Hovenia dulcis Fruit Peduncle Polysaccharides Modulate Glutamate Metabolism and Tight Junction Protein Expressions to Attenuate the Neurotoxic Effects of Alcohol on Mice
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摘要: 目的：本研究旨在明确枳椇果梗多糖（HDPs）对酒精暴露所致的小鼠神经行为异常的改善效果，并探究谷氨酸代谢和紧密连接蛋白表达在其中的作用。方法：雄性C57BL/6小鼠按114 μL/20 g剂量连续酒精灌胃14 d，建立酒精暴露模型，同时设置干预组进行HDPs干预（114 μL/20 g酒精+100 mg/kg HDPs）。应用行为学实验（旷场实验、高架十字迷宫实验）评估神经行为学变化，采用气相色谱法测定小鼠血液中乙醇浓度，γ-H2AX荧光检测小鼠脑海马组织DNA损伤，免疫组化分析检测小鼠脑组织中紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的表达，并通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）代谢组学技术对小鼠脑组织代谢物进行分析。结果：HDPs可有效降低酒精暴露小鼠血液乙醇浓度，由4.69±0.29 g/L降至1.64±0.104 g/L；改善酒精暴露所致的小鼠神经行为异常，旷场实验中，与酒精组相比，HDPs干预组总路程显著提升至27340±3304 cm（P<0.05），平均速度显著提升至67.4±13.4 cm/s（P<0.05），不动时间缩短29%（P<0.05）；高架十字迷宫实验中，与酒精组相比，HDPs干预组闭臂停留时间显著减少至195.6±10.3 s（P<0.05），开放臂进入次数显著增加26%（P<0.05））；还可降低酒精诱导的脑组织氧化应激与DNA损伤水平，ROS、MDA分别降低5.4%、29.5%（P<0.05），T-AOC提高10.9%，上调脑海马组织中Claudin-1（2.2倍）和ZO-1（0.1倍）蛋白的表达；并调节脑组织谷氨酸代谢通路，提高甘氨酸（19.7%）、谷光甘肽（25%）、琥珀酸（22.6%）等代谢物水平。结论：HDPs可有效改善酒精对小鼠神经行为的影响，其机制或可能通过抗氧化、保护紧密连接蛋白和调节谷氨酸代谢通路发挥作用，研究结果可为扩展枳椇资源在食品领域中的应用提供理论依据。
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关键词:
- 枳椇果梗多糖(HDPs) /
- 酒精 /
- 神经行为 /
- 谷氨酸代谢 /
- 紧密连接蛋白
Abstract: Objective: This study aimed to investigate the protective effects of Hovenia dulcis fruit peduncle polysaccharides (HDPs) on alcohol-induced neurobehavioral alterations in mice and to elucidate whether HDPs mitigate alcohol-induced neuronal damage by modulating glutamate metabolic pathways and the expression of tight junction proteins. Methods: Male C57BL/6 mice were administered alcohol intragastrically at a dose of 114 μL/20 g for 14 d to establish an alcohol exposure model, and an intervention group was set up for HDPs intervention (114 μL/20 g alcohol+100 mg/kg HDPs). Behavioral experiments (open field test, elevated plus maze test) were used to assess changes in neurobehavior, gas chromatography was used to determine ethanol concentrations in mouse blood. γ-H2AX fluorescence was used to detect DNA damage in mouse hippocampal tissue, and immunohistochemical analysis was used to detect the expression of tight