In Vitro Hypoglycemic, Hypolipidemic Activities and Antioxidant Capacity of Dark Tea and Pericarpium Citri Reticulatae Extract with Pericarpium Citri Reticulatae Volatile Oil
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摘要: 目的：探讨陈皮挥发油协同陈皮黑茶提取物的降糖降脂功能和抗氧化活性。方法：首先利用气相色谱法-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）分析了陈皮挥发油成分，再分别采用陈皮、黑茶、陈皮黑茶提取物和陈皮挥发油为原料，以阿卡波糖、奥利司他和维生素C（Vitamin C，VC）为对照，研究其对α-葡萄糖苷酶、胰α-淀粉酶、胰脂肪酶活性和对DPPH、ABTS+自由基清除率的影响。结果：柠檬烯为陈皮挥发油主要成分，其相对含量为62.89%；陈皮黑茶+挥发油组（0.1 mg/mL）对α-葡萄糖苷酶的抑制率达83.38%±1.82%，IC50值的顺序为：阿卡波糖<黑茶<陈皮黑茶+挥发油<陈皮黑茶<陈皮，所有组别对胰脂肪酶抑制率的IC50值在1.77~2.60 mg/mL范围内；陈皮黑茶+挥发油组（0.2 mg/mL）的DPPH自由基清除率为94.85%±1.39%；对ABTS+自由基清除率的IC50值在27.62~210.90 μg/mL；对DPPH自由基清除率的IC50值在46.73~68.39 μg/mL。陈皮黑茶所有组别对胰α-淀粉酶活性抑制率小于30%。结论：陈皮黑茶提取物具有良好的抗氧化能力与降糖、降脂活性，添加陈皮挥发油能提高陈皮黑茶提取物的抗氧化及降糖降脂能力。本研究为陈皮黑茶开发降血糖降血脂和抗氧化相关保健产品的研究提供理论基础。Abstract: Objective: Exploring the in vitro hypoglycemic, hypolipidemic and antioxidant activity of Pericarpium Citri Reticulatae volatile oil and dark tea/Pericarpium Citri Reticulatae extract. Methods: The volatile oil components of Pericarpium Citri Reticulatae were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and then the effects of Pericarpium Citri Reticulatae, dark tea, dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae extract and Pericarpium Citri Reticulatae volatile oil on in vitro α-glucosidase, pancreatic α-amylase, pancreatic lipase activity and the DPPH and ABTS+ free radicals scavenging capacity were studied with acarbose, orlistat and vitamin C (VC) as controls. Results: Limonene was the main component of Pericarpium Citri Reticulatae volatile oil, accounting for 62.89% of the total relative content. The inhibition rate of α-glucosidase of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae+volatile oil group (0.1 mg/mL) was 83.38%±1.82%, and the IC50 value was: acarbose<dark tea<dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae+volatile oil<dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae<Pericarpium Citri Reticulatae. The IC50 value of all groups on pancreatic lipase inhibition rate was in the range of 1.77~2.60 mg/mL. The DPPH free radical scavenging capacity of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae+volatile oil group at a concentration of 0.2 mg/mL was 94.85%±1.39%. The IC50 value of ABTS cation radical scavenging capacity was 27.62~210.90 μg/mL. The IC50 value of DPPH free radical scavenging capacity was 46.73~68.39 μg/mL. The inhibition rate of pancreatic α-amylase activity in the all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae was less than 30 %. Conclusion: The extract of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae has good antioxidant capacity and in vitro hypoglycemic and lipid-lowering activity, and the addition of volatile oil of Pericarpium Citri Reticulatae can improve the antioxidant, in vitro hypoglycemic and lipid-lowering ability of the extract of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae. This study provides a theoretical basis for the development of health care products related to hypoglycemic, hypolipidemic and antioxidation effects of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae.
