Study on Preparation and Functional Activity of Nano-silver Materials for Dried Ginger
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摘要: 为改善传统方法制作纳米银耗时长、污染大的问题，利用干姜提取物中丰富的活性物质绿色高效合成纳米银，通过单因素实验探究干姜提取物浓度、硝酸银浓度、加热温度和加热时间对纳米银合成的影响，通过紫外可见吸收光谱、透射电镜、Zeta电位、傅立叶变换红外光谱和热稳定性对其进行表征，并对抑菌活性和抗氧化活性进行探究。结果表明，优化后的合成条件为：干姜提取物16 mg/mL、硝酸银（AgNO3）浓度 0.02 mol/L、温度60 ℃、时间155 min。该条件下制备的纳米银，在418 nm有明显的紫外特征吸收峰，形状为球形，平均粒径为22.43 nm，晶格间距为0.2325 nm，具有良好分散性且为面心立方体结构。100 μg/mL纳米银对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力分别为50%和52.2%。MIC和2 MIC的纳米银对欧文氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的生长均表现出明显的抑制作用，其抑菌机理为破坏细胞膜的结构使其内容物泄漏造成细菌的死亡。该方法制备的纳米银稳定性良好，在果蔬保鲜、生物医药等领域的应用具有广阔的前景。Abstract: To address the lengthy and pollution-intensive process of traditional nano-silver synthesis, we developed a method using dried ginger extract, which is rich in active substances. This paper investigated the effects of various factors, including the concentration of dried ginger extract, silver nitrate concentration, heating temperature, and heating time, on nano-silver synthesis through single-factor experiments. The synthesized nano-silver was characterized using ultraviolet-visible (UV-Vis) absorption spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), Zeta potential measurement, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, and thermal stability analysis. Additionally, its antibacterial and antioxidant activities were examined. The optimized synthesis conditions were found to be: 16 mg/mL dried ginger extract, 0.02 mol/L silver nitrate (AgNO3), a temperature of 60 ℃, and a heating time of 155 min. Under these conditions, the nano-silver exhibited a distinct UV absorption peak at 418 nm, a spherical shape, an average particle size of 22.43 nm, a lattice spacing of 0.2325 nm, good dispersibility, and a face-centered cubic structure. The scavenging capacities of 100 μg/mL nano-silver for DPPH and ABTS+ free radicals were 50% and 52.2%, respectively. The minimum inhibitory concentration (MIC) and twice