Effect of Exogenous Melatonin on Postharvest Storage Quality and Softening-Related Gene Expression of Prunus domestica
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摘要: 目的：探究外源褪黑素处理对采后西梅果实贮藏品质和相关代谢的影响。方法：该研究分别以60、120和240 μmol/L的褪黑素（melatonin，MT）处理“四川广安”西梅果实作为处理组，并以清水处理为对照组，观察西梅果实在常温（22±3 ℃，65%±5% RH）贮藏过程中的果实色度、失重率、可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量、可溶性蛋白含量、细胞膜通透性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量等贮藏品质及相关代谢的变化。结果表明：关于果实色度方面，不同MT处理组的L*和b*值相对于对照组均无明显的差异（P>0.05），而c*值在贮藏后期（9~12 d）具有明显差异（P<0.05），其中60和120 μmol/L MT处理组与对照组的差异最明显；关于贮藏品质方面，在贮藏中后期（6~12 d）不同MT处理组相对于对照组均显著抑制失重率的上升（P<0.05），其中60 μmol/L处理组效果最佳，同时不同MT处理组相对于对照组均可以有效抑制TSS含量的下降（P<0.05），其中240 μmol/L处理组效果最佳；关于西梅果实细胞膜结构方面，不同处理组相对于对照组均在贮藏中期（3~9 d）均可以有效抑制西梅果实细胞膜通透性和MDA含量的上升（P<0.05），其中60 μmol/L处理组效果最佳；关于西梅果实活性氧代谢方面，不同处理组相对于对照组均在贮藏后期（9~12 d）可以有效促进超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）酶活性上升的（P<0.05），其中60 μmol/L处理组效果最佳；关于软化相关代谢方面，相对于对照组，不同MT处理组均抑制多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、β-半乳糖苷酶（β-galaetosidase，β-Gal）和纤维素酶（cellulase，Cx）的活性和PdPG2、PdCx6和Pdβ-GAL3相对表达量的上升，同时有效维持Pd PME31的表达量，但只有60 μmol/LMT组与CK组之间存在显著性差异（P<0.05），而120和240 μmol/L MT处理组却无显著差异（P>0.05）。最后，经过主成分分析，发现60 μmol/LMT处理相对于120和240 μmol/L MT处理具有更好的保鲜效果。结论：外源MT处理一方面可有效调控软化相关酶活性及相关基因的表达量，延缓贮藏期间果实软化，另一方面促进抗氧化酶活性的上升，减轻活性氧对细胞膜结构的破坏，最终达到延缓采后西梅果实货架期的目的。研究结果为采后外源褪黑素在采后果蔬中的应用提供理论依据。Abstract: Objective:This study investigates the effects of exogenous melatonin treatment on the post-harvest quality and related metabolism of postharvest prune fruits. Methods: The "Sichuan Guang'an" prunes fruit with 60, 120 and 240 μmol/L melatonin (MT) were treated as the treatment groups, and water treatment was treated as the control group in this study.And the changes in storage quality and related metabolism of prunes fruit including color, weight loss rate, total soluble solid content (TSS), soluble protein content, cell membrane permeability and malondialdehyde (MDA) content were observed during room temperature (22±3 ℃, 65%±5% RH) storage. Results:The results showed that in terms of fruit color, there was no significant difference in L* and b* values between different MT treatment groups and the control group (P>0.05), while c* values showed significant differences in the later stage of storage (9~12 days) (P<0.05), with the 60 and 120 μmol/L MT treatment groups showing the most significant differences compared to the control group. In terms of storage quality, during the later stages of storage (6~12 days), the increase in weight loss rate was inhibited significantly in different MT treatment groups relative to the control group (P<0.05), with the 60 μmol/L treatment group showing the best effect. At the same time, different MT treatment groups were able to effectively inhibit the decrease in TSS content relative to the control group (P<0.05), with the 240 μmol/L treatment group showing the best effect.While the decrease in TSS content inhibited effectively in different MT treatment groups compared to the control group (P<0.05), with the 240 μmol/L treatment group showing the best effect. Regarding the cell membrane structure of prunes fruit, the increase of cell membrane permeability and MDA content were inhibited effectively in different treatment groups of prunes fruit during the mid storage period (3~9 days) compared to the control group (P<0.05), with the 60 μmol/L treatment group showing the best effect. Regarding the metabolism of reactive oxygen species in prunes fruit, different treatment groups were found to effectively promote the increase of superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) enzyme activities during the late storage period (9~12 days) compared to the control group (P<0.05), with the 60 μmol/L treatment group showing the best effect.Regarding softening related metabolism, compared to the control group, the activities of polygalacturonase (PG), β-galactosidase (β-Gal), and cellulase (Cx) were all inhibited in different MT treatment groups, as well as the relative expression increase in the expression levels of PdPG2, PdCx6 and Pd β-GAL3. And the expression level of Pd PME31 was effectively maintained, but there was only a significant difference between the 60 μmol/L MT group and the CK group (P<0.05), while there was a significant difference between the 120 and 240 μmol/L MT treatment groups (P>0.05). Finally, after principal component analysis, it was found that the 60 μmol/L MT treatment had better preservation effect compared to the 120 and 240 μmol/L MT treatments. Conclusion: Exogenous MT treatment can effectively regulate the activity of softening related enzymes and the expression levels of related genes, delaying fruit softening during storage. On the other hand, it promotes the increase of antioxidant enzyme activity, reduces the damage of reactive oxygen species to cell membrane structure, and ultimately achieves the goal of delaying the shelf life of post harvest plum fruit. The research results provide a theoretical basis for the application of exogenous melatonin in post-harvest fruits and vegetables.