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陈皮黑茶（Dark Tea with Pericarpium Citri Reticulatae）是以药食同源的新会陈皮与安化黑茶经冠突散囊菌（Eurotium cristatum）发酵后干燥制成的新工艺茶[1]。陈皮黑茶具有很高的营养价值和药用价值，主要含有黄酮类、多酚类和多糖类[2]，还含有茶多糖、茶多酚。而一些研究表明，茶多糖、茶多酚具有降糖、降脂作用[3−4]。陈皮（Pericarpium Citri Reticulatae）具有理气健脾、燥湿化痰功效[5]，其主要化学成分包括黄酮类、柠檬苦素、生物碱、挥发油等[6−7]。挥发油是陈皮的重要活性物质之一，目前陈皮挥发油中分离鉴定的化合物多达160多种，包括D-柠檬烯、γ-松油烯、β-月桂烯、α-蒎烯等[8]。经《本草纲目拾遗》记载，黑茶作为后发酵茶具有逐痰下气的功效[9]，富含自然生长代谢化合物与微生物发酵代谢的新成分，包括儿茶素类化合物、黄酮、酚酸、多糖、生物碱、萜类化合物等[10]。
糖脂代谢疾病，常常表现为肥胖或超重、非酒精性脂肪肝、II型糖尿病等以糖、脂代谢紊乱为关键触发因素的慢性、代谢性疾病，其病理学关键点包括胰岛素抵抗、炎症、肠道菌群失衡以及氧化应激等，因此对人类健康构成严重威胁[11−12]。目前，治疗糖脂代谢疾病常常需要长期用药，甚至需要终身用药来控制血糖、血脂水平以减少心脑血管疾病等并发症。在此过程中，药物的一些副作用也难以避免，尤其是他汀类、贝特类等调脂药物所致的肝功能损害、横纹肌溶解等不良反应[13]，以及降糖药物所致的胃肠道紊乱、乳酸性酸中毒等副作用，将会降低患者的服药依从性与生活质量[14]。因此，除了常规药物治疗外，能够同时兼顾疗效与安全的药食同源的天然药物，在辅助降糖调脂方面具有巨大的潜力。研究表明，陈皮黑茶能在临床上辅助治疗II型糖尿病和高脂血症，与单纯的二甲双胍或瑞舒伐他汀相比，联用陈皮黑茶后，患者的血糖、血脂水平显著改善[15−16]。而药理学方面的研究表明，陈皮黑茶对于高脂诱导的小鼠具有调节肠道菌群的能力，进而改善糖脂代谢紊乱[1]；而陈皮挥发油具有抗氧化活性，促进消化液分泌，排气和软化血管等功效[17]。崔佳韵等[18]评价了不同年份陈皮挥发油抗氧化活性，发现其均表现出清除和还原DPPH自由基、ABTS+自由基、羟基自由基的抗氧化能力。王娟[19]发现陈皮挥发油雾化治疗能够减轻COPD大鼠的肺病理损伤，发挥治疗呼吸系统的作用。同时一些挥发油具有一定的调节血脂功能，例如长期低剂量服用香薷挥发油对非高脂模型小鼠的胆固醇、甘油三酯水平均有显著降低[20]。然而，陈皮挥发油与陈皮黑茶提取物的生物活性的研究还很缺乏，通过添加挥发油辅助提高陈皮黑茶提取物功效作用研究较少。
本论文将研究陈皮、黑茶、陈皮黑茶、陈皮黑茶+挥发油的体外降糖、降脂、抗氧化活性，及陈皮黑茶提取物与陈皮挥发油是否具有协同抗氧化、降糖降脂作用，这为陈皮黑茶资源利用最大化和在功能性食品与医药产品的潜在应用提供理论支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新会陈皮 江门市新会区臻煌贸易有限公司；安化黑茶、陈皮黑茶 中茶湖南安化第一茶厂有限公司；阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）、胰脂肪酶（50 U/mL）、4-甲基伞形酮油酸酯（4-Methylumbelliferyl Oleate，4-MUO）、对硝基苯α-D-葡萄糖苷、维生素C（Vitamin C，VC）、2,2‘-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（2,2‘-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS） 上海Maclin生化技术有限公司；胰α-淀粉酶（2 U/mL）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源叶生物科技有限公司；奥利司他 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3,5-二硝基水杨酸、可溶性淀粉、酒石酸钾钠 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；过硫酸钾 分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司。
MA104/A电子分析天平（万分之一） 上海天美天平仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；UV-9600型紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司；INFINITE M 200 PRO型光栅型多功能微孔板检测仪 帝肯奥地利有限公司；T25 Basic ΜLTRA-TURRAX 高剪切混合器 德国 IKA-Werke 公司；HRP-100 超临界二氧化碳萃取系统 美国SUPERCRITIAL FLUID公司；Agilent 6809N气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；HR-06B 粉碎机 浙江哈瑞工贸有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 原料预处理
分别取新会陈皮、安化黑茶、陈皮黑茶放置于粉碎机内将其充分粉碎，过80目筛，过筛后的样品干燥储存。
1.2.2 陈皮、黑茶、陈皮黑茶提取物的制备
提取方法参照文献[21]并稍加修改。分别称取1.2.1预处理后的陈皮黑茶、黑茶和陈皮粉末，加入25倍样品质量（m/m）的蒸馏水，于沸水浴加热后浸泡1 h，100 ℃下回流加热1.5 h，过滤。再次加入25倍药材量的蒸馏水，于100 ℃下回流加热0.5 h，过滤。将两次滤液混合后进行减压浓缩、真空冷冻干燥，即得提取物，分别命名为陈皮黑茶组、黑茶组、陈皮组。
