Study on the Treatment of Hippophae Rhamnoides Polysaccharides on Alcoholic Hepatitis and Intestinal Barrier Function in Mice
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摘要: 目的：本研究旨在探讨沙棘多糖（Hippophae Rhamnoides Polysaccharides，HRP）对酒精性肝炎（Alcoholic Hepatitis，AH）的保护作用及其作用机制，特别是其对小鼠肝炎和肠道屏障损伤的影响。方法：通过建立小鼠酒精性肝炎模型，使用沙棘多糖（低剂量100 mg/kg、高200 mg/kg）对小鼠进行灌胃处理（1次/日），观察其对小鼠血浆生化指标、肝脏组织生化指标、肝脏及肠道组织病理形态学变化的影响。同时，分析沙棘多糖对小鼠肠道通透性及结肠组织炎症和肠道屏障功能的影响。结果：与模型组相比，沙棘多糖低、高剂量组小鼠血浆中的AST、ALT显著降低，ALB明显升高（P<0.01或P<0.05）。HRP低、高剂量组能显著降低血浆中TC、TG、LDL-C、FFA水平，并提高HDL-C水平（P<0.01或P<0.05）。肝脏组织中，HRP能显著降低TG与TC含量，减少促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，并提高肝脏SOD、GSH水平，降低MDA水平（P<0.01或P<0.05）。病理学检查发现，HRP能改善肝脏结构，减少脂肪变性和炎症细胞浸润。此外，HRP能显著降低血浆LPS和D-乳酸水平，改善肠道组织病理学变化，并提高紧密连接蛋白基因表达水平，降低结肠炎症因子表达（P<0.01或P<0.05）。结论：HRP对酒精性肝炎具有保护作用，能够改善小鼠的肝脏损伤和肠道屏障功能，降低肝脏脂质蓄积和炎症反应。Abstract: Objective: To investigate the protective effects of sea buckthorn polysaccharides (Hippophae Rhamnoides Polysaccharides, HRP) on alcoholic hepatitis (AH) and its underlying mechanisms, particularly its impact on the impairment of hepatitis and intestinal barrier in mice. Methods: A mouse model of alcoholic hepatitis was established, and the mice were administered with sea buckthorn polysaccharides (low dose of 100 mg/kg and high dose of 200 mg/kg) by gavage once daily. Effects of HRP on plasma biochemical parameters, liver tissue biochemical indicators, and pathological morphological changes in liver and intestinal tissues were observed. Additionally, the effect of HRP on intestinal permeability, inflammation in colon tissue, and intestinal barrier function was analyzed. Results: Compared with the model group, the levels of AST and ALT in plasma significantly decreased, while ALB increased significantly in the low and high dose HRP groups (P<0.01 or P<0.05). HRP at both low and high doses significantly reduced the levels of TC, TG, LDL-C, and FFA in plasma and increased the level of HDL-C (P<0.01 or P<0.05). In the liver tissue, HRP significantly reduced the contents of TG and TC, decreased the levels of pro-inflammatory factors IL-6, IL-1β, and TNF-α, and increased the levels of liver SOD and GSH, while reducing MDA levels (P<0.01 or P<0.05). Histopathological examination revealed that HRP improved liver structure, reduced fatty degeneration, and inflammatory cell infiltration. Furthermore, HRP significantly reduced plasma LPS and D-lactic acid levels, improved intestinal histopathological changes, increased the expression level of tight junction proteins, and decreased the expression of colonic inflammatory factors (P<0.01 or P<0.05). Conclusion: HRP have a protective effect on alcoholic hepatitis, improving liver damage and intestinal barrier function in mice, and reducing liver lipid accumulation and inflammatory response.