junction proteins Claudin-1 and ZO-1 in mouse brain tissue. Metabolites in mouse brain tissue were analyzed using ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) metabolomics technology. Results: HDPs effectively reduced blood ethanol concentration in alcohol-exposed mice (from 4.69±0.29 g/L to 1.64±0.104 g/L) and ameliorated alcohol-induced neurobehavioral abnormalities. In the open field test, compared to the alcohol group, HDPs intervention significantly increased total distance traveled (27340±3304 cm, P<0.05) and average velocity (67.4±13.4 cm/s, P<0.05), while reduced immobility time by 29% (P<0.05). The elevated plus maze test revealed that HDPs treatment decreased closed-arm dwelling time (195.6±10.3 s, P<0.05) and increased open-arm entries by 26% (P<0.05) compared to the alcohol group. Additionally, HDPs alleviated alcohol-induced oxidative brain damage by reducing ROS levels (5.4% reduction) and MDA content (29.5% decrease, P<0.05), while enhanced total antioxidant capacity (T-AOC) by 10.9%. It upregulated hippocampal expression of tight junction proteins Claudin-1 (2.2-fold increase) and ZO-1 (10% increase). HDPs also modulated glutamatergic metabolic pathways, elevating brain levels of glycine (19.7% increase), glutathione (25% increase), and succinate (22.6% increase). Conclusion: HDPs can effectively alleviate the neurobehavioral impact of alcohol on mice. The mechanism may involve antioxidant activity, protection of tight junction proteins, and modulation of glutamate metabolic pathways, providing a theoretical basis for the development and application of Hovenia dulcisis resources in the food field. -
过量饮酒和酒精依赖已成为一个严重的公共卫生问题[1]。长期或过量饮酒会对人体健康产生很多负面影响，尤其是对神经系统的损害。酒精性神经损伤可以导致认知功能障碍、记忆力减退以及行为异常等一系列神经行为学问题，酒精暴露诱导的氧化损伤和神经炎症被认为是酒精性神经损伤的主要机制之一[2]。因此，发现能够减轻酒精对神经系统影响的天然活性物质并探究其作用机制具有重要的现实意义和社会价值[3−4]。枳椇（Hovenia dulcis），又名拐枣，作为一种传统的药食两用植物，其果梗（占果实90%重量的可使用部分）含有多种生物活性成分，包括多糖、黄酮、皂苷等。枳椇果梗多糖（Hovenia dulcis fruit peduncle polysaccharides，HDPs）是枳椇梗部中的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、免疫调节等生物活性[5]，前期研究已对HDPs的提取工艺进行了优化，获得了HDPs，并在体外验证了其对生物大分子的氧化有抑制作用[6]。这提示HDPs可能通过清除自由基和降低氧化应激水平，保护神经细胞免受酒精引起的氧化损伤。