1.2.3 陈皮挥发油的制备
称取一定量预处理后的新会陈皮，装入萃取釜封紧，排出残余空气，在分离压力14 MPa，分离温度45 ℃下连续萃取120 min，从分离釜出口获得陈皮挥发油[8]。
1.2.4 陈皮挥发油的GC-MS分析
称取陈皮挥发油0.8 mL，置于20 mL容量瓶，用无水乙醇定容，摇匀后过0.45 μm滤膜进行GC-MS分析检测。GC-MS的条件如下：色谱柱：HP-5 MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 m）；载气为氦气（99.999%）；载气流速1.0 mL/min；进样口温度280 ℃；升温程序：起始柱温80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升温到320 ℃，然后保持6 min；进样量1 μL，不分流进样。质谱条件：电子轰击离子源，电子能量70 eV，离子温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质量扫描m/z 50～550，数据采集扫描模式为全扫描。挥发性化合物的定性分析：经过NIST08谱库检索、保留指数计算与http://webbook.nist.gov/chemistry/数据库文献值比较，经过质谱分析。
1.2.5 陈皮黑茶提取物+陈皮挥发油混合物的制备
用PBS缓冲液（pH7.0）溶解陈皮黑茶提取物，按陈皮黑茶提取物:陈皮挥发油=5.9:0.035（w/w）加入陈皮挥发油，高速6000 r/min 均质 2 min混匀，命名为陈皮黑茶+挥发油组。
1.2.6 体外降血糖活性的测定
α-葡萄糖苷酶活性抑制检测：将PBS缓冲液（pH7.0）制备0.02～1.0 mg/mL的样品溶液60 μL与1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液30 μL混匀，在37 ℃下孵育15 min。以30 μL对硝基苯α-D-葡萄糖苷（10 g/L）为底物，37 ℃水浴反应10 min后，以60 μL浓度为0.1 mol/L的Na2CO3终止反应。在405 nm处测定吸光度。以阿卡波糖为阳性对照。计算公式如下：
α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (1) 式中：A1：样品和酶反应后的吸光度；A2：样品和等量PBS反应后的吸光度；A0：酶和等量PBS反应后的吸光度。
胰α-淀粉酶活性抑制检测[21]：将0.4 mL的胰α-淀粉酶（2 U/mL）溶液在37 ℃下与0.2 mL样品溶液（0.02~10 mg/mL）预混合10 min，加入0.3 mL可溶性淀粉溶液（5%），反应10 min后加入DNS试剂2 mL（10 mg/mL 3, 5 -二硝基水杨酸和120 mg/mL酒石酸钾钠溶解于0.4 mol/L氢氧化钠水溶液中）以终止试验，在100 ℃下加热15 min。冷却后，在540 nm处测量吸光度。以阿卡波糖为阳性对照。计算公式为：
胰α-淀粉酶抑制率(%)=(1−A1−A2A3−A4)×100 (2) 式中：A1：样品和酶反应后的吸光度；A2：样品和等量PBS反应后的吸光度；A3：等量PBS和酶反应后的吸光度；A4：等量PBS和另一等量PBS反应后的吸光度。
1.2.7 体外降血脂活性的测定
参考文献[22]的方法并根据实际情况稍作修改。取一定浓度的样品溶液25 μL，加入以PBS缓冲液稀释为50 U/mL的胰脂肪酶溶液25 μL，混匀，在37 ℃孵育5 min。加入以PBS缓冲液稀释的4-MUO溶液（0.1 mmol/L）50 μL，避光反应20 min后，加入pH4.2、浓度为0.1 mol/mL的柠檬酸钠溶液100 μL终止反应。以奥利司他为阳性对照，在320 nm激发波长和450 nm发射波长下测量吸光度，其计算公式为：
胰脂肪酶抑制率(%)=(1−A1−A2A3−A4)×100 (3) 式中：A1：样品和酶反应后的吸光度；A2：样品和等量PBS反应后的吸光度；A3：等量PBS和酶反应后的吸光度；A4：等量PBS和另一等量PBS反应后的吸光度。
1.2.8 体外抗氧化活性的测定
样品溶液制备：用80%乙醇配成不同浓度的陈皮黑茶及其相关组别提取物的溶液。
DPPH自由基清除检测：取0.5 mL样品溶液（0.025~0.2 mg/mL），加入2.5 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L），避光缓慢摇匀30 min，在517 nm处测定吸光度，以VC为阳性对照。计算公式为：
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (4) 式中：A1：样品与DPPH反应后的吸光度；A2：样品与等量乙醇反应后的吸光度；A0：等量乙醇与DPPH反应后的吸光度。
ABTS+自由基清除检测：5 mL ABTS溶液（7 mmol/L）与88 μL K2S2O8溶液（40 mmol/L）混合，室温避光放置14 h，得ABTS+·溶液。经80%乙醇稀释后，ABTS+·溶液在734 nm处的吸光度约为0.7。取0.3 mL样品（0.02~0.2 mg/mL）与2.7 mL ABTS+·溶液充分混合，室温反应10 min。在734 nm处测量光吸收值。以VC为阳性对照。计算公式如下：
ABTS+自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (5) 式中：A1：样品与ABTS+·反应后的吸光度；A2：样品与等量乙醇反应后的吸光度；A0：等量乙醇与ABTS+·反应后的吸光度。
1.3 数据处理
