Recombinant Expression and Immobilization of Pantoea dispersa DJL-B Alcohol Dehydrogenase
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摘要: 为了提高重组醇脱氢酶在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达水平，本研究通过单因素实验探讨了诱导温度、诱导时间以及IPTG浓度对酶表达量的影响。并在此基础上，进一步通过海藻酸钠包埋法研究了重组醇脱氢酶的固定化，以提升其对香叶醇转化的应用价值。结果表明，重组醇脱氢酶在大肠杆菌BL21（DE3）中的最适表达条件为：诱导温度28 ℃，诱导时间20 h，IPTG浓度0.1 mmol/L。固定化的条件为：固定化温度20 ℃、海藻酸钠浓度3.5%、加酶量500 μL。同时固定化酶表现出良好的机械稳定性，经重复使用5次后，相对酶活性仍保持在60%左右，显示出较好的重复使用性。研究结果为工业上利用固定化酶催化法制备香叶醛提供了重要的理论参考，具有良好的应用前景。Abstract: To enhance the expression level of recombinant alcohol dehydrogenase in E. coli BL21(DE3), this study investigated the effects of induction temperature, induction time, and IPTG concentration on enzyme expression through one-way experiments. Additionally, the immobilization of recombinant alcohol dehydrogenase using sodium alginate embedding was examined to improve its application in geraniol conversion. The results indicated that the optimal expression conditions for recombinant alcohol dehydrogenase in E. coli BL21(DE3) were an induction temperature of 28 °C, an induction time of 20 hours, and an IPTG concentration of 0.1 mmol/L. Furthermore, the conditions for immobilization were: immobilization temperature of 20 ℃, sodium alginate concentration of 3.5%, and enzyme addition of 500 μL. Meanwhile, the immobilized enzyme showed good mechanical stability, and the relative enzyme activity was still maintained at about 60% after 5 times of reuse, demonstrating good reusability. The results of the study provide an important theoretical reference for the industrial preparation of geranial using immobilized enzyme catalysis, which has good application prospects.
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Keywords:
- alcohol dehydrogenase /
- heterogeneous expression /
- immobilization /
- geranial /
- bio-transformation
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柠檬醛是一种重要的单萜，广泛存在于诸多植物精油中[1]。由于其自身特殊的香味，被大量应用于化妆品、洗涤剂或是食品行业[2]。研究表明，柠檬醛赋予多种药用植物抗病毒特性，而香叶醛是其主要组成成分之一，占总柠檬醛含量的60%~80%左右，发挥着主要作用[3]。此外，香叶醛还是工业合成薄荷醇、紫罗兰酮和维生素A的重要前体[4−5]。传统的香叶醛制备方法主要依靠化学合成[6]，成本高、能耗大。相较而言，采用生物酶法合成香叶醛更具有绿色、高效且副产物少的优势。若能通过微生物酶法直接氧化香叶醇生成香叶醛，将丰富的可再生原料转化为高经济价值的香料产品，将具有极大的应用价值[7−8]。在这方面，醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase, ADH, EC 1.1.1.1）是最具潜力的氧化还原酶类生物催化剂之一，它能够催化醇与醛或酮之间的可逆氧化还原反应，从而实现这一转化过程[9]。例如，Iijima等[10]首次利用同位素分析研究了香叶醇的生物转化，对生姜根茎中的香叶醇脱氢酶基因ZoGeDH 进行了分子克隆，以NADP+为辅酶将香叶醇氧化为香叶醛，显著增强了生姜的柠檬香气。Sato-Masumoto等[11]从紫苏中分离出香叶醇脱氢酶，并建立了从香叶基二磷酸到香叶醛的生物合成途径。醇脱氢酶（ADH）是环烯萜生物合成路径中的关键酶基因[12]，在辅酶NAD+/NADP+的作用下，可将香叶醇脱氢合成香叶醛。目前，工业上的ADH主要来源于真菌及部分细菌[13−16]，而细菌来源的ADH具有生产周期短、成本低及产率高的特点，更受工业应用的青睐。此外，重组酶的无活性问题仍然是限制其工业应用的重要因素。因此，开发细菌来源的ADH并进行表达条件优化以获得大量重组酶具有重要的现实意义。
