Isolation, Identification and Biological Characterization of Spoilage Mold in Seedless White Raisins
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摘要: 葡萄干在加工及贮藏运输中极易受到微生物污染。为了解新疆特色干果无核白葡萄干霉菌污染情况，试验以无核白葡萄干为试验对象，分离纯化高温高湿环境贮藏3个月后无核白葡萄干表面污染霉菌。通过回接侵染试验，根据葡萄干霉变时间及程度筛选出腐败霉菌，利用rDNA-ITS序列分析结合形态特征和显微结构鉴定腐败霉菌，并对其生物学特性进行分析。结果表明：葡萄干表面四株污染霉菌中菌株A1、A2、A4为致腐霉菌，鉴定后确认为塔滨曲霉（Aspergillus tubingensis）、黑曲霉（Aspergillus niger）和岐皱青霉（Penicillium steckii），塔滨曲霉最适生长温度为28℃，环境湿度为90%，pH为7，热致死温度为60 ℃；黑曲霉最适生长温度为28 ℃，环境湿度为90%，pH为7，热致死温度为65 ℃；岐皱青霉最适生长温度为30 ℃，环境湿度为90%，最适pH为7，热致死温度为55 ℃。本文为葡萄干贮藏期间的霉变发生、控制及优化贮藏条件提供理论依据。Abstract: Raisins were highly susceptible to microbial contamination during their processing, storage, and transportation. To understand the mold contamination of Xinjiang's specialty dried fruit, seedless white raisins, in this study, seedless white raisins were selected as the experimental subject. The mold contaminating the surface of the seedless white raisins was isolated and purified after being stored for three months in a high temperature and high humidity environment. The spoilage molds were screened according to the time and degree of molding by performing return infection experiments, they were identified and biologically characterized using rDNA-ITS sequence analysis combined with morphological and microstructural analyses. Results showed that, among the four strains of molds contaminating the surface of the raisins, strains A1, A2 and A4 caused rot. Aspergillus tubingensis, Aspergillus niger, and Penicillium steckii were also detected. Aspergillus tubingensis had an optimum growth temperature of 28 ℃, an ambient humidity of 90%, a pH of 7, and a lethal temperature of 60 ℃. Aspergillus niger had an optimal growth temperature of 28 ℃, an ambient humidity of 90%, a pH of 7, and a lethal temperature of 65 ℃. Penicillium steckii had an optimum growth temperature of 30 ℃, an ambient humidity of 90%, a pH of 7, and a lethal temperature of 55 ℃. This study provides a theoretical basis for mold growth, control, and optimization of storage conditions during raisin storage.
