Research Progress on the Application of Bacillus in Baijiu Brewing
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摘要: 在白酒酿造工艺中,微生物扮演着举足轻重的角色,其中芽孢杆菌作为核心微生物群体之一,可以直接或间接影响白酒的风味和质量。为了揭示芽孢杆菌在白酒中的关键作用,并对其进行更好的应用,本文详细综述了白酒酿造生态系统中芽孢杆菌的物种多样性、产酶特性和产香特性,此外,还讨论了芽孢杆菌在白酒酿造生产中的广泛应用前景。在强化大曲、麸曲及酒醅等关键环节,芽孢杆菌的应用潜力巨大。本文有助于加深对白酒酿造微生物尤其是芽孢杆菌的认识,更为白酒品质的提升提供了有力的理论支持与实践指导。Abstract: Bacillus, one of the dominant microbial genera in Baijiu brewing, is recognized as crucial to the fermentation process, with the flavor and quality of Baijiu being directly or indirectly impacted through its metabolic functions. The species diversity, enzymatic activities, and flavor-enhancing capabilities of Bacillus in the Baijiu brewing environment are systematically investigated. This analysis is conducted to emphasize the critical role played by Bacillus in alcohol production, particularly through its synthesis of hexanoic acid and ethyl caproate, and to optimize its industrial potential via strain selection and metabolic pathway modulation. Furthermore, the broad potential of Bacillus in Baijiu brewing is also explored. Bacillus application has significant potential in enhancing Daqu, Fuqu, fermented grains, and other important linkages. This work offers strong theoretical support and useful insights on the microorganisms involved in Baijiu brewing, particularly Bacillus.
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Keywords:
- Baijiu /
- Bacillus /
- enzyme production /
- flavor /
- application
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白酒是中国古代的伟大发明之一,具有至少2000年的历史[1]。白酒通常用高粱或多种谷物进行固态发酵,以酒曲为发酵剂,将发酵后的谷物蒸馏而成[2]。大曲在白酒的发酵过程中起着重要的作用,它含有丰富的微生物群落、功能酶和风味前体[3]。相比于其他类型的酒,多菌种混合发酵是白酒发酵的主要特点,大曲微生物与白酒风味密切相关。微生物可以产生复杂酶系、风味成分和前体物质,最终导致白酒产生特殊香气。因此,微生物对白酒的品质有非常重要的影响[4]。
芽孢杆菌广泛存在于环境中,属于厚壁菌门、杆菌纲和杆菌目,其中革兰氏阳性菌可产生孢子,好氧或兼性厌氧杆菌,通常由周围鞭毛活动,无囊[5]。芽孢杆菌在白酒发酵体系中分布广泛,种类繁多[6−7]。在整个白酒酿造过程,包括大曲、酒醅堆积发酵中均被发现出,如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)等[8−10]。而且很多白酒发酵具有特殊的地理、气候、环境条件,为芽孢杆菌提供了耐高温、耐酸、耐酒精等条件,芽孢杆菌在高温等条件下具有较强的生存力,使其在发酵过程中逐渐成为优势菌[11−12]。
本文就白酒酿造生态系统中芽孢杆菌的物种多样性、产酶性能、产香性能等方面的研究进展进行了综述。此外,还讨论了芽孢杆菌在白酒生产中的应用现状,为优选芽孢杆菌并应用于生产,提升白酒品质提供参考依据及思路。
1. 白酒酿造过程中的芽孢杆菌多样性
芽孢杆菌存在于整个白酒酿造过程中,分布广泛,种类多样,在很多香型的白酒中,芽孢杆菌都占很大比例。图1总结了在白酒酿造过程中通过培养法和免培养法发现的芽孢杆菌种类。
1.1 基于培养法鉴定的芽孢杆菌