同时，游离酶在催化过程中容易不稳定、降解失活且难以分离[17]，限制了其在工业生产中的应用。因此，固定化技术被常用于改良和优化酶，以提升其性能和功能[18−19]。固定化酶在同一催化反应中的重复使用以及通过从反应混合物中去除酶来快速终止反应等方面，展现出了显著的优势[20]。而海藻酸钠包埋法是最常用的酶固定化方法。海藻酸钠是一种从植物中提取的天然高分子材料，与合成高分子材料相比，具有更好的生物相容性，并且其与钙离子的交联形成物理交联，具有反应条件温和且反应速度快的特点[21−22]。因此，利用海藻酸钠包埋法对重组醇脱氢酶进行固定化，这一策略不仅优化了酶的催化性能和重复使用性，还能有效提高了香叶醛生产的经济效益。
本研究将含有ADHP基因的pET-28a（+）质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，并优化了诱导温度、诱导时间和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）浓度，以期提高大肠杆菌中重组ADHP蛋白的产量。此外，通过海藻酸钠包埋法对重组醇脱氢酶ADHP（Pantoea dispersa alcohol dehydrogenase，ADHP）进行固定化，研究固定化温度、海藻酸钠浓度、酶液加入量和反应时间对固定化酶相对酶活的影响。研究结果为实现固定化酶在工业生产香叶醛中的应用提供了重要的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
分散泛菌DJL-B（Pantoea dispersa DJL-B） 本实验室−80 ℃保存；感受态大肠杆菌（DH5α和BL21）、IPTG（50 mg/mL）、氨苄青霉素（50 μg/mL）、卡那霉素硫酸盐（10 mg/mL）、细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；pET-28a（+）、pGEM-T质粒 武汉淼灵生物科技有限公司；限制性内切酶Not I （10 U/μL）、Eco RI （15 U/μL） 北京宝日医生物科技有限公司；T4 DNA连接酶（25000 U）、His标签纯化试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；香叶醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen，NADH）、海藻酸钠、氯化钙 上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析级。
T100TMPCR 扩增仪 美国伯乐Bio-Rad公司；Bio-Photometer紫外可见光分光光度计 上海艾本德国际贸易有限公司；DUT-486蓝光显色仪 上海巴玖实业有限公司；JY96-IIN超声破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；ZNCL-B智能磁力搅拌器 河南佰年仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 引物设计
通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取分散泛菌DJL-B的全基因组DNA，再根据GenBank检索得到分散泛菌DJL-B的1号染色体（GenBank: CP082346.1）上ADHP基因的完整序列，设计引物F1：5’-CGGAATTCATGCAAATCAAAACCACCATGAAAGC-3’；R1：5’-TAAAGCGGCCGCCTACAGCGACATATCCACCACAAT-3’，产物长度为1035 bp，下划线为Eco RⅠ和Not Ⅰ的酶切位点。
1.2.2 pGEM-T-ADHP质粒的构建
以获取的分散泛菌DJL-B的DNA作为模板，F1/R1为特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：DNA模板1 μg，F1/R1（10 μmol/L）各0.5 μL，2xTaq PCR Master Mix Ⅱ（终浓度1x）10 μL，最后添加ddH2O补足至20 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，30次循环；72 ℃ 5 min。使用凝胶回收试剂盒进行切胶回收，得到纯化后的基因片段，将其命名为ADHP，并通过T4 DNA连接酶与pGEM-T于16 ℃过夜连接。酶连产物pGEM-T-ADHP置于42 ℃热激70 s转化至E. coli DH5α，将菌液涂布于含氨苄青霉素（50 μg/mL），IPTG（40 μg/mL），X-Gal（40 μg/mL）的LB固体培养基中。挑取白色阳性克隆菌落送至上海生工生物工程股份有限公司测序。