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Keywords:
- raisins /
- spoilage mold /
- strain identification /
- biological characteristics
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葡萄干（Raisins）是指新鲜优质葡萄经过自然晒干、风干或人工脱水等工艺后制成的干制食品[1]，具有口感酸甜、营养丰富、食用方便的特点，是一种深受国内外消费者青睐的全球性干果产品[2]。作为国内最大的葡萄干产区，新疆葡萄干年产量在150~180千吨左右，占国内葡萄干总产量的95%以上，世界总产量的8%[3]。新疆吐鲁番及哈密地区葡萄干制干品种以无核白葡萄为主，由于具有生长力旺盛、结果率及果实含糖量高、果实无核的特性，无核白葡萄成为了最适宜的葡萄制干品种，有着悠久的制干历史[4]。盛产的无核白葡萄干，色泽鲜绿、果肉柔软、口味清甜，是新疆极具竞争力的特色干果制品[5]。
然而葡萄干在制干、运输和贮藏过程中容易沾染泥沙、灰尘、微生物以及虫卵等。王亚平等[6]对市面上销售的104份葡萄干样品进行了霉菌污染情况调查。所收集样本中，霉菌检出率为97%，检出霉菌均值为5800 CFU/g，按照外包装标注产地分类，新疆地区葡萄干霉菌均值与其他地区差异显著，且明显高于其他地区。霉菌的附着会使葡萄干在贮藏过程中发生霉变[7]，进而导致葡萄干发生变质腐烂，不仅影响葡萄干加工企业的经济效益，也对消费者的身体健康造成了威胁，在高温潮湿地区，霉菌污染造成的腐败现象则更加突出。研究无核白葡萄干霉菌污染情况，控制无核白葡萄干霉菌污染，对提升无核白葡萄干产品品质，助力无核白葡萄干在国内外销售有重要意义。目前，葡萄干霉菌污染种类及菌株分离鉴定的相关研究已经开展，李燕等[8]对葡萄干表面真菌分离检测，结果表明其表面真菌数量较多，但菌种单一；VARGA等[9]对多个国家葡萄干表面霉菌污染情况进行调查，发现黑曲霉和盛泡曲霉是葡萄干表面的主要污染霉菌；汤梦婷[10]对葡萄干表面污染霉菌进行鉴定，分离出的三株污染霉菌分别为：蓝状菌（Talaromyces）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黄曲霉（Aspergillus flavus）。近年来，有关无核白葡萄干的研究多集中于品质[11−13]的保持及加工工艺的优化[14−15]，有关无核白葡萄干在高温高湿地区贮藏过程中，葡萄干致腐霉菌污染及其生物学特性的相关研究并未深入。
本文以无核白葡萄干为研究对象，分离高温高湿环境中贮藏3个月（从购买当日开始计算）葡萄干表面滋生的污染霉菌，通过污染霉菌回接试验筛选出造成葡萄干腐败的霉菌，利用形态学观察和rDNA-ITS序列分析鉴定腐败霉菌，并分析腐败霉菌的生物学特性，以期为深入研究葡萄干贮藏期间的霉变发生、控制及优化贮藏条件提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
无核白葡萄干 购于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市华凌市场；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA） 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；盐酸、氢氧化钠 分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司。
DSX-L-I手提式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SPX-150B-ZII生化培养箱 上海迅博医疗生物仪器股份有限公司；SW-CJ-FD净化工作台 上海迅博医疗生物仪器股份有限公司；S550T-720HD生物显微镜 苏州倍特嘉光电科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 葡萄干污染霉菌的分离纯化