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Keywords:
- prunes fruit /
- melatonin /
- storage quality /
- gene expression
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西梅又名欧洲李（Prunus domestica），原产于西亚和欧洲，近年来在中国的种植面积不断扩大。西梅果实椭圆，肉质细腻，风味浓郁，含有丰富的矿物质、抗氧化活性成分及膳食纤维，果肉鲜嫩多汁，果核小，可食率高达85%[1]，也是补充维生素A的最佳来源[2]。目前，鲜食西梅受到越来越多消费者的青睐，具有很好的市场前景。但西梅属于呼吸跃变型的果实，呼吸作用较强，后熟较快。采后如果贮藏不当，室温放置6 d左右，果实开始严重失水软化皱缩、损失率高达20%~30%[3]，严重影响了西梅果实的外观品质和营养成分，降低了果实的经济价值。由此可见，为保持西梅果实品质、延长贮藏期、提高经济价值，解决采后西梅贮藏保鲜问题十分重要。目前近冰温贮藏[4−5]、微环境气调[6]和高浓度二氧化碳等[7]均已被证明可以有效延缓采后西梅软化，并维持较好的贮藏品质，然而这些处理均对处理准确度具有较高要求，这增加了处理方法应用难度，因此寻找安全简单的处理方法显得尤为重要。
褪黑素（N-乙酰-5甲氧基色胺）是一种色氨酸衍生物，也是一种内源性植物生长调节剂[8]。目前，褪黑素作为一种高效安全的生物保鲜试剂，在果蔬采后贮藏保鲜中展现出巨大的应用潜能[9]。研究发现，褪黑素外源处理能抑制草莓的腐烂，延缓果实硬度和可溶性固形物质量分数的下降，并维持抗坏血酸含量[10]。袁瑞敏等[11]研究发现褪黑素处理有效缓解了沙果果实硬度的下降和失重率的上升，抑制了呼吸作用。王天菊等[12]研究发现外源褪黑素处理可以保持“红地球”葡萄果实的色泽和硬度，维持果实的水分和可溶性固形物含量，抑制果实MDA、PPO活性、POD活性升高，保持了细胞膜的完整性，其中100 μmol/L的褪黑素处理可以更好地延长“红地球”葡萄采后贮藏保鲜的时间和保持贮藏期间的品质。董小盼等[13]研究发现MT处理也可有效减缓桃果实采后硬度、TSS和VC含量的下降，维持采后良好的品质并降低发病率，同时延缓POD和PPO活性的降低。孙萌萌等[14]研究发现150 mg·L–1处理的蓝莓果实保鲜效果最佳，可保持果胶含量，抑制PG、PL、PME和β-GAL细胞壁降解酶活性，减少果胶去甲基化，抑制果胶相关酶活性延缓细胞壁多糖的降解。陈强等[15]研究发现200 μmol/L的褪黑素处理‘花姑娘’甜瓜可以有效延缓果实软化、重量损失，显著抑制CmPG1等结构基因的表达，通过抑制果实软化相关基因的表达，延长果实的货架期。Liu等[16]表明，外源褪黑素处理可以调控梨果实蔗糖的基因，使可溶性糖和还原性糖的含量增加，维持相关酶的活性，保持单果重量。然而，目前尚缺乏外源褪黑素处理对采后西梅室温贮藏品质和相关软化基因表达影响的研究，因此，研究外源褪黑素和西梅果实软化生理指标之间的联系，探究外源褪黑素对西梅果实软化基因的影响，以及各种指标之间的相关性，确定适宜的处理浓度，对延长西梅贮藏时间和保持采后品质具有重要意义。
因此，该研究分别以60、120和240 μmol/L的MT处理“四川广安”西梅果实作为处理组，并以清水处理为对照组，观察西梅果实在常温（22±3 ℃，65%±5% RH）贮藏过程中的贮藏品质及软化相关基因表达的变化，以期为MT在采后果蔬的应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
西梅 采自四川广安现代农业园区（北纬30°01′-30°52′，东经105°56′-107°19′），9成成熟度，运至实验室后，挑选果形圆润，没有病虫害，没有机械损伤，作为本实验材料；三氯乙酸、乙酸、氮蓝四唑、磷酸二氢钠 分析纯，天津市华盛化学试剂有限公司；多聚半乳糖醛酸、水杨苷、EDTA-2Na 分析纯，无锡市亚泰联合化工有限公司；愈创木酚、H2O2、邻苯二酚、磷酸氢二钠 分析纯，深圳市勋业化学试剂有限公司；盐酸、酒石酸钾钠、蛋氨酸 分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；氢氧化钠、核黄素 分析纯，广东翁江化学试剂有限公司；硫代巴比妥酸、乙酸钠、羧甲基纤维素钠 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；施保功 工业纯，苏州市富美实植物保护试剂有限公司；植物RNA提取试剂盒、植物反转录提取试剂盒、PCR Mix（含SYBR荧光染料） 北京华越洋生物有限公司；PdPG2、PdCx6、Pdβ-GAL3和Pd PME31基因的引物设计 上海生工。
NR10QC色差仪 广东三恩时智能科技有限公司；HB-114ATC糖度计 郑州市南北仪器有限公司；Uv2802紫外可见分光光度计 上海尤尼柯公司；Dds307电导率仪 北京得利特公司；D1008e微量离心机 赛洛捷克公司；PCR仪 上海爱仪通公司；ViiA 7实时荧光定量PCR仪 美国赛默飞公司。
1.2 实验方法
1.2.1 分组及处理
将实验所用西梅先用清水洗净晾干，然后用取购买的施保功2 g，用2000 mL蒸馏水溶解，将西梅放在里面浸泡5 min，清除果实表面可能附着的霉菌和虫卵，清水清洗后取出室温晾干。分组处理：对照组（CK）：放在清水里浸泡5 min；处理组（MT）：参考乔沛[17]研究中对采后荔枝采用的褪黑素浓度，并稍作修改，分别采用60、120、240 μmol/L MT的溶液浸泡5 min；每组处理100个左右果实，晾干后放在常温下贮藏。在0、3、6、9和12 d取样测定各个组的相关生理指标（色度、失重率、可溶性固形物和细胞膜通透性），同时每次取样时取6个西梅果实果肉，液氮速冻后置于-80 ℃贮藏，可溶性蛋白含量、丙二醛含量、酶活及基因表达等指标测定前先利用液氮研磨成粉以便于后续实验的开展。
1.2.2 色泽测定
参考潘家丽的方法[18]，取样当天采用色差仪测定果皮的颜色，测定记录L*、a*、b*和c*值。每个处理三个重复，每个重复6个果实，依次在果实赤道处随机等距测定三个点。