1.2.3 pET-28a（+）-ADHP表达载体的构建
使用Eco RI和Not I两种限制性内切酶将pGEM-T-ADHP和pET-28a（+）质粒分别于37 ℃进行8 h酶切。切胶回收1035 bp处的ADHP目的基因和5400 bp处的pET-28a（+）表达载体，并用T4 DNA连接酶连接过夜，从而构建pET-28a（+）-ADHP重组表达载体。将连接产物热激至E. coli BL21（DE3）表达菌株中，涂布于含50 μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上。挑取阳性菌落送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。
1.2.4 重组ADHP酶粗酶液的获取与蛋白纯化
吸取10 mL的E. coli BL21（DE3）含pET-28a（+）-ADHP质粒的菌液于6000 r/min 4 ℃离心10 min，收集菌体。加入10 mL的细菌蛋白制备裂解液，冰浴条件下超声波破碎20 min（250 W，工作2 s，间隙6 s）。将裂解液于4 ℃ 12000 r/min离心20 min，收集的上清液即为可溶性蛋白并用于蛋白纯化。粗酶液采用His标签纯化试剂盒进行，取4 mL ADHP破碎粗酶液，加入已平衡的50% BeyoGold™ His-tag 纯化树脂，混匀后在冰浴环境下放入脱色摇床中缓慢以100 r/min摇动60 min，使His标签重组蛋白与5 mL的镍柱充分结合。用非变性洗脱液洗柱5次，并收集洗脱液至离心管中，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）观察洗脱蛋白的分子质量大小和纯度，其中分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%[23]。
1.2.5 重组ADHP酶的诱导表达及条件优化
1.2.5.1 诱导温度对重组ADHP酶表达量的影响
在20 mL含卡那霉素的LB培养基中培养重组菌株至OD600约0.5~0.6，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG于16、28、37、42 ℃以100 r/min分别诱导20 h，取10 μL菌液进行SDS-PAGE电泳检测。使用ImageJ软件计算其灰度值并对目标区域内信号强度的定量评估[24−25]。
1.2.5.2 诱导时间对重组ADHP酶表达量的影响
在20 mL含卡那霉素的LB培养基中培养重组菌株至OD600约0.5~0.6，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG于28 ℃转速100 r/min分别诱导4、8、12、16、20、24 h，取10 μL菌液进行SDS-PAGE电泳检测。使用ImageJ软件计算其灰度值并对目标区域内信号强度的定量评估。
1.2.5.3 IPTG浓度对重组ADHP酶表达量的影响
在20 mL含卡那霉素的LB培养基中培养重组菌株至OD600约0.5~0.6，加入终浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L的IPTG于28 ℃100 r/min诱导20 h，取10 μL菌液进行SDS-PAGE电泳检测。使用ImageJ软件计算其灰度值并对目标区域内信号强度的定量评估。
1.2.6 重组ADHP酶活性检测及NADH生成量的测定
1.2.6.1 酶活力测定
根据340 nm处NADH吸光度的变化进行测定ADHP重组酶活性[26]。反应混合物由160 μL甘氨酸缓冲液（pH10，50 mmol/L）、1 g/L的香叶醇加5%吐温20溶解和1 mmol/L NAD+以及20 μL的酶溶液组成[27]。1单位ADH活性定义为在上述条件下，每10 min生成1 μmol NADH所需的ADH量。相对酶活力（%）=游离酶活性/相对条件下游离酶酶活力最大值×100。
1.2.6.2 NADH生成量的测定
取76.34 mg的NADH标准品用10 mL的超纯水溶解，配制成10 mmol/L的母液。依次将母液稀释配制成1、2、5 、8、10 mmol/L浓度的子液，用紫外分光光度计测定每个标准溶液在340 nm波长下的吸光度，使用线性回归方法绘制拟合线，再将1.2.6.1样品在反应时间为10、20、30、40、50、60 min时的吸光度带入标准曲线方程中，以确定NADH的生成量。
1.2.7 重组ADHP酶酶动力学研究
在1.2.6.1的反应体系下，保持香叶醇及酶浓度不变的条件下，以0.2、0.5、0.8、1、1.5、2 mmol/L浓度的NAD+进行酶学动力学分析[28]，研究辅酶NAD+浓度对酶促反应的影响。使用GraphPad Prism 9.0对所获数据进行非线性拟合回归，根据米氏方程（Michaelis-Menten equation）得Km和Vmax。
1.2.8 重组ADHP酶的固定化及条件优化
1.2.8.1 温度对酶固定化过程中凝胶小球形态的影响