谷氨酸是中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，其在神经传递和突触可塑性中起着关键作用[7]。以往研究表明，酒精暴露可能会导致谷氨酸水平异常，引发神经毒性和神经退行性变化[8]。然而，酒精如何通过影响谷氨酸代谢通路进而导致这些病理变化的具体机制，目前尚不完全明确。此外，紧密连接蛋白，如Claudin-1和Zonula Occludens-1（ZO-1），是细胞间紧密连接的重要组成部分，对维持细胞极性、屏障功能和信号传递至关重要。在中枢神经系统中，紧密连接蛋白有助于形成血脑屏障，保护大脑免受有害物质的侵害[9−10]。酒精暴露是否可能会降低ZO-1的表达，破坏紧密连接、进一步加剧神经损伤仍有待进一步探索。
因此，本研究旨在明确HDPs对酒精暴露小鼠神经行为影响的改善作用，并揭示潜在的新机制，即HDPs是否通过调节谷氨酸代谢和紧密连接蛋白来减轻酒精引起的神经损伤。研究结果将为明确HDPs对酒精性神经损伤的改善效果和机制及扩展枳椇资源在食品领域的应用提供重要参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
雄性SPF级C57BL/6小鼠 6周龄，体重19～21 g，许可证号：SCXK（湘）2019-0004），湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物饲养于标准屏蔽环境（使用许可证号：SYXK（鄂）2018-0071，饲养室内温度22～24 ℃，相对湿度45～55%，12 h黑暗/12 h照明的昼夜规律），自由饮用食水，室内保持安静，避免强光照射。所有动物实验均按照茅台学院动物伦理和使用委员会批准的指南进行，并遵循“3R”原则（批号：MTI-IACUC-2022-007）；食用酒精（纯度95%） 鑫河阳酒精有限公司；HDPs 前期研究结果提取获得[6]；叔丁醇（纯度≥99.8%） Sigma Aldrich公司；DNA损伤检测试剂盒（货号C2035S） 上海碧云天有限公司；免疫组化抗体Claudin-1（货号AF0127）、ZO-1（货号AF5145） 江苏Affinif公司；总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒（货号A015-2-1）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（货号A003-1-2） 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。
数字幻灯片扫描仪（Panoramic MIDI） 匈牙利布达佩斯3DHISTECH公司；6890N高效气相色谱仪 美国安捷伦公司；EthoVision ® XT version 12动物行为分析系统 荷兰Noldus公司；SCIEX 6500 QTRAP+三重四极质谱仪 加拿大Sciex公司；BX53荧光显微镜 日本Olympus公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组
C57/BL6小鼠按体质量随机分为对照组、酒精暴露（114 μL/20 g）组、HDPs干预（114 μL/20 g酒精+100 mg/kg HDPs）组，每组12只。根据人均酒精消费量（32.8 g/d）[11]，进行人与小鼠的剂量等效换算，小鼠的酒精暴露剂量为114 μL/20 g[12]。对照组每天定时灌胃等量蒸馏水，酒精暴露组每天定时灌胃114 µL/20 g酒精。根据Yang等[13]研究提示100 mg/kg枳椇多糖（HDPs-2A）可改善胰腺损伤，同时结合本研究预实验情况，实验中HDPs干预组首先灌胃100 mg/kg HDPs 2 h后，再灌胃114 µL/20 g酒精。小鼠灌胃体积为0.01 mL/g。连续给药14 d后进行旷场、高架十字迷宫行为学实验及其他指标检测。
1.2.2 小鼠血液乙醇浓度测定
小鼠心脏取血后用顶空瓶收集血液，应用双柱双检测器顶空气相色谱法测定血液中乙醇含量[14]。移取100 μL血液样本加入20 mL顶空瓶中，然后加入500 μL叔丁醇内标工作液（浓度40 μg/mL），作顶空进样分析。色谱条件：毛细管色谱柱A柱：Elite-BAC1（30 m×1.8 μm×0.32 mm），B柱：Elite-BAC2（30 m×1.2 μm×0.32 mm）；柱温50 ℃，前检测器FID：温度200.1 ℃，后检测器FPD+：温度21.6 ℃；前进样口温度22.8 ℃、流量44 mL/min，后进样口温度177.6 ℃、流量24 mL/min；PerkinElmer TurboMatrix HS-40顶空自动进样，取样针温度90 ℃；样品瓶加热平衡时间10 min。
1.2.3 行为学实验
1.2.3.1 旷场实验
给药14 d后末次给药后30 min，采用动物行为分析系统（EthoVision ® XT version 12，荷兰Noldus公司）检测10 min内小鼠旷场自主活动。