1.2.3 失重率测定
参照许俊齐[19]的测定方法，取样当天测定西梅果实0 d的质量（m1）与每隔3 d后的质量（m2）。
失重率(%)=m1−m2m1×100 (1) 1.2.4 可溶性固形物（TSS）测定
参考帅良等[20]人的方法。取样当天每组处理取6个西梅果实，去皮后用破壁机打成匀浆状，用纱布过滤备用。吸取3 mL果汁置于4.5 mL离心管中，于室温12000 r/min条件下离心5 min，取上清液，用糖度计测定其TSS，单位以%表示。
1.2.5 可溶性蛋白测定
参考陈亚婷等[21]人的方法并修改，称取2 g果实粉末，加入5 mL蒸馏水充分振荡，4 ℃、8000 r/min条件下离心20 min，上清液为可溶性蛋白酶液，低温保存备用。移取1 mL上清液于试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，混匀静止2 min后，在595 nm处测定吸光度值，重复三次，以每克鲜重所含可溶性蛋白质的质量表示，即mg/g。
1.2.6 细胞膜通透性测定
参考李静等[22]的方法，取样当天用打孔器取直径为8 mm的相同大小的圆形果皮，取6片放入50 mL螺口离心管中，先用去离子水清洗三次后，加入去离子水20 mL，室温放在摇床上振荡1 h，用电导仪测定电导率A1，接着将含有圆形果皮的离心管沸水浴中煮沸20 min，降至室温后测定电导率A2。
相对导电率(%)=A1A2×100 (2) 1.2.7 丙二醛（MDA）含量测定
MDA含量测定参考殷菲胧[23]的方法，采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法。称取西梅果实粉末2 g置于50 mL预冷的离心管中，然后用移液管移取10 mL预冷的10%三氯乙酸（TCA）溶液，一同加入到预冷的50 mL离心管中，漩涡振荡30 s，冰水浴静止提取10 min后，常温4000 r/min条件下离心40 min。加入2 mL的0.6% TBA溶液，然后在沸水浴中煮沸20 min，取出后冷却至室温后，于4000 r/min条件下离心10 min，取上清液，以0.6% TBA溶液为空白，分别测量其在450、532和600 nm处的吸光度，MDA含量以μmol/g为单位。
MDA含量(μmol/g)=[6.45×(OD532−OD600)−0.56×OD450]×VVs×m×1000 (3) 式中：V代表提取液总体积，mL；Vs代表测定时所取样品提取液总体积，mL；m代表样品质量，g。
1.2.8 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
SOD活性的测定参考曹建康的方法[24]，采用氮蓝四唑（NBT）光还原反应的方法。称取2 g西梅果实粉末置于预冷的50 mL离心管，然后加入10 mL 0.1 mol/L，pH=7.8的磷酸缓冲溶液，振荡1 min，冰浴条件下静置提取10 min，取出于常温，4000 r/min条件下离心40 min，上清液即为酶液，备用。
每组处理取1支空白管，1支对照管和3支样品管，3 mL反应体系包含1.5 mL的50 mmol/L磷酸缓冲溶液（PBS）、0.3 mL 100 μmol/L EDTA-2Na溶液、0.3 mL 750 μmol/L NBT溶液、0.3 mL 130 mmol/L蛋氨酸溶液、0.05 mL酶液和0.25 mL蒸馏水，再加入0.3 mL 20 μmol/L核黄素溶液，振荡均匀后立即将空白管放入避光处，将对照管和样品管放在阳光下光照反应20 min，随后置于避光处终止反应，测定各管在560 nm处的吸光度，一个SOD活性单位以每分钟每克样品抑制NBT光化还原的50%表示。
1.2.9 过氧化物酶（POD）活性测定
过氧化物酶（POD）活性的测定参考朱广廉[25]的方法，采用愈创木酚法。粗酶液提取：方法同1.2.8。3 mL反应体系含有1 mL 0.3% H2O2，0.95 mL 0.2%愈创木酚溶液，1 mL pH7.0 PBS，加入50 μL酶液后立即启动反应，记录470 nm处吸光度降低速度。将每分钟的吸光度A470增加0.01定义为一个酶活性单位。
1.2.10 多酚氧化酶（PPO）活性测定
多酚氧化酶（PPO）活性的测定，采用邹朋[26]的方法。粗酶液提取：方法同1.2.8。向试管中加入8 mL 0.2%邻苯二酚和2 mL粗酶液，振荡均匀，立即在30 ℃水浴条件下反应10 min，之后测量420 nm处吸光度，以每克鲜重每分钟吸光值增加1为一个PPO活性单位（U）。
1.2.11 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性测定
参考杨宏顺[27]的方法对西梅果实粉末进行酶液提取。将0.5 mL酶液和煮沸5 min的0.5 mL酶液分别置于带有刻度的25 mL具塞试管中，加入1 mL 50 mmol/L、pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液和0.5 mL多聚半乳糖醛酸溶液，再37 ℃水浴条件下水浴1 h，加入1.5 mL还原糖含量测定试剂（DNS），然后煮沸5 min，迅速冷却至室温，之后用蒸馏水加至25 mL，混匀，于540 nm处测定其吸光度。以每小时每克果蔬组织样品在37 ℃催化多聚半乳糖醛酸水解成半乳糖醛酸的质量表示PG活性，即µg·h−1·g−1 FW。
1.2.12 纤维素酶（Cx）活性测定
参考刘程惠[28]的方法对西梅果实粉末进行酶液提取。分别取0.5 mL酶液和煮沸5 min的0.5 mL酶液分别置于25 mL具塞刻度试管中，加入1.5 mL 10 g/L羧甲基纤维素钠（CMC）溶液，余下操作同PG活性测定。以每小时每克果蔬组织样品在37℃催化CMC水解成还原糖的质量表示Cx活性，即µg·h−1·g−1 FW。
1.2.13 β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性测定