the MIC of silver nanoparticles significantly inhibited the growth of Erwinia carotovora, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Listeria monocytogenes. The inhibitory mechanism involves disrupting the cell membrane structure, leading to leakage of cellular contents and bacterial death. The nano-silver produced by this method demonstrates good stability and holds promising potential for applications in fruit and vegetable preservation and biomedicine.
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Keywords:
- dried ginger extract /
- nano silver /
- antimicrobial activity /
- antioxidant activity /
- green synthesis
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银作为一种金属无机杀菌剂有着悠久的应用历史。随着纳米技术的发展，纳米银（Nano silver, AgNPs）在抑菌等方面被广泛的研究和应用。AgNPs因其具有小尺寸和大的比表面积，其渗透性能和抗菌活性与普通银离子相比显著提高[1]。AgNPs的制备方法分为物理法、化学法和植物提取物合成法。物理法制备纳米银主要有物理气相沉积法、机械研磨法[2]、激光烧蚀法[3]等，制备原理相对简单，但对专业的设备仪器要求较高，成本高。化学法制备纳米银有辐照法、溶剂热法、电化学法等，可通过特殊方法制作不同形状的纳米银[4]，但化学法耗能高、污染大。物理法和化学方法合成纳米银都存在着一定的弊端。而植物提取物合成法通过提取植物组织内富含的多酚、黄酮等生物活性物质作为还原剂和稳定剂制备纳米银，此方法成本低、效率高、反应条件温和且绿色环保[5]。
植物提取物合成法一般采用植物组织（根、茎、叶和花等）的提取物绿色高效还原制备AgNPs[6]。之前的研究报道，柚皮[7]、柠檬草[8]、香蕉花[9]等植物组织的提取物可以还原制备分散性良好、性质稳定、平均粒径在10~50 nm的纳米银材料。同时，植物提取物中所含的携带负电荷的活性物质会吸附在纳米银表面[10]，使其受到静电力的作用稳定存在。且植物提取物合成法避免使用有毒有害的化学物质，减少对环境的危害，在纳米材料的制备和应用方面具有重要意义[11]。
姜为姜科多年生草本植物，其干燥后的干姜具有很高的药用价值。干姜含有丰富的生物活性成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化[12]、抗癌[13]等多种功效。其中含有的姜酚、黄酮类、姜辣素类等[14]多酚成分和黄酮类化合物具有较强的抗氧化作用和抑菌作用，能够清除活性氧自由基、抑制细菌的生长。以干姜提取物为还原剂制备纳米银时，多酚成分和黄酮类化合物表面吸附在纳米银的表面，达到协同提高抑菌作用和抗氧化作用的目的。
本实验利用干姜中富含的姜酚和姜酮类化合物作为还原剂温和绿色制备AgNPs，并通过单因素实验优化干姜提取物浓度、硝酸银浓度、加热温度和加热时间对AgNPs合成条件的影响；通过紫外可见吸收光谱、透射电子显微镜和选取电子衍射、Zeta电位、傅立叶变换红外光谱和热稳定性对AgNPs进行表征，并探究其抗氧化能力和对欧文氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌等常见菌的抑制能力，为纳米银的绿色合成和干姜的充分利用开辟新的途径。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
干姜（品种为小黄姜） 河北省保定市安国市；5%无菌TTC溶液 广东环凯微生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH自由基） 上海吉至生化科技有限公司；2,2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS+自由基） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司；十二烷基硫酸钠 福晨（天津）化学试剂有限公司；硝酸银 上海精细化工材料研究所；硫酸钾 天津市大茂化学试剂厂。