近年很多研究发现,运用传统可培养分离方法从白酒大曲、麸曲、小曲等中分离得到的多数是芽孢杆菌群,窖泥中可培养的细菌也是芽孢杆菌。其中邹铨等[13]从内蒙古河套地区中温大曲样品中共筛选培养得到30株芽孢杆菌,经过鉴定主要是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),分别占总分离株的36.67%和26.67%。王晓丹等[14]从酱香型白酒大曲中分离培养出地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2株,并发现其固态发酵产物具有浓郁酱香气味,对其挥发性风味物质进行分析,发现其中吡嗪类物质相对含量较高。刘小改等[15]的研究也证实清香型小曲中细菌的种类较多,芽孢杆菌属(Bacillus)为最主要优势菌之一,其中含有丰富的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),具有较强产香能力。MA等[16]从四川浓香型白酒发酵窖泥中分离到一株革兰氏染色阳性芽孢棒状好氧细菌LAM0415(T),对菌株表型、系统发育和化学分类特征进行分析,发现菌株LAM0415(T)为芽孢杆菌属新种,并将其命名为Bacillus vini sp. nov。通过以上众多研究表明,利用可培养方法可从白酒不同生产过程中分离到多种芽孢杆菌,表明芽孢杆菌是最主要的可培养微生物之一,但这些研究可能存在一定的局限性,仅采用传统可培养分离方法,可能会遗漏一些不可培养的芽孢杆菌种类。
1.2 基于免培养法鉴定的芽孢杆菌
在白酒生态系统中除了有可培养的微生物,还有很多微生物是不可培养的。近年来,随生物科学技术的飞速发展,研究微生物的方法已经不再局限于传统的培养技术,研究人员通过基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等手段,对大曲发酵和白酒酿造过程中的优势微生物群落进行了研究。其中芽孢杆菌也是其中之一,这类芽孢杆菌可以通过高通量测序等方法被发现。
任爱容等[17]分析了茅台镇不同酿造区域的高温大曲中的细菌菌群结构,发现不同区域生产大曲的细菌多样性丰富且存在差异,但各区域优势细菌属的菌群结构组成相似性高,芽孢杆菌(Bacillus)为其关键核心细菌属,还在酱香大曲中首次发现解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、鲁梅尔芽孢杆菌属(Rummeliibacillus)等。Wang等[18]分析了酱香白酒酿造过程以及环境等中的微生物,发现芽孢杆菌是酿造过程中优势菌之一,另外还检出了耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)。芽孢杆菌也是浓香型白酒大曲中的优势菌,在各个浓香型白酒厂均检测到芽孢杆菌种类,采用培养法和免培养法对中温大曲进行了分析,发现在已鉴定的各种物种中,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是最常见的[19]。通过克隆文库的构建,比较不同类型大曲的微生物群落组成,发现所有大曲样品均可检出地衣芽孢杆菌,高温大曲中还检出有蔬菜芽孢杆菌(Bacillus oleronius),中温大曲中检出蔬菜芽孢杆菌(Bacillus oleronius)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),低温大曲中还发现了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)、沙氏芽胞杆菌(Bacillus shackletonii)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus),表明芽孢杆菌在大曲中较为丰富,但是不同类型大曲中的芽孢杆菌有所差异[20]。
如图1所示,芽孢杆菌作为多种白酒酿造过程中的优势菌,能够适应不同的发酵条件,进一步证明了其在白酒酿造中的强大的适应能力,其普遍性和多样性也反映了这类细菌在白酒发酵中的重要作用,此外,芽孢杆菌的种类和数量还可能与酿造工艺、原料选择、环境条件等共同因素有关。通过培养法能够直接观察并分离到纯菌株,但可能忽略部分难以培养的微生物;免培养法则能更全面地反映微生物群落的多样性,但难以直接获得纯菌株。因此,在实际研究中应根据研究目的和条件选择合适的方法或结合多种方法进行分析。
2. 芽孢杆菌产酶性能
在白酒酿造过程中微生物区系产生的各种酶在淀粉原料的糖化、酒精发酵和风味形成中起着至关重要的作用。其中芽孢杆菌在代谢过程中能产生高活性的胞外产物酶,如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、酯化酶等,分解原料中的多糖、蛋白质、淀粉,这些酶会在发酵前期积累各种氨基酸和还原糖类,影响白酒风味[21]。
2.1 芽孢杆菌产蛋白酶性能
在白酒酿造过程中,蛋白酶可以分解蛋白质,这一过程会生成氨基酸,有助于丰富酒体的风味物质,同时蛋白酶还能与其他微生物进行协同发酵,有效抑制杂醇油的形成,从而提高原酒的产出量并有助于增强香气[22−23]。白酒酿造过程中的主要的蛋白酶类型为酸性、中性蛋白酶。芽孢杆菌是产蛋白酶的主要微生物之一,对白酒的生产具有重要意义,包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等都有很强的产蛋白酶的功能[24−25]。