参考刘程惠[28]的方法对西梅果实粉末进行酶液提取。分别取0.5 mL酶液和煮沸5 min的0.5 mL酶液于分别置于25 mL具塞刻度试管中，加入1.5 mL10 g/L水杨苷溶液，余下操作同PG活性测定。以每小时每克果蔬组织样品在37 ℃催化水杨苷水解成葡萄糖的质量表示β-GAL活性，即µg·h−1·g−1 FW。
1.2.14 相关基因差异性表达
先利用液氮将西梅果实研磨成粉，采用植物RNA提取试剂盒提取西梅果实RNA，利用植物反转录提取试剂盒将RNA反转录为cDNA片段备用，NCBI检录搜索和论文查阅西梅相关基因[25]，通过上海生工公司设计制作引物。采用20 μL反应体系，包含10 µL PCR Mix、1 µL正向引物、1 µL反向引物、1 µL cDNA片段和7 µL RNase-Free Water。设置反应条件：95 ℃预变性90 s；95 ℃变性30 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，进行40个循环。所有RT-qPCR试验均设置3个生物学重复，平行测定三次，以PdActin作为内参基因并按照2−△△Ct 法计算基因的相对表达。
表 1 RT-qPCR引物Table 1. RT-qPCR primers基因名称 正向引物（5′-3′） 反向引物（5′-3′） PdActin AGCCAGAATGGGGCACAA GCCACGCAAAGTAACCAAGA PdPG2 GCTTGGGAGAAGACAACGCA ACTTGAACTGCCGACCTCTG PdCx6 AGAGGTGGGAGATGGGAACA AGTGGCGGAAGACAATGGAG Pdβ-GAL3 ATGGGCAAGGGTCAAGTATGG AGCGTTTGGGTGGTGTTCTT PdPME31 ACCAGGCTTCTCGTGTGATT TCAAAGGTGATGTTCTCGGC 1.3 数据处理
实验数据为3次重复试验的平均值，结果以平均值±标准差表示。实验所测得的数据使用Excel 2019、SPSS 19.0、Origin 2018软件进行分析制图。
2. 结果与分析
2.1 贮藏期间品质变化
2.1.1 表观和色泽变化
果实表观是反应采后果蔬贮藏品质和货架期最直观的指标。如图1A可知，对照组的西梅果实在贮藏6 d发生了果皮皱缩，12 d果皮皱缩尤为明显，而不同浓度的MT处理均可以抑制果皮皱缩的发生，其中60 μmol/L MT处理组在贮藏12 d表观品质最好，这说明MT处理可有效延缓采后西梅的货架期。
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采后果实在贮藏期间，色度的各项指标也会发生变化，故可以通过色度指标评价果实的成熟程度[29]。如图1B所示，不同处理组西梅果实的L*均呈现逐渐下降的趋势，其中CK组L*下降最为迅速，12 d的L*达到27.84%±0.62%。与CK组相比，不同浓度的MT处理在贮藏12 d时均可以抑制L*下降，但无显著差异（P>0.05），此时60、120和240 μmol/L MT的L*分别为CK组的105.91%、110.11%和106.43%，但差异均不明显（P>0.05）。
如图1C所示，整个贮藏期间，CK组和MT处理组的a*值均呈现先上升趋势，西梅果实随着贮藏时间增加而变红，且MT处理组的a*值均小于CK组，其中60 μmol/L MT处理组显著（P<0.05）低于CK组。12 d时，CK、60、120、240 μmol/L MT的a*值分别为15.56、10.32、14.52、14.02，60 μmol/L MT处理组显著（P<0.05）低于其他3组。
如图1D所示，CK组和MT处理组的b*值均呈现下降趋势，在6~12 d时，60 μmol/L MT和120 μmol/L MT处理组的b*值均大于CK组，表明MT处理组可以延缓西梅果实成熟由黄变红进程，但不存在显著性差异（P>0.05）。
如图1E所示，贮藏前期（0~3 d）CK组、60和240 μmol/L MT组的c*值（色彩度）呈上升趋势，6~12 d时呈下降趋势。在贮藏9 d和12 d时，60和120 μmol/L MT处理组均显著高于CK组（P<0.05），而240 μmol/L MT组与CK组无显著差异（P>0.05），这表明，60和120 μmol/L MT处理采后西梅果实，可有效维持贮藏期内西梅果实的色泽，但两者之间无显著差异（P>0.05），因此，基于成本考虑，60 μmol/L MT处理组效果较优。
2.1.2 失重率、TSS和可溶性蛋白的变化
果实失重率是采后果实内容物消耗速率的重要指标之一[30]。如图2A所示，随着贮藏时间的延长，CK组和MT处理组的西梅失重率均不断上升，CK组由0升至12 d的35.30%，60 μmol/L MT处理组由0升至12 d的25.36%，120 μmol/L MT处理组由0升至12 d的31.17%，240 μmol/L MT处理组由0升至12 d的30.59%，其中3~12 d 不同MT处理组的失重率显著低于对照组（P<0.05）。整个贮藏期间，60 μmol/L MT处理组的西梅失重率均显著低于其它3组（P<0.05）。结果表明外源褪黑素处理可有效维持西梅贮藏期间的果实重量，其中60 μmol/L MT处理组效果较优。
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图 2 西梅贮藏期间失重率（A）、TSS（B）和可溶性蛋白（C）变化Figure 2. Changes in weight loss rate(A),TSS (B) and soluble protein content (C) of prune during storageTSS含量受果实的成熟度影响[31]。如图2B所示，CK组和不同MT处理组的西梅果实TSS含量整体上均呈下降趋势。然而整个贮藏期内，MT处理组的西梅果实TSS含量均显著高于CK组（P<0.05）。结果表明外源褪黑素处理可以有效保持西梅贮藏期间TSS含量。