配制3.5%的海藻酸钠溶液，加热至50~60 °C以确保完全溶解。冷却至室温后，加入500 μL重组ADHP酶液。将混合液用5 mL注射器滴加到已配制好的5 mL 2%壳聚糖溶液和1 mL 2%氯化钙混合溶液中，然后在不同的温度10、20、30、40、50 ℃下，使用磁力搅拌器形成凝胶小球，将凝胶小球在氯化钙溶液中静置30 min以进行固化。固化后，使用超纯水多次洗涤凝胶小球，去除表面的氯化钙溶液，于4 °C条件下保存备用[29]。并观察温度对凝胶小球的形态的影响。
1.2.8.2 海藻酸钠浓度对固定化醇脱氢酶酶活的影响
配制0.7%、1.4%、2.1%、2.8%、3.5%、4.2%的海藻酸钠溶液，加热至50~60 °C以确保完全溶解。冷却至室温后，加入500 μL重组ADHP酶液。将混合液用5 mL注射器滴加到已配制好的5 mL 2%壳聚糖溶液和1 mL 2%氯化钙混合溶液中，在20 ℃下，使用磁力搅拌器形成凝胶小球，将凝胶小球在氯化钙溶液中静置30 min以进行固化。固化后，使用超纯水多次洗涤凝胶小球，去除表面的氯化钙溶液，于4 °C条件下保存备用。并于OD340处测定固定化酶反应40 min后的相对酶活。
1.2.8.3 酶量对固定化醇脱氢酶酶活的影响
配制3.5%的海藻酸钠溶液，加热至50~60 °C以确保完全溶解。冷却至室温后，加入10、50、150、200、500、800 μL重组ADHP酶液。将混合液用5 mL注射器滴加到已配制好的5 mL 2%壳聚糖溶液和1 mL 2%氯化钙混合溶液中，在20 ℃下，使用磁力搅拌器形成凝胶小球，将凝胶小球在氯化钙溶液中静置30 min以进行固化。固化后，使用超纯水多次洗涤凝胶小球，去除表面的氯化钙溶液，于4 °C条件下保存备用。并于OD340处测定固定化酶反应40 min后的相对酶活。
1.2.8.4 最适条件下固定化醇脱氢酶的反应速率
配制3.5%的海藻酸钠溶液，加热至50-60 °C以确保完全溶解。冷却至室温后，加入500 μL重组ADHP酶液。将混合液用5 mL注射器滴加到已配制好的5 mL 2%壳聚糖溶液和1 mL 2%氯化钙混合溶液中，在20 ℃下，使用磁力搅拌器形成凝胶小球，将凝胶小球在氯化钙溶液中静置30 min以进行固化。固化后，使用超纯水多次洗涤凝胶小球，去除表面的氯化钙溶液，于4 °C条件下保存备用。并参考1.2.6.2于OD340处测定固定化酶反应10、20、30、40、50、60 min时NADH的生成量。
1.2.8.5 固定化酶酶活力的计算
参考1.2.6.1测定固定化酶的酶活力，加入0.2 g固定化酶进行反应，相对酶活力（%）=固定化酶活性/相对条件下固定化酶酶活力最大值×100。
1.2.8.6 固定化酶的重复使用性
取0.2 g固定化ADHP酶凝胶小球加入1.2.6.1的反应体系中，每次反应后，过滤凝胶小球并用超纯水洗涤3次，以清除表面残余物。待表面水分干燥后，再次将凝胶小球加入新的底物反应体系中，即为第二次重复使用。第一次循环的酶活力设定为100%。
1.3 数据处理
所有实验均重复进行三次，以确保结果的可靠性和可重复性。实验数据通过使用GraphPad Prism 9.0软件进行详细的统计学分析，并可视化数据结果。
2. 结果与分析
2.1 ADHP基因的扩增及克隆和表达载体的构建
PCR扩增所得的ADHP基因产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，参见图1。电泳结果显示在1035 bp位置出现一条清晰的条带，与预期大小一致。将ADHP基因进行切胶回收后，通过连接反应构建了pGEM-T-ADHP克隆载体，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。选择白色阳性克隆菌株提取质粒，并进行双酶切分析，如图2a所示，1泳道中有两个条带，并且其大小与预期的片段一致，这表明质粒被正确切开，并包含预期的插入片段。测序结果确认了重组pGEM-T-ADHP载体的正确构建。随后，将酶切后的克隆载体产物进行切胶回收，并通过连接反应转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。由上海生工生物工程股份有限公司进行测序，结果表明成功构建了pET-28a（+）-ADHP表达载体。经双酶切分析，图2b显示了成功构建的表达质粒pET-28a（+）-ADHP的结果，在1035 bp处出现了目的条带。
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图 1 ADHP基因PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图注：M：Marker；1：ADHP基因扩增结果。Figure 1. Agarose gel electrophoresis of PCR amplification results of ADHP gene![]()
图 2 pGEM-T-ADHP克隆质粒（a）及pET-28a（+）-ADHP表达质粒双酶切结果（b）的琼脂糖凝胶电泳图注：（a）M：Marker，1：ADHP基因条带位置，2：pGEM-T-ADHP克隆质粒双酶切结果；（b）M：Marker；1：pET-28a（+）-ADHP克隆质粒双酶切结果。Figure 2. Agarose gel electrophoresis of pGEM-T-ADHP cloning plasmid (a) and double digestion results of pET-28a(+)-ADHP expression plasmid (b)2.2 重组酶的诱导表达及分离纯化