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随着社会经济的繁荣，酒精消费量逐年增加，导致酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease，ALD）的发病率持续上升[1]。酒精性肝炎（Alcoholic Hepatitis，AH）是ALD的一种严重类型，其发病率和死亡率较高，临床预后不佳。AH可由酒精性脂肪性肝炎（Alcoholic Steatohepatitis，ASH）演变而来，表现为长期过量饮酒导致急性炎症性肝损伤[2]。该病多见于女性饮酒量≥40 g/d和男性饮酒量≥50~60 g/d，且饮酒史至少6个月，黄疸出现前戒酒时间少于60 d。AH的临床特征包括血清胆红素升高、天门冬氨酸转移酶（Alanine Aminotransferase，AST）水平介于50~400 IU/L之间以及AST/ALT比值大于1.5[3]。长期过量饮酒可能导致肝细胞脂肪变性，进而发展为AH，最终可能导致不可逆的肝硬化和肝癌[4]。
AH的发病机制复杂，其中肠道屏障损伤是重要影响因素[5]。肠屏障由紧密连接的肠上皮细胞、黏液层、免疫细胞和肠道菌群组成，这些结构共同维护肠道内环境的稳定[6]。肠道屏障是维持肠道内外环境稳定的重要屏障，包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障[7]。其中，机械屏障主要由肠道上皮细胞构成，紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-1等）在维持肠道屏障的完整性中起着关键作用[8]。酒精可通过直接损伤肠道上皮细胞、诱导紧密连接蛋白的降解、抑制肠道上皮细胞增殖等多种途径损伤肠道屏障，肠上皮结构破坏可导致肠道通透性增加，使肠腔内的有害细菌及其代谢产物渗透至肠黏膜下层，引发局部免疫系统的激活和炎症介质的释放，进一步损伤肝脏[9−10]。因此，在AH进展至不可逆阶段之前，寻找能够修复肠屏障并减轻肝脏损伤的治疗方法至关重要。中药因其多靶点、低毒副作用等特点，被认为符合AH治疗的需求[11]。
沙棘（Hippophae rhamnoides），隶属于胡颓子科沙棘属，是一种落叶灌木或小乔木，常见别名包括醋柳和酸刺。沙棘不仅是沙漠地区绿化的关键物种，其果实更是药食两用的佳品，富含多种营养成分和生物活性物质，如黄酮、鞣质、萜类、多糖和维生素等[12]。这些成分赋予沙棘果止咳化痰、健胃消食、活血散瘀等传统药用功效[13−14]。多糖是沙棘主要的活性成分之一，具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、免疫调节、改善肠道菌群、抗炎、抗高脂血症等作用[15]，研究与开发价值巨大，但其在治疗AH方面尚未见到报道。
因此，本研究旨在探讨沙棘多糖（Hippophae rhamnoides polysaccharides，HRP）对酒精性肝炎的保护作用及其作用机制。通过建立小鼠酒精性肝炎模型，观察沙棘多糖对小鼠肝炎和肠道屏障损伤的影响，并分析其改善酒精性肝炎的作用机制，为其作为保护肠道屏障的功能保健型食品或膳食补充剂的开发利用提供实验基础和理论依据，为酒精性肝炎的防治提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
沙棘果实 新疆阿勒泰地区市售；Lieber-DeCarli酒精液体饲料 南通特洛菲饲料科技有限公司；Trizol试剂、双辛可宁酸（Bicinchoninic Acid，BCA）蛋白定量试剂盒蛋白定量试剂盒、TRIzol裂解液 赛默飞世尔科技公司；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、总蛋白定量检测试剂盒、谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、AST、白蛋白（Albumin，ALB）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-PX）、总谷胱甘肽（Total Glutathione，T-GSH）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（High-Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）、游离脂肪酸（Free Fatty Acids，FFA）测试试剂盒 南京建成生物工程研究所；生理盐水 山东华鲁制药有限公司；；白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）检测试剂盒 上海将来实业股份有限公司；碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）检测试剂盒；碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）检测试剂盒、4%多聚甲醛 上海碧云天生物技术有限公司；D-乳酸（D-Lactic Acid，D-LA）含量检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）检测试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；核酸提取试剂盒、无RNase H2O 天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green Realtime PCR Premix试剂、PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；实时荧光定量PCR实验引物（详见表1） 上海生工生物；紧密连接蛋白1（Znula Ocludens-1，ZO-1） 武汉赛维尔生物公司；闭合连接蛋白1（Occludin-1） 英国Abcam公司；；碘酸-雪夫（Alcian Blue-Periodic Acid-Schiff，AB-PAS）染色试剂盒 北京普利莱基因技术有限公司；苏木素伊红（Hematoxylin and Eosin，H&E）染色试剂盒 美仑生物；免疫组织化学通用型试剂盒（PV-6002） 北京中杉金桥生物技术有限公司；Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）单克隆抗体、磷酸化核因子-κB p65（Phospho-NF-κB p65，p-NFκB p65）重组抗体 武汉三鹰生物科技有限公司。SPF级C57BL小鼠30只，体重范围18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（合格证号：SCXR（京）2021-0006）。
