Heterologous Expression and Characterization of Collagenase from Lysinibacillus sphaericus and Its Application in the Preparation of Antioxidant Peptides
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摘要: 目的:对来源于Lysinibacillus sphaericus的胶原酶LsCol1进行异源表达、纯化、酶学性质及底物特异性研究,并用于水解罗非鱼皮胶原蛋白制备抗氧化活性肽,以期为新型胶原酶资源的开发及其在生物活性肽制备中的应用提供理论依据。方法:使用序列分析工具BLAST、Clustal Omega等分析LsCol1的氨基酸序列,利用AlphaFold 3预测其三维结构,借助化学合成技术获得LsCol1的基因序列全长并在Escherichia coli中异源表达,使用镍亲和层析色谱分离纯化LsCol1,研究其酶学特性及底物特异性,最后利用LsCol1水解罗非鱼皮胶原蛋白制备抗氧化活性肽。结果:LsCol1基因序列全长为3219 bp,编码1072个氨基酸,N端含有催化域,C端附属结构域由一个多囊肾病样结构域和两个胶原结合结构域组成。纯化后的重组胶原酶LsCol1分子量为120 kDa,最适反应温度和pH分别为37 ℃和7.5,在低于30 ℃和pH7.0~10.0范围内稳定性较好,Ca2+对LsCol1的酶活力呈促进作用。底物特异性实验结果表明,LsCol1的最适作用底物为罗非鱼皮胶原蛋白。以罗非鱼皮胶原蛋白为底物制备的水解物具有良好的抗氧化活性,当水解物浓度为4 mg/mL时,其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基和羟基自由基清除率分别为65.9%、97.6%和32.1%。结论:L. sphaericus来源的重组胶原酶LsCol1具有良好的催化活性,在抗氧化活性肽制备方面具有潜在的应用价值。Abstract: Objective: Collagenase from Lysinibacillus sphaericus (LsCol1) was heterologously expressed and purified, and its enzymatic property and substrate specificity were determined. It was then used to hydrolyze tilapia skin collagen to prepare antioxidant peptides, with the aim of providing a theoretical basis for the development of a new collagenase resource and its application in the preparation of bioactive peptides. Methods: The amino acid sequence of LsCol1 was analyzed using BLAST and Clustal Omega, and the three-dimensional structure was predicted using AlphaFold 3. The gene sequence of LsCol1 was obtained using chemical synthesis technology, and it was then heterologously expressed in Escherichia coli. LsCol1 was purified using nickel affinity chromatography, and its enzymatic properties and substrate specificity were studied. Finally, the antioxidant peptide was prepared by hydrolyzing tilapia skin collagen with LsCol1. Results: The full length of LsCol1 gene was 3219 bp and encoded 1072 amino acids. The N-terminal of LsCol1 had a catalytic domain, and the C-terminal accessory domain consists of a polycystic kidney disease-like domain and two collagen-binding domains. The molecular weight of purified recombinant collagenase LsCol1 was 120 kDa. The optimal reaction temperature and pH of LsCol1 were 37 ℃ and 7.5, respectively, and it was relatively stable in the range below 30 ℃ and pH7.0~10.0. Ca2+ promoted LsCol1 activity. The substrate specificity experiment showed that the optimal substrate for LsCol1 was tilapia skin collagen. The hydrolysate prepared from tilapia skin collagen displayed good antioxidant activity, with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical, and hydroxyl radical, scavenging rates of 65.9%, 97.6%, and 32.1%, respectively, at a concentration of 4 mg/mL. Conclusion: The collagenase LsCol1 from L. sphaericus had high catalytic capacity and potential application in the preparation of bioactive peptides.
