Isolation, Purification, and in Vitro Hypoglycemic Activity of Pumpkin Seed Polysaccharides
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摘要: 南瓜籽提油后会产生大量废弃饼粕，而多糖是南瓜籽粕主要活性成分之一，为减少资源浪费并充分利用其价值，该研究以提油后的南瓜籽粕为原料，经连续相变萃取装置大批量提取南瓜籽粗多糖后，采用95%乙醇醇沉、Sevage法与酶法相结合除蛋白、DEAE-52和Experdex-75柱进行分离纯化，最后结合体外酶活抑制实验和3T3-L1脂肪细胞实验探究与比较各组分的降血糖活性，并初步探索其降糖机制。研究发现，南瓜籽多糖纯化后得到5种多糖组分（PSP、PSP-1、PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3），其中PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3的单糖组成及摩尔比有一定差异。体外α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制实验表明，效果最佳的PSP-1-1组分的IC50值分别为0.88 mg/mL和3.92 mg/mL。细胞实验则表明，PSP-1-1显著提高细胞摄取葡萄糖能力，同时极显著提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量至257%，而甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量分别降低了48.65%、55.91%、50%，说明其能通过改善糖脂代谢来缓解细胞的胰岛素抵抗。并猜测其降血糖机制为PSP-1-1通过促进胰岛素受体底物（IRS-1）/磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB，也称AKT）通路中基因的表达，恢复细胞正常代谢，达到降血糖效果。该研究提高了南瓜籽副产物的综合利用价值，为开发毒副作用低的降糖功能食品提供了理论支撑。Abstract: After oil extraction, pumpkin seeds generate a large amount of waste meal, and polysaccharides are one of the main active components in pumpkin seed meal. To mitigate resource waste and maximize its value, pumpkin seed meal was used as raw material in this study to extract crude polysaccharides in large quantities by continuous phase transition extraction device. The crude polysaccharides were then subjected to precipitation using 95% ethanol and deproteinization using the Sevage method combined with enzymatic treatment, followed by further separation and purification via DEAE-52 and Experdex-75 columns. Finally, in vitro enzyme activity inhibition assays and 3T3-L1 adipocyte experiments were conducted to investigate and compare the hypoglycemic activity and underlying mechanism of the resulted various components. The study revealed that five polysaccharide fractions (PSP, PSP-1, PSP-1-1, PSP-1-2, PSP-1-3) were obtained after purification of pumpkin seed polysaccharides. The monosaccharide composition and molar ratio of psp-1-1, psp-1-2 and psp-1-3 were different. In vitro α-amylase and α-glucosidase inhibition assays showed PSP-1-1 exhibited the most potent effects with IC50 values of 0.88 mg/mL and 3.92 mg/mL, respectively. Cellular experiments demonstrated PSP-1-1 significantly enhanced the cells’ ability to uptake glucose and markedly increased the high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) level to 257%, while reduced the levels of triglyceride (TG), total cholesterol (TC), and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) by 48.65%, 55.91% and 50%, respectively, suggesting it could alleviate cellular insulin resistance by improving glucose and lipid metabolism. It was hypothesized that the hypoglycemic mechanism of PSP-1-1 involved promoting the expression of genes in the insulin receptor substrate (IRS-1)/phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (PKB, also known as AKT) pathway, restoring normal cellular metabolism, and ultimately achieving hypoglycemic effect. This study enhances the comprehensive utilization value of pumpkin seed byproducts and provides theoretical support for the development of hypoglycemic functional foods with low toxicity and side effects.