实验平行重复3次，结果均采用平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism 9、Origin 2019b统计软件对数据进行分析与绘图，得到半数抑制（或清除）浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值，并采用单因素方差分析进行差异显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 陈皮挥发油化学成分分析结果
陈皮挥发油组成复杂，含有多种化合物，为探究其功能活性，需进行成分分析。本研究采用GC-MS对陈皮挥发油进行分析，研究结果与严绥平等[7]的结果相似。陈皮挥发油共分离出237个峰，通过NIST20数据库进行比对，鉴定出79种成分，运用峰面积归一化法计算各挥发性成分的百分含量，陈皮挥发油化学成分及其相对含量见表1。陈皮挥发油化学成分主要由烯和酯类化合物组成，柠檬烯所占的相对百分含量最高（62.89%），为陈皮挥发油的主要成分。其余成分还包括γ-萜品烯（16.47%）、对-伞花烃（3.17%）、邻氨基苯甲酸二甲酯（2.47%）、月桂烯（1.72%）、α-蒎烯（1.29%）、萜品油烯（1.11%）、β-蒎烯（1.10%）等。
表 1 陈皮挥发油成分分析Table 1. Analysis of volatile oil components in Pericarpium Citri Reticulatae序号 分类 化合物名称 保留时间（min） 匹配度（%） 相对含量（%） 1 烯 α-侧柏烯 17.4845 91 0.4268 2 α-蒎烯 17.9712 95 1.2951 3 3-亚甲基环庚烯 18.8212 70 0.0019 4 莰烯 18.9478 94 0.011 5 桧烯 20.6285 91 0.201 6 β-蒎烯 20.8843 91 1.101 7 月桂烯 21.8305 87 1.7197 8 α-萜品烯 23.6838 97 0.3111 9 柠檬烯 25.3499 97 62.89 10 （E）-Β-罗勒烯 25.9809 91 0.0358 11 γ-萜品烯 27.1103 96 16.4672 12 萜品油烯 28.9304 97 1.1138 13 1,3,8-对薄荷三烯; 30.569 93 0.0041 14 4-乙酰基-1-甲基环己烯 31.9342 94 0.0041 15 异萜品油烯 39.6645 94 0.0219 16 2,6-二甲基-2,6-辛二烯 47.1696 90 0.0242 17 3,4-二甲氧基苯乙烯 48.21 70 0.0551 18 1-十二烯 48.4908 86 0.009 19 石竹烯 51.8714 95 0.331 20 α-葎草烯 53.9863 98 0.0439 21 α-衣兰油烯 56.7595 93 0.0169 22 α-金合欢烯 57.0687 72 0.9767 23 δ-卡丁烯 58.157 98 0.1529 24 环氧石竹烯 61.8463 91 0.0283 25 角鲨烯 80.7433 91 0.1685 26 1,19-二十碳二烯 83.7363 95 0.1104 总计 87.5214 27 酯 乙酸橙花酯 47.9195 90 0.0202 28 乙酸香叶酯 49.1984 83 0.0158 29 邻氨基苯甲酸二甲酯 51.1346 81 2.468 30 十六烷酸甲酯 72.8983 98 0.0557 31 14-甲基十五烷酸甲酯 73.4152 99 0.1957 32 棕榈酸乙酯 73.6463 94 0.0461 33 亚油酸甲酯 74.563 99 0.0548 34 硬脂酸甲酯 74.7858 91 0.0108 35 十六烷酸，辛酯 78.0497 95 0.0256 36 十二酸苄酯 78.2309 80 0.0438 37 3,7-二甲基-6-辛烯-1-棕榈酸酯 79.3429 83 0.1206 38 月桂酸橙花酯 79.4578 82 0.0388 39 亚麻酸苄酯 80.1695 99 0.0539 40 亚油酸香茅酯 81.4811 90 0.1804 41 亚麻酸香茅酯 81.6378 83 0.1658 总计 3.496 42 烃 对-伞花烃 24.247 94 3.1711 43 醇 2,3-丁二醇 9.964 9 0.0019 44 4-侧柏醇 27.4501 93 0.0223 45 芳樟醇 29.6525 97 0.1015 46 香茅醇 33.4471 95 0.0342 47 4-松油醇 35.3211 87 0.1513 48 α-萜品醇 36.2906 74 0.3195 49 香芹醇 38.2313 89 0.0708 50 榄香醇（脑） 59.7048 91 0.0274 51 2-萘甲醇 65.6676 90 0.0092 总计 0.7381 52 酚 4-异丙基-3-甲基苯酚 35.8763 78 0.0335 53 2-异丙基-4-甲基苯酚 42.8657 87 0.058 54 百里香酚 43.3023 98 0.1919 55 香芹酚 43.5511 91 0.0335 56 3-甲基-4-异丙基苯酚 43.965 91 0.1396 总计 0.4565 57 醛 辛醛 22.6036 90 0.0142 58 壬那醛 29.9211 83 0.0224 59 癸醛 37.1592 91 0.1347 60 紫苏醛 42.1003 96 0.0494 61 十二烷基醛 50.8213 91 0.0812 62 2-十三烯醛 54.4057 80 0.016 63 顺式-7,10，-十六二烯醛 70.7242 96 0.0073 64 十七醛 71.2873 91 0.019 总计 0.3442 65 酮 香芹蒎酮 34.268 81 0.003 66 香芹酮 39.975 96 0.0308 