表 1 引物序列Table 1. Primer Sequences基因名称 上游引物（5'-3'） 下游引物（5'-3'） ZO-1 GAGCAGGCTTTGGAGGAGAC AGCTGCTGAACAGCAAAAGC Occludin GTGAATGGGTCACCGAGGG AGATAAGCGAACCTGCCGAG Claudin-1 CCACCATTGGCATGAAGTGC AGAGGTTGTTTTCCGGGGAC Occludin GTGAATGGGTCACCGAGGG AGATAAGCGAACCTGCCGAG IL-1β TGCCACCTTTTGACAGTGATG TTCTTGTGACCCTGAGCGAC IL-6 GCCTTCTTGGGACTGATGCT TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG TNF-α ACCCTCACACTCACAAACCA ACCCTGAGCCATAATCCCCT β-actin GCAGGAGTACGATGAGTCCG ACGCAGCTCAGTAACAGTCC ME204E万分之一电子天平 美国Mettler Toledo公司；Milli-Q实验室纯水系统 德国Merck公司；R-210型旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司；SpectraMax iD3型多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；LEICA DM 2000荧光正置显微镜 德国Leica公司。ABI7500实时荧光定量PCR系统 赛默飞世尔科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 沙棘多糖制备
参照文献[16]方法，沙棘干果40 ℃烘干至恒重，粉碎过40目筛。干果粉末与石油醚1:8比例室温浸泡1 h，70 ℃回流1.5 h，抽滤留滤渣。滤渣用石油醚1:6比例70 ℃回流1 h，抽滤留滤渣。滤渣加80%乙醇70 ℃回流2 h脱单糖，抽滤，滤渣烘干备用。
取500 g预处理沙棘，加蒸馏水1:20比例，70 ℃超声波提取22 min，抽滤。滤液加Sevage试剂（氯仿:正丁醇=4:1）混合20 min，室温4000 r/min（离心半径4.5 cm）离心20 min，，取上层液脱蛋白5次至无白色胶状层。上层液70 ℃浓缩至1500 mL，加三倍体积无水乙醇，4 ℃静置12 h，抽滤取沉淀。沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，抽滤，40 ℃烘干至晶体状得沙棘粗多糖。使用苯酚-硫酸比色法、考马斯亮蓝法和间羟基联苯法分别测定中性糖、糖醛酸和蛋白质含量。
1.2.2 模型建立与样品采集
参照周兴念等[17]的方法，24只雄性C57BL/6J小鼠通过随机数字法被分为正常组（N组）、模型组（M组）、HRP低剂量组（100 mg/kg）、HRP高剂量组（200 mg/kg），共4组，每组6只。正常组小鼠食用普通固体饲料，其余各组小鼠则喂养酒精液体饲料8周以建立AH模型。从第4周开始，HRPL组和HRPH组小鼠分别接受相应剂量的沙棘多糖灌胃处理，每日一次；N组和M组小鼠每日给予等体积生理盐水灌胃。
小鼠饲养于SPF级环境中，环境温度控制在（21±2）℃，湿度维持在（60%±10%），并实行12 h明暗循环。小鼠可自由获取食物和水，并在适应性饲养1周后开始实验。实验动物饲养地点为新疆医科大学实验动物中心。本研究中所有小鼠实验程序均已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的审查与批准，伦理批准编号为K202306-20。
第8周末，小鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（3%，10 mL/kg）进行深度麻醉。麻醉后，通过观察呼吸缓慢、肌肉松弛以及对手术操作无反应来确认麻醉状态。随后使用摘眼球法收集小鼠血液，颈椎脱位法处死小鼠，并收集肝脏和结肠样本以进行进一步分析。
1.2.3 血浆生化指标测定
取小鼠血浆适量，试剂盒操作方法检测ALT、AST、ALB、TC、TG、LDL-C、FFA、HDL-C的含量。
1.2.4 肝组织生化指标测定
取小鼠肝脏样本100 mg，按1:9质量体积比加入预冷生理盐水，冰水浴中机械匀浆。匀浆后以4,000 r/min离心15 min（离心半径4.5 cm），收集上清液，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按照试剂盒说明书操作，使用紫外可见分光光度计测定上清液中测定肝组织匀浆中IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD、MDA、GSH、AST、ALT、AKP的吸光度A，计算各物质含量，记录数据并进行统计分析。
1.2.5 肝组织病理形态学检查