1.2.3.2 高架十字迷宫实验
旷场实验结束后，进行高架十字迷宫测试实验，观察时间为5 min，采用动物行为分析系统检测小鼠闭臂进入次数、闭臂内活动路程、闭臂内时间。
1.2.4 脑海马组织氧化应激水平测定
采血后，新鲜收集的脑组织，在冰上迅速剥离出脑海马组织。脑海马组织制备成10%匀浆液，经10000×g 4 ℃离心10 min后收集上清，应用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯探针法检测氧自由基（ROS）水平[15]，硫代巴比妥酸法检测丙二醛（MDA）含量[16]，ABTS+自由基清除法检测总抗氧化能力（T-AOC）水平[17]。
1.2.5 脑海马组织DNA损伤检测
新鲜取材的脑海马经冰冻切片后，应用DNA损伤检测试剂盒（γ-H2AX免疫荧光法）检测脑海马组织中DNA双链断裂标志蛋白γ-H2AX荧光水平。试剂盒染色后，γ-H2AX呈绿色荧光（最大激发波长495 nm，最大发射波长519 nm），而细胞核呈蓝色荧光（最大激发波长364 nm，最大发射波长454 nm）[18]。
1.2.6 脑海马组织免疫组化分析
脑海马组织经固定、脱水、浸蜡、包埋、切片后，进行免疫组化染色，使用Pannoramic MIDI扫描切片获得可视化图像，同时应用Image Pro Plus 6.0软件（美国Media Cybernetics）测定阳性信号面积（棕黄色染色细胞）占比，分析各组脑海马组织中Claudin-1、ZO-1蛋白的表达。
1.2.7 脑代谢组学分析
代谢物提取：参照文献[19]，取50 mg脑组织样本于2 mL离心管（含6 mm研磨珠）中，400 μL提取液（甲醇:水=4:1（v:v））含0.02 mg/mL内标（L-2-氯苯丙氨酸）进行代谢产物提取。应用超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱（UHPLC-Q Exactive HF-X系统，赛默飞公司）对样本进行LC-MS/MS分析，上机检测由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
色谱条件：3 μL样本经HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）分离后进入质谱检测。流动相A为95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水（含0.1%甲酸）。流速为0.40 mL/min，柱温为40 ℃。
质谱条件：样品质谱信号采集采用正负离子扫描模式，质量扫描范围为70~1050 m/z。鞘气流速为50 psi，辅助气流速为13 psi，辅助气加热温度为425 ℃，正模式离子喷雾电压设置为3500 V，负模式离子喷雾电压设置为-3500 V，离子传输管温度为325 ℃，归一化的碰撞能为20-40-60 V循环碰撞能。一级质谱分辨率60000，二级质谱分辨率7500，采用DDA模式采集数据。
数据处理：LC-MS原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI（Waters Corporation，Milford，USA）进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，同时将MS和MSMS质谱信息与代谢公共数据库HMDB（http://www.hmdb.ca/）和Metlin（https://metlin.scripps.edu/）以及上海美吉公司自建库进行匹配，得到代谢物信息。对预处理后的数据矩阵进行主成分分析（PCA）和正交最小偏二乘判别分析（OPLS-DA），并使用7次循环交互验证来评估模型的稳定性。显著差异代谢物的选择基于OPLS-DA模型得到的变量权重值（VIP）和student’s t检验P值来确定，VIP>1，P<0.05的代谢物为显著差异代谢物。差异代谢物通过KEGG数据库（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）进行代谢通路注释，获得差异代谢物应用MetaboAnalyst 5.0数据库（http://www.MetaboAnalyst.ca/）进行代谢通路富集分析。
1.3 数据处理
实验数据均用平均数±标准误（±s）表示，应用GraphPad Prism 8.0.2（美国GraphPad公司）软件进行统计分析及作图，组间差异比较采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 各组小鼠的血液乙醇浓度变化
经外标法定量，乙醇保留时间为6.256 min。以峰面积（pa·min）确定进样浓度，如图1所示，测得各组全血乙醇的浓度分别为1.12±0.07、4.69±0.29、1.64±0.104 g/L，结果提示HDPs可提高酒精代谢速率，有效降低小鼠血液乙醇浓度。