67 哌啶酮 40.7161 95 0.0078 68 异哌啶酮 41.9198 83 0.0151 69 胡椒烯酮 46.6306 76 0.0188 70 5,6,7,4'-四甲氧基黄烷酮 81.9881 91 0.0253 71 5-羟基-3'，4'，6,7-四甲氧基黄烷酮 83.3466 94 0.0468 总计 0.1476 72 酮 香芹蒎酮 34.268 81 0.003 73 香芹酮 39.975 96 0.0308 74 哌啶酮 40.7161 95 0.0078 75 异哌啶酮 41.9198 83 0.0151 总计 0.0567 76 烷 1,1-二乙氧基乙烷 7.8353 78 0.0038 77 反式-α-佛手柑 56.1864 83 0.0277 78 东莨菪碱 73.5984 96 0.0076 79 α-瓜亚氹 52.9255 97 0.0055 2.2 陈皮黑茶提取物和陈皮挥发油体外降糖作用
2.2.1 陈皮黑茶提取物、陈皮挥发油对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
α-葡萄糖苷酶是碳水化合物转化为葡萄糖的重要酶，可以通过抑制其活性来降低肠道对葡萄糖的吸收速率，改善餐后体内血糖上升的情况[22]。由图1a可知，陈皮黑茶+挥发油组与黑茶组在低浓度下（0.02~0.1 mg/mL）具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制作用，且随着浓度的增加，其抑制能力也较为快速地增强。在浓度为0.1 mg/mL时，陈皮黑茶+挥发油组对α-葡萄糖苷酶的抑制能力已经达到83.38%±1.82%，与阿卡波糖的抑制能力85.50%±21.28%极为相近，且无显著差异性。由图1b可知，各组的IC50值由小到大的顺序为：阿卡波糖（6.74±0.02 μg/mL）<黑茶组（18.47±1.58 μg/mL）<陈皮黑茶+挥发油组（20.74±3.75 μg/mL）<陈皮黑茶组（125.77±15.80 μg/mL）<陈皮组（277.70±13.66 μg/mL）。陈皮黑茶所有组别中，陈皮黑茶+挥发油组的IC50值极显著低于陈皮黑茶组和陈皮组（P<0.0001），与黑茶组没有显著差异（P>0.05），证明挥发油的添加有助于增强陈皮黑茶体外功能活性。陈皮黑茶提取物+挥发油、陈皮黑茶提取物、黑茶提取物具有较强的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，可能通过抑制α-葡萄糖苷酶对葡萄糖的水解，延缓和减少人体肠道对葡萄糖的吸收，从而降低机体血糖水平[23]。结果表明，在一定条件下，陈皮黑茶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用（83.38%）可能与阿卡波糖（85.50%）相近。
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2.2.2 陈皮黑茶提取物、陈皮挥发油对胰α-淀粉酶的抑制作用
胰α-淀粉酶是体内淀粉分解的关键调控作用酶，抑制胰α-淀粉酶活性可以有效降低体内淀粉、糖原的分解，延缓摄取淀粉高分子碳水化合物的吸收速率，改善糖尿病患者就餐后体内血糖快速上升的情况[24]。图2表明，阳性对照阿卡波糖具有很强的胰α-淀粉酶活性抑制作用，当浓度从0.02 mg/mL到0.1 mg/mL时，其抑制率从59.76%±5.44%升到94.75%±0.71%。除陈皮黑茶+挥发油（0.002 mg/mL）浓度对胰α-淀粉酶的抑制率达到28.66%，其余组别减弱甚至出现浓度14%以下的激活现象（表2）。文献表明，不同厂家或存放不同时间的陈皮黑茶对胰α-淀粉酶表现出抑制作用减弱或激活的现象[2]。因此，没有足够的证据表明陈皮、黑茶或陈皮黑茶+挥发油对胰α-淀粉酶活性有明显抑制作用。
表 2 陈皮黑茶所有组别对胰α-淀粉酶的抑制作用Table 2. Inhibition of pancreatic α-amylase by all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae浓度（mg/mL） 陈皮黑茶+挥发油组（%） 黑茶组（%） 陈皮组（%） 0.002 18.97±5.27a −2.20±5.41b −0.14±9.12b 0.02 14.08±1.12a −7.04±3.72b −6.07±4.49b 0.2 −2.07±5.04a −10.15±4.26b −1.42±1.26a 2 −3.57±3.40a −10.80±4.28b −13.27±1.24b 10 28.66±3.73a 10.06±5.73b −8.54±1.63c 注：同一指标不同小写字母表示显著性差异（P<0.05）；表3同。 2.3 陈皮黑茶提取物、陈皮挥发油的体外降脂作用
甘油三酯含量增高会增加人体患心血管疾病的风险，抑制胰脂肪酶活性能减缓人体对脂肪的吸收速率，降低甘油三酯在体内的积累从而降低血脂水平[24]。如表3和图3a所示，相同浓度时，奥利司他对胰脂肪酶活性的抑制率高于其他实验组，具有很强的胰脂肪酶活性抑制作用。但陈皮黑茶所有组别的抑制率也随着浓度（0.1~5 mg/mL）的增加而增加，表现出良好的浓度依赖关系。对胰脂肪酶抑制率的IC50如图3b所示，其顺序为：奥利司他（0.017±0.001 mg/mL）<黑茶组（1.77±0.19 mg/mL）<陈皮黑茶+挥发油组（2.01±0.18 mg/mL）<陈皮黑茶组（2.07±0.02 mg/mL）<陈皮组（2.60±0.17 mg/mL）。其中，陈皮黑茶+挥发油组的IC50值显著低于陈皮组（P<0.01），极显著高于奥利司他（P<0.0001），与陈皮黑茶组和黑茶组没有显著差异（P>0.05）。陈皮黑茶所有组别的提取物胰脂肪酶抑制率相近，与阳性对照奥利司他的抑制作用相差比较大（P<0.05），其对胰脂肪酶的抑制率的IC50值在1.77~2.60 mg/mL范围内，这与侯粲等[2]的研究结果大致相似。因此，陈皮黑茶能够在一定程度上抑制胰脂肪酶的活性，减少甘油三酯的水解与合成，减缓机体肠道对脂肪的吸收[25]，陈皮挥发油的添加有利于提升降脂效果。综上，陈皮黑茶所有组别具有一定的胰脂肪酶活性抑制作用，但弱于奥利司他。
