Effect of Combination of Pulsed Electric Field and pH Shifting on Structure and Functional Properties of Soybean Protein Isolates
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摘要: 大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）是食品工业中一种重要的植物蛋白。然而，其致密的球形聚集结构导致分子柔韧性降低，严重影响了其功能特性。因此，本文采用脉冲电场（pulsed electric field，PEF）和pH偏移技术对SPI进行改性处理，研究了脉冲电场和pH偏移的三种不同组合处理方式（先PEF后pH偏移、先pH偏移后PEF、PEF联合pH偏移）对SPI结构和功能特性的影响。结果表明：三种方法中，PEF联合pH偏移处理对SPI聚集结构的影响最为明显，处理后的SPI具有最高的溶解度（90.23%）、最小的浊度（0.074）、最大绝对ζ-电位值（44.4 mV）和最小的颗粒大小（63.5 nm）。PEF联合pH偏移处理能够诱导SPI二三级部分的解折叠，使得球状堆积态的SPI转换为“熔球态”，并具有更低含量的α-螺旋和β-折叠，以及更高含量的无规卷曲，蛋白结构整体呈现松散和无序状。经不同方法改性后的SPI均表现出更好的功能特性，对SPI功能特性的改善效果排序如下：PEF联合pH偏移>先pH偏移后PEF>先PEF后pH偏移。与未处理组相比，PEF联合pH偏移得到的SPI的乳化性（EAI）、乳化稳定性（ESI）、起泡活性（FA）和与叶黄素的结合常数分别提高了119.24%、39.33%、59.03%和245.81%。综上，采用脉冲电场和pH偏移的不同组合处理能够显著影响SPI的结构和功能特性，其中PEF联合pH偏移处理能诱导SPI高级结构的更大程度的展开，改善其功能特性。Abstract: Soybean protein isolate (SPI) is an important vegetable protein source used in the food industry. Its functional properties are negatively impacted by its dense spherical aggregate structure, which reduces its molecular flexibility. In this study, pulsed electric field (PEF) and pH shifting techniques were applied to modify SPI structure. The effects of three different treatment strategies combining pulsed electric field and pH shifting (PEF first followed by pH shifting, pH shifting first followed by PEF, and simultaneous PEF and pH shifting) on the structure and functional properties of SPI were investigated. Among the three methods, simultaneous PEF and pH shifting achieved the most obvious effect on the aggregated structure of SPI. This treated SPI exhibited the highest solubility (90.23%), smallest turbidity (0.074), largest absolute ζ-potential value (44.4 mV), and smallest particle size (63.5 nm). Simultaneous PEF and pH shifting could induce partial unfolding of secondary and tertiary structures in SPI, converting the spherical aggregates into a "molten globule state" that exhibited lower α-helix and β-sheet content and higher random coil content. The overall treated protein structure was loose and disordered. Modified SPI using different methods showed better functional properties. The order of improvement in SPI functional properties was as follows: Simultaneous PEF and pH shifting>pH shifting first followed by PEF>PEF first followed by pH shifting. Compared with untreated SPI, simultaneous PEF and pH shifting treatment of SPI increased the emulsifying activity, emulsifying stability, foaming activity, and lutein binding constant by 119.24%, 39.33%, 59.03%, and 245.81%, respectively. In conclusion, different treatments combining pulsed electric field and pH shifting can significantly affect the structural and functional properties of SPI. Simultaneous PEF and pH shifting treatment can induce the greatest degree of unfolding of the advanced structure of SPI and most strongly improve its functional properties.