采用H&E染色与油红O染色将已固定的肝组织制备成石蜡切片，进行H&E染色，随后进行脱水处理和封片。同时，将固定肝组织制备成冰冻切片，经异丙醇浸洗后进行油红O染色，封片后于光学显微镜下观察[18]。参照《代谢相关（非酒精性）脂肪性肝病防治指南（2024年版）》中的脂肪性肝病活动度积分（Non-alcoholic fatty liver disease activity score，NAS；评分标准见表2）评判各组小鼠肝脏病理结果。
表 2 肝组织病理评分标准Table 2. Liver tissue pathological scoring criteria名称 0分 1分 2分 3分 肝细胞脂肪变 <5% 5%~33% 34%~66% >66% 小叶内炎症灶 无 <2个 2-4个 >4个 肝内气球样变 无 少量 大量 − 1.2.6 肠道组织病理学检测
对置于组织固定液中的空肠组织进行H&E染色；对置于卡诺氏固定液中的结肠组织进行AB-PAS染色，按照试剂盒说明进行操作。
1.2.7 小鼠结肠组织TLR4和p-NFκB p65免疫组织化学检测
采用免疫组织化学染色法对石蜡包埋的小肠组织标本进行处理，按免疫组织化学通用型试剂盒中说明书进行操作。制作4 μm厚的切片，将摊片机水温调至45 ℃，用黏附载玻片捞取切片后，在60 ℃下烤片2 h。二甲苯脱蜡后，通过梯度乙醇（在100%乙醇Ⅰ、Ⅱ中分别浸泡5 min，95%、90%、80%和70%乙醇中分别浸泡2 min）进行水化，并用PBS清洗三遍。将切片置于柠檬酸盐抗原修复液中，微波炉100 ℃加热8 min，静置30 min至室温。滴加2~3滴内源性过氧化酶阻断剂，湿盒中阻断20 min，PBS清洗三遍。接着滴加2~3滴山羊血清封闭液，湿盒中封闭20 min；滴加TLR4（1:400）和p-NFκB p65（1:600）一抗，4 ℃下孵育过夜。去除一抗，PBS清洗三遍，滴加2~3滴生物素标记的IgG聚合物，室温孵育20 min。PBS清洗三遍后，滴加2~3滴链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育20 min。PBS清洗三遍，滴加2滴DAB显色液，20 s后双蒸水中终止显色。苏木精复染1 s，1%盐酸乙醇分化1 s，自来水中返蓝10 min。梯度乙醇脱水（80%乙醇2 min，95%乙醇2 min，乙醇I和100%乙醇II各5 min），二甲苯透明，中性树胶封片晾干。光镜下TLR4和p-NFκB p65阳性表达呈棕色或棕褐色。
1.2.8 小鼠结肠组织中炎症因子及紧密连接蛋白基因表达水平测定
组织样本准备：使用2 mL TRIzol裂解液和钢珠以60 Hz频率研磨组织90 s。将匀浆转移到1.5 mL离心管中，加入200 µL氯仿，离心15 s。使用核酸提取试剂盒从300 µL混合物中提取总RNA至500 ng/µL。按照说明，使用PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser进行RNA逆转录和cDNA合成。RT1反应体系：2 µL RNA，2 µL 5x gDNA消除缓冲液，1 µL gDNA消除酶（酶活力为1 单位/μL），5 µL无RNase H2O。RT2反应体系：1 µL RT引物混合物，4 µL 5x引物缓冲液，1 µL酶，4 µL无RNase H2O。为定量目标mRNA，使用TB green进行20 µL反应混合物中的cDNA定量PCR。每个孔含20 µL反应混合物，包括10 µL TB Green，0.2 µL正反引物，0.4 µL染料II，7.2 µL ddH2O，2 µL cDNA。PCR反应条件：95 ℃加热30 s，后进行40个循环（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）。使用ABI7500测量RT-qPCR荧光。采用2−ΔΔCq评估基因表达，以β-actin为参考基因。
1.3 数据处理
各组数据均用（X±SD）表示，采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。通过GraphPad Prism 9.0软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 沙棘多糖物质组成测定
苯酚-硫酸比色法、考马斯亮蓝法和间羟基联苯法分别测得沙棘多糖提取物中含有中性糖21.35%±0.16%、糖醛酸63.23%±2.07%和蛋白质10.47%±0.58%。
2.2 沙棘多糖对血浆中AST、ALT、ALB的影响
血浆ALT和AST是评估肝细胞损伤的敏感指标，这些酶主要存在于肝脏以及其他组织中，但在肝细胞受损时，它们会泄漏到血液中，导致血浆中的水平升高[19]。血浆ALB的降低通常指示着肝脏合成能力的受损，在临床实践中常作为评估肝脏疾病严重程度和进展的指标[20]。根据图1所示，与N组相比，M组小鼠血浆中的AST、ALT明显升高（P<0.01），ALB明显降低（P<0.01），表明经过8周酒精液体饲料饮食成功引起小鼠肝脏损伤；与M组相比，HRP低、高剂量组的AST、ALT均显示出不同程度的降低（P<0.01或P<0.05），其中AST分别下降21.80%和50.48%，ALT分别下降40.01%和54.74%，HRP低、高剂量组的ALB分别显著升高15.32%和30.10%（P<0.05）。表明HRP能对受损肝细胞产生保护作用和恢复肝脏合成能力，对AH小鼠的肝损伤具有治疗作用。
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图 1 HRP对小鼠血浆中AST、ALT、ALB的影响（n=6，X±SD）注：（A）血浆AST水平；（B）血浆ALT水平；（C）血浆ALB水平；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。Figure 1. Effect of HRP on AST, ALT, ALB in mouse serum (n=6, X±SD)2.3 沙棘多糖对小鼠血浆脂质相关指标的影响