表 3 陈皮黑茶所有组别对胰脂肪酶的抑制作用Table 3. Inhibition of pancreatic lipase by all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae浓度
（mg/mL）陈皮黑茶+
挥发油组（%）陈皮黑茶组
（%）黑茶组（%） 陈皮组（%） 0.1 15.56±0.58a 15.46±3.43a 16.42±3.39a 14.10±1.75a 0.2 20.21±1.20a 19.93±1.12a 21.04±2.57a 17.74±5.50a 0.5 24.46±3.98a 23.54±1.85a 29.38±2.16a 23.35±5.53a 1 29.63±2.12b 29.71±1.30b 37.67±3.67a 30.33±4.43b 1.5 38.55±2.13a 39.31±2.13a 41.85±4.20a 35.78±3.89a 2 51.25±2.96a 50.04±0.54a 50.89±3.68a 44.93±0.60b 2.5 56.77±0.25a 56.03±1.18a 57.66±2.32a 51.48±1.91b 5 72.50±2.33a 71.17±2.62a 72.26±2.83a 64.63±0.18b ![]()
图 3 陈皮黑茶所有组别对胰脂肪酶的抑制作用注：a：奥利司他对胰脂肪酶抑制率；b：胰脂肪酶抑制率IC50。Figure 3. Inhibitory effects of all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae on pancreatic lipase2.4 陈皮黑茶提取物、陈皮挥发油的体外抗氧化作用
2.4.1 陈皮黑茶提取物、陈皮挥发油对DPPH自由基的清除能力
陈皮黑茶所有组别对DPPH自由基的清除能力见图4。从图4a可知，阳性对照VC具有很强的抗氧化性，相同浓度下，其DPPH自由基清除率明显高于其他实验组。陈皮黑茶+挥发油组、陈皮黑茶组与黑茶组具有较强的DPPH自由基清除能力，随着浓度的增加，其对DPPH自由基的清除率均明显增强，且在0.2 mg/mL时的清除率已超过90%。而陈皮组的DPPH自由基清除率增长幅度小。经计算，图4b中各组对DPPH自由基的清除率的IC50值由小到大的顺序为：VC（11.17±0.33 μg/mL）<黑茶组（46.73±2.26 μg/mL）<陈皮黑茶+挥发油组（64.54±0.59 μg/mL）<陈皮黑茶组（68.39±3.67 μg/mL）。陈皮黑茶+挥发油组的IC50极显著高于黑茶与阳性对照（P<0.0001），但当浓度为0.2 mg/mL时，陈皮黑茶+挥发油组的DPPH自由基清除率可达94.85%±1.39%。陈皮黑茶提取物+挥发油、陈皮黑茶提取物、黑茶提取物对DPPH自由基具有比较强的清除能力，可能通过调节机体的自由基平衡，减轻氧化应激[26]，减缓糖脂代谢疾病的发展[27]。有研究表明，氧化应激从脂质储存、炎症激活等多层面上干扰肝脏脂质代谢，诱导了大鼠肝细胞中的脂质超载和炎性损伤[28]，这迫使抗氧化药物疗法成为治疗脂质代谢异常的主要焦点之一[28]。临床上，长期补充抗氧化剂能够改善非酒精性脂肪肝患者的人体测量参数、血脂状况、肝脏脂肪堆积和肝脏僵硬[29−30]。陈皮黑茶可能通过较强的抗氧化作用发挥调脂作用，但这还需进一步研究。因此，陈皮黑茶具有很强的DPPH自由基清除作用。
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图 4 陈皮黑茶及其所有组别对DPPH自由基的清除能力注：a：DPPH自由基清除率；b：DPPH自由基清除率IC50。Figure 4. DPPH radical scavenging capacity of all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae2.4.2 陈皮黑茶提取物、陈皮挥发油对ABTS+自由基的清除能力
陈皮黑茶所有组别对ABTS+自由基的清除能力见图5。如图5a所示，陈皮黑茶所有组别对ABTS+自由基有明显的清除能力，随着浓度的增加，清除能力越强，其清除趋势与阳性组VC较为相近（除了陈皮组）。陈皮黑茶+挥发油组、陈皮黑茶组与黑茶组随着浓度在0.02～0.1 mg/mL范围内增加时，其ABTS+自由基的清除率较为迅速地增加，且在0.1 mg/mL时，三组清除率均已超过90%，尤其陈皮黑茶+挥发油组已达到99.03%±0.16%。从图5b可知，不同组别对ABTS+自由基的清除率的IC50由小到大的顺序为：VC（17.17±0.08 μg/mL）<陈皮黑茶+挥发油组（27.62±0.22 μg/mL）<陈皮黑茶组（31.01±0.87 μg/mL）<黑茶组（36.42±0.09 μg/mL）<陈皮组（210.90±0.52 μg/mL）。结果表明，添加陈皮挥发油后的陈皮黑茶的IC50极显著低于陈皮黑茶组、黑茶组与陈皮组（P<0.0001），可能与陈皮挥发油中含有大量柠檬烯相关，起到一定抗氧化作用[31]。陈皮提取物的抗氧化功效最差，远不如黑茶与陈皮黑茶提取物，可能是在水提加热过程中损失了部分活性物质。但因陈皮气味芳香，在陈皮黑茶里适量添加陈皮提取物及其挥发油可优化茶的口感与味道，提高消费者接受度，还可能提高陈皮黑茶的抗氧化能力。因此，增加陈皮挥发油后的陈皮黑茶提取物可能提高了其ABTS+自由基清除能力，具有更强的抗氧化能力。陈皮黑茶在临床上的运用中未见不良反应，与西药联用治疗糖脂代谢疾病时，在一定程度上降低了西药的副作用，尤其能够降低转氨酶水平，减少肝损害[14−15]。
