Isolation and Identification of Eurotium Cristatum from Different Dark Tea Sources and the Effect of Solid-state Fermentation on the Nutritional and Functional Components of Tartary Buckwheat
-
摘要: 从8种市售黑茶中分离和鉴定冠突散囊菌，并固态发酵苦荞籽粒。测定发酵前后的营养物质总淀粉、可溶性蛋白、脂肪、还原糖，以及功能成分总黄酮和总多酚的含量，并分析两种重要生物转化酶（苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶）的活性以及与营养功能成分间的关系，以比较不同冠突散囊菌对苦荞营养功能成分的转化作用。结果表明，分离菌中7株为冠突散囊菌，1株为谢瓦氏曲霉；经冠突散囊菌发酵后，苦荞籽粒营养物质中的总淀粉、可溶性蛋白和脂肪含量皆显著低于发酵前，而多糖以及功能成分总黄酮和总多酚的含量多数显著高于发酵前；总黄酮含量较高的为LB和YZ菌株，总多酚含量较高的为JW和YZ菌株。相关性分析显示，发酵苦荞的总黄酮、总多酚分别与苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性呈显著正相关，而还原糖和总淀粉呈显著负相关，提示发酵苦荞营养物质的变化与冠突散囊菌的生物转化过程密切相关。本研究为基于益生菌发酵工艺开发新型苦荞产品提供了理论依据。Abstract: Candidate Eurotium cristatum strains from 8 types of commercial dark tea were isolated and identified. Solid-state fermentation of tartary buckwheat grains by isolated Eurotium cristatum strains was carried out. The content of nutrients, including starch, reducing sugars, soluble proteins and fats, and functional components flavonoids and polyphenols before and after fermentation, was measured. The transformation effects of different Eurotium cristatum strains on the nutritional and functional components of tartary buckwheat were compared. Moreover, the activities of two rate-limiting enzymes (phenylalanine ammonia lyase and polyphenol oxidase), responsible for the biosynthesis of key buckwheat pharmaceutical components flavonoids and polyphenols, were determined. Results showed that, among the 8 candidate strains, 7 strains were identified as Eurotium cristatum, with the other strain being Aspergillus chevalieri. The content of total starch, soluble protein, and fat in the fermentation system after fermentation were lower than those before fermentation, while most of the content of reducing sugar, and functional components including total flavonoids and total polyphenols, was significantly higher than before fermentation. The fermentation products with LB and YZ strains had relatively higher total flavonoid content, while those with JW and YZ strains had relatively higher total polyphenol content. Correlation analysis showed that the activities of phenylalanine ammonia lyase and polyphenol oxidase the content of total flavonoids and polyphenols in fermented tartary buckwheat were significantly positively correlated with the activities of phenylalanine ammonia lyase and polyphenol oxidase, respectively, while the contents of reducing sugars were significantly negatively correlated with starch. These results suggest that the changes in nutritional and functional components in the fermented tartary buckwheat are closely related to the biotransformation by Eurotium cristatum. This study can provide a theoretical basis for the development of new fermented tartary buckwheat products.
-
冠突散囊菌（Eurotium cristatum，简写为E. cristatum）是散囊菌属的一种好氧性真菌，无性型称为冠突曲霉（Aspergillus cristatus，简写为A. cristatus），具有耐干燥、耐渗透压的特性[1−4]，在土壤、茶叶、海洋等中有分布。冠突散囊菌是茯砖茶制作过程中的关键优势真菌[1,4] 。茯砖茶是在特定条件下经“发花”工艺加工而成的黑茶[4]。在“发花”过程中，冠突散囊菌大量增殖形成金黄色菌落（即为“金花”）[5]。其分泌多酚氧化酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等多种胞外酶，促进茶叶成分的转化，产生色素和多种活性代谢物，从而提高黑茶的色泽和香气，改善茶的品质、滋味和生物学活性[6−10]。除茯砖茶外，冠突散囊菌亦在藏茶、六堡茶、陕西茯茶等多种黑茶中发现，且有效参与了黑茶的风味形成过程[6,11]。此外，茶来源的冠突散囊菌具有调节血糖、调节肠道菌群、降血脂及减肥等功效[12−17]，被认为是益生菌，被用于大豆、燕麦、三七等的生物转化[18−20]。冠突散囊菌固态发酵大豆后，糖类物质持续下降，总蛋白和总黄酮含量呈先升高后下降的趋势，挥发性成分也发生明显变化；发酵后的大豆能促进小鼠的排便[18]。以冠突散囊菌发酵燕麦，发酵过程中多酚含量与多酚氧化酶、阿魏酸酯酶和苯丙氨酸解氨酶的活性密切相关；发酵后燕麦的抗氧化能力大幅提升[19]。冠突散囊菌发酵后的三七，其三七皂苷含量显著提高，体外抗氧化、降血糖能力增强[20]。