污染霉菌的分离方法参照汤梦婷[10]、倪泽平等[16]的方法并稍作修改，高温高湿贮藏3个月（自购进日计算）的无核白葡萄干，随机选取50 g葡萄干，放入已灭菌的烧杯中，倒入无菌水没过葡萄干后超声波洗涤20 min收集清洗液。使用梯度稀释法稀释清洗液，选取稀释倍数为10−3和10−4的稀释液培养。分别吸取1 mL不同倍数的稀释液滴入PDA培养基上，用无菌涂布器涂抹均匀后置于30 ℃恒温培养箱中倒置培养，培养第5~7 d，根据形态学判别特征，在无菌操作条件下挑取形态学差异显著的菌株，转接至洁净PDA培养基中，采用连续划线的方法纯化菌株，在30 ℃下多次培养，最终得到的纯种菌株放置于4 ℃冰箱中备用。
1.2.2 葡萄干腐败霉菌的筛选
分离出的各个菌株分别于30 ℃恒温培养箱中倒置培养，培养第5 d用含有体积分数为0.05%（v/v）的吐温-80的无菌水将孢子洗脱，并调节孢子浓度为106 CFU/mL[16]。选取大小均一，品质良好的葡萄干，用体积分数为75%（v/v）的乙醇消毒后无菌水洗涤，在净化工作台上风干。无菌葡萄干分装于保鲜盒中并均匀喷洒不同污染霉菌的孢子悬浮液以及无菌水（作对照组），处理后的葡萄干分别置于无菌环境下（温度：25±2 ℃；环境湿度：80%±2%）贮藏，根据葡萄干发霉速度及霉变程度确定腐败霉菌。
1.2.3 腐败霉菌的形态特征观察
纯化后的腐败霉菌点植培养于PDA培养基中心处，倒置于30 ℃恒温培养箱中培养7 d，对各菌株的形态、颜色、大小、边缘特征、菌丝生长情况等进行观察。
1.2.4 腐败霉菌的显微镜结构观察
纯化后的腐败霉菌采用显微镜直接观察法[17]观察，记录观察结果并拍摄清晰照片，参考《真菌鉴定手册》[18]、《真菌分类学》[19]等相关资料，初步鉴定出腐败菌种。
1.2.5 rDNA-ITS序列分析
按照Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书指导提取DNA，使用真菌rDNA通用扩增引物ITS1和ITS4（表1）扩增目的片段基因，PCR扩增体系及扩增程序见表2~表3。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，溴化已锭（Ethidium Bromide，EB）染色，用凝胶成像仪观察。用San Prep柱式胶回收试剂盒回收PCR产物，产物送生工生物工程（上海）服务有限公司测序。
表 1 PCR扩增引物Table 1. Primer of PCR amplification引物名称 引物序列（5'→3'） ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 表 2 PCR扩增体系Table 2. System of PCR amplification试剂 体积（µL） Template（基因组DNA 20~50 ng/μL） 1 ITS1（10 µmol/L） 1 ITS4（10 µmol/L） 1 dNTP（2.5 mmol/L） 1 Taq DNA聚合酶 0.2 10×Taq reaction buffer 2.5 ddH2O 25 表 3 PCR扩增程序Table 3. Procedure of PCR amplification温度（℃） 时间（s） 程序 94 240 预变性 94 45 30cycle 55 45 72 60 72 600 修复延伸 4 ∞ 终止反应 将获取的有效序列在NCBI中采用BLAST进行比对，并导出同源性较高菌株ITS的基因序列区，基于ITS序列邻接法（Neighbor-joining），利用MEGA 6.06软件构建发育树。
1.2.6 腐败霉菌生物学特性研究
1.2.6.1 腐败霉菌生长曲线的绘制
生长曲线的绘制参照刘鑫燕等[20]的方法，无菌条件下制备各株腐败霉菌孢子悬浮液（1×106 CFU/L），分别移取1 μL孢子悬浮液至含有20 mL无菌PDB培养基的锥形瓶中，30 ℃、120 r/min振荡培养。每10 h抽滤锥形瓶中菌丝体，在70 ℃干燥箱中干燥至恒重获得腐败霉菌菌丝干重，直至霉菌菌丝干重无明显变化。
1.2.6.2 不同温度对菌丝生长的影响
参照王春红等[21]的方法并稍作修改，用灭菌后的打孔器沿各腐败霉菌菌落边缘打孔，获得若干直径为5 mm的腐败霉菌菌饼，将菌饼接种于PDA培养基上，正置4 h后，分别置于不同温度（4、20、25、28、30、35、40 ℃）恒温培养箱中倒置培养，采用十字交叉法在倒置培养第5 d测量菌落净生长直径，并记录菌株生长状况。
1.2.6.3 不同环境湿度对菌丝生长的影响
参照王春红等[21]的方法并稍作修改，用灭菌后的打孔器沿各腐败霉菌菌落边缘打孔，获得若干直径为5 mm的腐败霉菌菌饼，将菌饼接种于PDA培养基上，正置4 h后，分别置于不同环境湿度（50%、60%、70%、80%、90%）的30 ℃恒温培养箱中倒置培养，采用十字交叉法在倒置培养第5 d测量菌落净生长直径，并记录菌株生长状况。
