Insights Into Rapid Screening and Activity Investigation of Novel Hemp Seed Pancreatic Lipase/Cholesterol Esterase Inhibitory Peptides
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摘要: 本研究旨在快速筛选鉴定汉麻籽蛋白水解物（Hemp seed protein hydrolysates，HSPHs）中的胰脂肪酶（Pancreatic lipase，PL）和胆固醇酯酶（Cholesterol esterase，CE）抑制肽，验证其活性并初步分析其分子机制。首先探究了HSPHs在不同缓冲液体系下的PL和CE抑制活性，然后通过超滤、肽组学和虚拟筛选相结合的方法对PL和CE抑制肽进行快速鉴定筛选，最后验证其活性并采用分子对接探究分子相互作用类型。研究发现，与常规缓冲液体系相比，模拟肠液体系减弱了HSPHs对PL的抑制作用，但提高了对CE的抑制作用，因此后续采用模拟肠液体系检测PL和CE抑制活性。碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶HSPHs中小于3 kDa的部分具有最高的PL/CE抑制活性，对其多肽序列进行鉴定后选取含量和潜在活性较高的136条多肽建立候选肽库，从中鉴定出14种结合能较低的PL和CE抑制肽。体外活性验证表明APAM和RLPA对PL和CE同时表现出良好的抑制能力。分子对接结果表明APAM和RLPA可能通过与酶活性位点及位点表面环中的残基发生氢键和疏水作用来限制酶活性位点的暴露以及反应底物的进入，从而抑制PL和CE的活性。本研究表明汉麻籽是开发控制脂质消化酶抑制肽的潜在来源，为后续开发汉麻籽降脂肽产品提供了参考依据。Abstract: This study aims to rapidly screen and identify pancreatic lipase (PL) and cholesterol esterase (CE) inhibitory peptides from hemp seed protein hydrolysates (HSPHs), and validate their activities, accompanied by preliminarily analyzing their molecular mechanisms. Initially, the PL and CE inhibitory activities of HSPHs were explored under different buffer systems. Subsequently, a combination of ultrafiltration, peptidomics, and virtual screening methods was employed for the rapid identification and screening of PL and CE inhibitory peptides. Finally, their activities were validated, and molecular docking was used to investigate the types of molecular interactions involved. The results indicated that, compared to conventional buffer systems, the simulated intestinal fluid system reduced the inhibitory effect of HSPHs on PL but enhanced their inhibitory effect on CE. Therefore, subsequent tests of PL and CE inhibitory activities were conducted using the simulated intestinal fluid system. The fractions of HSPHs smaller than 3 kDa, released by alcalase and papain, exhibited the highest PL/CE inhibitory activities. After identifying the peptide sequences, 136 peptides with higher content and potential activity were selected to establish a candidate peptide library. From this library, 14 peptides with lower binding energies were identified as PL and CE inhibitory peptides. In vitro activity validation demonstrated that APAM and RLPA exhibited significant inhibitory effects on both PL and CE. Molecular docking results suggested that APAM and RLPA might inhibit the activities of PL and CE by forming hydrogen bonds and hydrophobic interactions with the residues at the enzyme active sites and surface loops, thereby restricting the exposure of the active sites and the entry of substrates. This study indicates that hemp seeds are a potential source for developing lipid digestion enzyme inhibitory peptides, providing a reference for the subsequent development of lipid-lowering peptide products from hemp seeds.