苦荞含有丰富的蛋白质、淀粉、脂肪等基本营养成分，且富含多酚及黄酮类化合物等活性成分的药食两用作物，具有抗氧化、抗衰、降糖和降脂等保健功能[21−22]。苦荞蛋白的生物利用率高，含有谷蛋白、清蛋白、球蛋白等多种组分，营养价值高[23]。其淀粉中直链淀粉占20%~38%，支链淀粉占12%~13%。苦荞的脂肪含量为2.1%~2.5%，其中包括油酸和亚油酸在内的不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的70%以上，是人体的必需脂肪酸，还能有效促进幼儿的生长发育。苦荞富含黄酮和多酚类化合物，主要有芦丁、槲皮素、山奈酚、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷等，其中芦丁的含量占总黄酮的80%左右[21−22]。黄酮和多酚类化合物具有降“三高”、抗氧化、预防心血管疾病等功效[21−22]。近年来，随着大健康产业的快速发展，苦荞类功能产品的需求激增，但已有的苦荞产品存在加工工艺单一、种类简单化和低值化等问题。因此，基于益生菌发酵等新工艺研发新型苦荞产品具有重要的现实意义。
为有效利用苦荞的营养和功能价值，丰富苦荞加工产品的种类，本文拟研究冠突散囊菌对苦荞的生物转化过程。从不同市售黑茶中分离和鉴定冠突散囊菌，并固态发酵苦荞籽粒，通过测定发酵前后产物的总淀粉、还原糖、可溶性蛋白、脂肪等营养物质，功能成分总黄酮和总多酚的含量，以及两种重要生物转化酶（苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶）的活性，分析不同冠突散囊菌对苦荞营养功能成分的转化作用，以求为新型苦荞发酵产品的开发提供了理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
苦荞籽粒 米荞1号，由成都大学国家农业农村部杂粮加工重点实验室提供；三鹤六堡 广西梧州茶厂有限公司；六堡茶 桂林漓江茶厂有限公司；金叶蔓子茯砖茶 陕西泾阳蔓子茯茶有限公司；泾渭茯茶 咸阳泾渭茯茶有限公司；安化特制茯砖茶 中茶湖南安化第一茶厂有限公司；安化茯砖茶 安化县立党茶业有限公司；雅安藏茶 雅安美安雅茶业有限公司；泾阳茯砖茶 陕西泾阳裕兴重茯砖茶业有限公司；真菌基因组提取试剂盒 北京索莱宝科技有限公司，引物合成和测序服务由擎科生物有限公司提供；芦丁（≥98%）、没食子酸（≥98%）、无水葡萄糖（≥98%）、牛血清白蛋白（≥98%） 标准品，上海源叶生物科技有限公司；福林酚试剂、三氯化铝、乙酸钾、DNS试剂、考马斯亮蓝、石油醚、甲醇、无水碳酸钠、石英石、硼酸钠、硼酸、柠檬酸、盐酸、偏磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、脯氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、邻苯二酚和苯丙氨酸 均为分析纯，成都市科隆化学品有限公司；植物淀粉含量测定试剂盒 南京建成生物工程研究所。
LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；ZWY-240恒温培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；SW-CJ-2D超净工作台 上海苏净实业有限公司；JY96-IIN超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；W-6 110808004恒温水浴锅 上海力辰仪器科技公司；H2050R冷冻离心机 上海菲恰尔分析仪器公司；2720 thermal cycler PCR仪 赛默飞世尔科技公司；DYCP-31DN DNA电泳槽 北京六一仪器厂；FR980凝胶成像仪 上海复日科技仪器有限公司；Synergy HTX多功能微孔板检测仪 美国BioTek公司；SCZ-101脂肪测定仪 上海纤检仪器有限公司；UPH-I-10T超纯水仪 西安优普仪器设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株的分离和鉴定
1.2.1.1 培养基的制备
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：按培养基配方称取去皮马铃薯200.0 g，用小刀切成小块，加入蒸馏水煮15 min，四层纱布过滤至1000 mL烧杯中，加入无水葡萄糖20.0 g，琼脂粉20.0 g，玻璃棒搅拌溶解，蒸馏水定容至1 L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。待冷却到60 ℃左右，在超净工作台中倒平板备用。
1.2.1.2 菌种的分离纯化和生长曲线绘制
分别从8种黑茶中挑取含有金黄色颗粒较多的茶样，采用10倍稀释涂布分离法分离金黄色真菌。用无菌水稀释茶样，并将稀释液均匀涂布于PDA平板上，倒置于28 ℃培养箱中培养，观察并记录其形态特征。选取平板上的金黄色菌株，再多次进行稀释纯化，直至得到单菌落。根据菌落的颜色、形状等特征，挑取不同的金黄色菌落，用平板划线法多次划线分离，确认得到的是单一菌落。每天用游标卡尺测量并记录单菌落的直径。以生长时间为横坐标，菌体直径为纵坐标，用Origin软件绘制生长曲线。
1.2.1.3 BenA基因序列获取
将分离到的菌接种于PDA培养基，置于28 ℃下倒置培养5~7 d。按照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取真菌基因组DNA。以β-tubulin基因序列引物BenA-Bt2A-F（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’）和BenA-Bt2b-R（5’-ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC-3’），以提取的真菌基因组DNA为模板，扩增BenA基因序列，PCR扩增程序设置为94 ℃预变性10 min，94 ℃变性20 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环30次后，72 ℃延伸10 min，并于4 ℃保存。回收扩增DNA片段并送公司测序。
1.2.1.4 构建系统发育树
利用Blast分析方法，将测序得到的BenA序列在NCBI的GenBank数据库进行同源性序列比对，下载同源性较高的序列。利用MEGAX软件以Clustal W法进行多序列比对，后通过邻接法构建系统发育树，步长值设定为1000，选用K2模型。
1.2.2 苦荞籽粒固态发酵
1.2.2.1 孢子悬浮液的制备
将不同的纯化菌株接种到PDA培养基中，于28 ℃恒温培养5~7 d。待菌落长出大量金黄色菌丝后，用接种环刮取金黄色菌丝转移到盛有50 mL无菌水的锥形瓶中。向锥形瓶中加入适量玻璃珠，180 r/min振荡30 min。用无菌脱脂棉过滤菌液，用血球计数板法统计菌液孢子浓度，加入无菌水，将孢子浓度稀释至1×107~8 个/mL，即可得到孢子悬浮液。
1.2.2.2 固态发酵
称取20 g苦荞籽粒，置于150 mL的锥形瓶中，加入20 mL纯水，用橡胶塞和牛皮纸封口，121 ℃ 高压蒸汽灭菌锅灭菌20 min，冷却至室温备用。按照1×107~8 个孢子/100 g苦荞籽粒的接菌量加入孢子悬浮液，封口并混匀。将接种后的苦荞籽粒置于28 ℃恒温培养箱中培养10 d，每隔1 d手动摇晃发酵瓶1次，使孢子悬浮液充分与苦荞籽粒混合。发酵结束后，将发酵后的苦荞籽粒冻干、粉碎、过60目筛，存于4 ℃冰箱干燥保存备用。空白对照组（CK）将孢子悬浮液替换为等体积的无菌水。试验组和对照组均设置3组平行。
1.2.3 营养及功能成分含量测定
1.2.3.1 提取液制备
准确称取发酵后的苦荞籽粒粉末0.20 g，加入70%甲醇25 mL，100 Hz超声30 min，8000 r/min离心10 min，取上清，将沉淀重复上述步骤提取3次，合并上清，40 ℃旋蒸上清，用70%甲醇定容至50 mL，存于−4 ℃冰箱备用测定。
1.2.3.2 总淀粉含量
采用南京建成生物工程研究所提供的植物淀粉含量测试试剂盒进行测定。
1.2.3.3 可溶性蛋白含量
采用考马斯亮蓝法测定[24]。具体方法为，取0.05 g样品于10 mL离心管，加入5 mL蒸馏水，超声（100 Hz）提取30 min，随后4000 r/min离心10 min，取0.5 mL上清液与2.5 mL考马斯亮蓝染液混合，避光反应5 min，在595 nm处测定其吸光值。以牛血清蛋白为标准品绘制标准曲线，获得回归方程y=4.68x+0.0062（R2=0.9994），计算可溶性蛋白含量。