王晓丹等[26]发现从酱香型大曲中分离出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生的酸性蛋白酶活力比较高。Liu等[27]从张弓老酒生产的中温大曲中筛选出一株蛋白酶活性为99.54 U/mL的高产蛋白酶菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),进行全基因组测序(WGS),共预测到3662个蛋白编码基因,其中196个高产蛋白酶基因主要富集于丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丝氨酸的代谢,以及ABC转运蛋白和转运蛋白通路。Wu等[28]从芝麻味白酒大曲中分离到11株芽孢杆菌,发现这些芽孢杆菌不仅能产生蛋白酶和淀粉酶,而且对常见病原菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌也有拮抗作用,这11株芽孢杆菌属于摩加夫芽胞杆菌(Bacillus mojavensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。冯利芳等[29]从清香型大曲中分离出一株产中性蛋白酶的细菌,经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),优化产酶实验表明其在50 ℃,pH为7的条件下酶活最高,达到202.7 U。这些研究共同揭示了不同种类芽孢杆菌在白酒大曲发酵过程中,特别是在蛋白酶产生方面的重要作用,同时强调了产酶条件对酶活性有很大影响,可以通过优化发酵条件来提高蛋白酶产量和活性,从而改善白酒的风味品质。
2.2 芽孢杆菌产淀粉酶性能
淀粉酶作为芽孢杆菌的主要胞外产酶类型,其中液化型淀粉酶和糖化型淀粉酶大曲在大曲中尤为关键,它们构成了核心的淀粉水解酶体系[30]。这些淀粉酶能够高效地将原料中的淀粉分解为可发酵的糖类,进一步通过发酵过程生成醇类、酯类以及各种有机酸等。不仅显著提升了糖化效率,为酵母提供了丰富的营养来源,推动了酒精的发酵过程,还有助于增强白酒的香气,丰富了其风味层次。许多芽孢杆菌展现出出色的淀粉酶产生能力,其中包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等[31]。
Wang等[32]发现解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的淀粉酶活性较高,对含有α-淀粉酶基因的芽孢杆菌进行定量分析,结果表明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是酒曲中分泌α-淀粉酶最占优势的微生物,其生物量在酒曲发酵过程中呈增加趋势。张璋等[33]从酱香型高温大曲中筛选出产淀粉酶芽孢杆菌,经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),经过高温驯化,其产淀粉酶活性提升3.1倍,达到322.1 U/mL,最适反应温度从40 ℃提高到70 ℃。王志山等[34]研究人员成功地从芝麻香白酒大曲中分离筛选出一株产淀粉酶的菌株-贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),其酶活为5.852 U/mL,进一步深入分析了其产酶相关功能基因,发现其基因组长度为3475602 bp,其中包括蛋白酶和淀粉酶等重要编码基因,从基因层面揭示了其产淀粉酶的潜力。胡晓龙等[35]研究团队从中温大曲中分离出一株高产淀粉酶的菌株,即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),经过一系列的优化条件后,该菌株的淀粉酶活力得到了显著提升,高达14.75倍,达到8158.23 U/mL,这一成果预期能够有效提高白酒的出酒率,也展示了优化条件在提高酶产量方面的巨大作用,可以显著提高白酒的出酒率。因此,芽孢杆菌是酿酒过程中的影响淀粉酶的最主要微生物之一,对白酒出酒率和品质至关重要[36−38]。
2.3 芽孢杆菌产纤维素酶性能
在白酒酿造过程中,纤维素酶的作用在于将原料中的纤维素分解为可发酵的糖,随后这些糖再由酵母进行发酵,转化为酒精,从而有效提升了白酒的产量和出酒率[39]。比起酵母菌株,大曲中芽孢杆菌产纤维素酶的能力明显更强。刘延波等[40]运用可培养技术从张弓老酒大曲中得到一株高产纤维素酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),优化后其酶活提高1.3倍,达到1014 U/mL。周平等[41]从中高温大曲中分离得到一株细菌,经鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),发现其耐盐、耐pH能力较强,耐温度能力较好,并且发现该菌产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力较强。阳刚[42]从浓香型大曲、酱香型酒醅中共分离出39株菌,分别被鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),结果发现这两株菌共培养时纤维素酶活力提高了30%~70%。筛选产纤维素酶菌株,可提高原料利用率进而提高出酒率,对白酒品质的提升有重要的意义。这些研究强调了纤维素酶在白酒酿造过程中的重要作用,也揭示了不同种类芽孢杆菌在产纤维素酶方面的优势和潜力。未来可以基于这些研究成果,进一步探索如何在实际生产中更有效地利用这些产纤维素酶的芽孢杆菌,优化酿造工艺。
2.4 芽孢杆菌产酯化酶性能
酯化酶是指脂肪酶、酯合成酶、酯分解酶的总称,其在白酒酿造过程中起着重要作用,可以催化醇与己酸、乙酸、乳酸、丁酸等多种酸的酯化,产生己酸乙酯、乙酸乙酯等风味物质,形成白酒的主要香气[43]。大曲中的细菌、真菌、霉菌都具有产生酯化酶的能力,芽孢杆菌也是产生酯化酶的主要微生物之一。