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二型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）是机体发生胰岛素抵抗或者胰岛β细胞受损不能产生足量的胰岛素而导致代谢发生紊乱的疾病，它是一种常见的占糖尿病病例比例最大的糖尿病类型，且患病率逐年迅速上升[1]。相关研究发现，长时间患有糖尿病会引发多种并发症，如高血压、肾功能衰竭、失明、血管疾病等，以致多种器官产生功能性损伤及衰竭，给人类健康造成极大威胁[2]。目前临床上暂未能彻底根治糖尿病，通常使用一些降糖药物如阿卡波糖、二甲双胍、噻唑烷二酮类、磺酰脲类等药物来控制病情，但这些药物会带来较多的不良反应，如低血糖、体重增加、胃胀气、腹泻等[3]。然而至今尚未发现可以减少或产生零副作用的药物。因此，将目光转移到安全无毒的降糖物质上尤为重要。
天然多糖是一类重要的生物大分子，其结构特点在于由超过十个的醛糖或酮糖单元，通过特定的糖苷键紧密相连。多糖显著优势在于自然来源广泛、无毒无害，并且展现出了多种多样的生物活性，如免疫调节[4]、抗肿瘤[5]、减少氧化应激[6]、降血糖[7]等，成为领域研究热点。同时已有较多文献报道多糖在降血糖方面有明显作用，如茶多糖[8]、葛根多糖[9]、枸杞多糖[10]和灵芝多糖[11]等，而种子多糖的报道相对较少。南瓜籽是一种药食两用的植物种子，其主要加工产品为南瓜籽油，但南瓜籽提油后会产生大量的南瓜籽粕副产物，目前未得到有效开发与利用，造成资源浪费。多糖是南瓜籽粕中主要活性成分之一，而目前国内外对南瓜籽多糖的研究较少，尤其在构效关系及作用机制层面的相关研究还不够深入[12]。基于此，本文在前期拥有最优提取工艺基础上，使用课题组自主研发的连续相变萃取装置大批量高效提取南瓜籽粗多糖，并进一步分离纯化，获得纯度较高的多糖，进而以体外α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制率和胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞模型相关糖脂代谢指标为依据，筛选出活性最高组分并探究其降血糖可能机制，为后续南瓜籽多糖的结构鉴定及体内动物实验奠定基础，也为南瓜籽副产物的精深加工和预防二型糖尿病功能性产品的开发提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
南瓜籽 新疆乌鲁木齐市；DEAE-52填料 瑞达恒辉商城；Experdex-75填料 扬州市博睿糖生物技术有限公司；3T3-L1前脂肪细胞 美国模式培养物保藏所（american type culture collection，ATCC）；26.5 U/mg α-葡萄糖苷酶、800000 U/mg α-淀粉酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-7H-xanthine，IBMX）、地塞米松、胰岛素 上海源叶生物科技有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT ） 上海Sigma公司；DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、胎牛血清、青-链霉素、 0.1 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、0.25%（质量分数）胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethylsulfide，DMSO） 美国Gibco公司；蛋白质（bicinchoninic acid，BCA）、葡萄糖、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测定试剂盒 南京建成生物科技有限公司；二甲双胍、Triton-X100裂解液 索莱宝公司；油红O染色试剂盒 碧云天生物；RNA提取试剂盒RC112 、逆转录试剂盒R223、 qPCR荧光定量试剂盒Q711 南京诺维赞生物科技有限公司；引物 生工生物上海有限公司；可溶性淀粉、氯化钠、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、硫酸、苯酚亚硫酸钠、酒石酸钾钠 天津市富宇精细化工厂。
AL104万分之一电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；玻璃层析柱 瑞达恒辉商城；BS-100A自动收集器、HL-2S蠕动泵 上海青浦沪西仪器厂；CO2培养箱 新加坡ESCO公司；Nanodrop微量紫外分光光度计 北京Merinton公司；实时荧光定量PCR仪 美国BIO-RAD公司；XSP-15C倒置生物显微镜 上海长方光学仪器有限公司；MH-2微量振荡器 海门市其林贝尔仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 南瓜籽粗多糖的提取
称取适量经连续相变萃取技术提油后的南瓜籽粕在连续相变萃取装置的提取釜内，以水为溶剂，在压力0.2~0.6 Mpa、温度60 ℃、流速60 L/h、时间2 h的参数下大批量提取多糖，随后进行浓缩得到南瓜籽多糖浓缩液。使用五倍多糖浓缩液体积的95%乙醇醇沉1 d，4000 r/min离心取多糖沉淀，挥发酒精冻干。取冻干后的粗多糖以1:4的比例溶于一级水形成糖液，然后按糖液：Sevage试剂（三氯甲烷:正丁醇=3:1，v/v）为3:1（v/v）的比例加入于烧杯并置于磁力搅拌器中搅拌25 min，4500 r/min离心10 min后取最上层液体重复以上操作2次，最后通过旋转蒸发仪去掉有机试剂。将浓缩后的糖液加入2%（w/v）木瓜蛋白酶，在温度60 ℃、pH6.5的条件下于搅拌水浴锅中恒温搅拌2.5 h，煮沸灭酶后以8000 r/min的转速离心10 min，取上层液体用3500 Da透析袋依次在三级水、一级水中透析2~3 d，冻干后即为脱蛋白后的南瓜籽粗多糖PSP。
1.2.2 南瓜籽多糖的分离纯化
DEAE-52柱纯化：参考Wu等[13]的方法并略作修改。将南瓜籽粗多糖PSP用去离子水配成15 mg/mL的浓度，过0.45 μm滤膜后，用吸管环壁上DEAE-52纤维柱，以一级水和不同浓度的盐（0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L）为溶剂通过蠕动泵进行洗脱，用自动收集器收集。每管以1 mL/min的流速收集7 min，各梯度浓度收集120管，利用苯酚-硫酸法[14]测其吸光值，以横坐标为管数、纵坐标为吸光值绘制洗脱曲线。然后收集出现峰的管中的洗脱液，于截留量为3500 Da的透析袋中透析1~2 d，间隔3~6 h换一次水，冻干后即为DEAE-52柱纯化后的南瓜籽多糖PSP-1。
Experdex-75柱纯化：参考Hui等[15]的方法并略作修改。将收集到的PSP-1配成25 mg/mL的浓度，过0.22 μm滤膜后环壁上Experdex-75柱（每次上样2 mL），以水为溶剂进行洗脱，用自动收集器收集。每管以0.2 mL/min的流速收集2 min，收集600管，每隔4管取样，利用苯酚-硫酸法[14]测其吸光值，然后以横坐标为管数、纵坐标为吸光值绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线出现的不同峰分别收集管中洗脱液，冷冻干燥后即为Experdex-75纯化组分，依次为PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3。