1.2.6.4 不同pH对菌丝生长的影响
参照王春红等[21]的方法并稍作修改，用灭菌后的打孔器沿各腐败霉菌菌落边缘打孔，获得若干直径为5 mm的腐败霉菌菌饼，分别接种于不同pH（3、4、5、6、7、8、9）的培养上，正置4 h后，于30 ℃恒温培养箱中倒置培养，采用十字交叉法在倒置培养第5 d测量菌落净生长直径，并记录菌株生长状况。
1.2.6.5 腐败霉菌热致死温度的测定
参照马乔女等[22]的方法，分别移取1 μL腐败霉菌孢子悬浮液（1×106 CFU/L）至无菌试管中，置于温度为45、50、55、60、65、70 ℃的恒温水浴锅中热处理10 min，30 ℃保湿培养48 h后，用光学显微镜观察（各霉菌每种处理至少200个孢子），统计孢子萌发率。
孢子萌发率(%)=孢子萌发数孢子总数目×100 1.3 数据处理
每组试验重复三次，采用IBM SPSS Statistics 26软件进行单因素方差分析，Origin 2024软件绘图，试验数据用“平均值±标准差”表示，统计检验的显著水平以P<0.05为基准。
2. 结果与分析
2.1 葡萄干污染霉菌的分离纯化
无核白葡萄干高温高湿贮藏3个月（自购进日计算），超声洗涤获得含有污染霉菌的清洗液。清洗液稀释后经PDA培养基培养，通过肉眼观察，挑选出形态学差异明显的菌株分离纯化，可获得形态各异的污染霉菌。共挑选出4株具有典型特征的霉菌（图1），经纯化后置于4 ℃冰箱中保存备用。四株分别命名为A1、A2、A3、A4。
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图 1 清洗液中污染霉菌在PDA培养基上的形态注：a~b为正面；c~d为反面。Figure 1. Colony morphology of contaminated mold in the cleaning solution on PDA medium2.2 腐败霉菌的筛选
无核白葡萄干分别回接4株污染霉菌后的腐败情况如图2所示。回接菌株A1的无核白葡萄干，在贮藏第5 d长出少量白色霉斑，霉斑在贮藏过程中不断扩大，贮藏第15 d观察到大部分葡萄干表面被白色霉斑覆盖，霉斑较厚的部位颜色较深呈鹅黄色，并且霉斑上出现少量的黑色孢子。无核白葡萄干在喷洒A2菌株孢子悬浮液后的第5 d表面长出少量灰黑色霉斑，贮藏第15 d，霉斑面积明显扩大，霉斑覆盖处长出白色较薄菌丝。喷洒A4菌株孢子悬浮液的无核白葡萄干贮藏第5 d表面长出少量白色霉斑，霉斑较厚。随着贮藏时间的延长，霉斑面积不断扩大，颜色加深为青绿色，第15 d，葡萄干表面已被厚厚的青绿色霉斑包裹。喷洒A3菌株孢子悬浮液和无菌水浸泡的健康葡萄干，在整个观察期间无霉变腐烂现象。根据回接后腐败情况将A1、A2和A4菌株确定为引起葡萄干贮藏中霉变的腐败霉菌。
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图 2 回接污染霉菌后无核白葡萄干的腐败情况Figure 2. Spoilage of seedless white raisins after backtracking contaminated mold2.3 腐败霉菌的鉴定
2.3.1 腐败霉菌的形态特征
各株腐败霉菌菌落特征如图3所示。A1菌株在PDA培养基上蔓延式生长，菌丝生长速度迅速，菌落直径生长至8~9 cm，菌丝质地绒状且致密，具有辐射状沟纹，菌落正面中心呈褐色，外围有少量淡黄色菌丝，菌落反面呈淡黄色。A2菌株在PDA培养基上迅速生长，菌落直径生长至8~9 cm，中间为较厚黑色绒状菌丝，边缘白色波状菌丝，菌落反面为淡黄色，菌落边缘光滑平整。A4菌株在PDA培养基上生长缓慢，菌落直径生长至3~4 cm，菌落中心有肚脐状凸起，外围部分有放射状条纹，质地紧密，后期菌落中心颜色加深呈青色，并产生少量透明的晶体颗粒，菌落反面为白色。
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图 3 A1、A2、A4在PDA培养基上的菌落形态注：a~c为正面；d~f为反面。Figure 3. Colony morphology of A1, A2 and A4 on PDA medium2.3.2 腐败霉菌的显微结构