长期过量饮酒引起的脂肪代谢紊乱是AH的主要特征，血浆TC、TG水平升高反映出由于酒精干扰了正常的脂肪代谢途径，导致脂肪合成增加和/或脂肪氧化减少；肝脏对LDL-C的清除能力受损，导致血浆中LDL-C水平升高，而HDL-C水平的降低会加剧肝脏的炎症状态和脂质代谢紊乱，这可能会促进动脉粥样硬化的发生；高水平的FFA对肝细胞具有毒性作用，可能导致肝细胞损伤和炎症反应[21]。根据图2的结果显示，与N组相比较，M组血浆中TC、TG、LDL-C、FFA水平显著升高（P<0.01或P<0.05），HDL-C水平显著降低（P<0.01），说明本研究成功复制了AH模型的脂代谢紊乱；与M组相比较，HRP低、高剂量组TC、TG、LDL-C、FFA水平显著下降（P<0.01或P<0.05），其中TC分别下降37.20%和50.64%，TG分别下降34.85%和46.11%，LDL-C分别下降34.00%和46.01%，FFA分别下降36.02%和46.60%，HRP低、高剂量组HDL-C水平分别升高112.12%和173.74%（P<0.01或P<0.05）。表明HRP可能是由于其对肝细胞的保护作用实现改善AH小鼠脂代谢紊乱，具有显著的降血脂功能。
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图 2 HRP对小鼠血浆脂代谢相关指标的影响（n=6，X±SD）注：（A）血浆TC含量；（B）血浆TG含量；（C）血浆LDL-C含量；（D）血浆HDL-C含量；（E）血浆FFA含量；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。Figure 2. Effect of HRP on serum lipid metabolism related indicators in mice (n=6, X±SD)2.4 沙棘多糖对小鼠肝脏组织脂质和炎症因子相关指标的影响
肝脏内TG与TC的显著增加是AH形成的关键因素[22]。如图3所示，发现N组及用药组小鼠肝脏中TG与TC的含量明显低于M组（P<0.01）；与M组相比，HRP低、高剂量组TG水平分别下降21.05%和37.63%，TC分别下降18.16%和29.84%（P<0.01或P<0.05）。这些数据提示，HRP可能对AH小鼠肝脏具有保护作用，并能有效减少肝脏脂质的过量积聚。
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图 3 HRP对小鼠肝脏组织脂质和炎症因子相关指标的影响（n=6，X±SD）注：（A）肝脏TC含量；（B）肝脏TG含量；（C）肝脏IL-6含量；（D）肝脏IL-1β含量；（E）肝脏TNF-α含量，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。Figure 3. Effect of HRP on lipid and inflammation factor-related indicators in mouse liver tissue (n=6, X±SD)长期酒精的摄入导致枯否细胞的激活，引起氧化应激反应，并产生炎症细胞因子，如TNF-α、IL-1β与 IL-6，而这些炎症细胞因子又导致肝细胞的凋亡和死亡，最终导致肝脏损伤[23]。与N组比较，M组小鼠肝脏匀浆中促炎因子IL-6、IL-1β水平升高（P<0.05），炎症因子TNF-α水平升高（P<0.01）；与M组相比，HRP给药组（HRP低剂量组和高剂量组）均显示促炎因子IL-6、IL-1β水平下降和炎症因子TNF-α水平下降（P<0.01或P<0.05），其中IL-6分别下降27.5%和67.5%，IL-1β分别下降61.70%和72.34%，TNF-α分别下降31.91%和55.60%。以上结果说明HRP可以通过调节肝脏中的相关酶活性、改善肝细胞的代谢状态、减少氧化应激和炎症反应，降低酒精对肝细胞的刺激从而调节AH小鼠的炎症因子水平，减少因炎症带来的肝细胞死亡和细胞内代谢失衡，减缓肝脏损伤。
2.5 沙棘多糖对小鼠肝脏组织损伤和氧化应激相关指标的影响
SOD、GSH和MDA是衡量机体氧化应激水平的重要指标，长期摄入酒精会导致乙醇及其代谢物（如乙醛）在氧化过程中改变肝细胞的氧化还原状态（NAD+向还原型NADH转换，NADP向还原型NADPH转换），诱导线粒体电子向氧的转移形成活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），诱发氧化应激[24]。如图4所示，与N组相比，M组小鼠肝脏中SOD和GSH水平明显降低，MDA水平明显升高；与M组相比，HRP低、高剂量组中肝脏的SOD、GSH水平明显升高（P<0.05），MDA水平明显降低（P<0.05），其中SOD分别升高131.17%和240.70%，GSH分别升高63.22%和102.01%，MDA分别下降30.99%和50.15%；与N组相比，模型组小鼠肝脏的AST、ALT和AKP活性均显著升高（P<0.01）；而与模型组相比，HRP的低、高剂量均能显著降低AST、ALT和AKP的活性（P<0.01或P<0.05），其中AST分别下降51.84%和63.19%，ALT分别下降47.08%和60.29%，AKP分别下降36.94%和46.89%。结果表明，HRP具有促进AH小鼠内源性抗氧化系统活性的作用，减轻体内氧化应激状态和增强体内抗氧化防御机制的能力从而减少自由基对机体的损害。
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图 4 HRP对小鼠肝脏组织损伤和氧化应激相关指标的影响（n=6，X±SD）注：（A）肝脏SOD水平；（B）肝脏GSH含量；（C）肝脏MDA含量；（D）肝脏AST含量；（E）肝脏ALT含量；（F）肝脏AKP水平；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。Figure 4. Effect of HRP on oxidative stress-related indicators and tissue damage in mouse liver (n=6, X±SD)2.6 沙棘多糖对小鼠肝脏病理的影响