1.2.3.4 脂肪含量
采用索氏抽提法测定。精密称取恒重后样品1 g，用恒重后的滤纸紧密包裹，并记录包裹后总质量。将样品置于索氏抽提装置中，加入石油醚，设置装置程序，9 h后取出样品。经恒重后，测定其质量。样品两次恒重前后的质量差为样品中总脂肪含量。
1.2.3.5 还原糖含量
采用二硝基水杨酸（DNS）法，参照索化夷等的方法[25]，略有改动。将0.1 g的样品粉末加入5 mL蒸馏水中，50 ℃超声提取20 min，每隔5 min摇匀一次，提取结束后8000 r/min离心15 min，取0.1 mL上清液，依次加入0.4 mL蒸馏水和1.5 mL DNS试剂，摇匀，沸水浴5 min，随后立即用冷水冲淋冷却至室温，定容至10 mL，于波长420 nm处测吸光值，以无水葡萄糖为标准品作标准曲线，通过回归方程y=0.0788x−0.0042（R2=0.9992）计算还原糖含量。
1.2.3.6 总黄酮含量
采用三氯化铝比色法[26]，具体方法参照NY/T1295-2007稍修改。以芦丁为标准样品绘制标准曲线，得到回归方程y=31.842x−0.0028（R2=0.9998）。取1 mL上述提取液于10 mL容量瓶中，加入2 mL三氯化铝溶液（0.1 mol/L）和3 mL乙酸钾溶液（1 mol/L），用70%甲醇定容至10 mL，摇晃均匀，室温静置反应30 min，以4000 r/min离心10 min，用70%甲醇替代提取液作为空白对照，在420 nm处测吸光值。通过回归方程计算样品中总黄酮含量。
1.2.3.7 总多酚含量
采用福林酚法，参考洪佳敏等[27−28]和MEHDI等[28]的方法，稍作修改。用没食子酸为标准品绘制标准曲线，得到回归方程y=95.078x−0.0806（R2=0.9998）。取1 mL提取液，加入2.5 mL福林酚试剂，摇匀，静置5 min，再加入2.5 mL的15%碳酸钠溶液，用水定容至10 mL，摇匀后40 ℃水浴避光反应1 h。若溶液浑浊，则以4000 r/min离心10 min，取蓝色上清液，于778 nm处测吸光值。通过回归方程计算样品中总多酚含量。
1.2.4 相关酶活性测定
1.2.4.1 苯丙氨酸解氨酶活性
称取1 g样品于预冷的研磨管中，加入10 mL 0.1 mol/L硼酸缓冲液（pH8.8，内含1 mmol/L的EDTA，5 mmol/L β-巯基乙醇和质量分数1%聚乙烯吡咯烷酮和体积分数5%的甘油）及适量钢珠，在冷冻研磨机中，4 ℃研磨30 min，随后在4 ℃条件下10000 r/min低温离心10 min。取1 mL粗酶液加入1 mL苯丙氨酸溶液（0.02 mol/L）和2 mL 0.1 mol/L硼酸缓冲液（pH8.8）。空白对照组将粗酶液换为等量的蒸馏水。溶液混匀后将反应液置于30 ℃恒温水浴恒温反应60 min后加0.1 mL HCl（5 mol/L）终止反应。在290 nm处每增加0.01的吸光值记为1个酶活单位。苯丙氨酸解氨酶活性由公式（1）计算。
(1) 式中：U为苯丙氨酸解氨酶活性[U/（g·h）]，ΔA为反应前后测试液吸光度的差值，V1为苯丙氨酸解氨酶提取液的总体积（mL），m为称取样品的质量（g），t为反应时间（h），V2为参加反应的苯丙氨酸解氨酶液体积（mL）。
1.2.4.2 多酚氧化酶活性
取待测样品0.50 g，加入0.30 g PVPP、适量石英砂和10 mL的柠檬酸-磷酸缓冲液（pH5.6），冰浴研磨成浆后，置于4 ℃冰箱中浸提12 h，然后以8000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液。取1 mL粗酶液、3 mL反应混合液（pH为6.0的柠檬酸-磷酸缓冲液、0.1%脯氨酸溶液、1.5%邻苯二酚溶液按体积比10:2:3混合），于37 ℃下恒温水浴5 min后混合，反应10 min后立即加入1 mol/L偏磷酸溶液3 mL终止反应，用10 mm比色皿测定460 nm处的吸光度，空白对照液中用pH为6.0的缓冲液代替邻苯二酚。根据多酚氧化酶活力单位的定义，1个酶活单位即1 min每克样品OD460值增加0.001，符号为U/（g·min），多酚氧化酶活性由公式（2）计算。
(2) 式中：U为多酚氧化酶活性[U/（g·min）]，ΔA为反应前后测试液吸光度的差值，Vt为多酚氧化酶提取液的总体积（mL），W为称取样品的质量（g），t为反应时间（min），V2为参加反应的多酚氧化酶液体积（mL）。
1.3 数据处理
所有试验均重复三次，利用SPSS进行数据统计分析，数据用平均值±标准方差表示，采用单因素方差分析和Duncan's multiple range 检验确定各处理间的差异，通过Origin软件进行作图。计算Pearson相关性系数，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异非常显著，P<0.001表示差异极显著，利用Biologists绘制相关性热图。
2. 结果与分析
2.1 菌株的形态特征和表征鉴定
采用稀释涂布法从8种市售黑茶中分离优势真菌。每种黑茶中各分离出一株金黄色候选真菌，共8株，分别命名为SH（三鹤菌）、LB（六堡菌）、JM（金叶蔓子菌）、JW（泾渭菌）、AH（安化菌）、TZ（特制菌）、YZ（雅安藏茶菌）及JY（泾阳菌）。分离菌株在PDA培养基上生长5 d的菌落形态见图1，不同来源冠突散囊菌候选菌的生长形态特征与菌落形态存在较大差异。菌株SH、JM、JW和AH在PDA培养基上菌丝呈针状散射形，菌落边缘呈规则锯齿状；菌株LB、YZ、TZ和JY在PDA培养基上菌落呈绒状。8株菌株的菌落形态大同小异，内圈呈棕褐色，外圈呈淡黄色。TZ菌株在5 d已产生较多黑褐色液体（图1E）。培养基的营养成分、渗透压及pH等因素都会影响冠突散囊菌的生长情况和生殖方式[3]。培养基的渗透压会影响冠突散囊菌的生殖方式，当渗透压低时，冠突散囊菌呈有性生殖；当渗透压高时，冠突散囊菌呈无性生殖[2,5]。参考《真菌鉴定手册》和《中国真菌志 第5卷》[29]，初步推断菌株SH、LB、JM、JW、TZ、AH、YZ及JY可能为冠突散囊菌候选菌株。
![]()
图 1 候选冠突散囊菌的菌落形态和生长曲线注：A~H为分离菌株在PDA培养基的菌落形态特征，分别对应A-SH、B-LB、C-JM、D-JW、E-TZ、F-AH、G-YZ、H-JY；I为分离菌株的拟合生长曲线。Figure 1. Colony morphology and growth curves of candidate Eurotium cristatum strains由图1I的生长曲线图可知，不同菌株在PDA培养基中生长速率差异较大。生长时间0~2 d为菌株生长迟缓期，整个菌落生长缓慢呈白色或淡黄色；2~26 d为菌株生长对数期，生长速度迅速，菌落呈稳定的倍数增大，菌落内圈从金黄色变成棕色，产生黑色的小水珠和灰白色粉末，菌落外圈呈金黄色或淡黄色；在26 d以后，菌株进入稳定期，整个菌落呈棕色，并产生大量的黑色液珠。其中，AH和YZ在对数生长期的速率最快，且皆较早达到稳定期（约18 d左右），但YZ的生长速率更高，其菌落直径明显大于AH（图1I）。8株菌中，JM菌的生长速率最低。JM和JY的生长曲线较为平缓，32 d时尚未到达明显稳定期，但JY的生长速率更高，其菌落直径明显大于JM。其他菌株生长速率介于上述两类菌之间。
2.2 菌株的分子生物学鉴定