各株腐败霉菌在显微镜下观察到的形态见图4。A1分生孢子明显，浅褐色球形，呈放射状，直立于孢子梗茎上，孢子梗不分枝无隔膜。A2分生孢子为球形，呈黑褐色，分生孢子梗茎中空，壁光滑无隔膜。A4分生孢子梗为典型的扫帚状，孢子梗短粗有隔膜，多分生或簇生，小梗顶端有圆形浅青色分生孢子。根据菌株的形态学特征（包括PDA培养基上的菌落形态以及显微镜下的形态），初步判断A1属于曲霉属（Aspergillus）霉菌，A2为曲霉属的黑曲霉（Aspergillus niger），A4属于青霉属（Penicillium）霉菌。
2.3.3 腐败霉菌的rDNA-ITS序列分析
利用真菌试剂盒分别提取菌株A1、A2、A4的DNA，以A1、A2和A4基因组DNA为模板，以真菌通用引物ITS对其进行特异性扩增结果如图5所示，样品A1、A2、A4分别获得长度为574、574、568 bp的条带。
扩增产物测序后进行BLAST比对，所测菌株的ITS全序列与比对结果中同源性较高序列采用MEGA6.06软件构建系统发育树（图6）。依据真菌分子分类鉴定原则，通过ITS区域比对OUT（Operational taxonomiccunits）与Gen Bank中参照序列大于99%的菌株鉴别为相同种[23]。A1、A2、A4菌株ITS序列分别与Gen Bank中登录号为MN818622.1、MT218381.1、MW793721.1的菌株处于同一分支，序列相似性为100%、100%、99.77%，基于ITS序列的系统发育树，并结合形态学观察结果，将A1菌株鉴定为塔滨曲霉（Aspergillus tubingensis），A2菌株鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger），A4菌株鉴定为岐皱青霉（Penicillium steckii）。
2.4 生物学特征研究
2.4.1 腐败霉菌生长曲线的绘制
三株腐败霉菌的生长曲线见图7。菌株A1在培养开始的前20 h菌丝的干重无明显变化，第20 h菌丝干重开始增加，40~90 h菌株干重显著上升（P<0.05），此时为菌株A1的对数生长期，培养90 h后直至结束记录，菌丝干重无明显变化为生长稳定期。菌株A2培养初期前10 h内菌丝干重无明显变化，培养第20 h菌丝干重的上升趋势显著（P<0.05）进入生长对数期，100~170 h菌丝干重无明显变化进入生长稳定期。培养20 h后，菌株A4菌丝干重显著增加（P<0.05），30~130 h菌丝干重从0.064 g增长至0.843 g，此时为对数生长期，130 h至结束记录，菌株A4的菌丝干重无明显变化为稳定期。
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2.4.2 温度对菌丝生长的影响
不同温度对三株腐败霉菌菌丝生长的影响见图8。菌株A1仅在4 ℃下不生长，菌落直径在20~28 ℃与温度呈正相关，在30~40 ℃呈负相关，28 ℃、30 ℃下，A1的菌落直径分别为5.49 cm和5.45 cm，显著高于其他温度（P<0.05）。菌株A2的菌落直径变化趋势与菌株A1相似，在28 ℃下菌落直径最大为5.27 cm，30 ℃下菌落直径与最大菌落直径相比差异不明显。菌株A4在4 ℃和40 ℃下不生长，菌落直径在20~35 ℃的温度范围内先升后降，在30 ℃下菌落直径最大为1.96 cm。
2.4.3 环境湿度对菌丝生长的影响
不同环境湿度对三株腐败霉菌菌丝生长的影响见图9。菌株A1在环境湿度50%~90%均能生长，菌落直径随着环境湿度的增长而增大，环境湿度上升至90%时，菌株A1的菌落直径最大为4.95 cm，与环境湿度80%时A1的菌落直径相比，差异不显著，当环境湿度小于80%，菌株A1的生长受到显著抑制（P<0.05）。菌株A2在环境湿度50%~90%均能生长，菌落直径与湿度呈正相关，环境湿度90%时菌落直径最大为4.87 cm，环境湿度小于90%菌株A2的生长受到抑制，与最大菌落直径相比差异显著（P<0.05）。菌株A4在环境湿度50%~90%均能生长，菌落直径随着环境湿度的增长而增大，90%的环境湿度下菌株A4的菌落直径最大为1.98 cm，环境湿度60%~80%下菌株A4的菌落直径与最大菌落直径差异较小，环境湿度50%下的菌落直径显著低于其他环境湿度（P<0.05）。
2.4.4 pH对菌丝生长的影响
不同pH对三株腐败霉菌菌丝生长的影响见图10。菌株A1在pH3~9均能生长，pH3~7菌株A1菌落直径与pH呈正相关，pH为7时菌株A1的菌落直径最大为6.43 cm，pH大于7，菌株A1的菌落直径变化较小，与最大值相比无明显差异。菌株A2在pH3~9均能生长，pH3~7菌株A2菌落直径与pH呈正相关，pH大于7时，菌株A2的菌落直径减小但与最大值差异较小，pH为4和3时，A2的菌落直径与最大值相差较大（P<0.05）。菌株A4在pH3~9均能生长，pH3~7菌株A4菌落直径与pH呈正相关，pH7~9菌株A4菌落直径与pH呈负相关，菌株A4在pH为7的条件下长势最好，菌落直径为2.74 cm显著高于其他pH（P<0.05），pH为6、8、9时菌落直径与最大菌落直径差异较小，pH小于6时，对株菌A4生长的抑制效果显著（P<0.05）。