如图5所示，H&E染色用于分析小鼠肝脏的病理改变，特别关注脂肪变性、气球样变和炎性浸润。N组小鼠肝脏结构条理清晰，肝板排列有序，无明显的脂肪堆积、气球样细胞或炎性细胞浸润。相比之下，M组小鼠的肝板布局混乱，肝小叶架构受损，肝细胞内脂肪堆积显著，并伴有气球样变和明显的小叶内炎症，导致NAS评分显著升高（P<0.01）。经HRP给药处理后的小鼠肝脏展现出显著的病理改善，肝板排列更为规整，肝细胞和小叶结构在一定程度上得到了恢复，并未发现桥接坏死或碎屑样坏死的迹象，NAS评分分别降低53.75%和62.91%（P<0.05）。这些观察结果表明，HRP能够有效改善AH小鼠肝脏的病理特征。油红O染色结果显示，与N组相比，M组红色脂滴显著增加，颜色较深且融合成片。与M组相比，HRP给药组的脂滴减少，颜色较浅，油红O染色面积分别降低41.50%和66.44%（P<0.05），表明药物干预可减少AH小鼠肝脏中的脂质沉积。
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图 5 HRP对小鼠肝脏H&E染色和油红O染色的影响（n=6，X±SD）注：（A）肝脏H&E染色结果和病理评分；（B）肝脏油红O染色结果和油红O染色面积分析；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。Figure 5. Effect of HRP on H&E staining and Oil Red O staining in mouse liver (n=6, X±SD)2.7 沙棘多糖对小鼠肠道通透性的影响
在分子层面，LPS和D-乳酸被广泛认为是反映肠道屏障功能受损的关键标志物[25]。本项研究通过ELISA方法测定了小鼠血液中LPS和D-乳酸的水平，旨在探讨HRP对小鼠肠道通透性的作用，结果如图6所示。与N组相比较，M组小鼠血浆中LPS和D-乳酸的含量明显升高；与M组相比，HRP各处理组LPS和D-乳酸的含量均极显著降低（P<0.01或P<0.05），其中LPS分别降低21.01%和41.20%，D-乳酸分别降低17.11%和40.75%。这表明HRP会促进肠道屏障通透性的降低，阻止长期饮用酒精造成的肠粘膜生物屏障破坏，缓解潜在致病微生物及其代谢产物对肝脏的损伤。
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图 6 HRP对小鼠血浆中LPS和D-乳酸含量的影响（n=6，X±SD）注：（A）血浆D-乳酸含量；（B）血浆LPS含量；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。Figure 6. Effect of HRP on the content of LPS and D-lactate in mouse plasma (n=6, X±SD)2.8 沙棘多糖对小鼠肠道组织病理学的影响
HE染色结果显示（图7），N组小肠的肠绒毛结构完整，排列整齐、完整且连续，固有层腺体细胞结构清晰，小鼠小肠上皮细胞的微绒毛结构正常，排列整齐、完整且连续；与N组比较，M组小鼠微绒毛排列紊乱，微绒毛明显变短；与M组比较，HRP低、高剂量组小鼠的微绒毛形态有所改善。AB-PAS染色病理结果显示，N组结肠未排空的杯状细胞数量最多；与N组比较，M组小鼠空肠的未排空的杯状细胞数量明显减少，酸性黏液蛋白分泌量明显增多；HRP低、高剂量组与M组比较，空肠和结肠酸性黏液蛋白分泌有所减少。
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图 7 HRP对小鼠肠道H&E染色和AB-PAS染色的影响注：（A）结肠HE染色，图中黑色箭头所指为小肠微绒毛受损；（B）结肠AB-PAS染色，图中黑色圆圈为杯状细胞减少区域。Figure 7. Effect of HRP on H&E staining and AB-PAS staining in mouse liver2.9 沙棘多糖对小鼠结肠组织炎症和肠道屏障的影响
在AH的病理过程中，由于酒精刺激和肝脏毒素的累积，患者常常出现肠道屏障功能受损和结肠炎症反应[26]。如图8所示，与N组相比，M组小鼠的结肠组织中，关键紧密连接蛋白如ZO-1、Occludin和Claudin-1的基因表达水平普遍降低（P<0.01或P<0.05）。然而，HRP治疗显著提高了ZO-1、Occludin和Claudin-1的基因表达水平（P<0.01或P<0.05），HRP低、高剂量组的ZO-1分别升高100.10%和96.77%，Occludin分别升高190.48%和98.36%，Claudin-1分别升高65.63%和96.23%。说明HRP对AH小鼠结肠紧密连接蛋白的基因表达的具有修复作用。在结肠炎症因子表达方面，与N组相比，M组小鼠的结肠组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表达量显著增加（P<0.01或P<0.05），TLR4和p-NFκB p65的阳性表达增强。HRP治疗后，与M组相比，炎症因子的表达量显著降低（P<0.01或P<0.05），其中IL-1β分别降低29.00%和60.37%，IL-6分别降低22.18%和55.38%，TNF-α分别降低47.32%和121.93%，TLR4和p-NFκB p65的阳性表达减弱。结合病理结果可说明HRP能增加结肠组织中紧密连接蛋白的表达从而保持上皮细胞之间的紧密连接结构，维持肠上皮屏障的完整性，严格限制过量的酒精和有害微生物代谢产物进入肠道，减轻肠道内免疫屏障的反复激活以及损伤从而减轻结肠炎症反应水平。