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Keywords:
- pulsed electric field /
- pH shifting /
- soy protein isolate /
- structure /
- functional properties
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大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）作为一种以脱脂大豆粕为原料制得的蛋白类产品，不仅具有来源广、价格低、营养高等特点，还具备出色的功能特性，广泛应用于食品、材料和医药等领域[1]。近年来，我国大豆产业蓬勃发展，SPI生产规模不断扩大。然而大豆蛋白表现出较为致密的刚性结构且在提取和生产过程中由于外部环境的变化，蛋白会发生构象的改变和分子的变性聚集，从而形成蛋白聚集体，导致SPI分子灵活性低，功能特性受限，严重制约了其在食品工业中的应用[2]。
为了让SPI能够更为广泛地应用于食品工业中，对SPI进行改性处理，改善其功能特性已成为一种常用的科学手段。其中热处理是最为常见的物理改性方法，刘紫薇等[3]研究发现90 ℃下SPI的溶解性从70%提高到80.6%。但是热加工中产生的热效应极易破坏蛋白的营养成分，对大豆分离蛋白类产品色、香、味产生负面影响。而超声波、冷等离子体、高压脉冲电场等非热加工技术能够在较低的温度下改性蛋白，且保持蛋白质的营养成分和生物活性，其中脉冲电场（pulsed electric fields，PEF）技术是一种在两电极之间的处理室中施加场强0~100 kV/cm、脉宽1~100 μs的平方波电脉冲，对处理室中物料进行处理的过程，具有作用物料时间短（μs或ms）、能耗低、无显著热效应、绿色环保等优点，是一种有潜力的取代传统物理改性手段的新方法[4−6]。李迎秋[7]研究表明中等PEF处理诱导SPI分子结构部分解折叠，SPI的溶解度、乳化性、起泡性等功能性质均有所提高但不明显，如溶解度经处理后仅提高约8%，其他功能性质的提升效果也十分有限。另外，当PEF处理条件较强时，会诱导原本已经解聚的蛋白之间通过疏水相互作用重新聚集，导致溶解度和功能特性的降低。Wang等[8]的研究中发现在20 kV/cm场强下处理的商业化SPI的溶解度从70.34%下降至61.25%，过强的PEF处理会对蛋白的溶解性产生不利影响。PEF技术破碎蛋白聚集体，使不溶性蛋白聚集体转换为可溶性蛋白聚集体的能力明显要弱于热、超声等物理加工手段。
因此，仅仅依靠单一PEF处理改性SPI，还不足以满足SPI在工业应用中的性能要求。近年来有研究发现，在酸碱环境中的蛋白结构趋于松弛，使其对热、超声和高静水压力等物理因素敏感度增加[9−10]。Sun等[11]研究指出不同温度下pH偏移可有效改善SPI的溶解度、粒径、表面疏水性等性能。谭孟娜[1]研究利用超高压（400 MPa）协同酸性或碱性pH偏移处理，发现两种SPI的溶解度分别提高至对照组的1.71倍和2.94倍，同时形成了小粒径聚集体，蛋白表面电荷含量增加。本研究提出假设：PEF与pH偏移的组合可以达到协同改性的效果，实现对SPI聚集结构的调控和功能特性的改善，从而解决单一PEF处理效果有限的问题。其中，PEF与pH偏移组合中存在三种不同的处理顺序（先PEF后pH偏移、先pH偏移后PEF、PEF联合pH偏移）可能会对蛋白结构性质产生不同程度的影响，值得深入研究。
因此，本研究通过利用不同PEF和pH偏移的组合方式对SPI进行处理，探究SPI浊度、粒径分布、二三级结构、溶解性、乳化性、起泡性和小分子结合特性等结构和功能性质的变化，并筛选出最佳的组合改性手段，为PEF技术在大豆蛋白开发利用方面的研究提供进一步的理论基础，以期为功能性大豆蛋白产品的应用技术的拓展提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
低温脱脂大豆粕（蛋白质含量45.2%） 山东山松生物制品有限公司；D407410-01-1EA干型透析袋（分子量3500 kDa）、十二烷基硫酸钠（SDS）（纯度98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；叶黄素（HPLC≥90%） 上海源叶科技有限公司。