2.4.5 腐败霉菌热致死温度的测定
不同温度热处理对腐败霉菌的孢子萌发率影响见表4。菌株A1、A2、A4的孢子萌发率均随热处理温度的升高呈下降趋势。菌株A1在45 ℃条件下热处理10 min的孢子萌发率为35.91%，热处理温度上升至55 ℃，A1的孢子萌发率降至6.88%，热处理温度为60 ℃时孢子萌发率为0。菌株A2在热处理温度为45~60 ℃条件下处理10 min均有孢子萌发，当热处理温度达到65 ℃时，A2的孢子萌发率为0。菌株A4热处理温度为45℃时孢子萌发率为27.39%，热处理温度上升至55 ℃时，孢子萌发率降为0。
表 4 腐败霉菌的致死温度Table 4. Lethal temperature of spoilage mold菌株编号 孢子萌发率（%） 45 ℃ 50 ℃ 55 ℃ 60 ℃ 65 ℃ 70 ℃ A1 35.91±0.55a 17.86±0.12b 6.88±0.75c 0d 0d 0d A2 41.48±0.22a 24.24±0.18b 11.36±0.09c 4.26±0.73d 0e 0e A4 27.39±0.31a 9.23±0.54b 0c 0c 0c 0c 注：同行不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。 3. 讨论与结论
回接侵染实验是应用广泛的优势腐败霉菌筛选手段。朱祎一等[24]通过回接侵染试验确认冷藏期板栗致腐霉菌为层出镰刀菌（Fusariumproliferatum）、皮落青霉（Penicilliumcrustosum）和链格孢菌（Alternariaalternata）。牛佳佳等[25]回接纯化病原菌至健康酥梨果实上，观察酥梨的发病情况，验证病原菌的致腐能力。本文稀释并培养高温高湿环境贮藏的葡萄干清洗液，共分离出4株形态具有明显差异的污染霉菌菌株，根据回接试验结果，将四株污染菌株中引起葡萄干霉变腐烂的菌株A1、A2、A4确认为无核白葡萄干腐败霉菌。ITS序列能从分子水平为菌种鉴定提供科学依据[26]，利用rDNA-ITS序列分析结合形态特征和显微结构，将菌株A1菌株鉴定为塔滨曲霉（Aspergillus tubingensis），A2菌株鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger），A4菌株鉴定为岐皱青霉（Penicillium steckii）。倪泽平等[16]对引起葡萄干腐败的优势霉菌进行鉴定，发现芽枝状枝孢霉（Cladosporium velox）和暗黄青霉（Penicillium citreonigrum）是引起葡萄干腐败的优势霉菌。张容鹄等[27]对高温高湿环境中，导致槟榔干果腐败的霉菌进行鉴定，结果表明，灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）和泡盛曲霉（Aspergillus awamori）是导致槟榔干果高温高湿环境贮藏过程中腐败的优势霉菌。本试验研究结论与多位学者对引起干制食品腐败变质霉菌研究结果相似，发现引起干制食品腐败的霉菌多属于曲霉属和青霉属。除干制食品外，曲霉属及青霉属霉菌也是引起板栗[24]、玉米[28]、谷物[29]、水果[30]、海鲜[31]等食品变质的最常见霉菌之一。优势腐败霉菌鉴定结果与其他学者的研究结论中菌种之间存在的差异推测是食品种类，加工方式，原料产地，贮藏条件不同导致。
霉菌的生长繁殖需要一定的温度、湿度、酸碱环境等条件[32]，研究腐败霉菌的生物学特性研究，有助于在贮藏期间控制霉变发生。本试验绘制三株优势腐败霉菌的生长曲线，并初步研究不同温度、环境湿度、pH对葡萄干优势腐败霉菌菌落生长的影响及其热致死温度。研究发现，菌株A1、A2的最适生长温度为28 ℃，并且两株霉菌在4 ℃下不生长，菌株A4的最适生长温度为30 ℃，在4、40 ℃下不生长。三株霉菌的最适生长温度均在28~30 ℃，这与大多数霉菌的生物学特性相符。宁露娟等[33]对黄曲霉原变种（Aspergillus flavus var. flavus）的生物学特性进行研究后发现，该菌株在30 ℃时生长最快，丁仁惠等[34]对不同环境因子下青霉病病原菌的生长生物学特性进行研究，结果表明意大利青霉的最适生长温度为28~30 ℃。