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Keywords:
- hemp seed /
- bioactive peptide /
- enzyme inhibiting /
- peptidomics /
- virtual screening /
- molecular docking
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汉麻（Cannabis sativa L.）也称工业大麻、火麻等，是一种一年生草本植物。中国是汉麻种植面积最大的国家，约占全世界的50%[1]。汉麻的种子即汉麻籽，以其高蛋白（20%-40%）、高脂肪及具有的降血脂、降血压和提升免疫力等多种生理活性著称。2001年汉麻籽被我国卫生部列为药食同源名录，是一种极具开发价值与应用前景的食品原料[2−3]。目前，国内外对汉麻籽蛋白的开发主要集中在提取技术、功能性分析和蛋白类食品制作等方面，深入解析其蛋白/多肽的结构特征、揭示其生理活性机制及构效关系是汉麻籽蛋白资源开发中亟待突破的技术瓶颈。Gilda等[4]发现汉麻籽蛋白水解物具有降低胆固醇潜力，魏连会等[5]进一步通过动物实验发现汉麻籽多肽对高脂饮食喂养大鼠具有一定的降脂作用，表明汉麻籽蛋白及其水解物是潜在的缓解肥胖及降血脂食物来源。
肥胖是全球性的公共卫生问题，是心血管疾病、糖尿病等慢性病的重要危险因素。据统计，我国是全球肥胖人口最多的国家，到2025年超重及肥胖人数将突破2.65亿人[6−8]。胰脂肪酶（pancreatic lipase，PL）和胆固醇酯酶（cholesterol esterase，CE）是人体脂质消化吸收过程中起关键作用的酶[9]。因此，抑制PL和CE的活性，可使其失去部分分解能力，从源头减少人体对膳食脂质的吸收[8−9]。近年来，人们发现包括多糖、皂苷和多酚在内的天然化合物有抑制脂质消化酶的潜力[10]。然而，这些天然化合物的不稳定性、生物利用度低以及潜在不良影响限制了它们作为脂质消化酶抑制剂的应用。最新研究表明，生物活性肽具有抑制脂质消化酶的功能，是一种极具发展前景的食品功能因子，已发现包括燕麦、沙棘和藜麦在内的多种食源蛋白质水解物具备PL和CE抑制活性[11−13]。目前生物活性肽的分离方法中多级分离法存在耗时且昂贵的缺点，而新兴的虚拟水解法又存在难以与实际情况吻合的缺陷[14−17]。因此，将肽组学与虚拟筛选技术相结合，可以综合两种方法的优点，快速、准确地获得活性肽序列。
课题组前期初步研究发现汉麻籽蛋白水解物（hemp seed protein hydrolysates，HSPHs）具有良好的抑制PL和CE活性的能力，表明HSPHs可能是抗肥胖肽的良好来源。然而，目前对于脂质消化酶抑制肽的研究仍处于起步阶段，大多数研究仅停留在蛋白水解物的活性探究层面，对水解物中多肽进行分离鉴定的报道较少，进一步的验证多肽纯净物活性并探究其分子作用机制的研究更是鲜有报道。本研究首先探讨了HSPHs在常规缓冲液体系和模拟肠液体系下对PL和CE的抑制作用，随后采用肽组学和虚拟筛选相结合的方法，鉴定了HSPHs中的PL和CE抑制肽。最后，对筛选出的多肽进行合成以验证其活性，并初步探索其分子作用机制。这项研究将使人们更好地了解如何利用HSPHs作为潜在的PL和CE抑制剂和功能性成分来控制肥胖饮食。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
汉麻籽（汾麻3号） 购自山西长治平顺潞麻农业科技有限公司；胰脂肪酶（PL）（≥3 U/mg） 国药集团化学试剂有限公司（中国上海）；胆固醇酯酶（CE）（70.2 U/mg） 北京索莱宝科技有限公司；碱性蛋白酶（200 U/mg）、木瓜蛋白酶（200 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；对硝基苯丁酸酯、三羟甲基氨基甲烷、卵磷脂、胆汁盐、盐酸、氯化钙、氯化钠、奥利司他等 上海麦克林生化科技股份有限公司；其他化学试剂均为分析级。
Z-326K离心机 德国Hermle labortechnik GmbH公司；THM-2875恒温水浴锅 美国赛默飞世尔科技公司；Triad冷冻干燥机 美国Labconoco公司；S10手持式高速均质机 上海微弥科技有限公司；Infinite M200 Pro多功能酶标仪 瑞士帝肯公司；Easy nLC1200/Q Exactive plus纳升液相色谱-四极杆轨道阱质谱仪 美国赛默飞世尔科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 汉麻籽蛋白水解物制备
采用微波辅助碱溶酸沉法制备汉麻籽蛋白，参考宋炜昱等[18]的方法并稍作修改。将汉麻籽磨碎并过80目筛，用正己烷以1:5的比例（w/v）萃取脱脂3次，将脱脂的汉麻籽粉置于室温挥发正己烷至干燥后保存在−18 ℃。将脱脂后的粉末分散在去离子水（1:10）中，然后用1 mol/L NaOH将pH调至11，将混合物置于500 W微波提取装置中提取120 min，温度设置为40 ℃。然后将混合物在8000×g下离心10 min，取上清液用1 mol/L HCl将其pH调至4.5使蛋白沉淀，并置于4 ℃下过夜。在8000×g下离心15 min，取沉淀用1 mol/L NaOH将pH调至中性。透析脱盐后经冷冻干燥后得到汉麻籽蛋白置于−18 ℃下保存。
将汉麻籽蛋白分散在去离子水中，得到2%（w/v）的分散液，然后按照3000 U/g的酶与底物比（E/S）加入蛋白酶。在50 ℃、pH7的条件下被木瓜蛋白酶或在50 ℃、pH8.5的条件下被碱性蛋白酶水解3 h。水解过程中滴加0.1 mol/L NaOH维持体系pH不变。水解完成后得到的水解混合物在100 ℃下加热10 min使酶失活，然后在室温下冷却，在4 ℃下以8000×g离心20 min。最后，将得到的上清液冻干得到汉麻籽蛋白水解物（HSPHs），并储存在-20 ℃下直至使用。