HT7800透射电子显微镜 日本日立公司；TESCAN MIRA LMS傅里叶红外光谱仪 捷克公司；UV-2800A紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；K5500微量紫外可见分光光度计 北京凯奥科技发展有限公司；JS94K Zeta电位仪 上海中晨数字技术设备有限公司；TGA/DSC 3+热重分析仪 梅特勒托利多国际有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 干姜提取物的制备
参考申海玉等的方法[15]并作修改，将干姜带皮打磨成粉过60目筛，以料液比1:10加入体积分数为80%的乙醇，50 ℃下浸提2 h，抽滤后将澄清溶液在45 ℃旋蒸除去乙醇获得浓缩液，冷冻干燥后所得固体在−20 ℃保存备用。
1.2.2 AgNPs的合成条件的优化
参考Li等的方法[16]并做修改，称取一定量的干姜提取物，用10%的乙醇溶解，离心获取上清液。在离心管中加入0.4 mL 2%的十二烷基硫酸钠、1 mL硝酸银溶液、0.4 mL干姜提取物上清液和1.2 mL去离子水，在加热的条件下反应一段时间，冷却离心后得到纳米银溶液，冷冻干燥备用。使用紫外可见分光光度计（UV-Vis）对各组反应合成的纳米银溶液进行全波长扫描，探究干姜提取物浓度（14、16、18和20 mg/mL）、硝酸银浓度（0.01、0.02、0.03和0.04 mol/L）、加热温度（55、60、65和70 ℃）和加热时间（125、140、155和170 min）对纳米银合成的影响。
1.2.3 AgNPs的表征
1.2.3.1 紫外吸收光谱
将纳米银样品溶解在蒸馏水中，使用紫外可见分光光度计（UV-Vis）对纳米银进行全波长扫描，扫描范围设置为350~800 nm，以蒸馏水作为空白。
1.2.3.2 透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM）
参考Li等的方法[16]并做修改，使用TEM测定AgNPs的大小和形状。将稀释后的样品分散滴倒在涂有碳层的铜网格后进行防尘干燥处理，使用TEM对样品进行测试，观察AgNPs的形状和尺寸。通过高分辨TEM（HRTEM）和选区电子衍射（SAED）表征AgNPs晶型。
1.2.3.3 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR）
参考杨雯雯等[17]的方法并做修改，将溴化钾（KBr）在105 ℃烘干至恒重。取适量AgNPs粉末和干姜提取物分别与干燥后的溴化钾粉末混合，充分研磨后进行压片。将压好的KBr薄片放入傅里叶红外光谱仪，扫描范围为400~4000 cm−1，以4 cm−1的分辨率扫描32次。
1.2.3.4 Zeta电位
使用Zeta电位仪分析AgNPs样品的稳定性。将适量AgNPs样品溶解在蒸馏水中并放入样品池，使用Zeta电位仪测量AgNPs的Zeta电位。
1.2.3.5 热稳定性
参考韩婉毓等[18]的方法并做修改，通过热重分析仪测试干姜提取物和纳米银粉末的热稳定性。称取5 mg干姜提取物和纳米银粉末分别置于氧化铝坩埚中，热重分析仪温度设置为25~600 ℃，升温速率为10 ℃/min，氮气作为保护气体，设置氮气流速为20 mL/min。
1.2.4 AgNPs的抑菌性能测定
1.2.4.1 最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration, MIC）和最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration, MBC）的测定
参考曹雪玲等[19]的方法并做修改，采用微量肉汤稀释法和平板涂布法测试AgNPs的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度。将不同浓度的AgNPs（3.00、1.50、0.75、0.37、0.18、0.09、0.04、0.02、0.01、0.005 mg/mL）与菌液混合，以不同浓度的干姜提取物（200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、和0.78 mg/mL）作为对照，研究AgNPs和干姜提取物对欧文氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌（107~108 CFU/mL）的抑菌效果。将菌株分别在最适温度下培养24 h，以培养基为空白对照。将培养后的各孔菌液分别加入15 μL 5%无菌TTC溶液，静置30 min。将未变为粉红色对应的最低浓度认定为MIC。将所有菌液涂布在装有固体琼脂培养基的培养皿中，以未观察到菌落生长的培养皿对应的最小浓度为MBC。