重组ADHP酶编码345个氨基酸，分子质量约为36.5 kDa。SDS-PAGE分析的粗酶液结果如图3a所示，在36 kDa处出现了特征条带，这与预期设计的蛋白分子质量一致。而且在诱导表达前无ADHP相对应的条带，并在诱导后的上清液中观察到目标蛋白的条带，表明重组工程菌成功可溶性表达了醇脱氢酶。
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图 3 pET-28a（+）-ADHP在大肠杆菌BL21（DE3）的诱导表达后（a）和His标签纯化后（b）的重组ADHP酶液的SDS-PAGE图注：（a）M：Marker，1：IPTG诱导前蛋白，2：IPTG诱导后总蛋白，3：IPTG诱导后破碎上清液；（b）M：Marker，E1~E5：含目的蛋白的洗脱液。Figure 3. SDS-PAGE plots of recombinant ADHP enzyme solution after induced expression of pET-28a(+)-ADHP in E. coli BL21 (DE3)(a) and after His-tag purification (b)为了进一步纯化重组表达带有His标签ADHP醇脱氢酶蛋白，采用了镍柱亲和层析的方法。该方法基于His标签与镍离子之间的强亲和力，通过镍柱可以特异性纯化目标蛋白。收集的各组分洗涤液和洗脱液通过SDS-PAGE电泳分析，以检测His标签重组蛋白的纯化效果。根据电泳结果，选择含有目标蛋白的洗脱液进行储存，结果如图3b所示，第三次洗脱的蛋白含量最高。
2.3 重组ADHP酶诱导表达条件的优化
2.3.1 诱导温度对重组ADHP酶表达量的影响
如图4所示，合适的诱导温度有助于蛋白的折叠和翻译从而增加蛋白的表达量[30]。高温下蛋白质的合成速度可能超过其正确折叠的速度，导致产生大量无活性的蛋白质或包含错误折叠的聚集体；而低温下蛋白质的折叠速度可能减慢，导致蛋白质在细胞中滞留时间过长，从而被降解[31]。通过ImageJ软件对灰度值进行分析，灰度值越高意味着诱导表达的蛋白量增加。结果显示，随着温度的增高，蛋白的表达量先增加后减少。在诱导温度为28 ℃条件下，重组ADHP蛋白的表达量最高且灰度值也最高（表1），因此在后续研究中选择28 ℃作为最适诱导温度。
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图 4 不同诱导温度对蛋白表达量的影响注：M：Marker；L1：IPTG诱导前蛋白；L2~L5:16、28、37、42 ℃条件下重组ADHP酶蛋白表达量。Figure 4. Effect of different induction temperatures on protein expressions表 1 ImageJ灰度分析不同诱导温度下SDS-PAGE电泳结果Table 1. ImageJ grey scale analysis of SDS-PAGE electrophoresis results at different induction temperatures诱导温度（℃） 区域 区域内灰度平均值 最大灰度 校正后的像素总和 16 1456 23.456 59 33542 28 1456 47.178 80 67465 37 1456 24.546 62 35101 42 1456 19.257 55 27538 2.3.2 诱导时间对重组ADHP酶表达量的影响
如图5所示，诱导时间的合理选择对于最大化目标蛋白的表达量至关重要。若诱导时间不足，目标蛋白表达不充分；反之，若诱导时间过长，则可能导致目标蛋白的降解或失活[32]。此外，系统在诱导过程中，宿主细胞的新陈代谢负担增加，可能导致其生长速率下降，因此需要选定较短的诱导时间[33]。经SDS-PAGE检测，观察不同诱导时间对表达量的影响，可以确定最佳诱导时间。根据表2的灰度值分析结果，在20 h条件下，灰度值最大，且诱导表达的蛋白量显著升高。因此，最佳诱导时间确定为20 h。
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图 5 不同诱导时间对蛋白表达量的影响注：M：Marker；L1：IPTG诱导前蛋白；L2~L7：4、8、12、16、20、24 h温度条件下重组ADHP酶蛋白表达量。Figure 5. Effects of different induction times on protein expression表 2 ImageJ灰度分析不同诱导时间下SDS-PAGE电泳结果Table 2. ImageJ grey scale analysis of SDS-PAGE electrophoresis results at different induction times诱导时间（h） 区域 区域内灰度平均值 最大灰度 校正后的像素总和 4 4176 19.745 71 66343 8 4176 38.827 67 130460 12 4176 22.779 55 76538 16 4176 44.489 67 149483 20 4176 50.633 81 170127 24 4176 42.383 65 142408 2.3.3 IPTG浓度对重组ADHP酶表达量的影响
