品添加到牛奶样品中，制备了一系列SMZ浓度（10、100、1000、10000和100000 pg/mL），并通过所建立的检测方法回收测定牛奶样品中的SMZ。如表3所示，测得回收率在98.07%~106.90%之间，相对标准偏差（Relative standard deviations，RSDs）低于3.76%，表明所提出的检测方法具有潜在的实际应用价值。
表 3 所建立的电化学检测方法对牛奶样品中SMZ的检测结果Table 3. Results of SMZ detection in milk samples by using the developed method添加量
（pg/mL）检测量
（pg/mL）回收率
（%）相对标准偏差
（%）0 未检出 − − 10 10.53 105.30 3.76 100 106.90 106.90 3.75 1000 997.38 99.74 1.81 10000 10159.00 101.59 1.96 100000 98073.69 98.07 1.73 3. 结论
本工作基于CRISPR/Cas12a偶联金核球形核酸构建了一种新型SMZ电化学检测方法。CRISPR/Cas12a系统催化效率高，靶向精确，同时具有反应条件温和、灵活便捷等优点；金核球形核酸协同HCR显示出优异的信号放大效果，极大程度地提高了检测方法的灵敏度。与已有的一些SMZ检测方法相比，本方法操作简便、耗时少且不依赖昂贵仪器，实现了对SMZ的快速、高灵敏和高特异性检测。同时，所构建的检测方法在实际食品样本检测初步应用中表现出良好的检测性能，有望成为一种可靠的食品安全检测工具。本工作测定的实际食品样本相对较单一，后续研究工作需要选取多样化动物源性食品进行分析检测，综合评估检测方法的实用性。
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图 1 基于CRISPR/Cas12a偶联金核球形核酸的磺胺二甲嘧啶检测原理示意图
Figure 1. Schematic representation of the principle of SMZ detection based on CRISPR/Cas12a coupled with spherical nucleic acid with core of gold nanoparticle
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图 2 AuNPs的合成和修饰表征
注：（A）~（C）TEM图像，（D）紫外-可见吸收光谱。
Figure 2. Characterization of the synthesis and modification of AuNPs
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图 3 EIS和CV测量验证检测原理
注：（A）靶标SMZ浓度为600 ng/mL时测得的EIS；（B）靶标SMZ浓度为600 ng/mL时测得的CV结果；（C）不存在靶标SMZ时测得的EIS；（D）不存在靶标SMZ时测得的CV结果；（a）裸电极；（b）P2探针修饰的电极；（c）MCH占位后的电极；（d）与Cas12a/crRNA孵育后的电极；（e）与P1@AuNPs孵育后的电极；（f）HCR反应后的电极。
Figure 3. EIS and CV measurements to validate the detection principle
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图 4 检测方法的可行性验证结果
注：（A）DPV验证检测体系对靶标SMZ的响应（实线：无SMZ，虚线：存在600 ng/mL SMZ）；（B）SWV验证检测体系对靶标SMZ的响应（实线：无SMZ，虚线：存在600 ng/mL SMZ）；（C）PAGE凝胶电泳验证检测方法的可行性，泳道1：SMZ+适体+Cas12a/crRNA+P2，泳道2：适体+Cas12a/crRNA+P2，泳道3：P1+H1+H2，M：Marker。
Figure 4. Feasibility verification
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图 5 实验条件优化
注：（A）电流峰值随靶标SMZ孵育时间的变化；（B）电流峰值随CRISPR/Cas12a浓度的变化；（C）电流峰值随CRISPR/Cas12a裂解时间的变化；（D）电流峰值随发夹探针浓度和反应时间的变化。
Figure 5. Optimization of experimental conditions
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图 6 检测方法对SMZ的定量检测
注：（A）不同浓度的靶标SMZ对应的SWV曲线，a~h：0、0.006、0.06、0.6、6、60、600、900 ng/mL；（B）电流峰值与SMZ浓度之间的关系，插图显示电流峰值与SMZ浓度对数的线性关系。
Figure 6. Quantitative detection of target SMZ by the proposed method
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图 7 测量不同抗生素产生的电流值以考察检测方法的特异性
注：空白：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.4），TET：四环素，KANA：卡那霉素，AMP：氨苄西林，CM：氯霉素，SDZ：磺胺嘧啶，SMZ：磺胺二甲嘧啶，混合物：TET，KANA，AMP，CM，SDZ和SMZ的混合溶液；所有抗生素的浓度均为600 ng/mL。
Figure 7. Specificity investigation by measuring the electrochemical responses of the proposed method to different antibiotics
表 1 核酸序列
Table 1 Sequences of nucleic acid
名称 序列（5′→3′） Aptamer[5] TTAGCTTATGCGTTGGCCGGGATAAGGATCCAGCCGTTGTAGATTTGCGTTCTAACTCTC P1（本研究设计） SH-（CH2）6-GGAAGAGATGTAATCTTTCT P2（本研究设计） SH-（CH2）6-AGAAAGATTACATCTCT CrRNA（本研究设计） UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGAGUUAGAACGCAAAUCU H1（本研究设计） GATGTAATCTCTTTGGCTTTAGAAAGATTACATCTCTTCC H2（本研究设计） AAAGCCAAAGAGATTACATCGGAAGAGATGTAATCT 
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表 2 所建立的电化学检测方法与已报道的SMZ检测方法之间的比较
Table 2 Comparison of the developed method and other reported methods for SMZ detection
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表 3 所建立的电化学检测方法对牛奶样品中SMZ的检测结果
Table 3 Results of SMZ detection in milk samples by using the developed method
添加量
（pg/mL）检测量
（pg/mL）回收率
（%）相对标准偏差
（%）0 未检出 − − 10 10.53 105.30 3.76 100 106.90 106.90 3.75 1000 997.38 99.74 1.81 10000 10159.00 101.59 1.96 100000 98073.69 98.07 1.73
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