利用超滤将HSPHs分离成三种不同分子量的组分（>10 kDa、3~10 kDa、<3 kDa）。简言之，将HSPHs配制成10 mg/mL的溶液，然后用0.45 μM滤膜过滤。将滤液装入超滤管，在10000×g下通过不同截留分子量的滤膜进行分离。然后将滤液冻干并储存在−20 ℃下直至使用。
1.2.2 水解度测定
汉麻籽蛋白的水解度根据水解过程中消耗的NaOH计算如下，参考Yin等[19]的方法：
水解度(%)=B×CM×α×htot×100 式中，B是水解过程中为保持pH恒定而消耗的NaOH体积（mL），C是NaOH浓度（mol/L），M是蛋白质的质量（g）（N×6.25），α是反应过程中α-NH2基团的氨基解离度（碱性蛋白酶为0.93，木瓜蛋白酶为0.44），htot为每克蛋白质中肽键的分子量数（mmol/g），在本研究中汉麻籽蛋白的htot 为7.65 mmol/g。
1.2.3 PL和CE抑制活性的测定
在两种不同的溶液环境下测定水解物或肽的胰脂肪酶（PL）和胆固醇酯酶（CE）抑制活性，参考Herrera等[20]的方法并稍作修改：A）常规缓冲液体系，即使用Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L，pH7.5）作为缓冲液；B）模拟肠液体系，即使用消化缓冲液：将0.312 g卵磷脂、0.78 g胆汁盐、0.056 g CaCl2、0.88 g NaCl和100 mL Trizma-马来酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH7.5）混匀，并用均质机在10000 r/min转速下均质2 min。
将HSPHs（或肽）（50 μL）、PL或CE（50 μL，PL： 3 U/mL，CE： 0.1 U/mL）、对硝基苯丁酸酯（50 μL，5 mmol/L）和缓冲液（50 μL）混合。置于37 °C孵育30 min，用酶标仪在405 nm处测定吸光度。用下列公式计算酶活抑制百分比：
酶活抑制率(%)=(1−(C−DA−B))×100 式中，A：对照（含酶不含水解物或多肽）；B：对照空白（不含酶不含水解物或多肽）；C：样品（含酶含水解物或多肽）；D：样品空白（不含酶含水解物或多肽）。
1.2.4 汉麻籽蛋白水解物中多肽序列分析
参考Gilda等[4]的方法利用纳升液相色谱-四极杆轨道阱质谱仪对HSPHs进行序列鉴定。将分子量小于3 kDa的HSPHs组分使用Pierce™ C18离心吸头进行脱盐，然后使用EASY-nLC1200 Q Exactive Plus系统进行序列鉴定。多肽的分离采用EASY-SprayC18液相色谱柱（150 μm×150 mm，2 μm粒径；美国ThermoScientific公司），进样量1 μL，色谱柱温度55 ℃，流速300 nL/min。色谱分离过程如下：流动相A（0.1%甲酸水溶液，v/v）和流动相B（0.1%甲酸80%乙腈，v/v）采用线性梯度程序，流速为300 nL/min：从0~3 min，流动相B的浓度为2%~6%；从3~42 min，流动相B的浓度为6%~20%；从42~47 min，流动相B的浓度为20%~35%；从47~48 min，流动相B的浓度为35%~100%；最后流动相B在100%浓度下保持12 min。
质谱参数设置如下：（1）MS：扫描范围（m/z）350~1800；分辨率70000；AGC目标3e6；最长进样时间50 ms；（2）dd-MS²：分辨率17500；分离窗口2.0 m/z；AGC目标1e5；最长进样时间45 ms；碰撞能量28；动态排除时间30 s。通过Peaks软件对肽段进行鉴定，参数如下：母体质量误差容限：10.0 ppm；片段质量误差容限：0.02 Da；酶：无；消化模式：非特异性。只考虑肽段假阳性率（false discovery rate，FDR）小于1%的肽段。长度小于5个氨基酸的肽段则采用从头测序方法进行分析，使用的参数与上述相同。
1.2.5 靶向抑制PL和CE的候选汉麻籽多肽库建立及分析
首先筛选HSPHs中含量高于0.1%的组分作为备选多肽，然后使用Peptide ranker（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）对备选多肽的潜在生物活性进行评分，筛选出评分超过0.5的多肽作为靶向抑制PL和CE的候选多肽库。使用GRAVY CALCULATOR（https://www.gravy-calculator.de/）计算疏水性； PepDraw（https://www.pepdraw.com/）计算相对分子质量、净电荷和等电点。
1.2.6 PL和CE抑制肽的虚拟筛选
使用AutoDock Vina软件筛选候选多肽库中有潜力的多肽[9]。多肽的三维结构通过RPBS在线服务器（https://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3/）和殷赋科技平台中准备多肽结构板块（https://cloud.yinfotek.com/tools/molkit/prepare_peptides?id=85050）构建。由于1LPB和1AQL已被广泛用于PL和CE抑制剂研究，因此被选为目标蛋白质晶体结构。使用Pymol 2.1软件去除无关的小分子后，将蛋白质分子导入AutoDock Tools-1.5.6软件，去除水分子、添加氢原子并设置原子类型。使用Autodock Vina将多肽与酶进行虚拟筛选。筛选过程中使用的对接中心是根据酶的活性位点（PL：Ser152-His263-Asp176；CE：Ser194-Asp320-His435）的位置确定的，具体如下：1LPB：x=8.02469，y=23.5388，z=55.7064，1AQL：x=34.757，y=66.474，z=23.515，对接盒子长、宽、高设置为30×30×30 Å。
1.2.7 PL和CE抑制肽合成及活性验证