如图6和表3所示，IPTG的添加浓度对E. coli BL21（DE3）中ADHP蛋白的表达无明显的影响。但考虑IPTG具有一定的细胞毒性[34−35]，为降低成本并减少细胞毒性影响，IPTG的最终浓度优选为0.1 mmol/L。
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图 6 不同浓度IPTG对蛋白表达量的影响注：M：Marker；L1：IPTG诱导前蛋白；L2~L8：0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L浓度下重组ADHP酶蛋白表达量。Figure 6. Effects of different concentrations of IPTG on protein expressions表 3 ImageJ灰度分析不同IPTG诱导浓度下SDS-PAGE电泳结果Table 3. ImageJ grey scale analysis of SDS-PAGE electrophoresis results at different IPTG-induced concentrationsIPTG浓度
（mmol/L）区域 区域内灰度平均值 最大灰度 校正后的像素总和 0.05 4576 49.096 77 224662 0.1 4576 49.232 79 225285 0.2 4576 47.131 79 215673 0.4 4576 51.001 81 233381 0.6 4576 38.445 81 175926 0.8 4576 52.776 86 241505 1 4576 56.456 85 258342 2.3.4 重组ADHP酶的酶动力学研究
如图7所示，在1.2.6的反应体系下，反应进行60 min后，NADH的生成量约为0.7 mmol/L，转化效率在70%左右，说明表达的ADHP酶具有较高的催化活性。接着，在0~2 mmol/L范围内测定辅酶NAD+的初始酶反应速率。通过将辅酶浓度作为X轴，反应速度v作为Y轴进行曲线拟合，结果如图8所示。根据米氏方程，重组ADHP酶的特征性常数Km值为0.2058，Vmax值为2.078 μmol/L/min/mg。Km值越小，表明酶对底物的亲和力越大，即在较低的底物浓度下酶也能达到较高的反应速度[36]。
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图 8 辅酶NAD+与重组ADHP酶的非线性拟合方程（a）和双倒数图（b）Figure 8. Non-linear fitting equations (a) and double inverse plots (b) of coenzyme NAD+ with recombinant ADHP enzyme2.4 重组ADHP酶的固定化
2.4.1 温度对酶固定化过程中凝胶小球形态的影响
在酶的固定化过程中，温度是一个关键因素，会影响到溶液的粘度、酶的溶解度以及海藻酸钠小球的稳定性。在海藻酸钠浓度为3.5%，加酶量为500 μL的条件下，不同固定化温度的所制备的凝胶小球结果如图9所示。在高温条件（40 ℃和50 ℃）下，小球的成球率较低，容易出现拖尾和团聚现象；而在低温条件（10 ℃）下，微球表面形成的固定化膜强度不足，导致微球容易分散，机械强度较差，凝胶珠脆弱，易破裂。所以选择中等温度范围（20 ℃至30 ℃），后续在20 ℃的温度下进行固定化操作。
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图 9 固定化温度对凝胶小球形态的影响Figure 9. Effect of immobilization temperature on the morphology of gel pellets2.4.2 海藻酸钠浓度对固定化醇脱氢酶相对酶活的影响
如图10所示，海藻酸钠浓度以0.7%的梯度递增时，重组ADHP酶的相对酶活先升高再降低，在3.5%浓度时固定化酶的相对酶活达到最值。在较低浓度的海藻酸钠浓度（<2.1%）下形成的凝胶小球，机械强度较低，容易破碎，不足以有效包埋酶分子，导致酶流失或失活；而在较高浓度的海藻酸钠浓度（>2.8%）使用过程中保持了凝胶小球的完整性，减少破碎和损失；高浓度的海藻酸钠（>4.2%）形成的凝胶孔径较小，导致底物和产物的传质速率降低，影响酶的反应效率，从而导致相对酶活的降低[37]。
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图 10 海藻酸钠浓度对固定化效果的影响Figure 10. Effect of sodium alginate concentration on the immobilization effect2.4.3 酶量对固定化醇脱氢酶相对酶活的影响
如图11所示，随着固定化过程中所加入酶量的增加，凝胶小球的相对酶活性也逐渐增加。当加酶量达到500 μL时，海藻酸钠凝胶小球的吸附能力达到饱和。同时为了节省酶液材料成本，选择500 μL进行包埋应用。通过增加酶量，酶分子可以更加充分地被海藻酸钠凝胶小球吸附，从而提升整体酶活性。
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图 11 加酶量对固定化醇脱氢酶相对酶活的影响Figure 11. Effect of enzyme addition on the relative enzyme activity of immobilized alcohol dehydrogenases2.4.4 最适条件下固定化醇脱氢酶的反应速率