1.2.4.2 抑菌生长曲线的测定
参考王斌等[20]的方法并做修改。选取1/2 MIC、MIC、2 MIC三个AgNPs浓度，加入到菌液中，将欧文氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌分别在最适温度培养24 h，每隔2 h测量一次600 nm处的吸光度值，以时间为横坐标、对应OD值为纵坐标绘制抑菌生长曲线。
1.2.4.3 细菌细胞膜通透性的变化
参考黄权峰[9]的方法并做修改。选取MIC和2 MIC两个浓度的AgNPs溶液加入到细菌悬浮液中，在对应温度下培养，分别在0、1、2、3和4 h时取样，将细菌悬浮液以10000 r/min离心5 min，用微量紫外可见分光光度计测定上清液在260 nm处的吸光度值，每组实验重复三次。不添加纳米银的菌悬液作为对照。
1.2.5 AgNPs抗氧化性能的测定
1.2.5.1 DPPH自由基清除能力
参考程体艳等[21]的方法并做修改，使用蒸馏水溶解干姜提取物和AgNPs分别配置浓度为20、40、60、80和100 μg/mL的溶液备用。使用无水乙醇溶解DPPH粉末配置浓度为0.2 mmol/L DPPH溶液置于棕色容量瓶中。记A0组为0.1 mL无水乙醇+0.1 mL DPPH；A1组为0.1 mL样品溶液+0.1 mL DPPH；A2组为0.1 mL样品溶液+0.1 mL无水乙醇。3组混合后暗处反应30 min测定其在517 nm处的吸光度，每组重复3次。同时以相同浓度的抗坏血酸作为阳性对照。按照式（1）计算DPPH清除率：
$$ \mathrm{D}\mathrm{P}\mathrm{P}\mathrm{H}\mathrm{自}\mathrm{由}\mathrm{基}\mathrm{清}\mathrm{除}\mathrm{率}(\text{%})=\frac{{\mathrm{A}}_{0}-({\mathrm{A}}_{1}-{\mathrm{A}}_{2})}{{\mathrm{A}}_{0}}\times 100 $$ (1) 式中：A0、A1、A2分别为A0组、A1组、A2组在517 nm处的吸光度。
1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力
参考王鑫等[22]的方法并做修改，将ABTS+溶液和硫酸钾溶液按1:1混合后室温避光存放16 h，得到ABTS+自由基溶液。记A0组为0.1 mL蒸馏水+0.1 mL ABTS+；A1组为0.1 mL样品+0.1 mL ABTS+；A2组为0.1 mL样品溶液+0.1 mL K2SO4溶液，其中样品溶液浓度同1.2.5.1中的浓度。3组混合后暗处反应60 min测定其在734 nm处的吸光度，每组重复3次。同时以相同浓度的抗坏血酸作为阳性对照。按照式（2）计算ABTS+清除率：
$$ {\mathrm{A}\mathrm{B}\mathrm{T}\mathrm{S}}^+\mathrm{自}\mathrm{由}\mathrm{基}\mathrm{清}\mathrm{除}\mathrm{率}(\text{%})=\frac{{\mathrm{A}}_{0}-\left({\mathrm{A}}_{1}-{\mathrm{A}}_{2}\right)}{{\mathrm{A}}_{0}}\times 100 $$ (2) 式中：A0、A1、A2分别为A0组、A1组、A2组在734 nm处的吸光度。
1.3 数据处理
利用Excel软件和Origin软件对数据进行统计处理并绘制相关图像，使用SPSS中单因素方差（ANOVA）对数据进行显著性分析（P<0.05）。所有实验进行3次平行，结果以平均数±标准差的形式呈现。
2. 结果与分析
2.1 纳米银制备条件的优化