委托南京肽谷生物科技有限公司（中国南京）合成1.2.6中虚拟筛选出的多肽，并按照1.2.3中的方法测定多肽对PL和CE的抑制率，以多肽质量浓度为横坐标，酶活抑制率为纵坐标进行曲线拟合，计算IC50。
1.2.8 PL和CE抑制肽的分子对接
使用AutoDock Vina进行分子对接，研究筛选出的多肽与PL/CE之间可能的相互作用[9]。筛选出的多肽作为小分子配体，1LPB和1AQL两种蛋白质作为受体。筛选过程中的其他参数与1.2.6一致。通过分析化合物与目标蛋白质之间的相互作用模式，获得化合物与蛋白质残基之间的相互作用，如由此产生的氢键、疏水相互作用等。三维和二维对接图像分别由PyMOL 2.1和LigPlot获得。
1.3 数据处理
统计差异由SPSS20软件（IBM，Chicago，IL，USA）通过单因素方差分析和Duncan后检验进行评估。当P值小于0.05时，认为差异显著。每个实验重复三次。
2. 结果与分析
2.1 汉麻籽蛋白的水解度
如图1所示，随着水解时间的延长，汉麻籽蛋白的水解度逐渐增加。碱性蛋白酶处理组的水解度在0.5 h内可达到17.25%±0.35%，然后缓慢增加，最后达到27.49%±0.53%。而木瓜蛋白酶处理组的水解度要低得多，水解3 h后仅达到9.42%±0.46%。谢晋祥等[21]和江婷等[22]在水解核桃蛋白和葛根蛋白时同样发现碱性蛋白酶处理的水解度要高于木瓜蛋白酶。这主要是由于酶的反应速度、特异性和底物亲和性不同造成的。碱性蛋白酶优先裂解疏水氨基酸残基的羧基侧，而木瓜蛋白酶主要水解赖氨酸、精氨酸和苯丙氨酸等相邻氨基酸的肽键[22]。
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图 1 汉麻籽蛋白经蛋白酶水解的水解度Figure 1. Degree of hydrolysis of hemp seed protein by protease hydrolysis2.2 HSPHs的PL和CE抑制活性
HSPHs的PL抑制活性如图2A−B所示。在常规缓冲液体系中，木瓜蛋白酶水解组抑制胰脂肪酶的IC50值为5.69±0.21 mg/mL，而碱性蛋白酶水解组的IC50值为4.31±0.15 mg/mL。林娈等[23]发现蛋白核小球藻的蛋白水解物的<5 kDa组分在8 mg/mL浓度下对PL的抑制率达到45.44%±3.52%。刘晓静[24]测得亚麻籽肽中≤1 kDa组分的PL抑制的IC50为6.20 mg/mL，与HSPHs的PL抑制活性相当。而钟婉滢等人制备的藜麦蛋白肽对PL抑制的IC50则达到了7.49 μg/mL[8]。然而，目前有关抑制PL多肽的活性检测主要在简化的静态环境中进行，没有考虑到脂质在人体消化道中的实际情况和动态变化。如图2A、B所示，模拟肠液体系中HSPHs对PL的抑制活性有所降低。在模拟肠液体系下，木瓜蛋白酶水解组抑制PL的IC50值为10.68±0.94 mg/mL，而碱性蛋白酶水解组的IC50值为6.76±0.14 mg/mL。造成这种现象的原因有很多，脂肪酶在不同环境下活性的变化、反应成分之间的相互作用以及多肽的不同组成均可能会造成不同的结果。Herrera等[20]认为葫芦巴和藜麦种子乙醇提取物在模拟肠液体系中的PL抑制活性降低是由于生物活性化合物降解所致。此外，PL在模拟肠液体系中能与表面活性剂、胆汁盐和卵磷脂相互作用，使PL继续吸附在乳化脂质表面，更容易与底物相互作用，从而增强PL的活性，导致多肽更难抑制PL的活性[25]。
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图 2 HSPHs在常规缓冲液体系和模拟肠液体系中对PL（A、B）和CE（C、D）的抑制效果Figure 2. Inhibitory effects of HSPHs on PL (A, B) and CE (C, D) in conventional buffer system and simulated intestinal fluid system图2C、D显示了HSPHs对CE的抑制活性。与对PL的抑制活性相同，碱性蛋白酶水解组对CE的抑制作用比木瓜蛋白酶水解组强。在常规缓冲液体系中，木瓜蛋白酶处理组抑制CE的IC50值为23.16±2.49 mg/mL，而碱性蛋白酶处理组的IC50值为8.23±0.61 mg/mL。HSPHs对CE的抑制活性与已有研究的亚麻籽肽和藜麦蛋白肽相当[8,24]。然而，如图2C、D所示，与PL的抑制活性不同的是，在模拟肠液体系中，HSPHs对CE的抑制活性均强于常规缓冲液体系下。在模拟肠液体系下，木瓜蛋白酶处理组抑制CE的IC50值为7.26±0.09 mg/mL，而碱性蛋白酶处理组的IC50值为4.81±0.14 mg/mL。这主要是由于PL和CE酶结构的不同造成的，肠道中胆汁盐会与CE中两个不同的结合位点结合，从而增强CE结合位点的疏水性[26]。因此，那些比反应底物更疏水的肽更容易与活性位点结合，从而限制了底物与活性位点的结合。Herrera等[20]还发现，在模拟肠液体系中，葫芦巴和藜麦种子乙醇提取物反而会提高淀粉酶的催化活性，表明肠道中复杂的成分组成以及活性物质的不同可能会对酶活产生完全不同的影响。由于模拟肠液体系更贴近脂质消化酶的实际作用场景，因此本研究后续使用模拟肠液体系对多肽的抑制活性进行检测。
2.3 超滤膜分离HSPHs组分对PL和CE活性的抑制作用
为了进一步研究HSPHs对脂质消化酶的抑制活性，用不同截留分子量的超滤膜将HSPHs分成>10 kDa、3~10 kDa和<3 kDa三个组分。小于3 kDa的组分占绝大多数，在木瓜蛋白酶处理组中，小于3 kDa的组分占71.42%，而在碱性蛋白酶处理组中，小于3 kDa的组分占78.29%（图3A）。在模拟肠液体系下测定了不同分子量HSPHs组分对脂质消化酶的抑制活性，结果见图3。所有组都显示出分子量越小抑制活性越强的趋势。这可能是由于小肽更容易附着在PL和CE的催化中心，因此分子量较低的HSPHs对PL和CE有更强的抑制能力[22]。Awosika等[27]研究了豌豆蛋白水解物对PL的抑制活性，发现分子量较低的水解物对PL的抑制作用优于其他组分。林娈等[23]也发现蛋白核小球藻的蛋白水解物<5 kDa组分对胰脂肪酶活性抑制率最高（45.44%±3.52%）。因此，选取经碱性蛋白酶处理组和木瓜蛋白酶处理组中分子量小于3 kDa的肽组分进行进一步的分析。