基于rDNA的ITS区序列是真菌菌种分子鉴定的重要DNA条形码，但其并不适用于曲霉属、枝孢菌属、镰刀菌属和青霉属等[30−32]，因此，还可以通过一些特异性序列，如β-微管蛋白（tub2/BenA）、RNA聚合酶的最大亚基（RPB1）和第二大亚基（RPB2）基因、翻译延伸因子1-α（tef1）和钙调素（CaM）等的基因序列对真菌进行分子鉴定[30−32]。冠突曲菌（A. cristatus）和谢瓦氏曲菌（Aspergillus chevalieri，简写为A. chevalieri）皆为在黑茶中存在的金黄色曲霉，性状比较接近，较难区分[32,34−35]。本研究扩增候选菌的BenA基因序列，并通过NCBI的GenBank数据库进行序列Blast比对。选取同源性较高的序列，进一步基于BenA基因序列通过Neighbor Jointing法构建系统发育树，以鉴定不同黑茶来源的优势菌。如图2所示，A. cristatus和A. chevalieri分属于发育树的两个分支，且区别于A. amstelodami, A. proliferans等曲霉所在的分支，说明BenA基因序列可以有效区分冠突曲菌、谢瓦氏曲霉以及其他真菌。从图2可知，JY、JM、LB、TZ、JW、SH和YZ菌株的序列相似性较高，皆属于冠突曲霉分支。结合形态特征，将上述7种菌株认定为冠突散囊菌。AH位于A. chevalieri分支，与该种亲缘关系接近，而与冠突曲霉的亲缘关系相对较远，因此将AH认定为谢瓦氏曲霉。另外，JY、TZ、JM、JW、SH 和YZ菌株之间的差异可能无法通过BenA序列进行有效区分，或可结合CaM和 RPB2 等鉴定基因，以及其他孤儿基因序列等进行进一步鉴别[30,34]。
![]()
图 2 基于BenA基因序列构建的菌株系统发育树Figure 2. Phylogenetic tree of strains constructed based on BenA gene sequence2.3 苦荞发酵后营养和功能成分的含量变化
图3A为不同菌株发酵的苦荞籽粒总淀粉的含量。发酵后苦荞籽粒的总淀粉含量均显著减少（P<0.05），其总淀粉含量范围为168.77±19.82~256.27±12.61 mg/g，较未发酵组（596.65±15.62 mg/g）降低了57.05%~64.98%。其中，YZ发酵后，总淀粉降低最多，达64.98%。样品中的总淀粉含量从高到低排序依次是CK>AH>TZ>JM>JW>SH>JY>LB>YZ。还原糖是影响食品口感的重要成分，其分子结构中含有游离半缩醛羟基或半缩酮羟基，具有较强的还原能力和抗氧化性。如图3B所示，不同菌株发酵后苦荞籽粒中的还原糖含量较未发酵组（6.69±0.70 mg/g）均显著升高（P<0.05），其含量范围为216.79±11.44~291.38±11.26 mg/g。其中，经菌株YZ发酵后的苦荞籽粒中还原糖含量最高，是未发酵组的43.55倍。冠突散囊菌在发酵期间可分泌如淀粉酶和纤维素酶等的胞外酶[6−7]，可将苦荞籽粒的淀粉和纤维素等多糖分解成小分子糖，从而使还原糖含量升高，且为其生长繁殖提供碳源。苦荞蛋白是苦荞中重要的营养物质之一，其氨基酸组成均衡，能够满足人体对必需氨基酸的需求，是苦荞及其制品品质的重要评价指标之一。苦荞籽粒发酵前后的可溶性蛋白含量变化如图3C所示，发酵后，苦荞籽粒中可溶性蛋白含量为2.67±0.09~4.06±0.03 mg/g，较未发酵组（4.90±0.06 mg/g）均显著降低（P<0.05）。其中，菌株YZ发酵后可溶性蛋白降低程度最小，约为发酵前含量的80.24%。图3D显示了不同冠突散囊菌发酵后苦荞籽粒中脂肪的含量。发酵后，苦荞籽粒中脂肪含量为32.24±1.01~54.56±3.18 mg/g，较未发酵组（99.71±1.47 mg/g）显著降低（P<0.05）。其中，菌株SH、TZ、AH及YZ发酵后脂肪含量下降幅度最小。不同实验组的脂肪含量从高到低的排序为：CK>SH>TZ>AH>YZ>JW>LB>JY>JM。冠突散囊菌基因组含有丰富的纤维素酶、蛋白酶、氧化酶和脂肪酶相关基因[3,35]，可将蛋白分解成肽和氨基酸，以利于菌体吸收和利用[4,36]。蛋白质和氨基酸还会被微生物产生的水解酶催化发生脱羧和脱氨反应，成为微生物生长需要的氮源[37]。与黄酮和多酚的转化效果类似，AH菌株对还原糖、淀粉等的水解效果亦与其他冠突散囊菌无明显区别。
![]()
图 3 不同冠突散囊菌发酵前后营养功能成分的含量变化注：A.总淀粉；B.还原糖；C.可溶性蛋白质；D.脂肪；E.总黄酮；F.总多酚。CK为未发酵对照；图中不同的小写字母表示差异显著性，P<0.05，图4同。Figure 3. Changes in the content of nutritional and functional components before and after fermentation of different strains黄酮类化合物是苦荞的重要活性物质。冠突散囊菌固态发酵能提高发酵体系的黄酮类化合物含量[38]，其固态发酵葡萄渣籽[39]和豆类[18,40]后，体系总黄酮的含量和抗氧化能力均显著提高。为比较不同黑茶来源冠突散囊菌的生物转化效果，将7株分离菌株分别接种苦荞籽粒并固态发酵10 d。同时接种AH菌株，以比较不同菌种的转化效果。发酵前后苦荞中总黄酮和总多酚的含量变化如图3所示，经不同菌发酵后，苦荞籽粒中总黄酮含量的浓度范围在10.16±0.47~14.44±0.30 mg/g（图3E），除JM组与未发酵组差异不明显外，其余组含量较未发酵组（10.02±0.12 mg/g）均有显著提高。其中，经菌株LB、AH和YZ发酵的苦荞籽粒中总黄酮含量增加最显著，分别达14.37±0.75 mg/g、13.70±0.57 mg/g和14.44±0.30 mg/g，较未发酵苦荞籽粒分别提高了43.41%、36.73%和44.11%。多酚类化合物是苦荞的重要活性成分之一，具有抗氧化和降血糖等功效[21]。8种菌发酵苦荞籽粒前后的总多酚含量范围为10.48±0.54~16.34±0.70 mg/g（图3F）。其中，经菌株JW和YZ发酵的苦荞籽粒中总多酚含量增加最显著，分别达16.34±0.70 mg/g和16.05±0.46 mg/g，较未发酵苦荞籽粒（11.40±0.38 mg/g）分别提高了43.33%和40.79%；而经菌株JY发酵的苦荞籽粒中总多酚含量显著低于其他发酵组，与未发酵组差异不明显。样品总多酚含量从高到低依次是JW>YZ>TZ>LB>AH>SH>JM>CK>JY。因此，苦荞籽粒总黄酮和总多酚的含量经发酵后在不同菌株间存在显著差异，且经冠突散囊菌发酵后，多数菌株发酵后呈现上调趋势。植物富含多酚类化合物，但可溶性游离酚含量较少。大部分多酚类化合物是与细胞壁上的糖类和蛋白质等成分共价结合，以不溶性结合酚形式存在[41]。固态发酵过程中，冠突散囊菌会分泌丰富的水解酶，催化细胞壁结构成分和不溶性结合酚类之间的共价键的水解，促进可溶性多酚的释放[42]。此外，微生物的代谢活动和酶促反应能促进多酚类物质的代谢生成，从而提高总多酚的含量[36,42−43]。从图3可知，AH菌株虽为谢瓦氏曲霉，但其对苦荞黄酮和多酚亦有较好的转化效果。
2.4 发酵前后苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶的活性变化
苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷类化合物生物合成途径中的关键限速酶[44]，其催化L-苯丙氨酸经非氧化脱氨基作用生成反式肉桂酸，将碳通量从初级代谢途径分流引导至反式肉桂酸合成途径，再进一步转化为不同的次级代谢物，包括黄酮类化合物、木质素及生物碱等。如图4A所示，不同菌株发酵体系中苯丙氨酸解氨酶的活性差异较明显。发酵组的苯丙氨酸解氨酶活力范围为6.67±1.40~98.06±7.94 U/（g·h），其中，经菌株YZ发酵后的最高，其次为JW，显著高于其他菌株（P<0.05）。各组苯丙氨酸解氨酶的活力值从高到低分别是YZ>JW>LB>TZ>AH>SH>JM>JY>CK。多酚氧化酶是广泛存在植物中的三型铜氧化还原酶，也是参与多种酚类物质交联聚合形成的活性酶，其通过单羟基酚羟基化生成邻位双酚，再氧化成醌类化合物，与蛋白质和氨基酸聚合形成黑色素。研究表明，植物中多酚氧化酶活性与多酚含量呈正相关[45]。不同菌株发酵后体系中多酚氧化酶的活性差异显著（图4B）。发酵组的多酚氧化酶活力范围为7.47±2.00~34.66±3.09 U/（g·min）之间。其中，经菌株YZ发酵后体系多酚氧化酶活力最高，其次为TZ，菌株JY的最低。各体系中多酚氧化酶活力值从高到底依次是YZ>TZ>JW>JM>AH>LB>SH>JY>CK。未发酵组均未检测出酶活性，可能是高温高压灭菌处理有效杀灭了苦荞籽粒本身的酶活性。因此，发酵后的苦荞的黄酮含量提高可能与菌株中苯丙氨酸解氨酶的活性密切相关。分析NCBI数据库中的冠突曲霉的基因组数据[3,35]，发现其中含有潜在的苯丙氨酸解氨酶（Accession：ODM22472.1）和酚氧化酶（Accession：ODM14462.1）基因。冠突散囊菌在生长和发酵期间能产生大量的黑色素，如图1所示，推测这可能与其酚氧化酶的酶活性密切相关。黑色素具有抗氧化、抗辐射、抗菌等功能[46]，可进一步提高苦荞的生物学活性。与转化黄酮和多酚等营养成分的效果类似，AH菌株亦表现出与冠突散囊菌类似的苯丙氨酸解氨酶活性和多酚氧化酶活性，进一步验证了黑茶来源的冠突散囊菌与谢瓦氏曲霉的相似性。此外，谢瓦氏曲霉的基因组中也发现有苯丙氨酸解氨酶（Accession：XP_043131183.1）和酚单氧化酶（Accession：XP_043138668.1）候选基因的存在。因此，黑茶来源的两种“金花”菌在茶叶等基质的生物转化过程中的异同点值得通过比较基因组学、功能基因组学、比较转录组学等方法进行进一步研究。