可溶性蛋白是重要的渗透调节物质和营养物质[32]。如图2C所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组的西梅果实可溶性蛋白含量均呈先上升后下降趋势，且在9 d时达到峰值，此时60 μmol/L MT处理组西梅果实可溶性蛋白含量约为0.08 mg/g，显著高于其它3组（P<0.05）。贮藏末期12 d时，60 μmol/L MT处理组西梅果实可溶性蛋白含量比CK组、120和240 μmol/L MT处理组高16.83%、12.78%、18.93%，并具有显著性（P<0.05）。由此可知，外源MT处理可有效维持西梅贮藏期间可溶性蛋白含量，其中60 μmol/L MT处理效果最优。
2.1.3 细胞膜通透性和丙二醛含量的变化
果实的衰老与细胞膜结构有着密不可分的关系，当细胞膜结构的完整性和细胞膜的功能性因果实衰老受到损伤时，组织细胞膜的相对导电率也会增加，膜脂过氧化产物丙二醛含量也会上升[33]。如图3A所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组的西梅细胞膜通透性均呈上升趋势，期间CK组始终高于MT组，但只有60 μmol/L MT处理组显著低于CK组（P<0.05）并低于其他MT组。在12 d时，60 μmol/L MT处理组分别低于CK组、120和240 μmol/L MT处理组14.14%、9.98%和11.07%，并具有显著性（P<0.05）。在西梅果实贮藏期内，外源褪黑素处理可以有效延缓西梅的细胞膜通透性，其中60 μmol/L MT处理效果最佳。
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图 3 西梅贮藏期间细胞膜通透性（A）与丙二醛（B）含量变化Figure 3. Changes in membrane permeability (A) and malondialdehyde content (B) during storage of prune fruit如图3B所示，整个贮藏期间，CK组和MT处理组的西梅MDA含量均呈上升趋势。贮藏末期12 d时，CK组的西梅MDA含量升至24.38 μmol/g，显著高于所有MT处理组（P<0.05）。3~12 d内，60 μmol/L MT处理组的西梅MDA含量始终显著低于CK组（P<0.05）。在西梅果实贮藏期间，外源褪黑素处理可以有效降低西梅果实的MDA含量，其中60 μmol/L MT处理效果最佳。
综上，外源褪黑素处理可有效延缓采后西梅贮藏品质的降低，其中60 μmol/L MT处理组具有最好的效果。
2.2 贮藏期间酶活变化
果实的硬度、果胶含量、原生细胞壁的完整性以及细胞中间层结构时刻影响着果实的衰老软化进程，参与这些变化过程的酶主要有果胶甲酯酶（PME）、SOD[34]、POD[35]、PPO[36]、PG[37]、Cx[38]和β-GAL等[39]。如图4A所示，整个贮藏期内，西梅果实SOD活性均呈上升趋势，MT处理组均高于CK组，其中60 μmol/LMT处理组显著高于CK组（P<0.05）。12 d时，60 μmol/L MT处理组的西梅果实SOD活性分别高于CK组、120和240 μmol/L MT处理组26.61%、11.90%和10.84%，并具有显著性差异（P<0.05）。
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图 4 西梅贮藏期间SOD （A）、POD （B）、PPO （C）、PG （D）、Cx （E）和β-GAL （F）酶活变化Figure 4. Changes in SOD SOD (A), POD (B), PPO (C), PG (D), Cx (E) and β-GAL (F) enzyme activity during storage of prune如图4B所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组的西梅果实POD活性均呈先上升后下降趋势，MT处理组均高于CK组，其中60 μmol/LMT处理组显著高于CK组（P<0.05）。3 d时，CK组、60和240 μmol/L MT处理组的西梅果实POD活性到达峰值，其中60 μmol/LMT处理组西梅果实POD活性是CK组的1.38倍（P<0.05）。贮藏结束（12 d）时，60、120和240 μmol/LMT处理组的西梅果实POD活性分别是CK组的2.01倍、1.95倍和1.92倍，并具有显著性差异（P<0.05）。
如图4C所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组的西梅果实PPO活性均呈先上升后下降趋势，MT处理组始终低于CK组，其中CK组和120 μmol/L MT处理组在6 d时达到峰值，60和240 μmol/L MT处理组在9 d时达到峰值。贮藏中期（3~9 d）时，CK组的西梅果实PPO活性高于60和240 μmol/L MT处理组。贮藏结束时，各组之间的西梅果实PPO活性无显著性差异（P>0.05）。
如图4D所示，CK组和MT处理组的西梅果实的PG活性在整个贮藏期内呈先上升后下降趋势，均在9 d时达到峰值，此时CK组的PG活性为6260.53 µg·h−1·g−1·FW，显著高于（P<0.05）60、120和240 μmol/L MT处理组的5058.46、5553.74和5491.83 µg·h−1·g−1·FW，同时60 μmol/LMT处理组显著低于120和240 μmol/L MT处理组（P<0.05）。另外贮藏期（3~12d）内，只有60 μmol/LMT处理组的西梅果实PG活性显著低于CK组（P<0.05）。
如图4E所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组的西梅果实的Cx活性呈先上升后下降趋势，其中CK组和60 μmol/L MT处理组在3 d时到达峰值，120 μmol/L MT处理组在6 d时达到峰值，240 μmol/L MT在9 d时到达峰值。贮藏后期（9~12 d），60 μmol/L MT处理组的西梅果实Cx活性显著低于其它3组（P<0.05）；12 d时，60 μmol/L MT处理组的西梅果实Cx活性分别低于CK组、120和240 μmol/L MT处理组19.97%、13.18%和18.56%，并具有显著性差异（P<0.05）。