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Keywords:
- collagen /
- collagenase /
- enzymatic properties /
- collagen hydrolysate /
- antioxidant activity
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胶原蛋白是一种重要的结构蛋白,由三条多肽链相互缠绕形成稳定的右手超螺旋结构,螺旋区域由重复的氨基酸序列Gly-X-Y构成,其中X多为脯氨酸,而Y多为羟脯氨酸[1]。胶原蛋白广泛存在于动物体的肌腱、骨骼、软骨、韧带和皮肤中,约占总蛋白含量的30%[2]。胶原蛋白水解后得到的胶原蛋白肽生物活性十分广泛,如抗氧化[3]、改善关节疼痛[4]、提高骨密度[5]、降血压[6]、降血糖[7]、促进伤口愈合[8]、提高面部皮肤的水分含量和弹性以及增强表皮屏障功能[9]等,对人类健康具有积极影响。目前,胶原蛋白肽已作为膳食补充剂被添加到食品和饮料中,或者作为生物活性成分加入到化妆品、医疗保健品和药品中[10]。罗非鱼是我国重要的经济鱼类,据统计2023年罗非鱼的全国年产量约为181万吨[11]。罗非鱼经生产加工后会产生大量富含胶原蛋白的鱼皮、鱼鳞等副产物,但是这些加工副产物的高值化利用率较低,造成了严重的资源浪费。因此,以罗非鱼皮或鱼鳞为原料提取胶原蛋白进而将其水解制备生物活性肽,不仅可以减轻环境负担,同时提高了其经济价值。
胶原蛋白的水解方法包括化学法和酶法。化学法缺乏特异性和选择性,并且需要使用腐蚀性化学品,易污染环境[12]。相较于化学法,酶法反应过程可控,反应条件温和,降低了氨基酸被破坏的风险[13],因此更符合清洁生产和安全食用的生产模式。
胶原酶(EC 3.4.24.3)是一种在生理条件下能够水解天然胶原蛋白的酶,对胶原蛋白具有高度特异性[14],可用于嫩化肉制品[15]、澄清和稳定啤酒[16]、制备胶原蛋白活性肽[17]等。根据胶原酶的来源,可分为微生物来源的胶原酶和动物来源的胶原酶。但是,对前者的研究更早些。细菌胶原酶能够与天然胶原蛋白结合并打开缠绕的多肽链,而且可以在多个酶切位点水解胶原蛋白的肽键,最终得到小分子胶原蛋白肽[18−19]。目前,已报道的产胶原酶的微生物包括梭菌(Clostridium histolycum、Clostridium perfringens、Clostridium capito)、弧菌(Vibrio alginolyticus、Vibrio barveyi、Vibrio parahaemolyticus)和芽孢杆菌(Bacillus pumilus、Bacillus cereus、Bacillus subtilis)等[20],并且C. histolyticum和V. alginolyticus来源的胶原酶已被开发为商品化胶原酶。但是,上述菌株大部分为致病菌,在产胶原酶的同时也会产生相应的毒素,因而不适用于食品和营养领域。因此,从食品安全的角度出发,继续筛选非致病性的产胶原酶微生物仍是当下的研究方向。
最近,Bach等[21]报道了一株产胶原酶的微生物Lysinibacillus sphaericus VN3,以牛跟腱胶原蛋白为底物时,粗酶液的酶活力高达56.8 U/mg(酶活力定义为每分钟生成1 µmol亮氨酸所需要的酶量)。随后,该课题组从L. sphaericus VN3的发酵液中纯化到了胶原酶LS,研究发现LS能够将小块牛皮和肌腱水解为可溶性的胶原蛋白溶液,并且在pH 6.0~8.0的条件下,可溶性的胶原蛋白形成了具有良好抗炎以及促进伤口愈合作用的胶原膜。L. sphaericus是一种非致病性的革兰氏阳性细菌,属于Lysinibacillus属,也被称为Bacillus sphaericus。综合考虑L. sphaericus较强的产胶原酶能力及其非致病性特点,有望从L. sphaericus的发酵液中分离纯化到适用于食品加工业的胶原酶。然而,野生酶缺乏稳定性,并且以各种同工酶的形式共存,使得分离纯化过程复杂,成本较高,这严重阻碍了胶原酶的大规模生产和应用。而利用基因工程技术构建异源表达系统,是解决上述问题的有效手段。基于上述研究背景,本研究从已公布的L. sphaericus KCCM 35418的基因组中检索到了一条可能编码胶原酶的基因序列(命名为Lscol1),并首次在大肠杆菌中异源表达,分离纯化后研究其酶学特性以及底物特异性,最后用于酶解罗非鱼皮胶原蛋白制备抗氧化活性肽。本研究旨在丰富现有的胶原酶资源,为杆菌来源胶原酶的研究奠定理论基础,同时提供一种罗非鱼皮抗氧化活性肽的制备方法,为酶法制备抗氧化活性肽的研究提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
Escherichia coli BL21(DE3)、表达质粒pET-28a(+) 德国Novagen公司;LB(Luria-Bertani)培养基、酪蛋白、不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG)、硫酸卡那霉素和咪唑 生工生物工程(上海)股份有限公司;牛皮明胶、鸡Ⅱ型胶原蛋白、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS) 上海麦克林化学试剂化工有限公司;酸溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白 北京索莱宝科技有限公司;乙二醇双四乙酸(Ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA)、乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA) 阿拉丁试剂(上海)有限公司;罗非鱼皮 海南翔泰渔业股份有限公司;其它试剂均为国产分析纯。