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图 1 各组小鼠的血液乙醇检测气相色谱图注：（a）对照组、（b）酒精暴露组、（c）HDPs干预（酒精+HDPs）组。Figure 1. Gas chromatograms of blood ethanol concentration of mice in each group2.2 HDPs改善酒精暴露小鼠的神经行为
在旷场实验中，与对照组比较，酒精暴露组小鼠总路程、平均速度极显著减少（P<0.01），不动时间显著增加（P<0.05）；与酒精暴露组比较，HDPs干预组小鼠总路程、平均速度显著增加（P<0.05）、不动时间显著减少（P<0.05）（图2A，表1）。在高架十字迷宫实验中，与对照组比较，酒精暴露组小鼠闭臂总路程、闭臂时间、闭臂进入次数显著升高（P<0.05）；与酒精暴露组比较，HDPs干预组小鼠闭臂总路程、闭臂时间、闭臂进入次数显著降低（P<0.05）（图2B，表1）。上述结果提示，HDPs可改善酒精暴露小鼠的神经行为异常。
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图 2 各组小鼠神经行为热图注：（A）旷场实验热图，（B）高架十字迷宫实验热图；a~c分别为对照组、酒精暴露组、HDPs干预（酒精+HDPs）组。红色、黄色和蓝色轨迹代表小鼠在整个区域的运动停留时间，红色轨迹表示运动时间最长，其次是黄色轨迹，再次是蓝色轨迹。无痕迹则表示小鼠没有移动到该区域。Figure 2. Neurobehavioral heatmaps of mice in each group表 1 各组小鼠旷场及高架十字迷宫的行为学结果Table 1. Behavioral results of open field and elevated maze of mice in each group组别 旷场实验 高架十字迷宫实验 总路程
（cm）平均速度
（cm/s）不动时
间（s）闭臂总路
程（mm）闭臂时间
（s）闭臂进入
次数（次）对照 39114±
249396.2±
11.179.8±
7.98813±
820.9171.1±
12.915.4±
2.1酒精 20030±
6591**30.4±
8.3**151.3±
7.8*14483±
1076*238.7±
10.6*29.4±
2.5*酒精+
HDPs27340±
3304#67.4±
13.4#107.5±
13.7#11386±
959.1#195.6±
10.3#21.7±
2.6#注：与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与酒精组比较，#P<0.05、##P<0.01；表2~3同。 2.3 HDPs降低酒精诱导的氧化应激与DNA损伤水平
与对照组比较，酒精暴露组小鼠脑海马组织的ROS、MDA水平极显著升高（P<0.01）、T-AOC水平显著降低（P<0.05）（表2）。与酒精暴露组比较，HDPs干预组小鼠脑海马组织的ROS、MDA水平显著降低（P<0.05）。图3显示了γ-H2AX蛋白在各组小鼠脑海马组织中的表达情况，酒精暴露组小鼠脑海马神经细胞内γ-H2AX蛋白荧光强度显著高于对照组和HDPs干预组（图3）。上述结果提示，HDPs可降低酒精诱导的氧化应激与DNA损伤水平。
表 2 各组小鼠脑海马组织的氧化应激水平Table 2. Oxidative stress levels in the hippocampus of mice in each group组别 ROS（平均荧光强度，AFU） T-AOC（nmol/mg） MDA
（nmol/mg）对照 3659±100.7 2.38±0.08 0.70±0.07 酒精 4043±53.7** 1.82±0.18* 1.29±0.08** 酒精+HDPs 3824±47.9# 2.02±0.08 0.91±0.09# ![]()
图 3 各组小鼠脑海马神经元DNA损伤结果注：A.脑海马神经元γ-H2AX蛋白荧光染色图；γ-H2AX蛋白（绿色荧光），白色箭头显示DNA损伤程度较强。a~c分别为对照组、酒精暴露组、HDPs干预（酒精+HDPs）组。B.脑海马神经元γ-H2AX蛋白荧光定量图。与对照组比较，**P<0.01；与酒精组比较，##P<0.01。Figure 3. DNA damage in hippocampal neurons of mice in each group2.4 HDPs上调脑海马组织Claudin-1、ZO-1蛋白表达
如图4所示，Claudin-1、ZO-1蛋白在各组小鼠脑海马神经细胞中均有不同程度表达，且ZO-1蛋白表达要远大于Claudin-1蛋白。与对照组比较，酒精暴露组小鼠脑海马组织CA1区神经细胞Claudin-1、ZO-1蛋白表达显著降低（P<0.01，P<0.05）；与酒精暴露组比较，HDPs干预组小鼠脑海马组织CA1区神经细胞Claudin-1、ZO-1蛋白表达显著升高（P<0.01，P<0.05）（表3）。上述结果提示，HDPs可上调脑海马组织Claudin-1、ZO-1蛋白表达。