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图 5 陈皮黑茶所有组别对ABTS+自由基的清除能力注：a：ABTS+自由基清除率；b：ABTS+自由基清除率IC50。Figure 5. ABTS cation radical scavenging capacity of all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae3. 结论
本研究对陈皮挥发油进行GC-MS分析，共分离出237个峰，鉴定出79种成分。陈皮挥发油具有协同提高陈皮黑茶降糖降脂能力以及抗氧化活性效果。在降糖降脂方面，浓度为0.1 mg/mL的陈皮黑茶+挥发油组对α-葡萄糖苷酶的抑制率为83.38%，抑制作用接近阿卡波糖（85.50%），浓度为5 mg/mL时，陈皮黑茶及其组别的提取物胰脂肪酶抑制率相近（64.67%~74.45%），具有良好的降血糖降血脂能力。陈皮黑茶+挥发油组、陈皮黑茶组与黑茶组具有较强的ABTS+自由基的清除率和DPPH自由基清除能力，在0.1 mg/mL时陈皮黑茶及其组别的提取物ABTS+自由基清除率均已超过90%，陈皮黑茶+挥发油组达99.03%。陈皮黑茶提取物协同陈皮挥发油虽然对胰α-淀粉酶活性抑制效果较弱，但陈皮挥发油的协同作用可显著提高陈皮黑茶降糖降脂及抗氧化的能力。这为相关营养健康食品的开发提供了一定的指导意义。
综上所述，陈皮黑茶具有良好的抗氧化能力与降糖、降脂活性，添加陈皮挥发油的陈皮黑茶抗氧化能力得到提高，可能通过抑制肠道对糖类、脂质的吸收与抗氧化作用，发挥降糖调脂功效，在辅助防控糖脂代谢病方面具有巨大潜力。而陈皮黑茶提取物与挥发油的混合物长时间保存可能出现分层失稳现象，进一步可研究通过乳化等工艺技术提高体系的稳定性。本研究可以为陈皮黑茶降糖调脂的保健功效研究提供一定的理论支撑，为进一步动物和临床实验提供参考。
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图 3 陈皮黑茶所有组别对胰脂肪酶的抑制作用
注：a：奥利司他对胰脂肪酶抑制率；b：胰脂肪酶抑制率IC50。
Figure 3. Inhibitory effects of all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae on pancreatic lipase
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图 4 陈皮黑茶及其所有组别对DPPH自由基的清除能力
注：a：DPPH自由基清除率；b：DPPH自由基清除率IC50。
Figure 4. DPPH radical scavenging capacity of all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae
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图 5 陈皮黑茶所有组别对ABTS+自由基的清除能力
注：a：ABTS+自由基清除率；b：ABTS+自由基清除率IC50。
Figure 5. ABTS cation radical scavenging capacity of all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae
表 1 陈皮挥发油成分分析
Table 1 Analysis of volatile oil components in Pericarpium Citri Reticulatae
序号 分类 化合物名称 保留时间（min） 匹配度（%） 相对含量（%） 1 烯 α-侧柏烯 17.4845 91 0.4268 2 α-蒎烯 17.9712 95 1.2951 3 3-亚甲基环庚烯 18.8212 70 0.0019 4 莰烯 18.9478 94 0.011 5 桧烯 20.6285 91 0.201 6 β-蒎烯 20.8843 91 1.101 7 月桂烯 21.8305 87 1.7197 8 α-萜品烯 23.6838 97 0.3111 9 柠檬烯 25.3499 97 62.89 10 （E）-Β-罗勒烯 25.9809 91 0.0358 11 γ-萜品烯 27.1103 96 16.4672 12 萜品油烯 28.9304 97 1.1138 13 1,3,8-对薄荷三烯; 30.569 93 0.0041 14 4-乙酰基-1-甲基环己烯 31.9342 94 0.0041 15 异萜品油烯 39.6645 94 0.0219 16 2,6-二甲基-2,6-辛二烯 47.1696 90 0.0242 17 3,4-二甲氧基苯乙烯 48.21 70 0.0551 18 1-十二烯 48.4908 86 0.009 19 石竹烯 51.8714 95 0.331 20 α-葎草烯 53.9863 98 0.0439 21 α-衣兰油烯 56.7595 93 0.0169 22 α-金合欢烯 57.0687 72 0.9767 23 δ-卡丁烯 58.157 98 0.1529 24 环氧石竹烯 61.8463 91 0.0283 25 角鲨烯 80.7433 91 0.1685 26 1,19-二十碳二烯 83.7363 95 0.1104 总计 87.5214 27 酯 乙酸橙花酯 47.9195 90 0.0202 28 乙酸香叶酯 49.1984 83 0.0158 29 邻氨基苯甲酸二甲酯 51.1346 81 2.468 30 十六烷酸甲酯 72.8983 98 0.0557 31 14-甲基十五烷酸甲酯 73.4152 99 0.1957 