DYY-60蛋白电泳仪 北京市六一仪器厂;LG2020D凝胶成像系统 杭州朗基科学仪器有限公司;SMP7多功能酶标仪 美国BIO-RAD公司;NRY-200恒温培养摇床 上海南荣实验室设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 目的基因的获取及其生物信息学分析
根据美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)已公布的L. sphaericus KCCM 35418的全基因组DNA序列信息(NCBI登陆号CP026120.1),从中筛选出一条可能编码胶原酶的基因序列Lscol1(NCBI登录号 WP_107921913.1)。去除信号肽后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司对基因序列进行密码子优化及合成。
使用NCBI数据库中的BLAST功能对LsCol1的氨基酸序列进行同源性分析;利用在线工具SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽序列以及利用ExPASy的ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)预测理论分子量和等电点[22];利用InterPro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)预测结构域[23];利用AlphaFold 3预测三维结构[24],借助PyMOL 2.5软件对三维结构进行可视化分析;利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo)和Jalview 2.11.32软件进行同源序列比对[23],参考氨基酸序列包括来源于B. cereus ATCC 14579的ColA(NCBI登录号Q81BJ6)、来源于C. histolyticum的ColG(Q9X721)和ColH(Q46085)、来源于B. cereus Q1的ColQ1(B9J3S4)以及来源于Clostridium tetani的ColT(Q899Y1),对各结构域进行比对时,ColG、ColH和ColT的结构域边界参考Eckhard等[25]的研究结果,ColQ1和ColA的结构域边界参照Hoppe等[23]的研究结果。
1.2.2 重组胶原酶的表达及分离纯化
参照王逗等[22]报道的方法,略作修改。将合成的目的基因与表达载体pET-28a(+)连接,转化到感受态细胞E. coli BL21(DE3)中。之后,将重组菌接种到含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB液体培养基中,在37 ℃、180 r/min的条件下培养。当菌液的OD600值达0.6~0.8时,添加终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,继续在18 ℃、160 r/min的条件下诱导培养。24 h后,离心(4 ℃,8000 r/min,5 min)收集菌体。而后,将菌体重悬在pH7.5的Tris-HCl缓冲液中,在冰水浴下超声破碎(功率350 W,工作3 s,间隔5 s),破碎结束后离心(4 ℃,8000 r/min,10 min),留取上清液,即获得粗酶液。最后,使用镍亲和层析色谱柱分离纯化重组胶原酶。纯化重组酶前,向镍亲和层析色谱柱中加入5倍体积的结合缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,pH7.5)使色谱柱平衡,之后将上述粗酶液上样于平衡好的纯化柱中,静置 10 min后使杂蛋白流出,再用10倍柱体积的清洗缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,pH7.5)洗脱杂蛋白,最后使用洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,pH7.5)将目的蛋白洗脱下来,回收目的蛋白。
1.2.3 重组胶原酶的酶谱分析