图1是不同条件下合成纳米银的紫外吸收光谱。如图1（a）所示，随着AgNO3浓度的增加，峰值在不断增加，吸收峰变窄，这说明反应合成的纳米银的数量在不断增加。适量的银离子会被干姜提取物中的活性成分还原成AgNPs，但是当银离子浓度增加到0.03 mol/L和0.04 mol/L时，紫外吸收光谱在451 nm处出现不平滑的断层，这是因为生成的AgNPs发生聚集，粒径增大，所制备的银离子粒径相差较大而不均匀，在451 nm处将出现新的吸收峰， Khan等[23]的试验也证实了这一点。如图1（b）所示，当温度逐渐增大时，峰值增加，吸收峰变窄，表明大量的银离子被还原成AgNPs，反应物的快速消耗有利于生成直径较小的AgNPs；当温度达到65 ℃时，吸收光谱图在450 nm处出现断层，这是因为温度过高导致Ag+反应剧烈，合成的AgNPs粒径不均匀，部分银离子出现成团聚集的现象。Tomar等[24]研究发现，在60 ℃的情况下使用印楝叶提取物合成AgNPs，反应速率高且合成的AgNPs粒径较小。如图1（c）所示，随着反应时间的增加，峰值强度先增加后减少，说明合成AgNPs的数量先增加后减少，AgNPs的吸收峰逐渐变窄，说明其分布更加集中。反应时间的增加使得Ag+与还原剂充分接触，AgNPs的合成量增多；但是当反应时间过长时，AgNPs会出现团聚现象，粒径增加。邱泽奎[25]研究发现，利用白芨提取物生物合成纳米银，反应2.5 h时出现最大紫外吸收峰，反应3 h时，AgNPs的大量团聚，紫外吸收峰峰值降低，与本实验结果一致。如图1（d）所示，不同浓度提取物溶液所制备的AgNPs在417~430 nm处存在最大吸收峰。随着干姜提取物浓度的增加，峰值强度逐渐增加，说明生成的AgNPs数量增加。当浓度增加到18 mg/mL时，紫外吸收光谱在450 nm处出现不平滑的断层，且吸收峰逐渐变宽，这是因为随着反应的进行，AgNPs出现团聚现象，粒径增加且变得不均匀。有研究表明，随着提取物浓度的增加，合成纳米银的粒径先减小后增加[26]。
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图 1 不同条件下合成的纳米银紫外吸收光谱注：（a）AgNO3浓度、（b）温度、（c）反应时间、（d）干姜提取物浓度。Figure 1. UV absorption spectra of silver nanoparticles synthesized under different conditions综合考虑，为获得粒径均匀且直径较小的纳米银，最佳的合成条件为AgNO3浓度0.02 mol/L、反应温度60 ℃、反应时间155 min、干姜提取物浓度为16 mg/mL。
2.2 纳米银的表征
2.2.1 紫外吸收光谱
本实验采用植物提取物合成法来制备纳米银。由图2可知，反应前的混合溶液呈现浅黄色，反应后混合溶液变为红棕色。紫外吸收光谱显示混合溶液在反应前没有吸收峰，反应后在418 nm处有明显的吸收峰。金属表面松散结合的金属电子云会在入射光线的影响下发生偏振，使其具有特殊的颜色变化，结合紫外可见光吸收光谱上吸收峰的变化[9]，可以证明溶液中有AgNPs生成。
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图 2 合成纳米银的混合溶液反应前后紫外吸收光谱图Figure 2. UV absorption spectrum before and after reaction of mixed solution of synthesized nano silver2.2.2 TEM和Zeta电位
通过TEM来表征AgNPs的形状和粒径大小。如图3（a）、（b）和（c）所示，合成的纳米银呈现球形、粒径均匀呈现孤立分布。选取其中230个AgNPs粒子，经计算得出，纳米银的粒径范围为5~50 nm，平均粒径为22.43 nm，测量其晶格间距为0.2325 nm。粒径分布直方图基本呈现正态分布，在20~25 nm范围内的AgNPs所占比重最高，在10~30 nm范围内的粒子占到80%以上，说明合成的AgNPs粒径均匀。
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图 3 纳米银的透射电子显微镜（TEM）图注：（a）TEM图、（b）粒径分布图、（c）高分辨率TEM图、（d）选取电子衍射图。Figure 3. Transmission electron microscope (TEM) diagram of AgNPs在常温状态下，利用Zeta电位仪测量AgNPs的电位。AgNPs的Zeta电位为-41.98 mV，这说明干姜提取物中携带负电荷的糖类物质吸附在生成的AgNPs周围，造成纳米银携带负电荷。而正是负电荷的存在，会使得纳米银粒子间由于静电排斥的作用孤立分布，具有较好的稳定性，不易发生团聚现象，这在FT-IR光谱图中也得到了证实[27]。
纳米银粒子的选区电子衍射图呈现四个明显的同心衍射环，如图3（d）所示，分别对应纳米银的（111）、（200）、（220）和（311）四个衍射晶面，证明合成的纳米银具有很好的面心立方体结构。干姜提取物中的活性成分作为还原剂将Ag+还原成Ag0后以结晶的形式沉淀下来，提高纳米银的稳定性。这与纳米纤维素作为还原剂和分散剂制备的面心立方体结构的纳米银结果一致[28]。