三株霉菌均不能在4 ℃下生长，说明低温环境下贮藏葡萄干可以抑制致腐霉菌生长进而抑制霉变的发生。本试验研究结果表明，三株菌株的菌落均随环境湿度的增加而增加，在环境湿度为90%时，菌落直径最大，表明潮湿环境利于腐败霉菌生长，干燥的贮藏空间更有利于葡萄干的保存。三株霉菌最适生长pH均为7，碱性环境和酸性环境菌对菌株的生长有影响，但是酸性环境对霉菌生长的抑制效果更为明显。该结论与汤梦婷[10]的结果发现酸性条件能明显抑制黑曲霉的生长结论一致，与王帆等[35]认为培养基pH小于6能抑制赭绿青霉生长的实验结论也有相似之处。优势腐败霉菌A1、A2、A4热处理10 min的致死温度分别为60、65、55 ℃。
综上所述，本研究探明在高温高湿环境中无核白葡萄干贮藏期间的腐败霉菌种类，分析腐败霉菌的生物学特性及环境因素对菌株生长的影响，为控制无核白葡萄干霉变、保持葡萄干品质及食用安全提供理论指导。本文研究结论对近一步开展腐败霉菌致腐机制的研究具有重要意义，后续可运用环境调节措施结合化学、生物抑菌剂，对无核白葡萄干贮藏期间霉变进行针对性防控。
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图 1 清洗液中污染霉菌在PDA培养基上的形态
注：a~b为正面；c~d为反面。
Figure 1. Colony morphology of contaminated mold in the cleaning solution on PDA medium
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图 2 回接污染霉菌后无核白葡萄干的腐败情况
Figure 2. Spoilage of seedless white raisins after backtracking contaminated mold
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图 3 A1、A2、A4在PDA培养基上的菌落形态
注：a~c为正面；d~f为反面。
Figure 3. Colony morphology of A1, A2 and A4 on PDA medium
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表 1 PCR扩增引物
Table 1 Primer of PCR amplification
引物名称 引物序列（5'→3'） ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 
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表 2 PCR扩增体系
Table 2 System of PCR amplification
试剂 体积（µL） Template（基因组DNA 20~50 ng/μL） 1 ITS1（10 µmol/L） 1 ITS4（10 µmol/L） 1 dNTP（2.5 mmol/L） 1 Taq DNA聚合酶 0.2 10×Taq reaction buffer 2.5 ddH2O 25
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表 3 PCR扩增程序
Table 3 Procedure of PCR amplification
温度（℃） 时间（s） 程序 94 240 预变性 94 45 30cycle 55 45 72 60 72 600 修复延伸 4 ∞ 终止反应
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表 4 腐败霉菌的致死温度
Table 4 Lethal temperature of spoilage mold
菌株编号 孢子萌发率（%） 45 ℃ 50 ℃ 55 ℃ 60 ℃ 65 ℃ 70 ℃ A1 35.91±0.55a 17.86±0.12b 6.88±0.75c 0d 0d 0d A2 41.48±0.22a 24.24±0.18b 11.36±0.09c 4.26±0.73d 0e 0e A4 27.39±0.31a 9.23±0.54b 0c 0c 0c 0c 注：同行不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。
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