1.2.3 多糖理化指标测定
以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法[14]测定南瓜籽多糖组分总糖含量，得到葡萄糖标准曲线方程为y=0.0052x+0.0055，R2=0.9993；以半乳糖醛酸为标准品，采用间羟基联苯法[16]测定南瓜籽多糖组分糖醛酸含量，得到糖醛酸标准曲线方程为y=0.004x−0.0131，R2=0.9952；以考马斯亮蓝G-250为标准品，采用考马斯亮蓝法[17]测定南瓜籽多糖组分蛋白质含量，得到蛋白质标准曲线方程为y=3.4752x+0.0077，R2=0.999。
1.2.4 多糖单糖组成的测定
使用离子色谱仪测定PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3的单糖组成，具体参考Tedesco等[18]的方法并略作修改。分别取适量15种单糖标准品（岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸）配成标准母液溶液，取各单糖标准溶液精密配制浓度标准品作为混标。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，并根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。然后精密称量5 mg PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3于安瓿瓶中，加入3 mol/L三氟乙酸2 mL，120 ℃水解3 h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5 mL去离子水涡旋混匀，吸取50 µL加入950 µL去离子水，12000 r/min离心5 min，上清液进行离子色谱分析。
色谱条件：检测器为电化学检测器；色谱柱为Dionex CarbopacTM PA20（3×150 mm）；流动相：A：H2O；B：15 mmol/L NaOH；C：15 mmol/L NaOH & 100 mmol/L醋酸钠；流速：0.3 mL/min；进样量：25 µL；柱温：30 ℃；洗脱梯度：0 min A相/B相/C相（98.8:1.2:0，V/V），18 min A相/B相/C相（98.8:1.2:0，V/V），20 min A相/B相/C相（50:50:0，V/V），30 min A相/B相/C相（50:50:0，V/V），30.1 min A相/B相/C相（0:0:100，V/V），46 min A相/B相/C相（0:0:100，V/V），46.1 min A相/B相/C相（0:100:0，V/V），50 min A相/B相/C相（0:100:0，V/V），50.1 min A相/B相/C相（98.8:1.2:0，V/V），80 min A相/B相/C相（98.8:1.2:0，V/V）。
1.2.5 体外酶活力抑制率测定
1.2.5.1 α-淀粉酶活力抑制率测定
参考赵凯等[19]的方法配制DNS溶液于褐色瓶内，一周后使用。α-淀粉酶活力抑制率的测定参考Deng等[20]的方法并略作修改。首先配制pH6.8、0.1 mol/L的PBS，然后用PBS配制5%的淀粉溶液、20 U/mL的淀粉酶溶液及0.5、1、2、4、8 mg/mL的各南瓜籽多糖纯化组分溶液和阳性药物阿卡波糖溶液。先往样品组A1试管加入300 μL的多糖溶液和400 μL的酶溶液，空白组A0加入同等体积的水与酶溶液，对照组A2加入同等体积的相应浓度的多糖溶液与缓冲液，随即放于生化孵育箱中37 ℃孵育10 min，再全部试管加入300 μL的可溶性淀粉溶液，振荡后放于生化孵育箱中37 ℃孵育15 min，然后往试管中加2 mL DNS溶液呈色，并在电磁炉上高温灭酶10 min，最后用PBS补充至10 mL，于540 nm测定吸光值。按以下公式计算α-淀粉酶活力抑制率，算出其IC50值。
α-淀粉酶抑制率(%)=(1−A1−A2A0)×100 1.2.5.2 α-葡萄糖苷酶活力抑制率测定
参考Deng等[20]的方法并略作修改。用PBS（pH6.8，0.1 mol/L）配制2.5 mmol/L的PNPG溶液、0.25 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液及0.5、1、2、4、8 mg/mL的各南瓜籽多糖纯化组分溶液和阳性药物阿卡波糖溶液，然后在96孔板中进行点样反应。样品组A1加入50 μL的多糖溶液和50 μL的酶溶液，空白组A0加入同等体积的缓冲液与酶溶液，对照组A2加入同等体积的相应浓度的多糖溶液与缓冲液，随即放于生化孵育箱中37 ℃孵育10min，再全部加入50 μL的PNPG溶液，振荡孔板混匀后放于生化孵育箱中37 ℃孵育30 min，于405 nm测定吸光值，进行3次平行实验。按以下公式计算α-葡萄糖苷酶活力抑制率，算出其IC50值。
α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=(1−A1−A2A0)×100 1.2.6 3T3-L1脂肪细胞实验
1.2.6.1 3T3-L1前脂肪细胞诱导成脂及油红O染色
采用6孔板进行培养，每孔接种约5×105个3T3-L1前脂肪细胞，隔天换完全培养基（含有89% DMEM高糖培养基、10%胎牛血清、1%青霉素链霉素），培养3~4 d直到细胞长满。随后让细胞接触抑制2 d，期间可换完全培养基继续培养。接着加入新鲜配制的诱导剂一（10 μg/mL胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、完全培养基）培养2 d，显微镜下观察是否有分化趋势，有则换成新鲜配制的诱导剂二（10 mg/mL胰岛素和完全培养基）培养2 d，随后用完全培养基继续培养10 d，待95%左右细胞都有明显脂滴则诱导成脂完毕。吸掉细胞上层液体，PBS洗涤两遍后用4%多聚甲醛固定10 min，然后用蒸馏水洗涤两遍，按油红O染色试剂盒说明加入染色洗涤液覆盖20 s，吸除后用油红O工作液覆盖细胞染色20~30 min，最后用染色洗涤液保持30 s后用PBS清洗20 s，加入适量PBS覆盖细胞置于显微镜下观察诱导情况。
1.2.6.2 胰岛素抵抗模型的建立
去除表面培养液，加入含5%胎牛血清的完全培养基培养3 h，再换成低糖无血清的DMEM培养基（含1 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酸钠、110 mg/L丙酮酸钠）培养12 h，然后采用含高浓度胰岛素（0.1 mmol/L）的高糖完全培养基（含4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酸钠、110 mg/L丙酮酸钠）培养30 min。吸取细胞上清液，采用葡萄糖测定试剂盒测定葡萄糖含量，与正常组（即不加高浓度胰岛素组）对比如有显著性差异则为构建成功。