PEF-SY-500型连续式PEF 广州派虎科技有限公司；RF-6000型荧光光谱 日本岛津公司；UV-1800PC型紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；ChirascanTM-V100圆二色谱仪 英国应用光物理公司；Nano-ZS90纳米粒度仪 英国Malvern公司；T18数显型乳化分散机 德国IKA公司；JW-3021HR型高速离心机 安徽嘉文仪器装备有限公司；SCIENTZ-18N/A冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司；PHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂；A25高速剪切机 上海欧河机械设备有限公司；Zetasizer Ultra纳米粒度与Zeta电位分析仪 马尔文仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 大豆分离蛋白的制备
采用碱溶酸沉法制备SPI[12]。将脱脂豆粕与蒸馏水按1:15的质量比混匀，用1 mol/L NaOH调节pH至8.0后室温下浸提2 h，10000×g离心30 min后取上清液，加入1 mol/L HCl调节pH至4.5，继续10000×g离心15 min得到沉淀，对沉淀水洗后重新分散到蒸馏水中，并调整pH至7.0[13]。将蛋白溶液装入3500 kDa透析袋，进行透析处理48 h，以去除其中的盐离子，得到的蛋白溶液最后进行冷冻干燥得到SPI冻干粉末。采用凯氏定氮法测定蛋白质含量为93.27%（干基计）。
1.2.2 PEF和pH偏移的不同组合处理大豆分离蛋白
将SPI粉末溶解到蒸馏水中，配制成浓度为10 mg/mL的SPI水溶液，调节pH至7，常温下800 r/min搅拌2 h后，4 ℃下静置水合过夜。待样品恢复到室温后，将SPI溶液分为四组，每份400 mL。分别采用三种不同的PEF和pH偏移法的组合形式进行处理，具体如图1所示。
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图 1 PEF和pH偏移不同组合处理SPI示意图Figure 1. Diagram of SPI treated with different combinations of PEF and pH shiftinga. pH偏移：10 mg/mL的SPI水溶液，用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH为11，搅拌1 h后，用1 mol/L HCl回调pH至7并继续搅拌20 min。
b. 先PEF后pH偏移处理：SPI溶液以200 mL/min的流速泵入PEF连续式处理系统中，电场强度设置为10 kV/cm。将经过PEF处理后的SPI溶液用1 mol/L NaOH调节pH至11，搅拌1 h后，用1 mol/L HCl回调pH至7并继续搅拌20 min。
c. 先pH偏移后PEF处理：SPI溶液用1 mol/L NaOH调节pH至11，搅拌1 h后，用1 mol/L HCl回调pH至7并继续搅拌20 min。将经过pH偏移处理后的SPI溶液以200 mL/min的流速泵入PEF连续式处理系统中，电场强度设置为10 kV/cm。
d. PEF联合pH偏移处理：SPI溶液用1 mol/L NaOH调节pH至11，搅拌1 h后，立刻泵入PEF连续式处理系统中，电场强度设置为10 kV/cm，流速200 mL/min，集出口处SPI溶液，用1 mol/L HCl回调pH至7并继续搅拌20 min。
PEF处理均通过外接冷凝水的方式控制溶液温度在25~35 ℃范围内。将经过不同组合处理后的SPI溶液透析48 h，以排除盐离子干扰，冷冻干燥后干燥器内室温保存备用。
1.2.3 蛋白溶液浊度和溶解度测定
将冻干后的各SPI样品复溶，调节pH至7.0，分别取3 mL SPI溶液移入1 cm石英比色皿中，测定600 nm波长处吸光值，以吸光值表示浊度，未经过处理的SPI溶液为对照。
将未处理和经过不同处理方式获得的蛋白质样品（10 mg/mL）在室温下10000×g离心10 min，取上清液并稀释10倍，采用BCA法测定上清液中蛋白质含量[14]，用牛血清白蛋白（BSA）建立标准曲线（y=0.7162x+0.1286，R2=0.998）。蛋白质溶解度用上清液中蛋白质含量与原样中蛋白质含量之比表示。
1.2.4 蛋白溶液粒径分布、平均粒径和ζ-电位测定
SPI样品的粒度分布情况和平均粒径、ζ-电位采用纳米粒度及电位分析仪测定。颗粒折射率和分散剂折射率分别设定为1.460和1.330，测试温度为25 ℃。
1.2.5 圆二色谱分析
采用全自动圆二色谱仪采集SPI样品的圆二色谱。将400 μL SPI溶液（0.25 mg/mL）置于微型石英比色皿中，在氮气环境中以20 nm/min的速度进行扫描，波长范围为190~250 nm，用PBS缓冲液作为背景进行扣除。蛋白质二级结构含量通过CDNN 2.1软件计算得到。
1.2.6 内源荧光分析