参照陈世化[26]报道的方法,稍作修改。制备5%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)浓缩胶和10%的分离胶,向分离胶中分别加入0.1%(w/v)的酸溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白或明胶溶液用于胶原酶谱和明胶酶谱分析。电泳结束,将凝胶用洗脱液(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液,2.5% Triton X-100,5 mmol/L CaCl2,pH7.6)振荡(50 r/min)清洗4次,洗脱液每15 min换一次。接着,用漂洗液(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液,5 mmol/L CaCl2,pH7.6)振荡(50 r/min)漂洗2次,漂洗液每10 min换一次。之后,用孵育液(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液,5 mmol/L CaCl2,0.2 mmol/L NaCl,0.02% 聚氧乙烯月桂醚,pH7.6)孵育凝胶,于室温下静置反应24 h。最后,用考马斯亮蓝快速染色对凝胶染色,室温下染色半个小时。染色结束后脱色处理,直至凝胶上显示白色条带。
1.2.4 不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白的扫描电镜分析
称取5 mg不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白于含有50 mmol/L Tris-HCl及10 mmol/L氯化钙的离心管中,加入6 U/g LsCol1,在30 ℃下反应,监测不同酶解时间下不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白的表观变化情况。
取上述反应5 h的样品,离心(8000 r/min,5 min)处理,除去上清液。用蒸馏水清洗底物3次,使用4%的戊二醛固定样品24 h。固定结束后,离心(8000 r/min,5 min)去掉固定液,用蒸馏水清洗3次。之后,使用梯度浓度的乙醇脱去水分。最后,放置于烘箱中60 ℃过夜烘干,用于扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)观察。
1.2.5 重组胶原酶活力的测定
参考Mandl等[27]报道的方法,稍作修改。向0.1 mL 1%的明胶溶液中加入0.5 mL pH7.0的Tris-HCl缓冲液(含10 mmol/L CaCl2),然后加入0.2 mL纯化的重组胶原酶液,对照组中加入0.2 mL热灭活的酶液。混匀之后,将反应液置于37 ℃恒温水浴中反应10 min。反应结束后,离心(8000 r/min,5 min)处理。吸取0.5 mL上清液至10 mL试管中,加入0.5 mL茚三酮显色剂和0.5 mL乙酸缓冲液,混匀后置于沸水浴中,15 min后取出冷却至室温,再加入1.5 mL 60%乙醇溶液,充分混匀,然后在570 nm下测定样品的吸光度。酶活力单位定义为:在37 ℃、pH7.0条件下,每分钟水解胶原产生1 μmol/L甘氨酸所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。
1.2.6 重组胶原酶酶学特性研究
1.2.6.1 最适反应pH及pH稳定性的测定
在方法1.2.5的基础上,分别在pH3.0~10.0的缓冲液中测定重组胶原酶的最适反应pH,将最适反应pH下的相对酶活定义为100%。为探究胶原酶的pH稳定性,将酶液加入到pH5~10的缓冲液中,在4 ℃下孵育1~6 h,孵育结束后测定重组胶原酶的酶活。将孵育前胶原酶的酶活定义为100%[28]。
1.2.6.2 最适反应温度及热稳定性的测定
在方法1.2.5的基础上,在最适反应pH下,分别在20~60 ℃下测定重组胶原酶的酶活,将最适反应温度下的相对酶活定义为100%。为探究胶原酶的温度稳定性,将酶液放置到20~50 ℃水浴中恒温孵育1~6 h。孵育结束后,在最适反应pH和温度下测定胶原酶的酶活。将孵育前胶原酶的酶活定义为100%[28]。
1.2.6.3 金属离子和金属离子螯合剂对重组胶原酶活性的影响
在方法1.2.5的基础上,向反应体系中分别加入终浓度为10 mmol/L的金属离子(K+、Li+、Mg2+、Zn2+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Ca2+、Cu2+、Pb2+、Fe2+)或终浓度为1 mmol/L或5 mmol/L的金属离子螯合试剂(EDTA、EGTA),测定重组胶原酶的酶活。将未添加金属离子或金属离子螯合试剂时的相对酶活定义为100%[26]。
1.2.6.4 胶原酶的底物特异性
在方法1.2.5的基础上,在最适反应条件下,分别以明胶、不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白、鸡Ⅱ型胶原蛋白、罗非鱼皮胶原蛋白、牛血清白蛋白和酪蛋白作为底物,测定重组胶原酶的活性。其中,以不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白作为底物时反应时间为3 h,其它底物的反应时间均为10 min[26]。
1.2.6.5 胶原酶动力学参数的测定
参照Wu等[29]报道的方法,稍作修改。在最适反应条件下,以不同的浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL)的明胶作为底物,反应10 min后测定重组胶原酶的反应初速度。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算重组胶原酶的动力学参数Km(mg/mL)和Vmax值(μmol/min/mg),计算公式如下:
1V=KmVmax×1[S]+1Vmax 式中,V为酶促反应速度(μmol/min/mg);[S]为底物浓度(mg/mL)。