![]()
图 4 不同冠突散囊菌发酵前后苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性的变化Figure 4. Changes in the activities of phenylalanine ammonia lyase and polyphenol oxidase before and after fermentation by different strains2.5 苦荞营养功能成分与酶活力关系的热图分析
为分析发酵前后苦荞籽粒营养成分的变化是否与冠突散囊菌的酶催化作用相关，分析了苦荞籽粒的营养成分之间以及与苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶的酶活力之间的相关性，如图5所示。结果发现，苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活力、总黄酮与总多酚含量呈极显著正相关（相关性系数皆大于0.6，且P<0.001），而总淀粉含量与还原糖含量呈极显著负相关（相关性系数为-0.96，且P<0.001）。提示发酵后苦荞营养成分的变化与冠突散囊菌酶活力密切相关。冠突散囊菌基因组中发现有苯丙氨酸解氨酶和酚氧化酶的编码基因，以及丰富的纤维酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶相关基因[3,35]。谷物中大多数酚类化合物是通过醚、酯或糖苷键等化学键与细胞壁结构成分共价结合，以不溶的结合形式存在，难以提取；仅有少量的酚类化合物是以简单、可溶性游离酯的形式存在[47−48]。在固态发酵过程中，微生物（尤其是真菌）可以分泌多种水解醚、酯或糖苷键的酶，有效作用于细胞壁结构[3,47−48]，从而促进细胞壁中不溶性化合物的释放，进而提高了谷物制品的生物学活性[47−48]。研究显示，多种丝状真菌在固态发酵豆谷类时β-糖苷酶表现活跃，如泡盛曲霉[49]、米曲霉[49]、安康曲霉[50]、酱油曲霉[51]、冠突曲霉[52]等。因此，冠突散囊菌发酵后总黄酮和多酚类化合物含量的提高，一方面可能是因为苯丙氨酸解氨酶促进了黄酮类化合物的合成，另一方面可能是菌分泌的胞外水解酶（如纤维素酶、淀粉酶、酚氧化酶等）有效促进了酚类物质从发酵基质中的释放[3,35,42,52]。因此，冠突散囊菌固态发酵是改善植物生物活性成分，并制备具有优异生物活性的苦荞产品/成分的一种有效方法。
![]()
图 5 苦荞中不同营养功能成分之间以及与苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性的相关性热图注：红色代表正相关（数值越大），蓝色代表负相关（数值越小）；颜色越深，相关性越显著；*代表差异显著（P<0.05），**代表差异非常显著（P<0.01），***代表差异极显著（P<0.001）。Figure 5. Heat map of the correlation between different nutritional and functional components in Tartary buckwheat and the activities of phenylalanine ammonia lyase and polyphenol oxidase3. 结论
从陕西、湖南、广西等多地的黑茶中分离“金花菌”菌株，通过其形态表观特征与分子生物学技术结合，最终鉴定得到SH、LB、JM、JW、TZ、YZ和JY共7株冠突散囊菌，AH为谢瓦氏曲霉。BenA基因序列在线比对结合系统进化树构建可以较好地区分黑茶中的冠突散囊菌、谢瓦氏曲霉和其他真菌。不同黑茶来源的冠突散囊菌固态发酵后，苦荞的营养功能成分中还原糖含量大幅提高，总淀粉、脂肪和可溶性蛋白含量显著降低，且总淀粉含量与还原糖含量呈极显著负相关。总黄酮除JM菌外，总多酚除JY菌外，其他菌株发酵苦荞后，体系总黄酮和总多酚呈现增加趋势，增加程度不尽相同。发酵后，体系的苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶均得到显著提高，且两种酶活力与总黄酮和总多酚含量成显著正相关关系。因此，发酵后苦荞中营养功能物质的变化与冠突散囊菌中酶的活性密切相关。本研究为新型苦荞产品的开发提供了有效的理论指导。
-
![]()
图 1 候选冠突散囊菌的菌落形态和生长曲线
注：A~H为分离菌株在PDA培养基的菌落形态特征，分别对应A-SH、B-LB、C-JM、D-JW、E-TZ、F-AH、G-YZ、H-JY；I为分离菌株的拟合生长曲线。
Figure 1. Colony morphology and growth curves of candidate Eurotium cristatum strains
![]()
图 2 基于BenA基因序列构建的菌株系统发育树
Figure 2. Phylogenetic tree of strains constructed based on BenA gene sequence
![]()
图 3 不同冠突散囊菌发酵前后营养功能成分的含量变化
注：A.总淀粉；B.还原糖；C.可溶性蛋白质；D.脂肪；E.总黄酮；F.总多酚。CK为未发酵对照；图中不同的小写字母表示差异显著性，P<0.05，图4同。
Figure 3. Changes in the content of nutritional and functional components before and after fermentation of different strains
![]()
图 4 不同冠突散囊菌发酵前后苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性的变化
Figure 4. Changes in the activities of phenylalanine ammonia lyase and polyphenol oxidase before and after fermentation by different strains
![]()
图 5 苦荞中不同营养功能成分之间以及与苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性的相关性热图
注：红色代表正相关（数值越大），蓝色代表负相关（数值越小）；颜色越深，相关性越显著；*代表差异显著（P<0.05），**代表差异非常显著（P<0.01），***代表差异极显著（P<0.001）。
Figure 5. Heat map of the correlation between different nutritional and functional components in Tartary buckwheat and the activities of phenylalanine ammonia lyase and polyphenol oxidase
-
[1] 温琼英. 茯砖茶中优势菌的种名鉴定[J]. 中国茶叶,1990(6):2−3. [WEN Q Y. Identification of dominant bacterial species in Fuzhuan tea[J]. Chinese Tea,1990(6):2−3.] WEN Q Y. Identification of dominant bacterial species in Fuzhuan tea[J]. Chinese Tea, 1990（6）: 2−3.