图12反映了最适条件下反应体系中NADH的生成量随反应时间的变化。反应进行到40 min时达到了最大值，生成了0.98 mmol/L的NADH，表明，在固定化酶的作用下，底物可以高效转化为产物，酶的催化性能得到了充分发挥。
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图 12 反应时间对固定化酶反应速率的影响Figure 12. Effect of reaction time on the reaction rate of immobilized enzymes2.4.5 固定化酶重复使用性
如图13所示，随着操作次数的增加，固定化酶的相对酶活性缓慢下降。在第5次仅剩60%的相对酶活，而在第8次重复操作后，固定化酶的相对酶活降低至20%，推测是由于循环操作的次数增加，使得凝胶颗粒的强度减弱，造成酶的流失，导致酶活力下降，表明其机械操作稳定性有待进一步提高[38]。
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图 13 固定化酶的使用次数稳定性Figure 13. Stability of immobilized enzymes in terms of number of uses3. 结论
香叶醛在香料工业、医药工业及有机合成领域都具有广泛的应用价值；本研究成功构建了含有醇脱氢基因的表达载体，并在大肠杆菌BL21（DE3）中实现可溶表达。经过单因素实验分析，确定了在诱导温度为28 ℃、诱导时间为20 h以及IPTG浓度为0.01 mmol/L的条件下，醇脱氢酶的蛋白表达量最高。同时，通过海藻酸钠包埋法实现了酶的固定化，所采用的固定化载体价格低廉，固定化方法简易有效，其固定化条件为：固定化温度20 ℃，海藻酸钠浓度3.5%，反应时间40 min。在上述条件下，对固定化酶进行重复使用实验，结果显示在使用5次后酶活性仍在60%左右，表明固定化酶具有较好的重复操作稳定性，但进一步提高其稳定性仍需更多研究。
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图 1 ADHP基因PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图
注：M：Marker；1：ADHP基因扩增结果。
Figure 1. Agarose gel electrophoresis of PCR amplification results of ADHP gene
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图 2 pGEM-T-ADHP克隆质粒（a）及pET-28a（+）-ADHP表达质粒双酶切结果（b）的琼脂糖凝胶电泳图
注：（a）M：Marker，1：ADHP基因条带位置，2：pGEM-T-ADHP克隆质粒双酶切结果；（b）M：Marker；1：pET-28a（+）-ADHP克隆质粒双酶切结果。
Figure 2. Agarose gel electrophoresis of pGEM-T-ADHP cloning plasmid (a) and double digestion results of pET-28a(+)-ADHP expression plasmid (b)
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图 3 pET-28a（+）-ADHP在大肠杆菌BL21（DE3）的诱导表达后（a）和His标签纯化后（b）的重组ADHP酶液的SDS-PAGE图
注：（a）M：Marker，1：IPTG诱导前蛋白，2：IPTG诱导后总蛋白，3：IPTG诱导后破碎上清液；（b）M：Marker，E1~E5：含目的蛋白的洗脱液。
Figure 3. SDS-PAGE plots of recombinant ADHP enzyme solution after induced expression of pET-28a(+)-ADHP in E. coli BL21 (DE3)(a) and after His-tag purification (b)
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图 4 不同诱导温度对蛋白表达量的影响
注：M：Marker；L1：IPTG诱导前蛋白；L2~L5:16、28、37、42 ℃条件下重组ADHP酶蛋白表达量。
Figure 4. Effect of different induction temperatures on protein expressions
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图 5 不同诱导时间对蛋白表达量的影响
注：M：Marker；L1：IPTG诱导前蛋白；L2~L7：4、8、12、16、20、24 h温度条件下重组ADHP酶蛋白表达量。
Figure 5. Effects of different induction times on protein expression