1.2.6.3 3T3-L1脂肪细胞增殖实验
吸取5×104个/mL的3T3-L1脂肪细胞悬液，按每孔200 μL接种于96孔板上，培养1 d，去上清液，用完全培养基配好不同浓度的各多糖纯化组分培养液（0.4、4、20、100、200、400 μg/mL）作为实验组，以缓冲液作空白组，每组6个复孔。往孔内加入100 μL的过完0.22 μm滤膜后的各浓度的多糖培养液和缓冲液分别培养24、48 h后，吸除细胞表面培养液，加入100 μL过膜后的1 mg/mL MTT溶液（避光配制、现配现用）培养4 h，去除细胞培养液后加入150 μL的DMSO溶液在微型振荡器上振荡混匀10 min，随后在492 nm测吸光度，细胞存活率按以下公式计算：
细胞存活率(%)=实验组OD值空白组OD值×100 1.2.6.4 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖、血脂四项测定
按1.2.6.1操作以5×105个/孔的密度接种细胞于6孔板并进行诱导，并按1.2.6.2建成胰岛素抵抗模型。将建模成功后的细胞分为二甲双胍组（4 mg/mL）、各南瓜籽多糖纯化组（4、50、200 μg/mL）和模型组，分别给药处理培养24 h后吸取细胞上清液，以1000 r/min转速离心10 min，收集上清液，采用葡萄糖测定试剂盒测葡萄糖含量，用PBS洗涤两遍后每孔加入100 μL Triton-X100裂解液。收集细胞裂解液，采用生化试剂盒测TG、TC、LDL-C、HDL-C含量。
1.2.7 PSP-1-1对IRS-1/PI3K/AKT通路上基因水平的影响
按1.2.6.1操作以5×105个/孔的密度接种细胞于6孔板并进行诱导，并按1.2.6.2建成胰岛素抵抗模型。将建模成功后的细胞分为二甲双胍组（4 mg/mL）、PSP-1-1组（4、50、200 μg/mL）、模型组，分别给药处理培养24 h后弃掉细胞上清液，在冰盒上按照RNA试剂盒的说明提取RNA，通过Nanodrop测其纯度在1.9~2.1间即可，放置于−80 ℃暂时保存。随即按照逆转录试剂盒说明将其逆转录为cDNA模板并保存于−20 ℃，最后根据设计好的引物进行cDNA扩增，测定各组胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）通路上基因的表达量。设计引物如表1所示。
表 1 RT-qPCR引物设计表Table 1. RT-qPCR primer design基因 上游引物序列（5'→3'） 下游引物序列（5'→3'） IRS-1 CTCCTGCTAACATCCACCTTG AGCTCGCTAACTGAGATAGTCAT PI3K AAAGCGGAGAACCTATTGC TGACTTCGCCGTCTACCAC AKT GCCACGACCCAACACCT TAGCCCGCATCCACTC GLUT4 AACTGGACCTGTAACTTCA AGGAGGACGGCAAAT β-actin AGCCATGTACGTAGCCATCC CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA 1.3 数据处理
采用SPSS 26.0软件对数据进行显著性分析，两组数据间采用t检验，三组及三组以上数据采用P值检验，P<0.05认为有显著性差异，P<0.01表示极显著，P>0.05则无统计学意义。以上实验重复三次，实验结果用均值±标准差表示，使用Origin 2022和GraphPad Prism9.0软件进行分析作图。
2. 结果与分析
2.1 南瓜籽多糖的分离纯化
柱层析法能有效分离纯化多糖。纤维柱基于多糖所带电荷强弱及其吸附性差异，能有效地洗脱出中性糖与酸性糖组分，并且同时能吸附色素等杂质；而凝胶柱是根据多糖分子量大小不同，流经凝胶间隙速度不同来洗脱分离[21]。经Sevage法结合酶法脱蛋白后的南瓜籽多糖采用DEAE-52纤维柱分离纯化后，其洗脱曲线如图1所示。从图1可见，水洗时曲线未形成峰，表明南瓜籽多糖不含中性多糖组分；而在0.3 mol/L NaCl溶液洗脱后，在300~360管出现一个明显的峰，表明南瓜籽多糖含有糖醛酸，是一种酸性多糖。冻干后该多糖组分为淡黄色蓬松轻盈固体，命名为PSP-1，测得其所含中性糖含量为43.46%±0.27%、糖醛酸含量为15.27%±0.41%（表2）。将PSP-1进一步采用Experdex-75柱分离纯化，洗脱曲线如图2所示。图2显示有三种组分，收集管数分别为165-212、224-276、292-400。各自合并后浓缩冻干分别命名为PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3，三种多糖组分冻干后均为白色絮状物，其中性糖含量分别为88.15%±1.55%、81.31%±2.61%、85.87%±1.73%，糖醛酸含量分别为9.76%±0.76%、4.09%±0.16%、2.57%±0.16%。
表 2 南瓜籽多糖各组分理化指标Table 2. Physicochemical indexes of pumpkin seed polysaccharide components组分 中性糖（%） 糖醛酸（%） 蛋白质（%） PSP 42.54±0.15 5.88±0.17 32.76±1.38 PSP-1 43.46±0.27 15.27±0.41 18.4±0.27 PSP-1-1 88.15±1.55 9.76±0.76 5.1±0.74 PSP-1-2 81.31±2.61 4.09±0.16 8.82±1.32 PSP-1-3 85.87±1.73 2.57±0.16 10.78±1.8 2.2 南瓜籽多糖单糖组成分析
多糖的单糖组成的种类及含量会因多糖提取方式、纯化方式不一样而有所差异[22]，进而影响多糖的功能活性[23]。一般而言，含单糖种类较多的多糖，其降血糖活性较强[24]。采用离子色谱法对PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3三种南瓜籽多糖组分的单糖组成进行检测，并通过出峰保留时间以及色谱峰面积分析单糖组成，结果如图3和表3所示。可以看出，三种南瓜籽多糖组分的单糖含量存在一定差异，但大多由半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）、木糖（xyl）组成，同时均含有糖醛酸，证明三种南瓜籽多糖组分均是酸性杂多糖。其中PSP-1-1四种单糖的相对摩尔比为61.5:24.4:5.9:0.5，含2.7%糖醛酸；PSP-1-2四种单糖的相对摩尔比为38.2:14.8:28.6:8.9，含2%糖醛酸；PSP-1-3四种单糖的相对摩尔比为38.8:14.2:31.7:7.3，含0.7%糖醛酸。由此可见，经两步柱层析分离纯化后所获得的三种南瓜籽多糖组分在单糖组成上具有一定差异，这也是导致后面其体外降血糖活性强弱不同的原因之一。有文献表明，具备良好降血糖活性的多糖主要以这四种单糖为主，同时糖醛酸的存在也可增强其活性作用[25]。