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图 3 不同分子量HSPHs组分占比（A）以及其对PL（B）和CE（C）的抑制作用Figure 3. Percentage of different molecular weight HSPHs fractions (A) and their inhibitory effects on PL (B) and CE (C)2.4 基于LC-MS/MS鉴定HSPHs组分多肽
与基于多次分离纯化后的MS/MS方法鉴定肽段不同，肽组学可以同时鉴定蛋白水解物中的所有肽段。本研究选择了误发现率小于1%的肽序列，在去除重复项后碱性蛋白酶处理组共鉴定出2948个肽，而木瓜蛋白酶处理组的多肽数量高于碱性蛋白酶处理组，共鉴定出3510个多肽，这与Yin等[19]的研究结果一致。如图4A的维恩图所示，由于两种蛋白酶的作用位点不一致，其水解物中只有321种多肽的序列相同。水解物中多肽的离子信号强度和数量如图4B、C所示。可以发现，两种蛋白酶的水解物主要含有小于10个氨基酸组成的短肽，木瓜蛋白酶水解物中平均多肽长度高于碱性蛋白酶处理组，与木瓜蛋白酶处理组水解度低于碱性蛋白酶处理组结果一致。而在离子强度方面，碱性蛋白酶处理组在短肽区域显著高于木瓜蛋白酶处理组，表明碱性蛋白酶处理组含有较高含量的短肽，可能具备较强的生物活性，与水解物的PL和CE抑制活性结果一致。考虑到多肽的丰度，选择了含量超过0.1%的多肽进行进一步的虚拟筛选，以筛选出具有最高抑制活性的确切多肽片段。
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图 4 HSPHs中<3 kDa组分的肽组学维恩图（A）和热图（B、C）注：PH：木瓜蛋白酶水解组；AH：碱性蛋白酶水解组。Figure 4. Peptidomics Venn diagrams (A) and thermograms (B, C) of <3 kDa fractions of HSPHs2.5 候选肽库的生物信息特征分析
基于HSPHs中分子量小于3 kDa部分的多肽组学结果，其中符合含量高于0.1%且Peptide Ranker评分高于0.5的多肽序列共有136条。生物活性肽通常通过其理化特性与分子结构有效发挥其生物活性，通过生物信息学分析工具从氨基酸排列特征、净电荷、疏水性等多方面分析候选肽库的生物信息学特征是否符合目标活性肽的已知分子特征，有助于提高筛选效率[28]。如图5A所示，候选肽库的氨基酸排列特征表现为：N端首个氨基酸主要由苯丙氨酸、亮氨酸和丝氨酸组成，其中苯丙氨酸和亮氨酸为疏水性氨基酸，有助于多肽与胰脂肪酶和胆固醇酯酶活性位点的结合[29]。N2和N3位置主要由亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸占据。C1位置精氨酸占比达到32%。精氨酸能够通过氢键与两个带电残基相互作用，并通过其亚甲基与疏水残基进行疏水相互作用，从而发挥其抑制脂质消化酶的作用，表明这些多肽可能具备较强的酶抑制活性[30]。C2位置则主要由疏水性的脯氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸占据，进一步证明了疏水性氨基酸在脂质消化酶抑制肽中的作用。图5B~D展示了候选肽库等电点、疏水性和净电荷与分子量的相关性。可以看到，低分子量的多肽等电点小于7，表明低分子量多肽含有较多的酸性氨基酸。而在疏水性方面（图5C），分子量高于600 Da的多肽其总平均亲水性大部分小于0，表明其更加疏水，而低于600 Da的多肽大部分总平均亲水性大于0，表明其更加亲水。由于多肽的疏水性与其抑制脂质消化酶的活性存在一定关联，因此低分子量多肽的脂质消化酶抑制活性可能更强[29]。而净电荷方面，大部分多肽的净电荷为0或+1，带有正电荷主要是多肽含有精氨酸。带有精氨酸的多肽可能具备较强的脂质消化酶抑制活性[30]。总之可以发现候选肽库的多种理化特征均符合PL和CE抑制肽的特征，有助于筛选出高活性多肽。
2.6 具有PL和CE抑制活性的多肽的虚拟筛选
PL（PDB ID：1LPB）和CE（PDB ID：1AQL）因其高精度结构（分辨率1lpb：2.46 Å，1AQL：2.80 Å）而被广泛用于PL和CE抑制剂的虚拟筛选[31−32]。然后使用Autodock Vina虚拟筛选多肽对PL和CE活性的抑制作用。考虑到肽段的数量，筛选出与PL和CE结合能均低于-7.0 kcal/mol的肽段进行下一步分析（表1）[33]。共筛选出14种具有抑制潜力的多肽，其中与PL的结合能最高的是FFVP和FPPPK的−8.3 kcal/mol，最低的是FEPPRYE的−9.7 kcal/mol。对于CE抑制肽，结合能最高的是VAPF，为−7.9 kcal/mol，最低的是FPFPR，为−9.7 kcal/mol。由于结合能与抑制能力之间没有绝对的对应关系，因此需要对这些多肽的抑制能力进行体外验证。Pepsite2（http://pepsite2.russelllab.org/）是一个可以预测多肽与酶的结合位点的网站，已被用于探索抑制PL和CE的多肽的结合位点[34]。Pepsite2的结果（表1）显示，绝大多数多肽与酶的结合P值低于0.05（高度显著），所有多肽与酶的结合P值均低于0.25（中度显著），进一步证明了这些多肽的酶抑制潜力。