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图 4 各组小鼠脑海马组织Claudin-1、ZO-1蛋白免疫组化注：A.Claudin-1免疫组化结果，B.ZO-1免疫组化结果；a~c分别为对照组、酒精暴露组、HDPs干预（酒精+HDPs）组。Figure 4. Immunohistochemistry of Claudin-1 and ZO-1 proteins in the hippocampus of the mice in each group表 3 Claudin-1、ZO-1蛋白免疫组化阳性细胞所占面积比Table 3. Area ratio of immunohistochemically positive cells for Claudin-1 and ZO-1组别 Claudin-1
（阳性面积占比）ZO-1
（阳性面积占比）对照 8.77±0.97 93.7±0.86 酒精 2.46±0.51** 80.3±0.68* 酒精+HDPs 7.89±1.74## 87.8±2.29# 2.5 HDPs调节脑组织谷氨酸代谢通路
PCA用于降低数据的维度并可视化各组小鼠脑组织代谢物的差异。PCA结果显示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别解释了总变异的19.40%和14.90%。酒精暴露组的代谢物在PCA图中明显偏离对照组，表明两组之间存在显著的代谢差异。酒精暴露组的代谢物在PC1上表现出较大的偏移，这可能与酒精引起的代谢途径变化有关（图5a）。OPLS-DA是一种监督学习方法，用于分析和区分不同组之间的代谢物。模型的R²（解释度）和Q²（预测度）值分别为0.9和0.85，表明模型具有良好的解释力和预测力。PLS-DA模型的交叉验证结果显示，对照组、酒精暴露组及HDPs干预组三者之间具有高度的区分度（图5b）。代谢通路富集分析揭示了酒精暴露可能影响脑组织的关键代谢途径及主要显著差异代谢物（图5c、5d），结果显示，酒精暴露组在某些代谢通路中表现出显著的富集，如氨基酸代谢。特别是，谷氨酸的代谢途径在酒精暴露组中显著下调，这可能与神经系统的功能障碍（氧化应激和细胞损伤）有关。
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图 5 各组小鼠脑组织中差异代谢物的分析结果注：a.PCA分析，b.PLS-DA分析，c.代谢通路富集分析，d.主要显著差异代谢物。Figure 5. Metabolic pathway analysis of differential metabolites in brain samples of mice图6显示了各组小鼠脑组织谷氨酸代谢通路中的差异代谢物，包括谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、谷光甘肽、N-乙酰天冬氨酸、天冬氨酸、α-酮戊二酸、琥珀酸9种。其中，酒精组神经细胞胞质中谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷光甘肽含量显著低于对照组（P<0.05，P<0.01），酒精组线粒体中N-乙酰天冬氨酸、天冬氨酸、α-酮戊二酸、琥珀酸含量均显著低于对照组（P<0.05，P<0.01）。与酒精组比较，HDPs干预组甘氨酸、谷光甘肽、琥珀酸含量显著升高（P<0.05）。上述结果提示，HDPs可能通过调节谷氨酸代谢通路，部分逆转酒精诱导的抗氧化系统抑制和能量代谢障碍。
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图 6 谷氨酸代谢通路分析结果注：TCA：三羧酸循环，与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与酒精组比较，#P<0.05。Figure 6. Glutamate metabolic pathway analysis results3. 讨论
HDPs是枳椇果梗中最主要的活性物质之一，近年来在研究中显示出多种生物活性，包括抗炎、抗氧化和神经保护作用[5−6]。本研究明确HDPs对酒精暴露所致的小鼠神经行为异常的改善效果，并探究谷氨酸代谢和紧密连接蛋白表达在其中的作用。研究结果表明，HDPs在多个层面上对酒精引起的神经系统损伤具有保护作用，具体表现在降低血液中乙醇的浓度、改善神经行为异常、降低氧化应激和DNA损伤等方面；并发现HDPs在调节紧密连接蛋白表达和谷氨酸代谢通路方面的新机制，以及这些机制如何共同作用以减轻酒精对小鼠神经行为学的负面影响。
3.1 提高酒精代谢与神经行为改善