[2] HUKBA V, KOLARIK M, KUBATOVA A, et al. Taxonomic revision of Eurotium and transfer of species to Aspergillus[J]. Mycologia,2013,105(4):912−937. doi: 10.3852/12-151
[3] GE Y Y, WANG Y C, LIU Y X, et al. Comparative genomic and transcriptomic analyses of the Fuzhuan brick tea-fermentation fungus Aspergillus cristatus[J]. BMC Genomics,2016,17(1):428.
[4] 刘玉倩, 杨家干. 茯砖茶发花过程菌落及主要内含物质变化[J]. 蚕桑茶叶通讯,2017(5):30−33. [LIU Y Q, YANG J G. Changes in bacterial colonies and main contents during the flowering process of Fuzhuan tea[J]. Sericulture and Tea Communication,2017(5):30−33.] doi: 10.3969/j.issn.1007-1253.2017.05.013 LIU Y Q, YANG J G. Changes in bacterial colonies and main contents during the flowering process of Fuzhuan tea[J]. Sericulture and Tea Communication, 2017（5）: 30−33. doi: 10.3969/j.issn.1007-1253.2017.05.013
[5] 温琼英. 茯砖茶中主要微生物的研究[J]. 茶叶通讯,1986(4):19−21. [WEN Q Y. A study on the main microorganisms in Fuzhuan tea[J]. Tea Communication,1986(4):19−21.] WEN Q Y. A study on the main microorganisms in Fuzhuan tea[J]. Tea Communication, 1986（4）: 19−21.
[6] ZHU M Z, LI N, ZHOU F, et al. Microbial bioconversion of the chemical components in dark tea[J]. Food Chemistry,2020,312:126043. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.126043
[7] 蔡正安, 刘素纯, 刘仲华, 等. 茯砖茶中冠突散囊菌纤维素酶的酶学性质研究[J]. 茶叶科学, 2010, 30 (1):57-62. [CAI Z A, LIU S C, LIU Z H, et al. Study on the enzymatic properties of cellulase from Fusarium oxysporum in Fuzhuan tea [J] Tea Science, 2010, 30(1):57-62.] CAI Z A, LIU S C, LIU Z H, et al. Study on the enzymatic properties of cellulase from Fusarium oxysporum in Fuzhuan tea [J] Tea Science, 2010, 30（1）: 57-62.
[8] DU Y, YANG W R, YANG C C, et al. A comprehensive review on microbiome, aromas and flavors, chemical composition, nutrition and future prospects of Fuzhuan brick tea[J]. Trends in Food Science & Technology,2022,119:452−466.
[9] LI Q, JIN Y L, JIANG R G, et al. Dynamic changes in the metabolite profile and taste characteristics of Fu brick tea during the manufacturing process[J]. Food Chemistry,2021,344:128576.
[10] ZHU Y F, CHEN J J, JI X M, et al. Changes of major tea polyphenols and production of four new B-ring fission metabolites of catechins from post-fermented Jing-Wei Fu brick tea[J]. Food Chemistry,2015,170:110−117. doi: 10.1016/j.foodchem.2014.08.075
[11] 陈然, 郝彬秀 , 田海霞, 等. 六堡茶真菌分布浅析及金花菌筛选鉴定[J]. 食品科技, 2016, 41(4):19-23. [CHEN R, HAO B X, TIAN H X, et al. Analysis of fungal distribution in Liubao tea and screening and identification of golden flower fungi[J]. Food Technology, 2016, 41(4):19-23.] CHEN R, HAO B X, TIAN H X, et al. Analysis of fungal distribution in Liubao tea and screening and identification of golden flower fungi[J]. Food Technology, 2016, 41（4）: 19-23.
[12] JIANG C K, ZENG Z, HUANG Y H, et al. Chemical compositions of Pu'er tea fermented by Eurotium cristatum and their lipid-lowering activity[J]. LWT-Food Science and Technology,2018,98:204−211.
[13] LI Q, LIU Z H, HUANG J A, et al. Anti-obesity and hypolipidemic effects of Fuzhuan brick tea water extract in high-fat diet-induced obese rats[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2013,93(6):1310−1316. doi: 10.1002/jsfa.5887
[14] KANG D, SU M, DUAN Y, et al. Eurotium cristatum, a potential probiotic fungus from Fuzhuan brick tea, alleviated obesity in mice by modulating gut microbiota[J]. Food Function,2019,10(8):5032−5045.
[15] KELLER A C, WEIR T L, BROECKLING C D, et al. Antibacterial activity and phytochemical profile of fermented Camellia sinensis (fuzhuan tea)[J]. Food Research International,2013,53(2):945−949.
[16] LI M Y, WU Y P, ZHONG K, et al. Structural characteristics and hypolipidemic activity of theabrownins from dark tea fermented by single species Eurotium cristatum PW-1[J]. Biomolecules,2020,10:204.
[17] WU X, YAO X S, CHEN Y L, et al. Metabolite profiling, antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of buckwheat processed by solid-state fermentation with Eurotium cristatum YL-1[J]. Food Research International,2021,143:110262.
[18] CHEN Y, WANG Y, CHEN J, et al. Bioprocessing of soybeans (Glycine max L.) by solid-state fermentation with Eurotium cristatum YL-1 improves total phenolic content, isoflavone aglycones, and antioxidant activity[J]. RSC Advances,2020,10(29):16928−16941.
[19] 唐梓尧, 刘素纯, 林辉, 等. 冠突散囊菌发酵制备燕麦面酱工艺研究[J]. 中国酿造,2019,38(2):117−121. [TANG Z Y, LIU S C, LIN H, et al. Preparation technology of oat flour paste fermented by Eurotium cristatum[J]. China Brewing,2019,38(2):117−121.] doi: 10.11882/j.issn.0254-5071.2019.02.022 TANG Z Y, LIU S C, LIN H, et al. Preparation technology of oat flour paste fermented by Eurotium cristatum[J]. China Brewing, 2019, 38（2）: 117−121. doi: 10.11882/j.issn.0254-5071.2019.02.022
[20] 李粟琳, 张翔宇, 王洋, 等. 可发酵三七等中药材的食用菌种筛选和皂苷生物转化产物的分析[J]. 食品与发酵工业,2017,43(12):164−168. [LI S L, ZHANG X Y, WANG Y, et al. Screening of edible fungi for fermentation of Panax notoginseng Chinese medicinal herbs and analysis of biotransformation products of saponins[J]. Food and Fermentation Industries,2017,43(12):164−168.] LI S L, ZHANG X Y, WANG Y, et al. Screening of edible fungi for fermentation of Panax notoginseng Chinese medicinal herbs and analysis of biotransformation products of saponins[J]. Food and Fermentation Industries, 2017, 43（12）: 164−168.