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图 8 HRP对小鼠肠道屏障及结肠炎症因子表达的影响（n=6，X±SD）注：（A-F）结肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-1、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量；（G）结肠组织p-NFκB p65免疫组织化学染色结果；（H）结肠组织TLR4免疫组织化学染色结果；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。Figure 8. Effect of HRP on the mouse intestinal barrier and the expression of colon inflammatory factors (n=6, X±SD)3. 讨论与结论
AH作为一种常见的肝脏疾病，其发生发展与肠道屏障功能损伤密切相关。肠道屏障的损伤不仅影响食物的消化吸收，还可能通过门静脉系统导致肝脏损伤。当外源物质突破肠道屏障后，通过肝门静脉大量涌入肝脏，引起炎症反应和肝损伤[27]。因此，保护肠道屏障对于预防和治疗AH具有重要意义。HRP作为一种具有多重生物活性的天然产物，已被证实具有抗炎、抗氧化及保护肝脏的作用[28−30]。但其肝保护的既往研究多集中在探讨HRP对LPS联合D-氨基半乳糖、四氯化碳、对乙酰氨基酚等多种药物诱导的小鼠急性肝损伤的治疗作用[31]。最近有研究发现沙棘多糖具有减轻小鼠高脂血症和缓解高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝病[32−33]，但其对AH的治疗作用以及是否能通过“肠-肝轴”发挥治疗AH的机制尚不明确。确定HRP对AH和肠道屏障损伤的治疗作用对进一步开发HRP作为一种功能性食品添加剂的应用具有重要意义。
本研究采用了经典的Lieber-DeCarli液体饲料饲养小鼠8周，成功建立了AH模型。与模型组相比，沙棘多糖（HRP）治疗组的小鼠肝组织在HE染色和油红O染色下显示出较少的肝细胞脂肪变性和气球样变，炎症细胞浸润也有所减轻。本研究发现，在AH的治疗研究中，HRP显示出潜在的应用价值，能够降低酒精性肝损伤小鼠的血浆AST、ALT和ALB水平，减轻肝细胞的变性和脂滴积聚。此外，能抑制肝细胞凋亡和炎症，从而减轻小鼠的AH。它还能降低氧化应激水平，减少IL-1β、IL-16和TNF-α炎症因子的产生，进而减轻酒精诱导的肝损伤。
肠道是AH患者中受到酒精影响的首要器官，肠黏膜形态学的直接观察为评估肠道屏障损伤提供了重要依据[34]。在本项研究中，通过病理学检查发现，模型组小鼠的空肠上皮细胞微绒毛出现缩短和排列混乱。在接受HRP治疗后，微绒毛的数量显著增加，结构更为完整，排列也更加有序。血浆中的LPS水平是肠道内毒素水平的一个指标，而D-乳酸水平则反映了肠道机械屏障的完整性及其损伤程度[35−36]。本研究的数据显示，模型组小鼠的血浆LPS和D-乳酸水平明显升高，而经过HRP低、中、高剂量治疗的小鼠组别中，这些指标均显著降低。最新的研究揭示了AH与肠道屏障完整性的密切联系。在肠道上皮细胞之间，紧密连接扮演着至关重要的角色，而ZO-1和Occludin这两种蛋白质在紧密连接蛋白中占据核心地位，它们不仅支持细胞结构，还确保了紧密连接的完整性，因此，它们是评估肠道屏障功能的关键指标[37−38]。位于肠道表层的上皮紧密连接构成了一个细胞间的屏障，其功能是防止细菌和有害物质通过细胞间隙进入体内[39]。先前的研究已经指出，AH动物模型的肠道通透性出现异常，并且观察到Occludin蛋白的水平降低[40]。本研究发现经过HRP的治疗后，酒精性肝损伤小鼠结肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1的基因表达水平明显升高，IL-1β、IL-6和TNF-α明显降低，说明HRP能通过减轻结肠炎症并修复肠道屏障损伤。
在AH的病理过程中，肠道组织中TLR4/NF-κB炎症信号通路的激活，能够促使IL-6、TNF-α等炎症介质的产生。血浆中这些炎症介质的水平在一定程度上可以反映机体的炎症程度[41−42]。在AH初期，炎症介质的过度增加可能会增加患者的病死率，因此，减少AH初期炎性因子的产生是AH治疗的关键之一[43−44]。在低剂量和高剂量的HRP治疗组中，这些指标均低于AH组的小鼠。这表明HRP可以抑制结肠组织中TLR4/NF-κB炎症信号通路的激活，并降低炎性因子的水平。此外，高剂量的组在这些指标上的表现优于低剂量的组，这表明对小肠组织TLR4/NF-κB炎症信号通路的激活和炎性因子的表达具有剂量依赖性的抑制作用。
综上所述，沙棘多糖可以通过维持机体抗氧化平衡、增强肠道屏障功能和减轻肠道炎症水平，降低肝脏脂质蓄积和炎症反应。因此，沙棘多糖有望作为功能性食品补充剂用于缓解长期乙醇摄入引起的肝损伤，从而有效缓解酒精性肝炎。
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图 1 HRP对小鼠血浆中AST、ALT、ALB的影响（n=6，X±SD）
注：（A）血浆AST水平；（B）血浆ALT水平；（C）血浆ALB水平；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 1. Effect of HRP on AST, ALT, ALB in mouse serum (n=6, X±SD)
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图 2 HRP对小鼠血浆脂代谢相关指标的影响（n=6，X±SD）
注：（A）血浆TC含量；（B）血浆TG含量；（C）血浆LDL-C含量；（D）血浆HDL-C含量；（E）血浆FFA含量；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 2. Effect of HRP on serum lipid metabolism related indicators in mice (n=6, X±SD)