表 1 <3 kDa HSPHs中靶向抑制PL和CE的多肽虚拟筛选结果Table 1. Results of virtual screening of peptides targeting PL and CE inhibition in <3 kDa HSPHs多肽序列 来源 含量（%） Peptide Ranker评分 PL CE 分子量（Da） PepSite2 P值 结合能（kcal/mol） PepSite2 P值 结合能（kcal/mol） APAM AH 0.19 0.768 0.00317 −8.6 0.00371 −8.4 388.178 EFPPRYE PH 0.40 0.520 0.119 −8.6 0.00798 −9.1 936.434 FEPPRYE AH 0.38 0.521 0.095 −9.7 0.0168 −9.6 936.434 FFVP AH 0.11 0.953 0.0140 −8.3 0.00990 −9.5 508.268 FPFPR PH 0.10 0.988 0.00932 −8.4 0.00552 −9.7 662.354 FPPPK PH 0.11 0.953 0.00289 −8.3 0.00130 −8.5 584.332 FYNPKAG PH 0.39 0.600 0.210 −8.5 0.212 −9.1 795.391 LPFRPPQPR AH 0.10 0.847 0.0313 −9.5 0.0112 −9.3 1106.634 NNNPFKF PH 0.17 0.910 0.109 −8.5 0.144 −8.8 879.423 NNNPFSFR PH 0.15 0.846 0.127 −8.9 0.216 −9.0 994.462 RLPA AH 0.24 0.543 0.0137 −9.1 0.00479 −8.7 455.285 TFPYPR PH 0.10 0.869 0.0162 −8.8 0.0580 −8.6 779.396 VAPF AH 0.10 0.775 0.0257 −8.9 0.00341 −7.9 432.237 WSLPMPR AH 0.10 0.951 0.0853 −8.5 0.0682 −8.0 885.453 2.7 合成PL和CE抑制肽活性验证
为避免出现假阳性结果，采用固相合成法制备这14种多肽，其抑制活性见表2。对于PL抑制肽，所有14种肽都显示出抑制活性，其中APAM、EFPPRYE、FEPPRYE、FPFPR和RLPA表现出相对较强的PL抑制活性，IC50值均低于500 μmol/L。这些结果表明，虚拟筛选可以有效地减少人力成本和时间，对筛选多肽抑制剂非常有效。据报道，从脱油米糠中提取的多肽FYLGYCDY对PL有抑制作用，其IC50值为0.47 μmol/L[35]。从芝麻蛋白中的肽TF、EW、QWM、NIF、AGY和PIF的IC50分别为751、907、986、1044、1183和5172 μmol/L[36]。此外，从蛋白核小球藻中分离出PL抑制活性最强的多肽FLGPF的IC50为13.80 mmol/L[23]。考虑到上述研究的实验条件不同，如酶的浓度、类型、缓冲液的pH和浓度、底物浓度以及操作过程中的其他条件等，多肽抑制PL的IC50值存在很大差异。因此，有必要引入阳性对照（如奥利司他）进行比较，以更好地反映生物活性化合物的活性。为了评估多肽对PL抑制作用的IC50值，使用了奥利司他作为阳性对照。奥利司他对PL的IC50（1.08±0.07 μmol/L）远低于多肽的IC50，这与Esfandi等[11]的研究结果一致。然而，严重的副作用和潜在的肝毒性限制了奥利司他的应用。因此，使用肽来部分替代奥利司他以联合抑制酶的活性是未来需要探索的一个方案。
表 2 合成多肽的PL和CE抑制活性验证Table 2. Validation of PL and CE inhibitory activities of synthesized peptides多肽 IC50（μmol/L） PL CE APAM 387.73±4.69 207.66±13.78 EFPPRYE 361.67±9.39 265.59±8.3 FEPPRYE 340.46±21.09 266.33±12.07 FFVP 728.22±37.44 503.95±46.18 FPFPR 393.05±25.64 370.44±22.16 FPPPK 854.62±52.03 399.77±16.26 FYNPKAG 522.32±39.64 425.4±14.63 LPFRPPQPR 535.26±28.39 282.8±19.52 NNNPFKF 554.2±27.97 285.2±16.86 NNNPFSFR 511.29±43.29 259.23±16.16 RLPA 176.22±4.17 222.15±7.12 TFPYPR 588.37±51.98 391.91±30.65 VAPF 949.25±43.68 508.91±45.92 WSLPMPR 609.01±31.29 295.25±29.75 在CE抑制肽方面，所有肽都表现出一定的CE抑制活性，IC50从APAM的207.66±13.78 μmol/L到VAPF的508.91±45.92 μmol/L不等。然而，与奥利司他（IC50=0.82±0.08 μmol/L）相比，这些肽的IC50仍然很高。Ye等[37]从茶叶蛋白水解产物中分离纯化出FLF、IYF和QIF三种小分子肽，具有一定的CE抑制作用。然而，据Garzón等[38]报道，啤酒糟中分离出的CE抑制肽中高分子量多肽WNIHMEHQDLTTME活性更强，因此，关于CE抑制肽的构效关系及其分子作用机制目前仍不明晰，有待进一步研究。总之，合成肽活性验证结果表明，APAM和RLPA肽对PL和CE均有一定的抑制作用，可作为抗肥胖分子进行进一步研究。
2.8 PL和CE与多肽之间的相互作用机制
PL是一种由449个氨基酸组成的糖蛋白，它有两个结构域：由中心β片状核心（残基1-335）产生的球状N端结构域和由β片状核心（残基336~449）组成的C端结构域[10]。PL的活性位点由残基Ser152-His263-Asp176共同形成催化三联体。活性位点外的三个表面环将其包裹起来，以抑制底物与活性位点的结合。其中，cys237-cys261通过二硫键形成最大的环，残基76~80和213~217形成另外两个较小的环[36]。当这些表面环处于水油界面时，它们会改变构象，从而打开底物结合位点，进而激活酶。因此，与结合位点或"环"结合都会抑制脂肪酶的活性。根据虚拟筛选和多肽合成的结果，可以发现所有PL抑制肽都含有疏水性氨基酸，如脯氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。Baba等[39]和Ngoh等[40]观察到脂肪酶抑制肽中的亮氨酸和脯氨酸大多与脂肪酶残基相互作用。此外，亲水性氨基酸精氨酸也是许多PL抑制肽的共同特征，包括之前已被证明具有抗肥胖作用的肠抑素（VPDPR）[41]。据推测，氢键是含有Arg残基的抑制肽抑制PL的主要因素。精氨酸含有一个α-氨基、一个α-羧酸基团和一个含胍的侧链，因此能够通过氢键与两个带电残基相互作用，并通过亚甲基与疏水残基发生疏水作用[30]。