1.2.7 罗非鱼皮胶原蛋白水解物的制备
1.2.7.1 罗非鱼皮胶原蛋白的制备
参照Bi等[30]的方法,略做改动。称取500 g鱼皮,将其剪成0.5 cm×0.5 cm小块。之后,加入5 L 0.1 mol/L的NaOH溶液,于4 ℃冰箱中搅拌两天,一天更换两次碱液,以除去杂蛋白。用蒸馏水将鱼皮清洗至中性,再按上述比例加入无水乙醇,在4 ℃冰箱里继续搅拌两天,每天更换一次试剂,除去鱼皮当中的脂肪和色素。结束后,用蒸馏水洗净,冷冻干燥。随后,按1:10(m/V)的比例向冷冻干燥的鱼皮中加入蒸馏水,在50 ℃下热提5 h。提取结束后,用纱布过滤除去不溶物质。最后,将样品真空冷冻干燥,并采用SDS-PAGE进行分析。
1.2.7.2 罗非鱼皮胶原蛋白水解物的制备
参照Hong等[31]的方法,稍做改动。取0.5 g 1.2.7.1中制备的罗非鱼皮胶原蛋白加入到50 mL Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L,pH7.5,含10 mmol/L CaCl2)中,之后加入3 U纯化的LsCol1,于 30 ℃下振荡反应。定时(20 min、1、6、12 h)取样,沸水中灭活10 min 后离心(8000 r/min,10 min),留取上清液用于后续试验。
1.2.7.3 罗非鱼皮胶原蛋白水解物水解度的测定
使用邻苯二甲醛法[32]测定胶原蛋白水解物的水解度(DH)。向试管中加入10 μL罗非鱼皮胶原蛋白水解物,再加入1.2 mL 邻苯二甲醛工作液,在室温下避光反应10 min后,于340 nm处测定吸光值。计算公式如下:
DH(\%)=(NH2)1−(NH2)0(NH2)2−(NH2)0 式中,(NH2)0为样品中未水解的游离氨基酸含量,mg/mL;(NH2)1为样品中水解的游离氨基酸含量,mg/mL;(NH2)2为样品的总游离氨基酸含量,mg/mL。
1.2.8 罗非鱼皮胶原蛋白水解物抗氧化活性的测定
1.2.8.1 DPPH自由基清除率的测定
参照陈惠敏等[33]的方法,稍有改动。取100 μL酶解6 h的罗非鱼皮胶原蛋白水解物加入到96孔板中,再加入100 μL的DPPH工作液,混匀后在室温下避光反应30 min。之后,于517 nm处测定吸光度值。以0.1 mg/mL的抗坏血酸作为阳性对照,每组试验三组平行。DPPH自由基清除率计算公式如下:
DPPH自由基清除率(\%)=(1−A1−A2A0)×100 式中,A0为100 μL DPPH溶液与100 μL无水乙醇混合液的吸光值;A1为100 μL样品与100 μL DPPH溶液混合液的吸光值;A2为100 μL样品与100 μL无水乙醇混合液的吸光值。
1.2.8.2 ABTS+自由基清除率
参照李小锋等[34]的方法,稍有改动。用0.2 mol/L pH7.4的PBS缓冲液将ABTS稀释,使其在734 nm处的吸光值为0.70±0.02。之后,取20 μL样品加入到96孔板中,再加入200 μL ABTS工作液,混匀,室温下避光放置5 min,在734 nm下测定吸光值。ABTS+自由基清除率按以下公式计算:
ABTS+自由基清除率(\%) =(1−A1−A2A0)×100 式中,A0为20 μL PBS溶液与200 mL ABTS溶液混合液的吸光值;A1为20 μL样品与200 μL ABTS溶液混合液的吸光值;A2为20 μL样品与200 μL PBS溶液混合液的吸光值。
1.2.8.3 羟基自由基清除率
参照Qiu 等[35]的方法,并略有改动。向离心管中依次加入0.5 mL 4.5 mol/L的FeSO4溶液、0.5 mL 4.5 mol/L的水杨酸乙醇溶液和0.5 mL 4.4 mol/L的H2O2溶液,立即混匀。随后,加入0.5 mL样液,在37 ℃水浴锅内反应30 min,并于510 nm下测定其吸光值,空白对照组为等体积的蒸馏水。计算公式如下:
羟基自由基清除率(\%) =A0−A1A0×100 式中,A0为对照组吸光值;A1为样品组吸光值。
1.3 数据处理
所有样品平行测定3次,实验结果均以平均值±标准偏差表示。使用SPSS 26软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)对数据进行显著性分析,P<0.05为差异显著。同时,采用Graphpad Prism 8.0软件绘制图表。
2. 结果与分析
2.1 胶原酶的生物信息学分析
胶原酶LsCol1基因序列全长为3219 bp,编码1072个氨基酸,蛋白亚基的分子量为123 kDa,预测的等电点为4.66。将LsCol1的氨基酸序列提交至NCBI数据库进行同源性分析,与B. cereus Q1来源的ColQ1氨基酸序列一致性为72.3%,与B. cereus14579来源的ColA一致性为71.7%,与C. histolyticum来源的ColG一致性为44.2%,与C. histolyticum来源的ColH的一致性为41.9%,与C. tetani来源的ColT一致性为48.9%。