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图 3 单糖标准品及南瓜籽多糖的离子色谱图注：1为岩藻糖；2为盐酸氨基半乳糖；3为鼠李糖；4为阿拉伯糖；5为盐酸氨基葡萄糖；6为半乳糖；7为葡萄糖；8为木糖；9为甘露糖；10为果糖；11为核糖；12为半乳糖醛酸；13为古罗糖醛酸；14为葡萄糖醛酸；15为甘露糖醛酸。Figure 3. Ion chromatograms of monosaccharide standards and pumpkin seed polysaccharides表 3 三种南瓜籽多糖纯化组分的单糖组成结果Table 3. Monosaccharide composition results of three purified components of pumpkin seed polysaccharides单糖 摩尔比 PSP-1-1（%） PSP-1-2（%） PSP-1-3（%） 岩藻糖 0.6 1.8 1 氨基半乳糖盐酸盐 0.5 0.6 0.5 鼠李糖 2.2 2.6 1.8 阿拉伯糖 24.4 14.8 14.2 盐酸氨基葡萄糖 0.8 1 1.1 半乳糖 61.5 38.2 38.8 葡萄糖 5.9 28.6 31.7 木糖 0.5 8.9 7.3 甘露糖 0.9 1.5 2.9 果糖 0 0 0 核糖
半乳糖醛酸0
0.70
0.90
0古罗糖醛酸 0 0 0 葡萄糖醛酸 2 1.1 0.7 甘露糖醛酸 0 0 0 2.3 南瓜籽多糖体外降血糖活性及作用机制
2.3.1 体外酶活力抑制实验
2.3.1.1 南瓜籽多糖的α-淀粉酶抑制率
α-淀粉酶是人体重要消化酶之一，它可以使机体摄入的碳水化合物的α-1，4糖苷键断裂从而产生葡萄糖。一些药物如阿卡波糖等通过抑制α-淀粉酶活力减少机体摄入葡萄糖，以达到降血糖效果。如图4所示，不同浓度的各南瓜籽多糖组分对α-淀粉酶都有较好的抑制效果，且随着质量浓度的上升，抑制率基本都呈现增加的趋势。在浓度0.5~8 mg/mL范围内，阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制效果最好；而在浓度0.5~4 mg/mL范围内，PSP-1-1与PSP-1-3对α-淀粉酶的抑制能力相当（P>0.05），但均显著高于PSP、PSP-1与PSP-1-2（P<0.05）。在浓度8 mg/mL时，阿卡波糖与PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3的α-淀粉酶抑制率分别为97.33%±0.48%、62.67%±1.21%、53.58%±2.83%、53.61%±3.22%，三种纯化南瓜籽多糖组分中以PSP-1-1抑制效果最好（P<0.05），显著高于PSP和PSP-1（P<0.05），其抑制能力达到阿卡波糖的64.39%，对应的IC50值为0.88 mg/mL。这可能与PSP-1-1的中性糖及糖醛酸含量较高有一定关系。Gu等[26]研究表明，番荔枝多糖具备有效的抑制α-淀粉酶能力，其IC50值为1.360 mg/mL，高于本研究结果，进一步表明南瓜籽多糖PSP-1-1降糖效果显著。
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图 4 各南瓜籽多糖组分对α-淀粉酶的抑制效果注：不同大写字母表示同一浓度不同多糖组分的显著性差异（P<0.05）；不同小写字母表示同种多糖组分不同浓度的显著性差异（P<0.05），图5同。Figure 4. Inhibitory effect of various pumpkin seed polysaccharide components on α-amylase2.3.1.2 南瓜籽多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率
α-葡萄糖苷酶也是人体消化系统重要水解酶之一；它也是现今研究缓解二型糖尿病的靶点之一，能破坏淀粉类物质的糖苷键释放葡萄糖。如图5所示，在0.5~8 mg/mL浓度范围内，各南瓜籽多糖组分的α-葡萄糖苷酶抑制率大多随着浓度升高而上升，最后趋于平缓。这与朱振元等[27]研究的蛹虫草多糖抑制α-葡萄糖苷酶趋势一致。抑制效果大小基本呈现PSP-1-1>PSP-1-2>PSP-1-3>PSP-1>PSP的规律。由此可见，在相同质量浓度条件下，纯化程度越高的南瓜籽多糖组分，其对α-葡萄糖苷酶的抑制效果一般也越好。在浓度为8 mg/mL时，刚脱完蛋白的PSP和经过DEAE柱分离纯化得到的PSP-1，其α-葡萄糖苷酶抑制率分别只有17.79%±2.23%、41.25%±2.66%；而经Experdex-75柱进一步分离纯化得到的PSP-1-1的抑制率高达59.14%±0.42%，虽低于阳性药物阿卡波糖（P<0.05），但显著高于PSP和PSP-1（P<0.05）。PSP-1-2、PSP-1-3在浓度8 mg/mL时，其α-葡萄糖苷酶抑制率也分别达到50.86%±2.54%和41.77%±2.01%，其中PSP-1-2的抑制率也显著高于PSP和PSP-1（P<0.05），而PSP-1-3的抑制率则显著高于PSP（P<0.05）。PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值分别为3.92、4.03、18.48 mg/mL，其中PSP-1-1的IC50值与黑加仑多糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值（3.28 mg/mL）相近[28]。综上可见，南瓜籽多糖PSP-1-1对α-葡萄糖苷酶的抑制作用最显著，具备较好的降血糖作用。南瓜籽多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，可能归因于南瓜籽多糖对α-葡萄糖苷酶的竞争性抑制作用[29]。
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图 5 各南瓜籽多糖组分对α-葡萄糖苷酶抑制效果Figure 5. Inhibitory effect of various pumpkin seed polysaccharide components on α-glucosidase2.3.2 3T3-L1前脂肪细胞实验
2.3.2.1 3T3-L1前脂肪细胞诱导成脂及胰岛素抵抗模型的建立
3T3-L1前脂肪细胞在接触抑制阶段可以通过细胞自噬体使得线粒体发生重构，使细胞具备脂肪细胞特性。诱导剂的加入可以通过激活一些酶途径，增强调控因子如PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ）的表达从而加速向脂肪细胞的转化[30]。由图6可以看出，随着诱导剂的加入，3T3-L1前脂肪细胞由原始的梭形分化成椭圆形，细胞间隙增大，诱导越久，细胞会变成圆形，并渐渐增大。通过油红O染色后发现，诱导2 d时，细胞成脂较少，有分化趋势，且细胞开始由梭形转变为椭圆形；诱导4 d时，细胞脂滴增多变大，有少量呈圆形，到后期10~14 d，细胞积攒的脂滴越多，并逐渐变大，成“戒环”圆状，且整个显微镜界面有95%以上的细胞都有明显脂滴，说明诱导完成。将诱导成熟的细胞给予高糖高胰岛素后，其细胞上清液葡萄糖含量相比未加胰岛素的正常组极显著增加（P<0.01），如图7所示，说明该组细胞摄取葡萄糖的能力变弱，产生了胰岛素抵抗，建模成功。
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图 6 “鸡尾酒”法诱导的脂肪细胞及油红O染色（40×）注：a、b、c、d、e分别为诱导2、4、10、12、14 d的成脂情况。Figure 6. Adipocytes induced by "cocktail" method and stained with oil red O (40×)![]()