2.2.3 FT-IR
通过FT-IR分析反应前后体系内官能团的变化情况。如图4所示，提取物在3371 cm−1处的峰是由于O-H伸缩振动，2929和2858 cm−1处的峰是由于甲基和亚甲基中C-H伸缩振动[29]，在AgNPs的图谱中分别偏移到3321、2920和2852 cm−1处。1714和1058 cm−1处的峰是由于C=O和酚类C-O的伸缩振动。1625 cm−1处的峰是由于蛋白质酰胺键的氮氢（N-H）和芳香族C=C的伸缩振动[30]。在提取物的光谱中，出现了明显的芳香环的峰和酚类C-O的峰，这说明提取物中存在着大量的多酚类化合物。纳米银的FT-IR图谱在1384 cm−1处出现一个新的特征吸收峰，这表明银离子与提取物中羰基结构中的氧结合，促使提取物中的多酚类化合物等作为包裹物质粘附在AgNPs的表面，不仅可以使多酚类化合物等其他活性物质继续发挥其抗氧化等作用，还可以防止纳米银的聚集，提高稳定性[8]。
2.2.4 热稳定性能
如图5所示是纳米银和干姜提取物的TGA图和DTG图，AgNPs和干姜提取物的重量都在减少。在温度较低时，重量的损失是由于水分的缓慢蒸发[18]。随着温度的升高，AgNPs和干姜提取物都出现了明显的重量减轻。结合图5（b） DTG图像可以看出，AgNPs具有较好的稳定性。当温度达到200 ℃时，提取物剩余67.5%，而纳米银为80.41%，重量损失低于干姜提取物。300 ℃时，AgNPs重量损失为63.8%，而提取物为53.4%，这可能是因为附着在AgNPs表面多糖等物质发生了热分解，从而在AgNPs的表面剥离[31]，造成重量的损失。当温度大于400 ℃时，AgNPs的重量损失低于干姜提取物，重量趋近于稳定。温度达到600 ℃后，纳米银和提取物的重量损失分别为74.2%和81.4%，这说明绿色合成的纳米银具有较好，的热稳定性为其应用提供较好的基础。
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图 5 纳米银和干姜提取物的热稳定性注：（a）TGA图、（b）DTG图。Figure 5. Thermal stability of silver nanoparticles and dried ginger extracts2.3 纳米银的抑菌性能测定
2.3.1 MIC和MBC
使用96孔板法结合5%无菌TTC和涂布平板的方法，测定干姜提取物和纳米银分别对欧文氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的抑制作用。结果如表1所示，干姜提取物对六种菌表现出一定的抑制效果，革兰氏阳性菌（单增李斯特菌的MIC和MBC分别为3.12和25 mg/mL、枯草芽孢杆菌的MIC和MBC均为12.5 mg/mL）对提取物比较敏感，抑制效果相对较好。而由提取物还原制备的纳米银对六种菌均表现出很好的抑制效果，MIC和MBC对纳米银比较敏感的是荧光假单胞菌和欧文氏菌，MIC均为0.02 mg/mL，MBC均为0.04 mg/mL。合成的纳米银对革兰氏阴性菌的抑制效果更加明显。该抑菌效果与之前研究报道的纳米银对革兰氏阴性菌的抑制效果要优于革兰氏阳性菌这一结果相似[32]。
表 1 AgNPs对不同菌种的MIC和MBCTable 1. MIC and MBC of AgNPs to different strains菌种名称 10%乙醇溶姜提取物
（mg/mL）AgNPs
（mg/mL）MIC MBC MIC MBC 荧光假单胞菌（P. Fluorescens） 25 50 0.02 0.04 枯草芽孢杆菌（B. subtilis） 12.5 12.5 0.04 0.04 欧文氏菌（E. carotovora） 25 50 0.02 0.04 大肠杆菌（E. coli） 25 200 0.09 1.50 金黄色葡萄球菌（S. aureus） 25 25 0.09 0.18 单增李斯特菌（L. monocytogenes） 3.12 25 0.04 0.09 2.3.2 纳米银对菌体生长的影响
欧文氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌在不同纳米银浓度下的抑制生长曲线如图6所示。可以看出纳米银的加入抑制细菌的生长，并且和纳米银的浓度呈现一定的剂量依赖性关系。