[21] ZOU L, WU D, REN G, et al. Bioactive compounds, health benefits, and industrial applications of Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum)[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2023,63(5):657−673. doi: 10.1080/10408398.2021.1952161
[22] LUTHAR Z, GOLOB A, GERM M, et al. Tartary buckwheat in human nutrition[J]. Plants (Basel, Switzerland),2021,10(4):700.
[23] 石桃雄, 郑俊青, 黎瑞源, 等. 苦荞种质资源种子蛋白质及组分含量的变异分析[J]. 河南农业科学,2021,50(9):25−35. [SHI T X, ZHEN J Q, Li R Y, et al. Analysis of variation in seed protein and component content of tartary buckwheat germplasm resources[J]. Henan Agricultural Science,2021,50(9):25−35.] SHI T X, ZHEN J Q, Li R Y, et al. Analysis of variation in seed protein and component content of tartary buckwheat germplasm resources[J]. Henan Agricultural Science, 2021, 50（9）: 25−35.
[24] 索化夷, 赵欣, 骞宇, 等. 永川豆豉发酵过程中总糖和氨基酸变化与滋味的形成[J]. 食品科学,2015,36(21):100−104. [SUO H Y, ZHAO X, QIAN Y, et al. The changes in total sugar and amino acids during the fermentation process of Yongchuan fermented soybean and the formation of taste[J]. Food Science,2015,36(21):100−104.] doi: 10.7506/spkx1002-6630-201521020 SUO H Y, ZHAO X, QIAN Y, et al. The changes in total sugar and amino acids during the fermentation process of Yongchuan fermented soybean and the formation of taste[J]. Food Science, 2015, 36（21）: 100−104. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201521020
[25] 姜惠萍, 刘万顺, 宋福来, 等. 改良考马斯亮蓝试剂法测定壳聚糖及其衍生物中蛋白质含量[J]. 现代食品,2022,28(17):173−178. [JIANG H P, LIU W S, SONG F L, et al. Improved Coomassie brilliant blue reagent method for determining protein content in chitosan and its derivatives[J]. Modern Food,2022,28(17):173−178.] JIANG H P, LIU W S, SONG F L, et al. Improved Coomassie brilliant blue reagent method for determining protein content in chitosan and its derivatives[J]. Modern Food, 2022, 28（17）: 173−178.
[26] 叶兴乾, 沈淑妤, 黄睿, 等. 谷物食品总黄酮比色法定量的问题及选用原则[J]. 中国食品学报,2018,18(2):1−14. [YE X Q, SHEN S Y, HUANG R, et al. The problems and selection principles of colorimetric quantification of total flavonoids in cereal food[J]. Chinese Journal of Food Science,2018,18(2):1−14.] YE X Q, SHEN S Y, HUANG R, et al. The problems and selection principles of colorimetric quantification of total flavonoids in cereal food[J]. Chinese Journal of Food Science, 2018, 18（2）: 1−14.
[27] 洪佳敏, 林宝妹, 张树河, 等. 4种藜麦抗氧化活性比较研究[J]. 粮食与油脂,2020,33(8):51−53. [HONG J M, LIN B M, ZHANG S H, et al. Comparative study on antioxidant activity of four types of quinoa[J]. Grain and Oil,2020,33(8):51−53.] doi: 10.3969/j.issn.1008-9578.2020.08.014 HONG J M, LIN B M, ZHANG S H, et al. Comparative study on antioxidant activity of four types of quinoa[J]. Grain and Oil, 2020, 33（8）: 51−53. doi: 10.3969/j.issn.1008-9578.2020.08.014
[28] MEHDI R, AHMAD A, BEHNAZ T. Essential oil composition, total phenolic, flavonoid contents, and antioxidant activity of Thymus species collected from different regions of Iran[J]. Food Chemistry,2017,220:153−161. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.09.203
[29] 齐祖同. 中国真菌志 第五卷 曲霉属及其相关有性型[M]. 科学出版社. 1997. [QI Z T. The Aspergillus genus and its related sexual types in Volume 5 of the Chinese Fungal Flora [M]. Science Press, 1997.] QI Z T. The Aspergillus genus and its related sexual types in Volume 5 of the Chinese Fungal Flora [M]. Science Press, 1997.
[30] RAJA H A, MILLER A N, PEARCE C J, et al. Fungal identification using molecular tools:A primer for the natural products research community[J]. Journal of Natural Products,2017,80(3):756−770. doi: 10.1021/acs.jnatprod.6b01085
[31] PETERSON S W. Aspergillus and Penicillium identification using DNA sequences:barcode or MLST?[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2012,95(2):339−344.
[32] 余烨颖, 赵以桥, 曾昱龙, 等. β-微管蛋白联合ITS序列在金花菌鉴定中的应用[J]. 茶叶通讯,2020,47(2):255−261. [YU Y Y, ZHAO Y Q, ZENG Y L, et al. Application of β-tubulin combined with ITS sequence in the identification of golden flower fungus[J]. Tea Communication,2020,47(2):255−261.] doi: 10.3969/j.issn.1009-525X.2020.02.012 YU Y Y, ZHAO Y Q, ZENG Y L, et al. Application of β-tubulin combined with ITS sequence in the identification of golden flower fungus[J]. Tea Communication, 2020, 47（2）: 255−261. doi: 10.3969/j.issn.1009-525X.2020.02.012
[33] 赵仁亮, 吴丹, 姜依何, 等. 不同产区加工的茯砖茶中“金花”菌的分离及分子鉴定[J]. 湖南农业大学学报(自然科学版),2016,42(6):592−600. [ZHAO R L, WU D, JIANG Y K, et al. Isolation and molecular identification of "golden flower" bacteria in Fuzhuan tea processed from different production areas[J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Science Edition),2016,42(6):592−600.] ZHAO R L, WU D, JIANG Y K, et al. Isolation and molecular identification of "golden flower" bacteria in Fuzhuan tea processed from different production areas[J]. Journal of Hunan Agricultural University （Natural Science Edition）, 2016, 42（6）: 592−600.
[34] WANG Z, JIN Q, LI Q, et al. Multiplex PCR identification of Aspergillus cristatus and Aspergillus chevalieri in Liupao tea based on orphan genes[J]. Foods (Basel, Switzerland),2022,11(15):2217.
[35] 陈小红, 王靖芳, 郑欣萍,. 一株冠突散囊菌的分离鉴定、基因组成及其枇杷花发酵特性分析[J]. 微生物学通报,2023,50(12):5376−5391. [CHEN X H, WANG J F, ZHENG X P, et al. Isolation and identification, genetic composition, and fermentation characteristics analysis of an Eurotium cristatum in loquat flowers[J]. Microbiology Bulletin,2023,50(12):5376−5391.] CHEN X H, WANG J F, ZHENG X P, et al. Isolation and identification, genetic composition, and fermentation characteristics analysis of an Eurotium cristatum in loquat flowers[J]. Microbiology Bulletin, 2023, 50（12）: 5376−5391.