图 7 胰岛素抵抗模型鉴定注：**表示与正常组对比差异极显著（P<0.01）。Figure 7. Identification of insulin resistance model2.3.2.2 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞增殖的影响
MTT实验是检验样品对细胞毒性的影响手段之一，其原理是活细胞的线粒体中的琥珀酸脱氢酶可还原MTT生成蓝紫色结晶甲臜，随后通过DMSO溶解这些结晶，并使用酶标仪测定吸光值，从而间接反映细胞活性[31]。如图8A所示，在处理24 h后，各多糖组与空白组对比未出现细胞存活率显著降低情况。在400 μg/mL时，PSP-1组的细胞存活率提高了73.52%，极显著高于空白组（P<0.01）；而PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3组的细胞存活率依次为81.78%、79.95%、97.26%，与空白组差异不显著（P>0.05）。在处理48 h后（图8B），大部分多糖组的细胞存活率降低，尤其在浓度大于等于100 μg/mL时，PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3组的细胞存活率与空白组相比都出现极显著降低（P<0.01）。这可能与高糖环境损伤细胞有关。因此，后续实验中细胞处理时间设为24 h，在此时间多糖浓度范围在0.4~400 μg/mL间都不会引起细胞存活率显著降低，但当浓度达到400 μg/mL时，相比较其低浓度的南瓜籽多糖干预细胞时的增殖情况要差，为了尽可能在不造成大量细胞死亡情况下，探索各浓度梯度的南瓜籽多糖间差异性以及考虑到减少资源浪费，并进一步结合相关文献，最终选用4、50、200 μg/mL为低中高三个梯度浓度进行相关指标测定。
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图 8 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞存活率的影响注：A为多糖组分处理24 h，B为多糖组分处理48 h；*表示与空白组的差异显著（P<0.05）；**表示与空白组的差异极显著（P<0.01）。Figure 8. Effect of pumpkin seed polysaccharides on the survival rate of 3T3-L1 adipocytes2.3.2.3 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取能力的影响
胰岛素抵抗是指胰岛素不能灵敏识别所作用的靶器官，导致机体摄取葡萄糖能力下降，无法正常吸收从而发生糖代谢紊乱[32]。从图9可以看出，二甲双胍组细胞上清液中葡萄糖含量较模型组降低24.03%，表明胰岛素抵抗细胞经药物二甲双胍刺激后，细胞上清液中葡萄糖含量极显著降低（P<0.01）。加入不同浓度（4、50、200 μg/mL）的各南瓜籽多糖组分后，PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3组细胞上清液中葡萄糖含量也极显著降低（P<0.01），且与二甲双胍组无显著差异（P>0.05），表明这三种南瓜籽多糖在4~200 μg/mL浓度范围内有较好的促进细胞葡萄糖转运的效果，使细胞摄取葡萄糖的能力得到提高，其中效果最好的是200 μg/mL时的PSP-1-1组，其葡萄糖含量较模型组降低34.45%。而PSP-1和PSP组分别在浓度为50、200 μg/mL时不再与模型组有显著性差异（P>0.05）。
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2.3.2.4 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞内TG的影响
人体内TG含量的升高会对极低密度脂蛋白有影响，该蛋白可通过巨噬细胞进入动脉壁并发生停留，导致动脉粥样硬化，诱发T2DM[33]。因此，降低TG含量是调节T2DM的靶点之一。由图10可以发现，经过诱导并建模后的脂肪细胞TG含量达到0.37±0.01 mmol/L/gprot，而随着南瓜籽多糖质量浓度的升高，TG含量逐渐降低。在浓度为4 μg/mL时，PSP-1-1组的TG含量显著低于模型组（P<0.05），而在浓度50 μg/mL时，其TG含量极显著低于模型组（P<0.01）。另外，在浓度为200 μg/mL时，PSP、PSP-1-1、PSP-1-2和PSP-1-3组的TG含量均极显著低于模型组（P<0.01），以PSP-1-1组的TG含量最低，为0.19±0.03 mmol/L/gprot，较模型组降低了48.65%，且与二甲双胍组无显著差异（P>0.05）；其次是PSP-1-2组，较模型组降低了37.84%，与PSP-1-1组差异不显著（P>0.05）。
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图 10 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞TG的影响Figure 10. Effect of pumpkin seed polysaccharides on TG content of 3T3-L1 adipocytes2.3.2.5 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞内TC的影响
TC是存在于人体血清脂蛋白中的胆固醇，是检验血脂的重要指标之一，高浓度的TC会造成血糖异常，T2DM患者体内TC含量普遍高[34]。图11结果表明，模型组TC含量为0.93±0.03 mmol/L/gprot，经过不同浓度的各南瓜籽多糖组分和药物二甲双胍处理后，细胞内的TC含量均呈一定水平的降低。与模型组相比，二甲双胍组TC含量降低50%，PSP-1-1组TC含量在4~200 μg/mL浓度范围内都极显著降低（P<0.01），且与二甲双胍组无显著差异（P>0.05）。在200 μg/mL时，PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3组的TC含量分别为0.41±0.1、0.54±0.04、0.63±0.25 mmol/L/gprot，较模型组分别降低了55.91%、41.92%、32.26%，均与阳性药物二甲双胍组无显著差异（P>0.05），其中以PSP-1-1组降低幅度最大，其次是PSP-1-2。
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图 11 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞TC的影响Figure 11. Effect of pumpkin seed polysaccharides on TC content of 3T3-L1 adipocytes2.3.2.6 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞内LDL-C的影响