如图4F所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组的西梅果实的β-GAL活性呈先上升后下降趋势，其中CK组在3 d时达到峰值，120和240 μmol/L MT处理组在6 d时达到峰值，60 μmol/L MT处理组在9 d时达到峰值。贮藏前期（3~6 d），60 μmol/L MT处理组的β-GAL活性显著低于CK组（P<0.05）；3 d时，CK组的β-GAL活性分别是60、120和240 μmol/L MT处理组的1.17倍、1.13倍和1.12倍，并具有显著性差异（P<0.05）。
综上，外源褪黑素处理可有效延缓采后西梅衰老软化相关酶活性的上升，其中60 μmol/L MT抑制效果最为显著（P<0.05）。
2.3 贮藏期间相关基因表达量的变化
如图5A所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组西梅果实的PdPG2表达量呈先上升后下降趋势，60 μmol/L MT处理组在6 d时达到峰值，其它3组在9 d时达到峰值；其中CK组PdPG2表达量的峰值是60 μmol/L MT处理组的1.43倍。贮藏后期（9~12 d），60 μmol/L MT处理组西梅果实的PdPG2表达量显著低于其它3组（P<0.05）；12 d时，CK组、120和240 μmol/L MT处理组的PdPG2表达量是60 μmol/L MT处理组的1.38倍、1.17倍和1.32倍，并具有显著性差异（P<0.05）。
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图 5 贮藏期间西梅果实中PdPG2 （A）、PdCx6（B）、Pdβ-GAL3（D）和PdPME31（E）表达量的变化Figure 5. Changes of PdPG2 (A)、PdCx6 (B)、Pdβ-GAL3 (D) and Pd PME31(E) expression during storage of prune fruit如图5B所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组西梅果实的PdCx6表达量均呈先上升后下降趋势，且均在3 d时到达峰值，此时CK组分别高于60、120和240 μmol/L MT处理组17.52%、13.41%和8.54%，并具有显著性差异（P<0.05）。贮藏期内（3~12 d），60 μmol/L MT处理组西梅果实的PdCx6表达量始终显著低于CK组（P<0.05）。
如图5C所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组西梅果实的Pdβ-GAL3表达量呈先上升后下降趋势，且均在3 d时到达峰值，此时60 μmol/L MT处理组分别低于CK组和240 μmol/L MT处理组17.12%和14.02%，并具有显著性差异（P<0.05）。贮藏期内（3~12 d），60 μmol/L MT处理组西梅果实的Pdβ-GAL3表达量始终显著低于CK组（P<0.05）。
如图5D所示，整个贮藏期内，CK组和MT处理组西梅果实的PdPME31表达量均呈下跌趋势。3 d时，60、120和240 μmol/L MT处理组的PdPME31表达量依次是CK组的1.8倍、1.74倍和1.71倍，并具有显著性差异（P<0.05）；贮藏中期（3~12 d），60 μmol/L MT处理组西梅果实的PdPME31表达量始终显著低于CK组（P<0.05）。
综上，外源褪黑素处理可以在一定程度上调控采后西梅果实衰老软化基因的表达量，其中60 μmol/L MT处理组效果最优。
2.4 各指标相关性分析
对西梅果实整个贮藏期间贮藏品质、酶活性和相关基因表达进行Pearson相关分析如图6所示。贮藏品质中，色度指标中的L*、b*和c*与POD酶活、TSS和PdPME31表达量呈不同程度的显著性正相关，色度指标中的L*、b*和c*与贮藏品质指标和酶活性呈不同程度的负相关；a*值仅与PdPME31表达量呈极显著性负相关（P<0.01）；失重率与TSS和PdPME31表达量呈极显著性负相关（P<0.01），与酶活性（除POD外）呈不同程度的正相关；TSS与L*、b*、c*和POD酶活性和PdPME31表达量呈极显著性正相关（P<0.01）；可溶性蛋白、细胞膜通透性和MDA之间互相呈极显著性正相关（P<0.01），并且同时与酶活性（除POD外）呈不同程度的正相关。酶活性之间，SOD酶活性与PPO和PG酶活性呈极显著正相关（P<0.01），与β-GAL呈显著性相关（P<0.05）；POD酶活性仅与Cx呈相关，但不显著（P>0.05）；PPO酶活性也与PG和β-GAL酶活性呈极显著性正相关（P<0.01）；Cx酶活性仅与β-GAL酶活性呈极显著性正相关（P<0.01）。此外，PG酶活与PdPG2表达量呈极显著性正相关（P<0.01），Cx酶活与PdCx6 表达量呈极显著性正相关（P<0.01），β-GAL酶活与Pdβ-GAL表达量呈极显著性正相关（P<0.01）；PdPME31表达量与L*、b*、c*、POD酶活性和TSS呈不同程度的正相关，与其他所有指标呈不同程度的负相关。
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图 6 贮藏期间西梅果实各指标间的相关性分析注：图中*为P<0.05，**为P<0.01，红色为正相关，蓝色为负相关。Figure 6. Correlation analysis among indexes during storage of prune fruit2.5 主成分分析
对西梅贮藏过程中贮藏品质及软化相关基因表达指标数据标准化处理之后进行主成分分析，第1、2和3主成分特征值分别为11.547、3.77和1.544，第1、2和3主成分贡献率分别为60.771%、19.844%和8.126 %，前3个主成分特征值均大于1且累积贡献率达到88.741%，可见前3个主成分可以说明西梅贮藏过程中贮藏品质及软化相关基因表达有关数据的变化趋势，完全符合主成分分析的基本要求，因此取前3个主成分进行数据分析。用3个变量Y1、Y2和Y3代替原来的19个指标，得出线性组合为（其中Z1~Z19均为标准化变量，且依次代表L*、a*、b*、c*、失重率、TSS含量、可溶性蛋白含量、细胞膜通透性、MDA含量、SOD酶活性、POD酶活性、PPO酶活性、PG酶活性、Cx酶活性、β-GAL酶活性、PdPG2基因相对表达含量、PdCx6基因相对表达含量、Pdβ-GAL3基因相对表达含量和PdPME31基因相对表达含量）：