[36] CHEN M X, ZU Z Q, CHEN Q, et al. Untargeted and targeted metabolomics reveal changes in the chemical constituents of instant dark tea during liquid-state fermentation by Eurotium cristatum[J]. Food Research International,2021,148:110623.
[37] ZHU Y C, LUO Y H, WANG P P, et al. Simultaneous determination of free amino acids in Pu-erh tea and their changes during fermentation[J]. Food Chemistry,2016,194:643−649.
[38] 姜良珍, 王罗, 杨涛, 等. 冠突散囊菌及其发酵应用研究进展[J]. 食品工业科技,2022,43(4):454−462. [JIANG L Z, WANG L, YANG T, et al. Research progress on the application and fermentation of Eurotium cristatum[J]. Food Industry Technology,2022,43(4):454−462.] JIANG L Z, WANG L, YANG T, et al. Research progress on the application and fermentation of Eurotium cristatum[J]. Food Industry Technology, 2022, 43（4）: 454−462.
[39] ZHAO Y, LIU D, ZHANG J, et al. Improving soluble phenolic profile and antioxidant activity of grape pomace seeds through fungal solid-state fermentation[J]. Foods (Basel, Switzerland),2024,13(8):1158.
[40] HUANG Y X, CHEN Y L, FAN Z Y, et al. Effects of solid-state fermentation with Eurotium cristatum YL-1 on the nutritional value, total phenolics, isoflavones, antioxidant activity, and volatile organic compounds of black soybeans[J]. Agronomy,2021,11:1029. doi: 10.3390/agronomy11061029
[41] ACOSTA-ESTRADA, B A, GUTIERREZ-URIBE, J A, SERNA-SALDIVAR, S O. Bound phenolics in foods, a review[J]. Food Chemistry,2014,152:46−55.
[42] 陈如扬, 樊子依, 潘一玲, 等. 冠突散囊菌对植物酚类物质的生物转化及生物活性的影响[J]. 食品研究与开发,2022,43(8):193−201. [CHEN R Y, FAN Z Y, PAN Y L, et al. The effect of Eurotium cristatum on the biotransformation and biological activities of plant phenolic substances[J]. Food Research and Development,2022,43(8):193−201.] doi: 10.12161/j.issn.1005-6521.2022.08.026 CHEN R Y, FAN Z Y, PAN Y L, et al. The effect of Eurotium cristatum on the biotransformation and biological activities of plant phenolic substances[J]. Food Research and Development, 2022, 43（8）: 193−201. doi: 10.12161/j.issn.1005-6521.2022.08.026
[43] CHEN G, LU F J, WU S, et al. Enzymatic action mechanism of phenolic mobilization in oats (Avena sativa L.) during solid-state fermentation with Monascus anka[J]. Food Chemistry,2018,245:297−304. doi: 10.1016/j.foodchem.2017.10.086
[44] 崔建东, 李艳, 牟德华. 苯丙氨酸解氨酶(PAL)的研究进展[J]. 食品工业科技,2008,29(7):306−308. [CUI J D, LI Y, MOU D H. Research progress of phenylalanine ammonia lyase[J]. Science & Technology of Food Industry,2008,29(7):306−308.] CUI J D, LI Y, MOU D H. Research progress of phenylalanine ammonia lyase[J]. Science & Technology of Food Industry, 2008, 29（7）: 306−308.
[45] LIU R R, XU S H, LI J L, et al. Expression profile of a PAL gene from Astragalus membranaceus var. Mongholicus and its crucial role in flux into flavonoid biosynthesis[J]. Plant Cell Reports,2006,25(7):705−710. doi: 10.1007/s00299-005-0072-7
[46] 黄群, 李彦坡, 陈林杰, 等. 冠突散囊菌液态发酵过程中黑茶活性成分变化研究[J]. 食品科学,2007,28(12):231−234. [HUANG Q, LI Y P, CHEN L J, et al. Study on changes of active components in dark tea during liquid fermentation by Eurotium cristatum[J]. Food Science,2007,28(12):231−234.] doi: 10.3321/j.issn:1002-6630.2007.12.053 HUANG Q, LI Y P, CHEN L J, et al. Study on changes of active components in dark tea during liquid fermentation by Eurotium cristatum[J]. Food Science, 2007, 28（12）: 231−234. doi: 10.3321/j.issn:1002-6630.2007.12.053
[47] DEY T B, CHAKRABORTY S. JAIN K K, et al Antioxidant phenolics and their microbial production by submerged and solid-state fermentation process:A review[J]. Trends in Food Science & Technology,2016,53:60−74.
[48] MATINS S, MUSSATTO SI, MARTINES-AVILA G, et al. Bioactive phenolic compounds:Production and extraction by solid-state fermentation. A review[J]. Biotechnology Advances,2011,29(3):365−373. doi: 10.1016/j.biotechadv.2011.01.008
[49] BHANJA T, KUMARI A, & BANERJEE R. Enrichment of phenolics and free radical scavenging property of wheat koji prepared with two filamentous fungi[J]. Bioresource Technology,2009,100(11):2861−2866.
[50] BEI Q, CHEN G, LU F, et al. Enzymatic action mechanism of phenolic mobilization in oats (Avena sativa L.) during solid-state fermentation with Monascus anka[J]. Food Chemistry,2018,245:297−304. doi: 10.1016/j.foodchem.2017.10.086
[51] SALAR R K, PUREWAL S S, & SANDHU K S. Fermented pearl millet (Pennisetum glaucum) with in vitro DNA damage protection activity, bioactive compounds and antioxidant potential[J]. Food Research International,2017,100:204−210. doi: 10.1016/j.foodres.2017.08.045
[52] XIAO Y, WU X, YAO X, et al. Metabolite profiling, antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of buckwheat processed by solid-state fermentation with Eurotium cristatum YL-1[J]. Food Research International (Ottawa, Ont.),2021,143:110262. doi: 10.1016/j.foodres.2021.110262
-
期刊类型引用(5)
1. 陈聪，薛桥丽，胡永金，魏美娟，陈中爱. 云南木姜子醇提物抑菌活性及其稳定性研究. 食品工业科技. 2023(16): 147-154 . 
本站查看
2. 段雪娟，黄煜强，张潼，韩雅莉，吴克刚，黄庶识. 肉桂醛熏蒸对金黄色葡萄球菌胞内生物大分子的影响. 中国食品学报. 2023(10): 90-100 . 百度学术
3. 张文艳，李俊杰，艾玲松，李茂东，赵仲霞，师睿. 青花椒总生物碱对金黄色葡萄球菌抑菌活性研究. 工业微生物. 2023(06): 50-54 . 百度学术
4. 王建梅，王国盼，陆安静，秦琳，鲁艳柳，白朝钧，何芋岐，谭道鹏. 金钗石斛提取物对5种耐药菌的体外抑菌活性评价. 遵义医科大学学报. 2022(03): 334-338 . 百度学术
5. 黄藩，王迎春，叶玉龙，龚雪蛟，黄颖博，熊元元. 变温萎凋技术对贡眉白茶品质的影响. 中国农学通报. 2022(19): 159-164 . 百度学术
其他类型引用(6)
下载:
下载:
计量
- 文章访问数: 10
- HTML全文浏览量: 6
- PDF下载量: 3
- 被引次数: 11