根据信号肽和结构域预测结果可知,LsCol1属于肽酶M9家族,含有引导蛋白胞外分泌的N端信号肽(signal peptide)、功能未知的前肽(propeptide)、与胶原水解有关的肽酶M9家族N端结构域(activator domain,AD)[36−37]、M9家族肽酶结构域(peptidase domain M9 family,PD)、一个多囊肾病样结构域(polycystic kidney disease-like domain,PKD)和两个能够结合纤维状胶原蛋白的胶原结合结构域(collagen-binding domain,CBD)(图1)。AD结构域和PD结构域共同构成了胶原酶的催化域(collagenase unit),能够将结合的纤维状胶原蛋白水解。据报道,来源于Pseudoalteromonas sp. SM9913的丝氨酸蛋白酶含有的PKD结构域能够与胶原微纤维结合并使其膨胀[38]。另有研究表明,PKD能够增强酶与胶原纤维的结合能力[39]。CBD结构域和PKD结构域在胶原酶水解明胶和可溶性胶原蛋白时并不是必需的,但是在水解不溶性胶原纤维时不可或缺[40]。结构域序列比对结果显示,在LsCol1的PD结构域中含有参与锌结合的保守氨基酸序列501HEXXH505和保守的谷氨酸残基(E533)(标记为红色字体)(图2A),而上述保守基序和保守氨基酸残基是肽酶M9家族中锌金属蛋白酶的典型特征。同时,在PD结构域和附属结构域(CBD或PKD结构域)中含有参与钙结合的保守氨基酸残基(标记为橙黄色字体)(图2A)。另外,LsCol1与芽孢杆菌属来源的ColQ1和ColA的相似性远高于梭菌属来源的ColG、ColH和ColT,并且与上述胶原酶相似性较高的氨基酸序列集中在PD结构域(图2B)。
图 1 胶原酶LsCol1的结构分析注:(A)LsCol1的结构域示意图,利用在线工具IBS Illustrator生成[41];PKD:多囊肾病样结构域;CBD:胶原结合结构域;(B)LsCol1的三维结构图。Figure 1. Structural analysis of collagenase LsCol1图 2 胶原酶LsCol1的序列分析注:(A)LsCol1与其它胶原酶的氨基酸序列比对分析;紫色背景为胶原酶的激活结构域(AD);蓝色背景为肽酶M9家族结构域(PD);红色字体为与锌结合的保守氨基酸残基;橙黄色字体为与钙结合的保守氨基酸残基;LsCol1的结构域边界根据结构域预测结果及其与其它胶原酶的氨基酸序列比对结果推断得出;每一行序列右侧的数字表示该行的氨基酸数目;(B)LsCol1的各结构域与其它来源胶原酶相应结构域的相似性(%)分析,蓝色背景颜色越深代表相似性越高;相似性通过BLASTp计算得出[42]。Figure 2. Sequence analysis of collagenase LsCol12.2 重组胶原酶的分离纯化及其水解能力分析
胶原酶基因Lscol1在E. coli BL21(DE3)中成功表达后,采用镍亲和层析色谱对重组胶原酶进行分离纯化。纯化后的LsCol1在SDS-PAGE上出现了单一条带,分子量约为120 kDa(图3A,泳道6),与其预测的分子量相一致。之后,利用酸溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白和明胶酶谱对纯化的重组胶原酶进行分析,以鉴定其对酸溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白和明胶的降解能力。如图3B和图3C所示,在与LsCol1分子量相对应的位置均观察到了负染条带,表明LsCol1具有水解酸溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白和明胶的活性。随后,本研究利用LsCol1酶解不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白。随着酶解时间的延长,不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白首先变得膨胀,然后被逐渐降解,反应12 h后基本降解完全(图3D)。为了进一步了解不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白在降解过程中的结构变化,反应5 h后将胶原蛋白取出进行SEM分析。由图3E可知,对照组的胶原蛋白结构致密,而实验组的胶原纤维束孔隙增大,已被降解为分散状的细小胶原纤维。由以上实验结果可知,LsCol1是真正的胶原酶。
图 3 胶原酶LsCol1的酶解特性注:(A)LsCol1的SDS-PAGE分析,M:marker;1:未经IPTG诱导的重组菌;2:经IPTG诱导的重组菌;3:诱导后重组菌的破壁上清液;4:诱导后重组菌的破壁沉淀;5:清洗缓冲液洗脱的杂蛋白;6:纯化后的胶原酶;(B)LsCol1的胶原酶谱分析,M:marker;(C)LsCol1的明胶酶谱分析;M:marker;(D)重组胶原酶LsCol1对不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白的降解活性;(E)水解反应5 h后牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白的SEM图;Control:未经酶解作用的对照组;对照组和实验组的放大倍数均为5000×。Figure 3. Enzymatic properties of collagenase LsCol12.3 重组胶原酶的酶学特性研究
2.3.1 最适反应pH及pH稳定性