本研究结果表明，HDPs能够有效降低酒精暴露小鼠血液中的乙醇浓度，反映其有提高酒精的代谢速率的效果。这一结果与前期研究结果一致，表明天然多糖具有促进酒精代谢的潜力[20]。HDPs可能增强了肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，从而加速酒精的清除[21]。此外，酒精暴露会导致小鼠出现神经行为学异常，包括运动协调性下降、认知功能障碍等。Xu等研究表明[22]，8周的间歇性酒精暴露可使小鼠表现出明显的抑郁和焦虑样行为，这一异常变化或与酒精暴露导致小鼠海马体的神经元损伤及铁死亡有关。其他研究证实，酒精代谢产生的自由基可攻击细胞膜、蛋白质和DNA，导致细胞线粒体功能障碍和细胞死亡[23−24]。本研究结果显示，HDPs能显著降低酒精诱导的脑海马氧化应激水平，减少DNA损伤，这可能与HDPs的抗氧化活性有关，可有效清除自由基，保护细胞免受氧化损伤[6]。本研究结果表明，HDPs可能通过清除自由基，减少神经细胞的氧化损伤，从而发挥对酒精暴露小鼠神经行为的改善作用。研究结果证实了HDPs在减轻酒精对神经系统的负面影响方面具有积极作用。
3.2 上调紧密连接蛋白表达与调节谷氨酸代谢
大脑神经细胞之间形成的紧密连接是维持血脑屏障避免脑损伤和神经功能障碍的关键因素之一。Occludin是紧密连接中发现的第一个跨膜蛋白[25]，ZO-1作为一种支架蛋白是紧密连接复合体中的关键组成部分，与跨膜蛋白如Occludin、Claudins以及细胞骨架蛋白如肌动蛋白结合，以维持细胞间通讯和细胞屏障功能，Occludin、ZO-1的表达和功能对于确保神经系统的健康和功能至关重要，其异常可能导致多种神经系统疾病的发生[26]。Chen等[27]研究表明，小鼠急性酒精性肝损伤或与ZO-1和Occludin低表达有关，而山萘酚可调节肠紧密连接蛋白（ZO-1和Occludin）和丁酸受体及转运蛋白减轻酒精性肝损伤。本研究发现，酒精暴露同样会减少这些蛋白在脑海马组织的表达；HDPs干预后，脑海马组织中Claudin-1和ZO-1蛋白表达上调，这表明HDPs可能通过保护和修复紧密连接蛋白，维护神经细胞间的正常通讯，从而减轻酒精的神经毒性。
越来越多的证据表明[28−29]，功能障碍的谷氨酸神经传递对于酒精的依赖和发展至关重要。先前的研究报道指出，饮酒会导致谷氨酸转运蛋白1的表达下调，青春期雌性偏好酒精大鼠的星形胶质谷氨酸转运蛋白和代谢型谷氨酸受体-1的表达也会受到影响[30]。谷氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质，其代谢失衡与多种神经疾病有关[31]。在神经细胞中，谷氨酰胺是谷氨酸的前体[32]；甘氨酸是一种抑制性神经递质，其含量的增加可能有助于平衡神经兴奋性[33]；谷光甘肽作为主要的抗氧化剂，其含量的增加可能有助于保护神经细胞免受氧化损伤[34]。N-乙酰天冬氨酸、天冬氨酸、α-酮戊二酸、琥珀酸这些代谢物在能量代谢和氨基酸代谢中起着关键作用[35]。本研究发现，酒精暴露导致小鼠脑组织中谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸等代谢物含量显著降低，这可能与酒精诱导的神经细胞能量代谢障碍和神经递质合成减少有关，并为进一步研究酒精对大脑的影响提供了重要的代谢标志物。HDPs干预后，这些代谢物的含量显著升高，表明HDPs可能通过促进谷氨酸代谢通路中关键酶的活性，恢复神经递质的平衡，从而保护神经功能。综上，通过对比酒精组与对照组，本研究发现酒精暴露导致神经细胞胞质和线粒体中多种代谢物含量显著降低。这些代谢物的降低可能与酒精诱导的能量代谢障碍和神经递质合成减少有关。HDPs干预后，甘氨酸、谷光甘肽、琥珀酸等代谢物含量的显著升高，表明HDPs可能通过促进这些代谢物的合成或减少其消耗来调节谷氨酸代谢通路，恢复神经递质平衡，从而改善神经功能。
4. 结论
综上所述，HDPs通过降低血液中酒精浓度、降低氧化应激与DNA损伤、上调紧密连接蛋白表达以及调节谷氨酸代谢，有效减轻了酒精对小鼠的神经行为影响。这些发现将为明确HDPs对酒精性神经损伤的改善效果和机制及扩展枳椇资源在食品领域的应用提供重要参考。未来的研究可进一步探索HDPs对谷氨酸转运体（如NMDA受体）及ZO-1涉及的神经递质信号通路的影响，以期进一步阐明HDPs在改善酒精性神经损伤中可能起到的作用。
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图 1 各组小鼠的血液乙醇检测气相色谱图
注：（a）对照组、（b）酒精暴露组、（c）HDPs干预（酒精+HDPs）组。
Figure 1. Gas chromatograms of blood ethanol concentration of mice in each group
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图 2 各组小鼠神经行为热图
注：（A）旷场实验热图，（B）高架十字迷宫实验热图；a~c分别为对照组、酒精暴露组、HDPs干预（酒精+HDPs）组。红色、黄色和蓝色轨迹代表小鼠在整个区域的运动停留时间，红色轨迹表示运动时间最长，其次是黄色轨迹，再次是蓝色轨迹。无痕迹则表示小鼠没有移动到该区域。