图6A、B显示了通过化学合成验证的高PL抑制活性的APAM和RLPA多肽的分子对接结果。对于多肽APAM，Ala3可以与活性位点内的His263形成氢键。除此之外，APAM中的Met4可以与表面环中的Phe77形成氢键，阻止了活性位点的暴露。据报道，Phe77在表面环中起到氢键供体和静电稳定的作用，并可以形成氧阴离子空穴[42]。因此APAM可以通过与表面环和活性位点的氢键相互作用抑制PL的活性。而多肽RLPA中则主要由Arg1和Leu2与表面环中Leu213、Gln244、Asp257和Ala259形成氢键来阻止表面环的展开从而抑制PL的活性。除此之外，多肽还富含疏水性氨基酸残基，包括Ala、Leu和Pro。这些氨基酸残基可通过疏水相互作用与PL结合，阻止结构域催化位点的重新定位以及盖子的展开，从而抑制PL的活性。目前已发现的一些PL抑制肽也能与活性口袋和环上的残基结合，占据酶活性位点的凹槽，阻止底物与酶活性位点结合[4,36−37]。
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图 6 多肽 APAM （A,C）, RLPA （B,D）与PL和CE相互作用分析Figure 6. Interaction analysis of peptides APAM (A,C), RLPA (B,D) with PL and CECE是一种丝氨酸水解酶，属于α/β-水解酶家族。由残基Ser194、Asp320和His435组成的催化三联体和由残基Gly107、Ala108和Ala195组成的氧阴离子空位共同构成了活性位点[4]。除此之外，覆盖活性位点的Cys64和Cys80之间的盐桥形成的环也会影响其活性[32]。图6C、D显示了通过化学合成验证的高CE抑制活性的APAM和RLPA多肽的分子对接结果。对APAM来说，Met4与活性位点的His形成了氢键以及Ala1与Ser194之间的疏水相互作用使多肽与CE紧密结合，从而占据了CE活性位点的凹槽，抑制了酶的活性。除此之外，Met4与Asp437形成的氢键也在多肽与CE的结合中发挥了重要作用。而多肽RLPA则没有与CE的活性位点形成氢键，仅有Arg1与His435之间存在疏水相互作用，表明RLPA可能是通过与活性位点附近的其他残基的相互作用来抑制CE的活性。Fisayo等[29]也发现，一些含有Arg残基的肽具有抑制CE的潜力。
表 3 APAM和RLPA与PL和CE之间的潜在结合位点Table 3. Potential binding sites between APAM and RLPA with PL and CE酶种类 多肽 相互作用 氢键 疏水相互作用 PL APAM Phe77，Asp79，
Asp176，Arg256，
His263Tyr114，His151，Ser152，Ala178，
Pro180, Phe215，Leu264，Ala259RLPA Leu213，Gln244，
Asp257，Ala259Ile78，Phe215，Cys237，Phe258，
Ala260，Cys261CE APAM Gly106，Tyr427，
Asp434，His435，
Asp437Leu124，Tyr125，Ser194，Leu323，
Ala436RLPA Ala113，Tyr125，
Tyr427Tyr105，Gly106，Met111，Gly112，
Gly116，Ala117，Leu124，Leu323，
Asp434，His435，Ala436，Asp4373. 结论
本研究探索了汉麻籽蛋白水解物在常规缓冲液体系和模拟肠液体系中对胰脂肪酶（PL）和胆固醇酯酶（CE）的抑制活性。通过超滤、肽组学和虚拟筛选相结合的方法，筛选出了14种具有同时抑制PL和CE潜力的多肽。进一步合成多肽验证了这14种多肽均可以抑制PL和CE的活性，14种多肽中APAM和RLPA对PL和CE同时具有较好的抑制作用。APAM抑制PL和CE的IC50分别为387.73±4.69、207.66±13.78 μmol/L，RLPA抑制两种酶的IC50分别为176.22±4.17、222.15±7.12 μmol/L。分子对接表明，多肽可能通过与活性位点的Ser152、His263以及表面环的Ala259和Phe77等残基形成氢键和疏水作用来抑制PL的活性，通过与活性位点的Ser194和His435形成氢键和疏水作用来抑制 CE的活性。本研究仅在体外水平鉴定和验证了多肽的活性，今后的工作应侧重于PL和CE抑制肽的分子作用机制、在模拟胃肠道条件下的稳定性以及在体内的降脂效果。
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图 1 汉麻籽蛋白经蛋白酶水解的水解度
Figure 1. Degree of hydrolysis of hemp seed protein by protease hydrolysis
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图 2 HSPHs在常规缓冲液体系和模拟肠液体系中对PL（A、B）和CE（C、D）的抑制效果
Figure 2. Inhibitory effects of HSPHs on PL (A, B) and CE (C, D) in conventional buffer system and simulated intestinal fluid system
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图 3 不同分子量HSPHs组分占比（A）以及其对PL（B）和CE（C）的抑制作用