如图4A所示,LsCol1的最适反应pH为7.5,与L. sphaericus VN3(pH7)[21]、B. subtilis B13(pH7.5)[15]和B. pumilus Col-J(pH7.5)[30]来源的胶原酶相近。LsCol1在pH7~10范围内催化活性较高,相对酶活力大于54.4%。但是,当反应液pH低于6时,催化活性明显降低,此时相对酶活力小于12.0%。LsCol1在pH7.0~10.0范围内稳定性较好,孵育3 h后相对酶活力为51.0%~70.8%。而来源于L. sphaericus VN3的胶原酶在pH6~8范围内稳定性较好,在37 ℃下孵育30 min后残余酶活力高于70%[21]。
2.3.2 最适反应温度及热稳定性
LsCol1的最适反应温度为37 ℃(图5A),与来源于L. sphaericus VN3[21]和B. cereus FRCY9-2[43]的胶原酶相一致,但是低于B. subtilis B13(50 ℃)[15]来源的胶原酶。当孵育温度低于30 ℃时,LsCol1的热稳定性较好,孵育6 h后,残余酶活力高于86.0%。但是超过此温度后,LsCol1的催化活性明显降低,在37 ℃下仅孵育1 h已经失去了大部分酶活力(图5B)。已报道的很多微生物胶原酶的热稳定性都比较差,如Streptomyces sp. strain 3B来源的胶原酶在47 ℃下处理20 min后相对酶活力低于10.0%[44],Vibrio vulnificus CYK279来源的胶原酶在45 ℃下处理1 h后残余酶活力下降至10.0%[45]。
2.3.3 金属离子和金属离子螯合剂对酶活性的影响
如表1所示,胶原酶LsCol1的酶活性受到金属离子螯合剂EDTA的强烈抑制作用,表明该胶原酶属于金属蛋白酶[46]。Zn2+对LsCol1的酶活性呈强烈的抑制作用,但是Ca2+对LsCol1的酶活性表现为激活作用,并且当Ca2+螯合剂EGTA存在时,其相对酶活力明显降低,表明LsCol1属于Ca2+依赖型。据报道,Ca2+能够改变胶原酶的局部构象结构,在Ca2+存在的情况下,酶的催化活性和稳定性均有所提高[40,47]。其它金属离子对LsCol1的酶活性表现为无影响或呈不同程度的抑制作用。
表 1 金属离子和金属离子螯合剂对胶原酶LsCol1活性的影响Table 1. Effects of metal ions and inhibitors on the activity of collagenase LsCol1金属离子或抑制剂 浓度 (mmol/L) 相对酶活力(%) 对照 0.0 100 EDTA 1.0 6.0±0.4 5.0 1.0±0.0 EGTA 1.0 81.0±4.5 5.0 39.7±2.5 K+ 10.0 100.5±2.2 Li+ 10.0 94.4±2.6 Mg2+ 10.0 96.2±1.6 Zn2+ 10.0 1.2±0.2 Ba2+ 10.0 84.9±6.9 Mn2+ 10.0 49.4±1.3 Co2+ 10.0 80.3±6.7 Ca2+ 10.0 117.8±1.0 Cu2+ 10.0 1.6±0.2 Pb2+ 10.0 3.5±0.2 Fe2+ 10.0 10.5±1.3 2.3.4 重组胶原酶的底物特异性及动力学分析
如表2所示,除了明胶和不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白外,LsCol1还能够水解罗非鱼皮胶原蛋白和鸡Ⅱ型胶原蛋白,并且以罗非鱼皮胶原蛋白为底物时酶活力最高。但是,LsCol1对牛血清白蛋白和酪蛋白无水解作用。另外,本研究以明胶为底物对胶原酶LsCol1的动力学参数进行了测定。如图6所示,经计算得知, LsCol1的Vmax值为5.9 μmol/min/mg,Km值为0.7 mg/mL。
表 2 胶原酶LsCol1的底物特异性Table 2. Substrate specificity of collagenase LsCol1底物 特异性酶活 (U/mg) 牛血清白蛋白 0 酪蛋白 0 明胶 2.1±0.0 罗非鱼皮胶原蛋白 14.1±0.4 不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白 0.2±0.0 鸡Ⅱ型胶原蛋白 1.0±0.1 2.4 罗非鱼皮胶原蛋白的提取及其水解物的制备
提取物经过SDS-PAGE分析,可以清楚地观察到三条(α1、α2和β)符合胶原蛋白特征的多肽链(图7A)。之后,以提取的罗非鱼皮胶原蛋白为底物,利用LsCol1进行酶解。如图7B所示,胶原蛋白水解物的水解度随着酶解时间的延长而升高,反应6 h后变化趋于平缓,此时的水解度为24.9%。
2.5 胶原蛋白水解物抗氧化活性分析
机体内氧化还原不平衡可能导致细胞、组织和器官等发生不可逆的病理改变,从而增加罹患炎症[48]、癌症[49]和高血压[50]等疾病的风险,而利用水产动物胶原蛋白制备抗氧化活性肽一直是研究的热点。本研究对制备的罗非鱼皮胶原蛋白水解物的抗氧化活性进行了分析,评价方法包括DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基清除能力。如图8所示,胶原蛋白水解物的抗氧化活性随着水解物浓度的提高而增强。当水解物浓度为4 mg/mL时,其DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基清除率分别为65.9%、97.6%和32.1%。盛周煌等[51]利用复合蛋白酶制备罗非鱼皮胶原蛋白水解物,当水解物的浓度为4 mg/mL时,其ABTS+自由基和羟基自由基清除率分别约为80%和30%;当水解物浓度为20 mg/mL时,其DPPH自由基清除率约为15%。邢瀚文等[52]利用B. subtilis固态发酵罗非鱼皮制备胶原蛋白水解物,当水解物的浓度为4 mg/mL时,其DPPH自由基和羟基自由基清除率分别约为50%和30%。由此可见,本实验制备的胶原蛋白水解物展现了更高的抗氧化能力。