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图 6 菌种在不同浓度AgNPs条件下的生长曲线注：（a）荧光假单胞菌、（b）枯草芽孢杆菌、（c）欧文氏菌、（d）大肠杆菌、（e）金黄色葡萄球菌和（f）单增李斯特菌。Figure 6. Growth curves of strains under different concentrations of AgNPs对照组中，菌落生长不受影响，基本呈现“S”型生长趋势。在2~10 h呈现快速增长的趋势，随后逐渐趋于平缓，这满足细菌生长的指数期和静止期。在实验组中加入纳米银，细菌的生长受到抑制。在1/2 MIC组处理的各菌中，欧文氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌的生长速度变缓；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在前10 h基本不生长，在10 h才逐渐开始生长；单增李斯特菌在前16 h基本未生长。几种菌的生长都出现了减缓和延迟。MIC组和2 MIC组处理的六种菌，吸光度值未出现上升的趋势，这说明菌未生长，纳米银处理完全抑制了菌的生长。陈皮纳米银在1MIC和2MIC明显抑制大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长，与本实验结果一致[33]。
2.3.3 细菌细胞膜通透性变化
纳米银可以通过破环细菌细胞膜的通透性使得内容物泄漏进而造成细菌的死亡。内容物泄漏出的核酸成分会在260 nm处出现强吸收峰。因此，可以通过测量260 nm处的吸光度值来判断细菌细胞膜的完整性。从图7中可以看出，未经纳米银处理的对照组上清液在260 nm处的吸光度值呈现缓慢上升的趋势，原因可能是在细菌生长过程中正常的死亡造成的少部分内容物的泄漏。而经过MIC和2 MIC处理的菌，260 nm处的吸光度值呈上升趋势，且2 MIC纳米银处理后的OD值显著高于MIC组（P<0.05），这说明细菌细胞膜遭到破坏，内容物大量泄漏。核酸泄漏在与纳米银浓度呈现剂量依赖性的同时，还呈现出时间依赖性。纳米银浓度越高，菌的细胞膜被破坏的越严重，菌受到的抑制作用越强，这与纳米银对菌的抑制生长曲线表现出相同的结果。魏亚楠[34]研究发现，AgNPs/CS能够破坏细胞膜完整性与通透性，随着AgNPs/CS浓度增加，灿烂弧菌细胞内核酸泄漏会越来越严重。
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图 7 菌种在不同浓度AgNPs条件下的内容物泄漏（OD260 nm）情况注：（a）荧光假单胞菌\（b）枯草芽孢杆菌、（c）欧文氏菌、（d）大肠杆菌、（e）金黄色葡萄球菌和（f）单增李斯特菌。Figure 7. Contents leakage (OD260 nm) of strains under different concentrations of AgNPs细菌与纳米银接触后，由于两者表面所带电荷的差异会使得两者吸附在一起，从而导致细菌细胞膜的去极化，造成不可逆的损伤[9]。细胞膜的损伤会使得细胞转运能力和通透性发生变化，细胞膜包裹的核酸和蛋白质等生物大分子会泄漏到外界环境中，造成菌的死亡[34]。
2.4 纳米银的抗氧化性能
从图8（a）中可以看出，浓度为20~100 μg/mL的AgNPs、干姜提取物和对照组抗坏血酸对DPPH自由基具有一定的清除作用，样品浓度与清除率成正比关系，且呈现剂量依赖性关系。当样品的浓度为100 μg/mL时，纳米银对DPPH自由基清除率可以达到50.0%±1.1%，而干姜提取物的清除率为47.1%±1.1%，对照组的抗坏血酸清除率为96%±0.5%。且纳米银的清除能力始终高于干姜提取物（P<0.05，P<0.01）。这是因为纳米银尺寸较小，比表面积大，且表面吸附了大量的活性物质（多酚、黄酮）能够与DPPH自由基充分反应[35]。
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图 8 AgNPs对自由基的清除能力注：（a）DPPH自由基，（b）ABTS+自由基，* P<0.05, ** P<0.01, *代表AgNPs和干姜提取物对比的显著性。Figure 8. Scavenging ability of AgNPs to free radicals从图8（b）中可看出，AgNPs、干姜提取物和抗坏血酸对ABTS+自由基的清除率与浓度呈正比，随着样品浓度的升高，清除率越来越高。当样品浓度为100 μg/mL时，纳米银对ABTS+自由基清除率可以达到52.2%±0.3%，而干姜提取物的清除率为40.6%±2.0%，对照组的抗坏血酸清除率为88.3%±0.3%。纳米银的清除能力始终高于干姜提取物（P<0.01），其表面吸附的多酚成分和黄酮类化合物等活性物质为提高AgNPs的抗氧化性能发挥了重要作用[22]。
3. 结论