申孟林[44]从浓香型白酒大曲中筛选到3个属(Bacillus、Paenibacillus和Cronobacter)的酯化酶产生菌,其中Bacillus属多样性最丰富,且是在大曲样品中都占绝对优势的菌群。张颖[45]从酱香型白酒大曲、糟醅中分离出115株芽孢杆菌,发现有17株产脂肪酶菌株,其中乳酸乙酯酯化酶活力最高为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),乳酸乙酯合成量为47.94 mg/L,己酸乙酯酯化酶活力最高为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),合成量为13.89 mg/L,这揭示了不同芽孢杆菌菌株在产特定酯化酶和合成相应酯类物质方面的差异。翟磊等[46]用改进的罗丹明B平板法从芝麻香型白酒高温大曲中筛选得到15株产脂肪酶菌株,鉴定结果为Bacillus pumilus和Bacillus aryabhatta,其中6株产脂肪酶活性较高。由此可见,酯化酶,作为白酒发酵工艺中的核心酶类,扮演着不可或缺的角色,而芽孢杆菌,作为这一关键酶的主要生产者之一,其重要性在白酒酿造中尤为凸显。
2.5 芽孢杆菌产其他酶性能
芽孢杆菌除了可以产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等水解酶,还可以产生果胶酶、葡聚糖酶、单宁酶等,对白酒的香味有重要影响。周晓龙[47]以北派酱香白酒大曲为样品,从中筛选鉴定出一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),发现该菌株产高活性淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶等多种酶,其酶活性优于其它菌株的活性,且产酶种类最丰富,可以选定作为强化大曲的功能菌。杨青杨[48]发现从酒曲中筛选出的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有高产单宁酶和酯化酶的能力,同时发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)降解单宁产生两种香味物质丁香酸和4-乙基愈创木酚。这种酶系的多样性使得芽孢杆菌在白酒酿造过程中能够参与多种复杂的生化反应,对原料的降解、风味物质的生成以及微生物群落的动态平衡起到重要的调控作用。
3. 芽孢杆菌产香性能
白酒中丰富的风味成分的形成离不开不同微生物的作用,而芽孢杆菌也参与多种风味物质的形成,其可以直接发酵产生酯类、吡嗪类、酸类等化合物[2−3],芽孢杆菌还促进多种游离氨基酸参与美拉德反应,使白酒具有独特的风味[49]。此外,芽孢杆菌可以通过与其他微生物进行相互作用,从而影响风味物质的生成[6]。
3.1 芽孢杆菌直接产生风味
芽孢杆菌作为白酒酿造过程中最重要微生物之一,对风味的贡献非常大。芽孢杆菌的发酵产物主要包括吡嗪类化合物、挥发性酸类化合物、芳香类化合物、酚类化合物等,这些化合物对白酒的香气有很大影响。
很多研究表明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中乙偶姻、四甲基吡嗪、苯乙醇和苯酚等相对含量较高。刘茗铭[50]用GC-MS对从高温大曲中分离筛选出的产香地衣芽孢杆菌进行分析,发现该菌发酵产香风味物质丰富,可产生2,3,5,6-四甲基吡嗪、乙偶姻、苯乙酸乙酯和苯乙醇等。除了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等也被发现可产生多种风味物质。其中有研究发现白酒中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产吡嗪类、醇类、酮类,包括乙偶姻、正戊醇、2, 3-丁二醇等物质,其中吡嗪类物质的相对含量最高,而吡嗪是发酵后期由乙偶姻转化而来的[51]。黄永光等[11]对3种芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens))的代谢产物进行分析,发现3种芽孢杆菌的共性代谢风味物质有:2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5,-三甲基吡嗪、乙醇、异丙醇、3-甲基丁醇、2,3-丁二醇、2-甲基丙酸、丁酸等,但含量有所区别,这可能是由于菌株间的遗传差异、发酵条件的不同或底物利用能力的差异所导致的。张春林等[52]对从贵州省茅台镇高温大曲中筛选出产酱香风味明显的3株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和1株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)进行了研究,发现发酵产物包括四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-丁基-2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪等,其中酸类化合物含量较高,为35%~39%。通过分析可见芽孢杆菌产风味物质的多样性,这些物质的存在使得白酒具有复杂而丰富的香气和口感,并且发现多数芽孢杆菌都可产生吡嗪类物质,已有研究表明吡嗪对酱香白酒酱味的形成有重要影响,而且对人体也有一定的益处,有降血糖、抗氧化等多种功能[53]。
3.2 芽孢杆菌与其他微生物相互作用产生风味
中国白酒采用开放式固态发酵酿造,发酵过程涉及许多微生物。微生物之间的相互作用是现在的一大研究热点。越来越多的研究已经发现在白酒酿造过程中,芽孢杆菌与其他微生物发生相互作用,从而影响风味物质的生产。