3. 结论
本研究从L. sphaericus KCCM 35418的基因组中筛选到的胶原酶LsCol1基因序列全长3219 bp,编码1072个氨基酸。LsCol1属于肽酶M9家族,N-端含有信号肽、前肽和催化域,C端含有一个PKD结构域和两个CBD结构域。重组胶原酶LsCol1不仅能够水解明胶和酸溶性牛跟腱胶原蛋白,并且对不溶性牛跟腱胶原蛋白也具有水解活性,表明该酶是真正的胶原酶。LsCol1的最适反应温度和pH分别为37 ℃和7.5,在30 ℃以下以及pH7.0~10.0范围内稳定性较好。LsCol1为Ca2+依赖型金属蛋白酶,当Ca2+存在时,LsCol1的催化活性显著提高。LsCol1对罗非鱼皮胶原蛋白和鸡Ⅱ型胶原蛋白也具有水解活性,尤其是以罗非鱼皮胶原蛋白为底物时水解活性最强,酶活力14.1 U/mg。利用LsCol1水解罗非鱼皮胶原蛋白制备抗氧化活性肽,当水解物浓度为4 mg/mL时,其DPPH自由基、ABTS+自由基和羟基自由基清除率分别为65.9%、97.6%和32.1%。在后续研究中,拟借助分子对接等手段分析LsCol1的关键氨基酸残基,通过分子改造提高LsCol1的体外稳定性,进而提升其工业适用性。
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图 1 胶原酶LsCol1的结构分析
注:(A)LsCol1的结构域示意图,利用在线工具IBS Illustrator生成[41];PKD:多囊肾病样结构域;CBD:胶原结合结构域;(B)LsCol1的三维结构图。
Figure 1. Structural analysis of collagenase LsCol1
图 2 胶原酶LsCol1的序列分析
注:(A)LsCol1与其它胶原酶的氨基酸序列比对分析;紫色背景为胶原酶的激活结构域(AD);蓝色背景为肽酶M9家族结构域(PD);红色字体为与锌结合的保守氨基酸残基;橙黄色字体为与钙结合的保守氨基酸残基;LsCol1的结构域边界根据结构域预测结果及其与其它胶原酶的氨基酸序列比对结果推断得出;每一行序列右侧的数字表示该行的氨基酸数目;(B)LsCol1的各结构域与其它来源胶原酶相应结构域的相似性(%)分析,蓝色背景颜色越深代表相似性越高;相似性通过BLASTp计算得出[42]。
Figure 2. Sequence analysis of collagenase LsCol1
图 3 胶原酶LsCol1的酶解特性
注:(A)LsCol1的SDS-PAGE分析,M:marker;1:未经IPTG诱导的重组菌;2:经IPTG诱导的重组菌;3:诱导后重组菌的破壁上清液;4:诱导后重组菌的破壁沉淀;5:清洗缓冲液洗脱的杂蛋白;6:纯化后的胶原酶;(B)LsCol1的胶原酶谱分析,M:marker;(C)LsCol1的明胶酶谱分析;M:marker;(D)重组胶原酶LsCol1对不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白的降解活性;(E)水解反应5 h后牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白的SEM图;Control:未经酶解作用的对照组;对照组和实验组的放大倍数均为5000×。
Figure 3. Enzymatic properties of collagenase LsCol1
表 1 金属离子和金属离子螯合剂对胶原酶LsCol1活性的影响
Table 1 Effects of metal ions and inhibitors on the activity of collagenase LsCol1
金属离子或抑制剂 浓度 (mmol/L) 相对酶活力(%) 对照 0.0 100 EDTA 1.0 6.0±0.4 5.0 1.0±0.0 EGTA 1.0 81.0±4.5 5.0 39.7±2.5 K+ 10.0 100.5±2.2 Li+ 10.0 94.4±2.6 Mg2+ 10.0 96.2±1.6 Zn2+ 10.0 1.2±0.2 Ba2+ 10.0 84.9±6.9 Mn2+ 10.0 49.4±1.3 Co2+ 10.0 80.3±6.7 Ca2+ 10.0 117.8±1.0 Cu2+ 10.0 1.6±0.2 Pb2+ 10.0 3.5±0.2 Fe2+ 10.0 10.5±1.3 表 2 胶原酶LsCol1的底物特异性
Table 2 Substrate specificity of collagenase LsCol1
底物 特异性酶活 (U/mg) 牛血清白蛋白 0 酪蛋白 0 明胶 2.1±0.0 罗非鱼皮胶原蛋白 14.1±0.4 不溶性牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白 0.2±0.0 鸡Ⅱ型胶原蛋白 1.0±0.1 -
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