FAC1-1=−0.083Z1+0.06Z2−0.079Z3−0.067Z4+0.086Z5−0.066Z6+0.085Z7+0.079Z8+0.077Z9+0.073Z10−0.038Z11+0.077Z12+0.08Z13+0.028Z14+0.053Z15+0.071Z116+0.008Z17+0.005Z18−0.081Z19
FAC2-1=0.055Z1+0.031Z2+0.07Z3+0.107Z4−0.009Z5+0.055Z6−0.027Z7+0.076Z8−0.08Z9+0.012Z10+0.164Z11+0.002Z12−0.013Z13+0.213Z14+0.166Z15+0.062Z116+0.242Z17+0.247Z18−0.067Z19
FAC3-1=−0.086Z1+0.423Z2−0.095Z3+0.174Z4+0.005Z5+0.286Z6−0.035Z7+0.054Z8−0.088Z9+0.28Z10+0.38Z11−0.121Z12+0.06Z13−0.188Z14−0.118Z15+0.024Z116−0.166Z17−0.078Z18−0.063Z19
主成分得分Y=FAC1-1×0.60771+FAC2-1×0.19884+FAC3-1×0.08126
由图7A可知，a*、失重率、可溶性蛋白含量、细胞膜通透性、MDA含量、SOD酶活性、PPO酶活性、PG酶活性和PdPG2基因相对表达含量聚集在PC1（60.771%）正轴上，L*、b*、c*和TSS含量在PC1（60.771%）负轴上，表明PC1（60.771%）越大，a*、失重率、可溶性蛋白含量、细胞膜通透性、MDA含量、SOD酶活性、PPO酶活性、PG酶活性和PdPG2基因相对表达含量越高，而L*、b*、c*和TSS含量越小，故定义PC1为贮藏品质指标；同时Cx酶活性、PdCx6基因相对表达含量和Pdβ-GAL3基因相对表达含量聚集在PC2（19.844%）正轴上，表明PC2（19.844%）越高，Cx酶活性、PdCx6基因相对表达含量和Pdβ-GAL3基因相对表达含量越高，故定义PC2为软化代谢相关指标。没有指标聚集在PC3（10.202%）两端，因此随后不对因子得分图中PC3（8.126%）的变化做过多的分析。
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图 7 主成分分析因子载荷图（A）、因子得分分布图（B）、因子得分总分图（C）Figure 7. Principal component analysis factor load diagram (A), factor score distribution diagram (B), factor score total score diagram (C)由图7B可知，不同处理组变化趋势既有相似处又有明显差异，相似是之处是整体均由PC1（60.771%）负轴变化至PC1（60.771%）正轴，结合因子载荷图来看，这伴随着a*、失重率、可溶性蛋白含量、细胞膜通透性、MDA含量、SOD酶活性、PPO酶活性、PG酶活性和PdPG2基因相对表达含量的升高和L*、b*、c*和TSS含量的下降。这表明，在常温贮藏下，L*、b*、c*和TSS含量均会逐渐下降而a*、失重率、可溶性蛋白含量、细胞膜通透性、MDA含量、SOD酶活性、PPO酶活性、PG酶活性和PdPG2基因相对表达含量逐渐上升，MT处理不会改变其变化趋势；明显差异首先表现在由PC1（60.771%）负轴变化至PC1（60.771%）正轴的变化速率以及程度，由因子得分图可以明显发现，相对CK组，不同浓度的MT处理明显抑制了该变化，其中60 μmol/L MT处理组的效果最为明显。同样由图7C可知，不同处理组的因子得分均呈现逐渐上升的趋势，而不同浓度的MT处理明显抑制了该变化，其中60 μmol/L MT处理组的效果最为明显。
3. 讨论
大多果蔬采后极易衰老，发生失水、转色、软化及营养品质降低等的变化。本实验中西梅果实在贮藏过程中也是如此：果实失重率不断增加而TSS含量逐渐降低，同时发生明显的转色。然而外源褪黑素处理采后西梅果实，可以有效维持其色度、失重率、TSS、可溶性蛋白和细胞膜通透性，抑制MDA含量的上升，进而维持较好的果实品质。这与褪黑素在甜瓜[40]、红毛丹[41]和鲜切紫甘蓝[42]保鲜效果一致。
关于褪黑素浓度使用方面，本研究中，不同浓度的外源褪黑素处理均可延缓采后西梅果实贮藏品质，其中通过整个实验结果和主成分分析数据表明，60 μmol/L MT处理组效果最优。同样，刘士琦[41]等人采用不同浓度（0.125、0.25、0.5 mmol/L）的褪黑素处理采后红毛丹果实，发现不同浓度的褪黑素均可以有效维持红毛丹的色度等贮藏品质，其中0.125 mmol/L的褪黑素处理效果最佳。张晶[42]等人采用不同浓度（0.01、0.1、0.5、1 mmol/L）的褪黑素处理鲜切紫甘蓝，发现不同浓度的褪黑素均可以有效维持鲜切紫甘蓝的色度、硬度和抗氧化成分等贮藏品质，其中0.5 mmol/L的褪黑素处理效果最佳。这表明，褪黑素在果蔬采后使用过程中受浓度的影响较大，这可能与外援褪黑素的使用会影响内源褪黑素的代谢有关[43]。