一些研究发现芽孢杆菌与酵母菌混合发酵后,芽孢杆菌在发酵中会明显受到酵母菌抑制,但是芽孢杆菌的存在使酵母代谢更多的风味物质。例如孟醒等[54]在高粱发酵培养基中将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行混合培养后,酿酒酵母会明显抑制地衣芽孢杆菌的生长,而混合发酵后有12种风味物质含量明显高于单独发酵,进一步探究发现金属还原酶基因FRE7是两菌互作的参与者之一,蛋白组分析显示,在混合培养发酵时地衣芽孢杆菌能够影响酿酒酵母的乙醇及有机酸代谢,地衣芽孢杆菌诱导酿酒酵母胞内69个蛋白差异表达。Wu等[55]从芝麻风味白酒发酵中分离出5种优势菌种:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、东方伊萨酵母(Saccharomyces orientalis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。将这些菌按一定比例进行共培养,结果表明,地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌)的加入减轻了其他三种菌株之间的竞争,五种微生物的共培养产生了最多的风味化合物。还有研究表明酿酒酵母可以通过产酸抑制地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的生长,其次可能是液态发酵体系不存在大分子的淀粉及蛋白质,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)即使产生了淀粉酶或者蛋白酶在液态体系里也发挥不了作用[56]。而某些芽孢杆菌可抑制酵母菌生长从而影响风味,蒲领平等[57]研究贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和酵母菌两者相互作用对酒醅发酵的影响时,发现贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)抑制酵母生长,两者相互作用有利于对酯类物质含量提高,可以降低高级醇含量。据报道,在蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)混合发酵体系中,两者相互作用有利于四甲基吡嗪、苯乙醇、乙酸等风味物质的生成[58]。芽孢杆菌与其他微生物的这种抑制与促进的平衡关系,可以促进一些风味物质的显著增加。这表明,在混合发酵体系中,通过调控微生物之间的相互作用关系,可以实现风味物质的优化组合。
综上所述,芽孢杆菌可以产生多种风味物质,赋予白酒特殊的香味特征,不同芽孢杆菌所产风味物质的种类和含量有所差异。未来研究可进一步深入探索芽孢杆菌产香的分子机制以及探究芽孢杆菌与其他微生物的互作机制,挖掘相关基因,为白酒风味提升提供更坚实的理论基础。
4. 芽孢杆菌在白酒生产中的应用
芽孢杆菌在白酒生产酿造中也已经有很多应用,包括应用于大曲、麸曲以及酒醅等的强化,还用于提高酒糟的利用率,表1和表2总结了芽孢杆菌在白酒酿造过程中的应用研究。
表 1 芽孢杆菌在强化曲中的应用Table 1. Application of Bacillus in strengthening Daqu and Fuqu芽孢杆菌种类 应用阶段 应用效果 参考文献 Bacillus pumilus 大曲 强化大曲的糖化力、液化力、中性蛋白酶活、酸性蛋白酶活都提高,酱香型白酒强化大曲较普通大曲升温快、高温时间持续长,可提高大曲中乙偶姻和四甲基吡嗪的含量,让大曲香气
成分更丰富。[29] Bacillus velezensis和Bacillus subtilis 强化大曲后中优势菌属与重要酯类和芳香化合物等风味成分含量增加,强化大曲改善了白酒的风味。 [60] Bacillus amyloliquefaciens 强化接种后四甲基吡嗪浓度比对照组分别增加了26倍,白酒的香气和产香物质都有所增加。 [62] Bacillus subtilis 强化后的大曲皮微生物群落中Bacillus、Aspergillus、Thermomyces和Rasamsonia的相对丰度增加,Weissella、Lactobacillus、Leuconostoc和Pichia的相对丰度降低,细菌群落与真菌群落的相关性显著增强。 [63] Bacillus thermophilus 强化大曲品温升高,中挺时间延长,由于它们具较高的、不同专一性的蛋白酶活性,能够实现对蛋白质的多级靶向酶解,从而生成种类丰富、含量较高的氨基酸。在高温条件下,这些氨基酸与还原糖发生羰氨反应,进一步促进了杂环化合物的生成,使大曲曲香更为馥郁,还赋予其幽雅纯正的风味。 [75] Bacillus subtilis 强化大曲较普通大曲糖化酶、蛋白酶活力提高,对大曲曲皮和曲心中微生物之间的相关性产生了影响。 [76] Bacillus licheniformis 和Bacillus velezensis 联合强化改变了大曲表面、中间、火圈部位和核心等四层中22个属的相对丰度,其中芽孢杆菌和曲霉的丰度增加,热囊菌、乳杆菌等部分属的丰度减少,接种后,火圈和表面的酯化能力显著提高,此外,醇、酸和酮的含量都有所改善。 [77] Bacillus subtilis 麸曲 功能麸曲组的酒醅中吡嗪类化合物提高,焦糊香浓郁,余味悠长,酒体醇厚饱满,表明功能酒醅对酒体改善有积极作用。 [64] Bacillus licheniformis 和Bacillus velezensis 强化发酵可明显降低高级醇含量。 [65] Bacillus subtilis 表明制作麸曲有利于产纤维素枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)获得有效增殖、提高产酶量及维持酶活性。 [66] Geobacillus stearothermophilus 制备强化麸曲试验表明麸曲具备分泌蛋白酶和淀粉酶能力。 [78] 表 2 芽孢杆菌在白酒发酵过程中的应用Table 2. Application of Bacillus in Baijiu fermentation process芽孢杆菌种类 应用阶段 应用效果 参考文献 Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens 酒醅 添加功能菌液的酒醅吡嗪类化合物含量高,强化后酒醅在堆积过程其温度和水分含量有一定程度的提升。 [64] Bacillus licheniformis 、Bacillus subtilis 经过强化发酵后四甲基吡嗪、4-乙基-2-甲氧基苯酚、3-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯含量均显著增加。 [67] Bacillus 强化接种后微生物群落丰度和多样性明显提升,同时提高酒醅蛋白酶活力,能够更好的提高白酒的风味与品质。 [68] Bacillus velezensis 芽孢杆菌显著提高了酒醅中风味物质的产量,使酒醅中总酯、总醇和总酸含量分别提高了19.1%、81.1%和25.9%。 [67] Bacillus licheniformis 、Bacillus subtilis 酒糟 两菌通过协同作用促进白酒糟降解,纤维素酶活力提高了30%~70%,最大白酒糟降解率可以达到 25.9%。 [42] Bacillus amyloliquefaciens、Streptomyces albidoflavus 利用复合菌剂进行发酵酒糟生产生物有机肥,制成的生物有机肥良好,改善了根际土壤微环境,提高了黄瓜植株的抗氧化保护酶活性,植株长势明显优于对照组,肥效显著。 [72] Bacillus licheniformis 、Paecilomyces varioti、Aspergillus fumigatus 3株菌株制备成的复合菌剂能够高效降解纤维素,明显促进酒糟堆肥腐熟和缩短堆肥周期,改善酒糟有机肥品质。 [73] Bacillus、Saccharomyces cerevisiae、Enterococcus faecium 利用复合益生菌固态发酵酒糟可以改善酒糟的蛋白品质。 [74] Bacillus cereus、Bacillus toyonensis 选定出一株高效降解酒糟纤维素的菌株,构建复合菌后可进一步转化生产乙醇。 [79] Saccharomyces cerevisiae、Bacillus subtilis、Lactobacillus plantarum 经过混菌固态发酵制备成的蛋白饲料中粗蛋白含量为(24.97%±0.05%),感官评价最终得分18分,等级为优良。 [80] 4.1 在强化用曲生产中的应用
4.1.1 在强化大曲生产中的应用
由于对环境的依赖,大曲的固有特性受到一定的限制,如酶活性上限,为了解决这些问题,很多学者和酿酒厂通常在大曲生产中使用从酿造环境中分离出的功能微生物或开发复合菌剂,进行强化大曲来改善大曲微生物群落的结构和理化性质,增强大曲的芳香物质和风味前体,从而提高原白酒的产量和质量[2,59]。
使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行强化大曲发酵浓香型白酒,改善了白酒的风味,使强化大曲中优势菌属与重要酯类、芳香化合物等风味成分含量增高[60]。王霜[61]利用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe):东方伊萨酵母(Saccharomyces orientalis):地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis):根霉(Rhizopus)构建了一种复合功能微生物菌剂,添加到不同月份的大曲中或以不同比例替代4个月份的大曲。结果表明,该组功能微生物菌剂具有提高发酵酒精产量和降低正丙醇含量的作用,具有提高白酒产量和质量的功能。Zhang等[62]使用具有四甲基吡嗪生产能力的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)进行强化大曲,发现接种后四甲基吡嗪浓度比对照组分别增加了26倍,白酒香气也有所增加。Yang等[63]对采用扩增子测序法等方法对接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的强化大曲微生物群落进行了研究,发现接种后,大曲细菌群落与真菌群落的相关性显著增强。以上研究表明使用芽孢杆菌进行强化大曲应用具有很好的发展前景,不仅可改善大曲微生物群落结构,有利于吡嗪类等风味物质生成,还可以提高白酒产量。
4.1.2 在麸曲生产中的应用
麸曲是白酒生产中常用的微生物扩培方法。这种方法主要以麸皮为基础原料,经过一系列处理工序后,接种微生物进行培养。在工业生产中,制备麸曲实现对纯种微生物的扩培,可以有效提高生产效益。