本研究利用干姜提取物中的生物活性成分（多酚成分和黄酮类化合物等）作为还原剂和稳定剂，开发了一种绿色高效合成纳米银的方法。该方法合成迅速，合成过程中未使用有害试剂，合成的纳米银在418 nm处有明显的紫外吸收峰，粒径均匀，且分散性良好。同时，干姜提取物中的多酚和黄酮类化合物等生物活性成分会吸附在纳米银周围，不仅提高了纳米银的稳定性，使其不易发生聚集，还能协同提高纳米银的抗氧化性能和抑菌性能。本实验为纳米银的高效绿色合成和干姜中活性成分的充分利用提供了新的途径，制备的纳米银在果蔬保鲜、生物医药等领域具有广阔的应用前景。
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图 1 不同条件下合成的纳米银紫外吸收光谱
注：（a）AgNO3浓度、（b）温度、（c）反应时间、（d）干姜提取物浓度。
Figure 1. UV absorption spectra of silver nanoparticles synthesized under different conditions
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图 2 合成纳米银的混合溶液反应前后紫外吸收光谱图
Figure 2. UV absorption spectrum before and after reaction of mixed solution of synthesized nano silver
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图 3 纳米银的透射电子显微镜（TEM）图
注：（a）TEM图、（b）粒径分布图、（c）高分辨率TEM图、（d）选取电子衍射图。
Figure 3. Transmission electron microscope (TEM) diagram of AgNPs
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图 5 纳米银和干姜提取物的热稳定性
注：（a）TGA图、（b）DTG图。
Figure 5. Thermal stability of silver nanoparticles and dried ginger extracts
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图 6 菌种在不同浓度AgNPs条件下的生长曲线
注：（a）荧光假单胞菌、（b）枯草芽孢杆菌、（c）欧文氏菌、（d）大肠杆菌、（e）金黄色葡萄球菌和（f）单增李斯特菌。
Figure 6. Growth curves of strains under different concentrations of AgNPs
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图 7 菌种在不同浓度AgNPs条件下的内容物泄漏（OD260 nm）情况
注：（a）荧光假单胞菌\（b）枯草芽孢杆菌、（c）欧文氏菌、（d）大肠杆菌、（e）金黄色葡萄球菌和（f）单增李斯特菌。
Figure 7. Contents leakage (OD260 nm) of strains under different concentrations of AgNPs
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图 8 AgNPs对自由基的清除能力
注：（a）DPPH自由基，（b）ABTS+自由基，* P<0.05, ** P<0.01, *代表AgNPs和干姜提取物对比的显著性。
Figure 8. Scavenging ability of AgNPs to free radicals
表 1 AgNPs对不同菌种的MIC和MBC
Table 1 MIC and MBC of AgNPs to different strains
菌种名称 10%乙醇溶姜提取物
（mg/mL）AgNPs
（mg/mL）MIC MBC MIC MBC 荧光假单胞菌（P. Fluorescens） 25 50 0.02 0.04 枯草芽孢杆菌（B. subtilis） 12.5 12.5 0.04 0.04 欧文氏菌（E. carotovora） 25 50 0.02 0.04 大肠杆菌（E. coli） 25 200 0.09 1.50 金黄色葡萄球菌（S. aureus） 25 25 0.09 0.18 单增李斯特菌（L. monocytogenes） 3.12 25 0.04 0.09 
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