LDL-C是运输胆固醇到人体外周组织细胞的细小颗粒，其可迅速进入动脉内膜，再停留于内皮细胞层，最后导致心血管疾病的发生，含量过高严重影响T2DM[35]。由图12可见，模型组的LDL-C含量为0.54±0.08 mmol/L/gprot，加入药物二甲双胍处理后LDL-C含量极显著降低（P<0.01），比模型组降低了75.94%。各南瓜籽多糖组的LDL-C含量与模型组相比，也均极显著降低（P<0.01），但降低幅度均低于二甲双胍组（P<0.01）。在南瓜籽多糖中，LDL-C含量最低的是浓度为200 μg/mL的PSP-1-1组，为0.27±0.07 mmol/L/gprot，比模型组降低了50%，其次是PSP-1-2、PSP-1-3组，但在浓度4~200 μg/mL范围内各南瓜籽多糖组的LDL-C含量差异不显著（P>0.05）。
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图 12 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞LDL-C的影响Figure 12. Effect of pumpkin seed polysaccharides on LDL-C content of 3T3-L1 adipocytes2.3.2.7 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞内HDL-C的影响
HDL-C是将体内胆固醇运输到肝脏进行代谢，随后胆固醇以胆汁酸的形式或者直接被排到体外的重要工具，还能抑制细胞摄取低密度脂肪酸，使得胆固醇不会沉积在血管壁，从而避免血管壁损伤而引发血管疾病[36]。南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞内HDL-C的影响结果如图13所示。图13表明，模型组细胞内HDL-C含量为0.14±0.01 mmol/L/gprot，而经二甲双胍处理后HDL-C含量上升了186%，极显著高于模型组（P<0.01）。当南瓜籽多糖浓度大于等于4 μg/mL时，PSP、PSP-1-1、PSP-1-2和PSP-1-3组细胞内的HDL-C含量都极显著升高（P<0.01），其中PSP-1-1、PSP-1-2和PSP-1-3组与二甲双胍组无显著差异（P>0.05）。PSP-1-1（200 μg/mL）、PSP-1-2（50 μg/mL）、PSP-1-3（50 μg/mL）组的HDL-C含量分别为0.5±0.09、0.42±0.18、0.39±0.06 mmol/L/gprot，依次比模型组升高了257%、200%、178%，其中PSP-1-1（200 μg/mL）组的HDL-C含量比阳性对照二甲双胍组增加了25%。
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图 13 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞HDL-C的影响Figure 13. Effect of pumpkin seed polysaccharides on HDL-C content of 3T3-L1 adipocytes2.3.2.8 PSP-1-1对IRS-1/PI3K/AKT通路上基因水平表达量的影响
胰岛素在发挥其生物学功能时，通过与其受体结合，激活PI3K/AKT信号通路，作为中介的胰岛素受体底物IRS将信号传递给PI3K，从而激活下游Akt和非典型蛋白激酶C （atypical PKC，aPKC），加快糖原的合成，防止糖原分解，增加葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）的表达，促进葡萄糖向胞内转运来调节糖脂代谢[31]。根据体外酶活抑制率实验与细胞实验可看出，PSP-1-1效果最好，因此选用该组分进行进一步实验，初步探究南瓜籽多糖降血糖作用机制。从图14可发现，相比于模型组，PSP-1-1能极显著上调IRS-1、PI3K、AKT、GLUT4的基因表达水平（P<0.01），其中PSP-1-1促进IRS-1、PI3K这两个基因的表达量比阳性药物二甲双胍组还高，最高表达量依次是二甲双胍组的3.42倍、1.43倍。而在50 μg/mL时，PSP-1-1促进GLUT4的基因表达水平是模型组的2.334倍，略低于二甲双胍组，但两者没有显著差异（P>0.05）。上述结果说明，南瓜籽多糖可能通过促进细胞内IRS-1/PI3K/AKT通路上的基因表达来发挥改善胰岛素抵抗的作用。类似结果也在其他多糖中发现。如Lee等[37]和Li等[38]分别发现岩藻多糖和黄芪多糖均能在3T3-L1脂肪细胞中激活PI3K-AKT-GLUT4信号通路，促使GLUT4发生易位到质膜来增强葡萄糖摄取，提高胰岛素敏感性。这些可能是预防T2DM胰岛素抵抗的新方向。
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图 14 PSP-1-1对IRS-1/PI3K/AKT通路上基因水平表达量的影响注：**表示与模型组的差异极显著（P<0.01）；不同小写字母表示各组间的差异显著（P<0.05）。Figure 14. Effect of PSP-1-1 on gene expression levels in the IRS-1/PI3K/AKT pathway3. 结论
采用连续相变萃取装置提取得到的南瓜籽多糖通过醇沉、脱蛋白和DEAE-52纤维柱与Experdex-75柱分离纯化后获得了五种组分，分别为PSP、PSP-1、PSP-1-1、PSP-1-2、PSP-1-3，其中PSP-1-1抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的能力最强。五种多糖组分均能降低3T3-L1 脂肪细胞上清液中葡萄糖含量，增强细胞转运葡萄糖的能力，并能降低细胞内TG、TC、LDL-C含量，提高HDL-C水平，其中效果最好的也是PSP-1-1。通过基因检测发现，PSP-1-1能上调细胞内IRS-1/PI3K/AKT通路上的IRS-1、PI3K、AKT、GLUT4的基因水平表达量。研究结果表明，南瓜籽多糖PSP-1-1可通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶酶活、提高3T3-L1脂肪细胞转运葡萄糖的能力以及改善脂肪细胞的脂代谢来缓解胰岛素抵抗。其可能机制是通过促进IRS-1/PI3K/AKT通路的mRNA表达起到降血糖作用。
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图 3 单糖标准品及南瓜籽多糖的离子色谱图
注：1为岩藻糖；2为盐酸氨基半乳糖；3为鼠李糖；4为阿拉伯糖；5为盐酸氨基葡萄糖；6为半乳糖；7为葡萄糖；8为木糖；9为甘露糖；10为果糖；11为核糖；12为半乳糖醛酸；13为古罗糖醛酸；14为葡萄糖醛酸；15为甘露糖醛酸。
Figure 3. Ion chromatograms of monosaccharide standards and pumpkin seed polysaccharides
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图 4 各南瓜籽多糖组分对α-淀粉酶的抑制效果