麸曲在白酒中一般应用于芝麻香白酒和馥合香白酒,而麸曲接种的功能微生物中,芽孢杆菌是其中之一。已有很多研究表明将芽孢杆菌应用于麸曲制作可以提升酶活和风味物质含量,有助于白酒口味提升。吕晓凤[64]将高产吡嗪类化合物的芽孢杆菌与麸皮进行混合培养得到的功能麸曲应用于白酒生产,发现功能麸曲组的酒醅中吡嗪类化合物提高,在功能麸曲实验组所产芝麻香原酒芝香风格较为典型,焦糊香浓郁,余味悠长,酒体醇厚饱满,表明功能麸曲对酒体改善有积极作用。黄治国等[65]采用2株功能芽孢杆菌制作麸曲,发现强化发酵后可明显降低高级醇含量,有助于解决白酒中高级醇含量偏高的问题。郑自强等[66]分离到一株产纤维素酶活性较高的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),制作成细菌麸曲进行固态发酵,结果发现优化产酶条件后有利于产麸曲中纤维素枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)增殖,还可以提高产酶量与酶活。由此可见芽孢杆菌应用于强化麸曲可提高麸曲质量,并且可通过影响酶活、提升风味物质、降低高级醇含量等提升白酒品质。
4.2 在白酒酿造生产中的应用
4.2.1 在强化酒醅生产中的应用
筛选功能微生物并应用到白酒酒醅发酵中,也是提升白酒品质的一种方法。相较于放霉菌、放线菌等。芽孢杆菌在白酒发酵中展现出显著的优势,其有助于发酵过程的顺利进行,同时,使用芽孢杆菌的成本相对较低;此外,其发酵周期短,能够提高生产效率;而且芽孢杆菌易于实现规模化生产,为白酒产业的可持续发展提供了更好的前景[1]。
Tong等[67]将Bacillus velezensis应用于浓香型白酒酒醅中进行强化,研究发现芽孢杆菌的生物强化提高了酒醅中微生物间的相关性,对微生物群落的整体网络结构产生了显著影响。此外,芽孢杆菌显著提高了酒醅中风味物质的产量,使酒醅中总酯、总醇和总酸含量分别提高了19.1%、81.1%和25.9%。一些研究人员将分离的功能芽孢杆菌强化接种至酱香型白酒酒醅中,结果表明可明显提升微生物群落的丰度和多样性,提高酒醅蛋白酶活力,更好的提高白酒的风味与品质[68]。在清香型白酒酿造过程中使用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)强化酒醅后有多种风味物质含量显著增加,包括辛酸乙酯、四甲基吡嗪、4-乙基-2-甲氧基苯酚、3-甲基丁酸乙酯等[69]。这些结果表明,将功能微生物,特别是芽孢杆菌,应用于白酒酒醅发酵中,已成为提升白酒品质的重要手段之一。
4.2.2 在酒糟处理中的应用
酒糟是白酒生产中的主要副产物,数量惊人,据统计我国白酒糟产量已超3000万吨。白酒丢糟中水分含量大、酸度高,如果不能及时有效地进行有效处理,随意丢弃将对生态环境产生实质性影响。白酒丢糟中的营养成分包括淀粉、蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性天然产物等。大多数先前的研究集中在使用其作为饲料和肥料,但它们可能是开发高附加值衍生物的良好来源,具有很大的回收价值和应用前景[70]。
由于白酒糟中的纤维素含量较高,纤维素的降解对白酒糟资源化利用非常关键。微生物降解法处理白酒糟相较物理和化学方法,具有费用低和环境友好等优势,是一种绿色安全、降解彻底的降解途径,有助于提高酒糟的蛋白质含量,改善酒糟的品质[71]。
赵佳等[72]采用了由两株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和一株微白黄链霉菌组成的复合菌剂,对酒糟进行发酵以生产生物有机肥,结果表明,制成的生物有机肥有效活菌数超过了109 CFU/g。应用后表明,生物有机肥肥效显著,可改善根际土壤微环境,提高抗氧化保护酶活性,有助于植株长势。吴耀领等[73]从酒糟中将筛选到3株高效降解纤维素的菌株(宛氏拟青霉、烟曲霉和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis))制备成复合菌剂,发现能够高效降解纤维素,明显促进酒糟堆肥腐熟和缩短堆肥周期,可用于酒糟堆肥的工业化生产。舒林等[74]发现通过采用芽孢杆菌等复合菌种,能够有效改善酒糟物质组成,提高酒糟蛋白质含量,混菌固态发酵酒糟制备蛋白饲料具有一定的指导价值。这些研究共同展示了使用芽孢杆菌等微生物在酒糟资源化利用中的广泛应用前景和巨大潜力。通过选择合适的微生物菌株和发酵条件,可以实现对酒糟的高效转化和综合利用,不仅解决了酒糟处理难题,还创造了新的经济价值和社会价值,为可持续发展做出更大贡献。
综上所述,芽孢杆菌在白酒发酵中的应用展现出巨大的潜力和优势。其不仅优化了微生物群落结构,提高发酵效率,还丰富了白酒的风味物质。同时由于白酒微生物群体复杂,研究芽孢杆菌与其他微生物的相互作用对于优化酿造工艺至关重要。随着微生物技术的不断发展和创新,未来将有更多种类的芽孢杆菌被筛选并应用于白酒发酵中,为白酒产业的可持续发展注入新的活力。
5. 结论与展望
越来越多的科学家们发现芽孢杆菌广泛存在于各种香型白酒的制曲及酿造整个阶段,其多样性、微生物群落动态变化以及代谢产物与白酒风味密切相关。芽孢杆菌不仅具有很强的产酶的能力,还能产生吡嗪类、酸、醇等等影响白酒口感和品质的芳香物质。芽孢杆菌在白酒酿造厂的应用不仅能提高大曲品质,还能提升白酒品质;应用于酒糟处理,有助于酒糟价值。因此进一步探索芽孢杆菌在白酒生产中的实际应用方式以及工艺控制条件在目前是非常重要的。
此外,白酒的酿造过程非常复杂,有很多不同的微生物在相互作用,仅对一种特定功能微生物的研究远远不能解释白酒的酿造机制和香气产生机制。分析芽孢杆菌与其他酿造微生物相互作用、以及酿造微生物与酿造环境之间的相互作用也是未来研究的中心方向。筛选出优良菌株并应用于白酒酿造生产中,以提升白酒品质,在加强应用研究的基础上,可以设计合成微生物菌群来进一步用于大曲发酵和酒醅发酵的风味调控,从群落结构、代谢物调节等各个方面对合成微生物群进行调节,这反过来将导致白酒质量的控制和标准化。
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表 1 芽孢杆菌在强化曲中的应用