Figure 3. Percentage of different molecular weight HSPHs fractions (A) and their inhibitory effects on PL (B) and CE (C)
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图 4 HSPHs中<3 kDa组分的肽组学维恩图（A）和热图（B、C）
注：PH：木瓜蛋白酶水解组；AH：碱性蛋白酶水解组。
Figure 4. Peptidomics Venn diagrams (A) and thermograms (B, C) of <3 kDa fractions of HSPHs
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图 6 多肽 APAM （A,C）, RLPA （B,D）与PL和CE相互作用分析
Figure 6. Interaction analysis of peptides APAM (A,C), RLPA (B,D) with PL and CE
表 1 <3 kDa HSPHs中靶向抑制PL和CE的多肽虚拟筛选结果
Table 1 Results of virtual screening of peptides targeting PL and CE inhibition in <3 kDa HSPHs
多肽序列 来源 含量（%） Peptide Ranker评分 PL CE 分子量（Da） PepSite2 P值 结合能（kcal/mol） PepSite2 P值 结合能（kcal/mol） APAM AH 0.19 0.768 0.00317 −8.6 0.00371 −8.4 388.178 EFPPRYE PH 0.40 0.520 0.119 −8.6 0.00798 −9.1 936.434 FEPPRYE AH 0.38 0.521 0.095 −9.7 0.0168 −9.6 936.434 FFVP AH 0.11 0.953 0.0140 −8.3 0.00990 −9.5 508.268 FPFPR PH 0.10 0.988 0.00932 −8.4 0.00552 −9.7 662.354 FPPPK PH 0.11 0.953 0.00289 −8.3 0.00130 −8.5 584.332 FYNPKAG PH 0.39 0.600 0.210 −8.5 0.212 −9.1 795.391 LPFRPPQPR AH 0.10 0.847 0.0313 −9.5 0.0112 −9.3 1106.634 NNNPFKF PH 0.17 0.910 0.109 −8.5 0.144 −8.8 879.423 NNNPFSFR PH 0.15 0.846 0.127 −8.9 0.216 −9.0 994.462 RLPA AH 0.24 0.543 0.0137 −9.1 0.00479 −8.7 455.285 TFPYPR PH 0.10 0.869 0.0162 −8.8 0.0580 −8.6 779.396 VAPF AH 0.10 0.775 0.0257 −8.9 0.00341 −7.9 432.237 WSLPMPR AH 0.10 0.951 0.0853 −8.5 0.0682 −8.0 885.453 
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表 2 合成多肽的PL和CE抑制活性验证
Table 2 Validation of PL and CE inhibitory activities of synthesized peptides
多肽 IC50（μmol/L） PL CE APAM 387.73±4.69 207.66±13.78 EFPPRYE 361.67±9.39 265.59±8.3 FEPPRYE 340.46±21.09 266.33±12.07 FFVP 728.22±37.44 503.95±46.18 FPFPR 393.05±25.64 370.44±22.16 FPPPK 854.62±52.03 399.77±16.26 FYNPKAG 522.32±39.64 425.4±14.63 LPFRPPQPR 535.26±28.39 282.8±19.52 NNNPFKF 554.2±27.97 285.2±16.86 NNNPFSFR 511.29±43.29 259.23±16.16 RLPA 176.22±4.17 222.15±7.12 TFPYPR 588.37±51.98 391.91±30.65 VAPF 949.25±43.68 508.91±45.92 WSLPMPR 609.01±31.29 295.25±29.75
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表 3 APAM和RLPA与PL和CE之间的潜在结合位点
Table 3 Potential binding sites between APAM and RLPA with PL and CE
酶种类 多肽 相互作用 氢键 疏水相互作用 PL APAM Phe77，Asp79，
Asp176，Arg256，
His263Tyr114，His151，Ser152，Ala178，
Pro180, Phe215，Leu264，Ala259RLPA Leu213，Gln244，
Asp257，Ala259Ile78，Phe215，Cys237，Phe258，
Ala260，Cys261CE APAM Gly106，Tyr427，
Asp434，His435，
Asp437Leu124，Tyr125，Ser194，Leu323，
Ala436RLPA Ala113，Tyr125，
Tyr427Tyr105，Gly106，Met111，Gly112，
Gly116，Ala117，Leu124，Leu323，
Asp434，His435，Ala436，Asp437
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