注：不同大写字母表示同一浓度不同多糖组分的显著性差异（P<0.05）；不同小写字母表示同种多糖组分不同浓度的显著性差异（P<0.05），图5同。
Figure 4. Inhibitory effect of various pumpkin seed polysaccharide components on α-amylase
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图 5 各南瓜籽多糖组分对α-葡萄糖苷酶抑制效果
Figure 5. Inhibitory effect of various pumpkin seed polysaccharide components on α-glucosidase
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图 6 “鸡尾酒”法诱导的脂肪细胞及油红O染色（40×）
注：a、b、c、d、e分别为诱导2、4、10、12、14 d的成脂情况。
Figure 6. Adipocytes induced by "cocktail" method and stained with oil red O (40×)
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图 7 胰岛素抵抗模型鉴定
注：**表示与正常组对比差异极显著（P<0.01）。
Figure 7. Identification of insulin resistance model
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图 8 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞存活率的影响
注：A为多糖组分处理24 h，B为多糖组分处理48 h；*表示与空白组的差异显著（P<0.05）；**表示与空白组的差异极显著（P<0.01）。
Figure 8. Effect of pumpkin seed polysaccharides on the survival rate of 3T3-L1 adipocytes
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图 10 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞TG的影响
Figure 10. Effect of pumpkin seed polysaccharides on TG content of 3T3-L1 adipocytes
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图 11 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞TC的影响
Figure 11. Effect of pumpkin seed polysaccharides on TC content of 3T3-L1 adipocytes
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图 12 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞LDL-C的影响
Figure 12. Effect of pumpkin seed polysaccharides on LDL-C content of 3T3-L1 adipocytes
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图 13 南瓜籽多糖对3T3-L1脂肪细胞HDL-C的影响
Figure 13. Effect of pumpkin seed polysaccharides on HDL-C content of 3T3-L1 adipocytes
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图 14 PSP-1-1对IRS-1/PI3K/AKT通路上基因水平表达量的影响
注：**表示与模型组的差异极显著（P<0.01）；不同小写字母表示各组间的差异显著（P<0.05）。
Figure 14. Effect of PSP-1-1 on gene expression levels in the IRS-1/PI3K/AKT pathway
表 1 RT-qPCR引物设计表
Table 1 RT-qPCR primer design
基因 上游引物序列（5'→3'） 下游引物序列（5'→3'） IRS-1 CTCCTGCTAACATCCACCTTG AGCTCGCTAACTGAGATAGTCAT PI3K AAAGCGGAGAACCTATTGC TGACTTCGCCGTCTACCAC AKT GCCACGACCCAACACCT TAGCCCGCATCCACTC GLUT4 AACTGGACCTGTAACTTCA AGGAGGACGGCAAAT β-actin AGCCATGTACGTAGCCATCC CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA 
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表 2 南瓜籽多糖各组分理化指标
Table 2 Physicochemical indexes of pumpkin seed polysaccharide components
组分 中性糖（%） 糖醛酸（%） 蛋白质（%） PSP 42.54±0.15 5.88±0.17 32.76±1.38 PSP-1 43.46±0.27 15.27±0.41 18.4±0.27 PSP-1-1 88.15±1.55 9.76±0.76 5.1±0.74 PSP-1-2 81.31±2.61 4.09±0.16 8.82±1.32 PSP-1-3 85.87±1.73 2.57±0.16 10.78±1.8
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表 3 三种南瓜籽多糖纯化组分的单糖组成结果
Table 3 Monosaccharide composition results of three purified components of pumpkin seed polysaccharides
单糖 摩尔比 PSP-1-1（%） PSP-1-2（%） PSP-1-3（%） 岩藻糖 0.6 1.8 1 氨基半乳糖盐酸盐 0.5 0.6 0.5 鼠李糖 2.2 2.6 1.8 阿拉伯糖 24.4 14.8 14.2 盐酸氨基葡萄糖 0.8 1 1.1 半乳糖 61.5 38.2 38.8 葡萄糖 5.9 28.6 31.7 木糖 0.5 8.9 7.3 甘露糖 0.9 1.5 2.9 果糖 0 0 0 核糖
半乳糖醛酸0
0.70
0.90
0古罗糖醛酸 0 0 0 葡萄糖醛酸 2 1.1 0.7 甘露糖醛酸 0 0 0
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