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图 6 不同浓度IPTG对蛋白表达量的影响
注：M：Marker；L1：IPTG诱导前蛋白；L2~L8：0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L浓度下重组ADHP酶蛋白表达量。
Figure 6. Effects of different concentrations of IPTG on protein expressions
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图 8 辅酶NAD+与重组ADHP酶的非线性拟合方程（a）和双倒数图（b）
Figure 8. Non-linear fitting equations (a) and double inverse plots (b) of coenzyme NAD+ with recombinant ADHP enzyme
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图 9 固定化温度对凝胶小球形态的影响
Figure 9. Effect of immobilization temperature on the morphology of gel pellets
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图 10 海藻酸钠浓度对固定化效果的影响
Figure 10. Effect of sodium alginate concentration on the immobilization effect
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图 11 加酶量对固定化醇脱氢酶相对酶活的影响
Figure 11. Effect of enzyme addition on the relative enzyme activity of immobilized alcohol dehydrogenases
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图 12 反应时间对固定化酶反应速率的影响
Figure 12. Effect of reaction time on the reaction rate of immobilized enzymes
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图 13 固定化酶的使用次数稳定性
Figure 13. Stability of immobilized enzymes in terms of number of uses
表 1 ImageJ灰度分析不同诱导温度下SDS-PAGE电泳结果
Table 1 ImageJ grey scale analysis of SDS-PAGE electrophoresis results at different induction temperatures
诱导温度（℃） 区域 区域内灰度平均值 最大灰度 校正后的像素总和 16 1456 23.456 59 33542 28 1456 47.178 80 67465 37 1456 24.546 62 35101 42 1456 19.257 55 27538 
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表 2 ImageJ灰度分析不同诱导时间下SDS-PAGE电泳结果
Table 2 ImageJ grey scale analysis of SDS-PAGE electrophoresis results at different induction times
诱导时间（h） 区域 区域内灰度平均值 最大灰度 校正后的像素总和 4 4176 19.745 71 66343 8 4176 38.827 67 130460 12 4176 22.779 55 76538 16 4176 44.489 67 149483 20 4176 50.633 81 170127 24 4176 42.383 65 142408
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表 3 ImageJ灰度分析不同IPTG诱导浓度下SDS-PAGE电泳结果
Table 3 ImageJ grey scale analysis of SDS-PAGE electrophoresis results at different IPTG-induced concentrations
IPTG浓度
（mmol/L）区域 区域内灰度平均值 最大灰度 校正后的像素总和 0.05 4576 49.096 77 224662 0.1 4576 49.232 79 225285 0.2 4576 47.131 79 215673 0.4 4576 51.001 81 233381 0.6 4576 38.445 81 175926 0.8 4576 52.776 86 241505 1 4576 56.456 85 258342
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