Figure 2. Neurobehavioral heatmaps of mice in each group
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图 3 各组小鼠脑海马神经元DNA损伤结果
注：A.脑海马神经元γ-H2AX蛋白荧光染色图；γ-H2AX蛋白（绿色荧光），白色箭头显示DNA损伤程度较强。a~c分别为对照组、酒精暴露组、HDPs干预（酒精+HDPs）组。B.脑海马神经元γ-H2AX蛋白荧光定量图。与对照组比较，**P<0.01；与酒精组比较，##P<0.01。
Figure 3. DNA damage in hippocampal neurons of mice in each group
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图 4 各组小鼠脑海马组织Claudin-1、ZO-1蛋白免疫组化
注：A.Claudin-1免疫组化结果，B.ZO-1免疫组化结果；a~c分别为对照组、酒精暴露组、HDPs干预（酒精+HDPs）组。
Figure 4. Immunohistochemistry of Claudin-1 and ZO-1 proteins in the hippocampus of the mice in each group
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图 5 各组小鼠脑组织中差异代谢物的分析结果
注：a.PCA分析，b.PLS-DA分析，c.代谢通路富集分析，d.主要显著差异代谢物。
Figure 5. Metabolic pathway analysis of differential metabolites in brain samples of mice
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图 6 谷氨酸代谢通路分析结果
注：TCA：三羧酸循环，与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与酒精组比较，#P<0.05。
Figure 6. Glutamate metabolic pathway analysis results
表 1 各组小鼠旷场及高架十字迷宫的行为学结果
Table 1 Behavioral results of open field and elevated maze of mice in each group
组别 旷场实验 高架十字迷宫实验 总路程
（cm）平均速度
（cm/s）不动时
间（s）闭臂总路
程（mm）闭臂时间
（s）闭臂进入
次数（次）对照 39114±
249396.2±
11.179.8±
7.98813±
820.9171.1±
12.915.4±
2.1酒精 20030±
6591**30.4±
8.3**151.3±
7.8*14483±
1076*238.7±
10.6*29.4±
2.5*酒精+
HDPs27340±
3304#67.4±
13.4#107.5±
13.7#11386±
959.1#195.6±
10.3#21.7±
2.6#注：与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与酒精组比较，#P<0.05、##P<0.01；表2~3同。 
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表 2 各组小鼠脑海马组织的氧化应激水平
Table 2 Oxidative stress levels in the hippocampus of mice in each group
组别 ROS（平均荧光强度，AFU） T-AOC（nmol/mg） MDA
（nmol/mg）对照 3659±100.7 2.38±0.08 0.70±0.07 酒精 4043±53.7** 1.82±0.18* 1.29±0.08** 酒精+HDPs 3824±47.9# 2.02±0.08 0.91±0.09#
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表 3 Claudin-1、ZO-1蛋白免疫组化阳性细胞所占面积比
Table 3 Area ratio of immunohistochemically positive cells for Claudin-1 and ZO-1
组别 Claudin-1
（阳性面积占比）ZO-1
（阳性面积占比）对照 8.77±0.97 93.7±0.86 酒精 2.46±0.51** 80.3±0.68* 酒精+HDPs 7.89±1.74## 87.8±2.29#
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