Table 1 Application of Bacillus in strengthening Daqu and Fuqu
芽孢杆菌种类 应用阶段 应用效果 参考文献 Bacillus pumilus 大曲 强化大曲的糖化力、液化力、中性蛋白酶活、酸性蛋白酶活都提高,酱香型白酒强化大曲较普通大曲升温快、高温时间持续长,可提高大曲中乙偶姻和四甲基吡嗪的含量,让大曲香气
成分更丰富。[29] Bacillus velezensis和Bacillus subtilis 强化大曲后中优势菌属与重要酯类和芳香化合物等风味成分含量增加,强化大曲改善了白酒的风味。 [60] Bacillus amyloliquefaciens 强化接种后四甲基吡嗪浓度比对照组分别增加了26倍,白酒的香气和产香物质都有所增加。 [62] Bacillus subtilis 强化后的大曲皮微生物群落中Bacillus、Aspergillus、Thermomyces和Rasamsonia的相对丰度增加,Weissella、Lactobacillus、Leuconostoc和Pichia的相对丰度降低,细菌群落与真菌群落的相关性显著增强。 [63] Bacillus thermophilus 强化大曲品温升高,中挺时间延长,由于它们具较高的、不同专一性的蛋白酶活性,能够实现对蛋白质的多级靶向酶解,从而生成种类丰富、含量较高的氨基酸。在高温条件下,这些氨基酸与还原糖发生羰氨反应,进一步促进了杂环化合物的生成,使大曲曲香更为馥郁,还赋予其幽雅纯正的风味。 [75] Bacillus subtilis 强化大曲较普通大曲糖化酶、蛋白酶活力提高,对大曲曲皮和曲心中微生物之间的相关性产生了影响。 [76] Bacillus licheniformis 和Bacillus velezensis 联合强化改变了大曲表面、中间、火圈部位和核心等四层中22个属的相对丰度,其中芽孢杆菌和曲霉的丰度增加,热囊菌、乳杆菌等部分属的丰度减少,接种后,火圈和表面的酯化能力显著提高,此外,醇、酸和酮的含量都有所改善。 [77] Bacillus subtilis 麸曲 功能麸曲组的酒醅中吡嗪类化合物提高,焦糊香浓郁,余味悠长,酒体醇厚饱满,表明功能酒醅对酒体改善有积极作用。 [64] Bacillus licheniformis 和Bacillus velezensis 强化发酵可明显降低高级醇含量。 [65] Bacillus subtilis 表明制作麸曲有利于产纤维素枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)获得有效增殖、提高产酶量及维持酶活性。 [66] Geobacillus stearothermophilus 制备强化麸曲试验表明麸曲具备分泌蛋白酶和淀粉酶能力。 [78] 表 2 芽孢杆菌在白酒发酵过程中的应用
Table 2 Application of Bacillus in Baijiu fermentation process
芽孢杆菌种类 应用阶段 应用效果 参考文献 Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens 酒醅 添加功能菌液的酒醅吡嗪类化合物含量高,强化后酒醅在堆积过程其温度和水分含量有一定程度的提升。 [64] Bacillus licheniformis 、Bacillus subtilis 经过强化发酵后四甲基吡嗪、4-乙基-2-甲氧基苯酚、3-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯含量均显著增加。 [67] Bacillus 强化接种后微生物群落丰度和多样性明显提升,同时提高酒醅蛋白酶活力,能够更好的提高白酒的风味与品质。 [68] Bacillus velezensis 芽孢杆菌显著提高了酒醅中风味物质的产量,使酒醅中总酯、总醇和总酸含量分别提高了19.1%、81.1%和25.9%。 [67] Bacillus licheniformis 、Bacillus subtilis 酒糟 两菌通过协同作用促进白酒糟降解,纤维素酶活力提高了30%~70%,最大白酒糟降解率可以达到 25.9%。 [42] Bacillus amyloliquefaciens、Streptomyces albidoflavus 利用复合菌剂进行发酵酒糟生产生物有机肥,制成的生物有机肥良好,改善了根际土壤微环境,提高了黄瓜植株的抗氧化保护酶活性,植株长势明显优于对照组,肥效显著。 [72] Bacillus licheniformis 、Paecilomyces varioti、Aspergillus fumigatus 3株菌株制备成的复合菌剂能够高效降解纤维素,明显促进酒糟堆肥腐熟和缩短堆肥周期,改善酒糟有机肥品质。 [73] Bacillus、Saccharomyces cerevisiae、Enterococcus faecium 利用复合益生菌固态发酵酒糟可以改善酒糟的蛋白品质。 [74] Bacillus cereus、Bacillus toyonensis 选定出一株高效降解酒糟纤维素的菌株,构建复合菌后可进一步转化生产乙醇。 [79] Saccharomyces cerevisiae、Bacillus subtilis、Lactobacillus plantarum 经过混菌固态发酵制备成的蛋白饲料中粗蛋白含量为(24.97%±0.05%),感官评价最终得分18分,等级为优良。 [80] -
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