32 棕榈酸乙酯 73.6463 94 0.0461 33 亚油酸甲酯 74.563 99 0.0548 34 硬脂酸甲酯 74.7858 91 0.0108 35 十六烷酸，辛酯 78.0497 95 0.0256 36 十二酸苄酯 78.2309 80 0.0438 37 3,7-二甲基-6-辛烯-1-棕榈酸酯 79.3429 83 0.1206 38 月桂酸橙花酯 79.4578 82 0.0388 39 亚麻酸苄酯 80.1695 99 0.0539 40 亚油酸香茅酯 81.4811 90 0.1804 41 亚麻酸香茅酯 81.6378 83 0.1658 总计 3.496 42 烃 对-伞花烃 24.247 94 3.1711 43 醇 2,3-丁二醇 9.964 9 0.0019 44 4-侧柏醇 27.4501 93 0.0223 45 芳樟醇 29.6525 97 0.1015 46 香茅醇 33.4471 95 0.0342 47 4-松油醇 35.3211 87 0.1513 48 α-萜品醇 36.2906 74 0.3195 49 香芹醇 38.2313 89 0.0708 50 榄香醇（脑） 59.7048 91 0.0274 51 2-萘甲醇 65.6676 90 0.0092 总计 0.7381 52 酚 4-异丙基-3-甲基苯酚 35.8763 78 0.0335 53 2-异丙基-4-甲基苯酚 42.8657 87 0.058 54 百里香酚 43.3023 98 0.1919 55 香芹酚 43.5511 91 0.0335 56 3-甲基-4-异丙基苯酚 43.965 91 0.1396 总计 0.4565 57 醛 辛醛 22.6036 90 0.0142 58 壬那醛 29.9211 83 0.0224 59 癸醛 37.1592 91 0.1347 60 紫苏醛 42.1003 96 0.0494 61 十二烷基醛 50.8213 91 0.0812 62 2-十三烯醛 54.4057 80 0.016 63 顺式-7,10，-十六二烯醛 70.7242 96 0.0073 64 十七醛 71.2873 91 0.019 总计 0.3442 65 酮 香芹蒎酮 34.268 81 0.003 66 香芹酮 39.975 96 0.0308 67 哌啶酮 40.7161 95 0.0078 68 异哌啶酮 41.9198 83 0.0151 69 胡椒烯酮 46.6306 76 0.0188 70 5,6,7,4'-四甲氧基黄烷酮 81.9881 91 0.0253 71 5-羟基-3'，4'，6,7-四甲氧基黄烷酮 83.3466 94 0.0468 总计 0.1476 72 酮 香芹蒎酮 34.268 81 0.003 73 香芹酮 39.975 96 0.0308 74 哌啶酮 40.7161 95 0.0078 75 异哌啶酮 41.9198 83 0.0151 总计 0.0567 76 烷 1,1-二乙氧基乙烷 7.8353 78 0.0038 77 反式-α-佛手柑 56.1864 83 0.0277 78 东莨菪碱 73.5984 96 0.0076 79 α-瓜亚氹 52.9255 97 0.0055 
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表 2 陈皮黑茶所有组别对胰α-淀粉酶的抑制作用
Table 2 Inhibition of pancreatic α-amylase by all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae
浓度（mg/mL） 陈皮黑茶+挥发油组（%） 黑茶组（%） 陈皮组（%） 0.002 18.97±5.27a −2.20±5.41b −0.14±9.12b 0.02 14.08±1.12a −7.04±3.72b −6.07±4.49b 0.2 −2.07±5.04a −10.15±4.26b −1.42±1.26a 2 −3.57±3.40a −10.80±4.28b −13.27±1.24b 10 28.66±3.73a 10.06±5.73b −8.54±1.63c 注：同一指标不同小写字母表示显著性差异（P<0.05）；表3同。
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表 3 陈皮黑茶所有组别对胰脂肪酶的抑制作用
Table 3 Inhibition of pancreatic lipase by all groups of dark tea with Pericarpium Citri Reticulatae
浓度
（mg/mL）陈皮黑茶+
挥发油组（%）陈皮黑茶组
（%）黑茶组（%） 陈皮组（%） 0.1 15.56±0.58a 15.46±3.43a 16.42±3.39a 14.10±1.75a 0.2 20.21±1.20a 19.93±1.12a 21.04±2.57a 17.74±5.50a 0.5 24.46±3.98a 23.54±1.85a 29.38±2.16a 23.35±5.53a 1 29.63±2.12b 29.71±1.30b 37.67±3.67a 30.33±4.43b 1.5 38.55±2.13a 39.31±2.13a 41.85±4.20a 35.78±3.89a 2 51.25±2.96a 50.04±0.54a 50.89±3.68a 44.93±0.60b 2.5 56.77±0.25a 56.03±1.18a 57.66±2.32a 51.48±1.91b 5 72.50±2.33a 71.17±2.62a 72.26±2.83a 64.63±0.18b
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