果实软化和内含量变化等生理变化普遍存在于果实采后贮藏过程中，其中造成果实软化的主要原因是：某些机构成分含量由于细胞壁多糖代谢反应导致细胞膜通透性升高而逐渐减少[44]。整个果实软化衰老进程中，有大量的酶参与调节，正是不同的酶在各个阶段的协同配合才导致了果实不同时期成分指标的差异[44]。SOD酶和POD酶通过在代谢过程中清理自由基，PPO酶通过消除酶促反应，PG、Cx、β-GAL和PME等酶通过细胞壁多糖代谢反应，以上几种酶协同作用、互相影响进而调节反应控制果实中的色度、多糖物质，影响果实细胞壁的完整性和细胞膜通透性，进而影响果实水分流失程度，同时还参与调节植物细胞生长发育过程中细胞壁的构成，影响果实的贮藏品质，与植物细胞的信息传递存在着密切联系[45−46]。在本试验中，60 μmol/ LMT处理组的西梅果实SOD、POD等酶活性显著高于CK组，PPO、PG、Cx和β-GAL等酶活性显著低于CK组（P<0.05），同时有效延缓了可溶性蛋白含量的下降，以及细胞膜透性和MDA含量的上升，积极抵御了果实的软化进程，有效保持了西梅果实的色泽，显著抑制了贮藏期间果实重量和可溶性固形物的下降。这说明外源褪黑素处理可以有效调控西梅果实体内软化相关酶的活性，从而有效保护了西梅细胞组织的完整性，减缓多糖代谢反应，延缓了果实软化衰老进程，保持了贮藏品质。
果实中的PdPG2、PdCx6、Pdβ-GAL3 和Pd PME31基因可以调节对应的酶活性[29,47]，影响其在果实中生理代谢的协同作用，进而影响果实的细胞膜通透性，控制果实软化衰老进程。本研究表明，整个贮藏期内，60 μmol/L MT处理组可有效降低西梅果实的PdPG2、PdCx6和Pdβ-GAL3基因的表达量，有效维持Pd PME31基因的表达量。结合相关性分析，该4个基因表达量与SOD、POD和PPO酶活之间存在不同程度的相关性，推测该4个基因可以调控对应酶活表达的同时影响SOD、POD、PPO、PG、Cx和β-GAL之间的协同作用，避免相关酶活促使细胞膜通透性上升和MDA含量上升，有效延缓果实的软化进程，保持西梅较好的贮藏品质。
4. 结论
本研究结果表明，整个贮藏期内，不同浓度的外源褪黑素处理均可延缓采后西梅果实贮藏品质，其中60 μmol/L MT处理组效果最佳。研究结果为采后外源褪黑素在采后果蔬中的应用提供理论依据。进一步机理分析表明外源MT处理一方面可有效调控PG酶活性、Cx酶活性和β-GAL酶活性等软化相关酶活性及相关基因的表达量，延缓贮藏期间果实软化，另一方面促进SOD酶、POD酶、PPO等抗氧化酶活的上升，减轻活性氧对细胞膜结构的破坏，最终达到延缓采后西梅果实货架期的目的。然而本实验一方面缺乏对60 μmol/L MT处理组为最优效果组的探讨，未来可通过测定如内源褪黑素含量及其合成相关代谢的表达来补充相关机理。另一方面，本实验虽然发现褪黑素对西梅果实贮藏过程中的水分变化有明显的影响，然而缺乏相关机理分析，未来可通过低磁场核磁测定水分变化趋势及水通道蛋白的表达来补充相关机理。
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图 2 西梅贮藏期间失重率（A）、TSS（B）和可溶性蛋白（C）变化
Figure 2. Changes in weight loss rate(A),TSS (B) and soluble protein content (C) of prune during storage
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图 3 西梅贮藏期间细胞膜通透性（A）与丙二醛（B）含量变化
Figure 3. Changes in membrane permeability (A) and malondialdehyde content (B) during storage of prune fruit
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图 4 西梅贮藏期间SOD （A）、POD （B）、PPO （C）、PG （D）、Cx （E）和β-GAL （F）酶活变化
Figure 4. Changes in SOD SOD (A), POD (B), PPO (C), PG (D), Cx (E) and β-GAL (F) enzyme activity during storage of prune
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图 5 贮藏期间西梅果实中PdPG2 （A）、PdCx6（B）、Pdβ-GAL3（D）和PdPME31（E）表达量的变化
Figure 5. Changes of PdPG2 (A)、PdCx6 (B)、Pdβ-GAL3 (D) and Pd PME31(E) expression during storage of prune fruit
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图 6 贮藏期间西梅果实各指标间的相关性分析
注：图中*为P<0.05，**为P<0.01，红色为正相关，蓝色为负相关。
Figure 6. Correlation analysis among indexes during storage of prune fruit
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图 7 主成分分析因子载荷图（A）、因子得分分布图（B）、因子得分总分图（C）
Figure 7. Principal component analysis factor load diagram (A), factor score distribution diagram (B), factor score total score diagram (C)
表 1 RT-qPCR引物
Table 1 RT-qPCR primers
基因名称 正向引物（5′-3′） 反向引物（5′-3′） PdActin AGCCAGAATGGGGCACAA GCCACGCAAAGTAACCAAGA PdPG2 GCTTGGGAGAAGACAACGCA ACTTGAACTGCCGACCTCTG PdCx6 AGAGGTGGGAGATGGGAACA AGTGGCGGAAGACAATGGAG Pdβ-GAL3 ATGGGCAAGGGTCAAGTATGG AGCGTTTGGGTGGTGTTCTT PdPME31 ACCAGGCTTCTCGTGTGATT TCAAAGGTGATGTTCTCGGC 
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