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图 3 HRP对小鼠肝脏组织脂质和炎症因子相关指标的影响（n=6，X±SD）
注：（A）肝脏TC含量；（B）肝脏TG含量；（C）肝脏IL-6含量；（D）肝脏IL-1β含量；（E）肝脏TNF-α含量，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 3. Effect of HRP on lipid and inflammation factor-related indicators in mouse liver tissue (n=6, X±SD)
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图 4 HRP对小鼠肝脏组织损伤和氧化应激相关指标的影响（n=6，X±SD）
注：（A）肝脏SOD水平；（B）肝脏GSH含量；（C）肝脏MDA含量；（D）肝脏AST含量；（E）肝脏ALT含量；（F）肝脏AKP水平；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 4. Effect of HRP on oxidative stress-related indicators and tissue damage in mouse liver (n=6, X±SD)
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图 5 HRP对小鼠肝脏H&E染色和油红O染色的影响（n=6，X±SD）
注：（A）肝脏H&E染色结果和病理评分；（B）肝脏油红O染色结果和油红O染色面积分析；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 5. Effect of HRP on H&E staining and Oil Red O staining in mouse liver (n=6, X±SD)
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图 6 HRP对小鼠血浆中LPS和D-乳酸含量的影响（n=6，X±SD）
注：（A）血浆D-乳酸含量；（B）血浆LPS含量；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 6. Effect of HRP on the content of LPS and D-lactate in mouse plasma (n=6, X±SD)
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图 7 HRP对小鼠肠道H&E染色和AB-PAS染色的影响
注：（A）结肠HE染色，图中黑色箭头所指为小肠微绒毛受损；（B）结肠AB-PAS染色，图中黑色圆圈为杯状细胞减少区域。
Figure 7. Effect of HRP on H&E staining and AB-PAS staining in mouse liver
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图 8 HRP对小鼠肠道屏障及结肠炎症因子表达的影响（n=6，X±SD）
注：（A-F）结肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-1、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量；（G）结肠组织p-NFκB p65免疫组织化学染色结果；（H）结肠组织TLR4免疫组织化学染色结果；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 8. Effect of HRP on the mouse intestinal barrier and the expression of colon inflammatory factors (n=6, X±SD)
表 1 引物序列
Table 1 Primer Sequences
基因名称 上游引物（5'-3'） 下游引物（5'-3'） ZO-1 GAGCAGGCTTTGGAGGAGAC AGCTGCTGAACAGCAAAAGC Occludin GTGAATGGGTCACCGAGGG AGATAAGCGAACCTGCCGAG Claudin-1 CCACCATTGGCATGAAGTGC AGAGGTTGTTTTCCGGGGAC Occludin GTGAATGGGTCACCGAGGG AGATAAGCGAACCTGCCGAG IL-1β TGCCACCTTTTGACAGTGATG TTCTTGTGACCCTGAGCGAC IL-6 GCCTTCTTGGGACTGATGCT TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG TNF-α ACCCTCACACTCACAAACCA ACCCTGAGCCATAATCCCCT β-actin GCAGGAGTACGATGAGTCCG ACGCAGCTCAGTAACAGTCC 
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表 2 肝组织病理评分标准
Table 2 Liver tissue pathological scoring criteria
名称 0分 1分 2分 3分 肝细胞脂肪变 <5% 5%~33% 34%~66% >66% 小叶内炎症灶 无 <2个 2-4个 >4个 肝内气球样变 无 少量 大量 −
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