采用荧光光谱仪采集SPI样品的内源性荧光光谱。用0.1 mol/L pH7.0的PBS缓冲液将SPI样品溶液稀释至0.5 mg/mL，取3 mL样品置于1 cm石英荧光比色皿中。测定条件设定为：激发波长为295 nm，扫描波长范围为290~500 nm，激发和发射的狭缝宽度分别设置为3 nm和3 nm，扫描速度为600 nm/min。
1.2.7 蛋白表面疏水性测定
参照Kato等[15]的方法对SPI的表面疏水性（PSH）进行测定。将4 mL不同浓度的SPI溶液（0.1、0.3、0.5、0.7和1 mg/mL）与ANS（20 μL，8.0×10−3 mol/L）混合，在暗中反应30 min，然后用荧光分光光度计测定所得溶液的荧光强度。激发和发射波长分别被设定为360 nm和482 nm，激发和发射的狭缝宽度分别设置为3 nm和3 nm。荧光强度与蛋白质浓度的初始斜率定义为PSH值。
1.2.8 乳化性（EAI）和乳化稳定性（ESI）
基于Tan等[16]的方法确定SPI的EAI和ESI。取12 mL SPI溶液（10 mg/mL）和3 mL大豆油混合，在12000 r/min转速下均质2 min。从烧杯底部取3 μL乳液，与3.0 mL 0.1%（m/v）SDS溶液充分混合。用紫外分光光度计在乳液制备后的0 min（A0）和10 min（A10）时测定500 nm处的吸光度。EAI和ESI计算公式如下：
EAI(m2/g)=2×2.303×A0×Dc×(1−∅)×10000 (1) ESI(%)=A10A0×100 (2) 式中，c为蛋白质浓度（0.01 g/mL）；D为稀释因子（1000）；∅为油相体积分数（20%）。
1.2.9 起泡性及起泡稳定性
将未经处理及经过不同条件处理制备的SPI冻干粉溶于蒸馏水中，配制浓度为10 mg/mL的蛋白溶液，并在室温下搅拌2 h以充分水合，然后，蛋白溶液以20000 r/min的速度均质2 min制备泡沫，并迅速转移到50 mL的量筒中。静置2 min的泡沫体积标记为V2，静置30 min的泡沫体积标记为V30。起泡性（FA）和起泡稳定性（FS）根据以下公式计算得到：
FA(%)=V2VS×100 (3) FS(%)=V30V2×100 (4) 式中，Vs为初始液体体积（mL）。
1.2.10 SPI与叶黄素的结合亲和力测定
通过荧光猝灭实验评估SPI和叶黄素之间的结合特性。固定SPI样品的浓度为0.5 mg/mL于荧光池中，再不断滴入叶黄素（10 μL/次，8次），叶黄素的浓度范围为0~3.28×10−5 mol/L，混合均匀并静置5 min，扫描体系的荧光光谱。仪器参数设置为：激发波长为280 nm，波长扫描范围为290~450 nm，激发/发射狭缝宽度为1.5/3.0 nm。得到的荧光数据根据以下公式进一步修正，以消除内部滤光片效应的干扰[17]：
Fc=Fme(A1+A2)/2 (5) 式中，Fc和Fm是校正后和实验所测的荧光强度；A1和A2是叶黄素在激发和发射波长下的吸光度。
将得到的荧光数据带入以下公式，可得到叶黄素与SPI相互作用的结合常数Ka：
log(F0−FF)=logKa+nlog[Lutein] (6) 式中，F0和F分别是存在和不存在叶黄素时SPI的荧光强度；[Lutein]是叶黄素的浓度；Ka和n分别指形成的复合物的结合常数和结合位点的数量。
1.3 数据处理
所有实验平行进行3次，结果以平均值±标准差（SD）表示。组间相关性分析采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，并用Duncan多重比较分析不同处理间的显著性差异（P<0.05）。
2. 结果与分析
2.1 PEF和pH偏移处理对SPI浊度和溶解度的影响
图2a为未处理和经过不同条件处理后的SPI水溶液的直观图。未处理组溶液呈现较为浑浊的半透明状态，溶解度为70.15%（图2c），存在部分不溶的SPI聚集体分散在溶液中。处理后的SPI溶液清澈透明，说明溶液浊度显著降低，溶解度提升，更多不溶的SPI聚集体转换为可溶状态。但通过肉眼观察并不能区分各处理组之间的差异，因此需要通过测定600 nm处的吸光值判断溶液的浊度情况（图2b）。pH偏移处理后SPI的浊度值为0.145，相比于SPI溶液在pH11下的溶液浊度值（0.118）略有升高，这说明回调pH至中性后，部分原本展开的SPI分子重新折叠并聚集。PEF的先后处理使得SPI的浊度值继续降低，但相比单一pH偏移处理并不显著，说明两种方法的先后处理对SPI聚集体的解聚效果有限。而在PEF联合pH偏移处理组中，浊度值则显著降低至0.074（P<0.05），并伴随着溶解度提升至90.23%，SPI的聚集程度相比单一pH偏移处理又得到进一步的改善。
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2.2 PEF和pH偏移处理对SPI粒径分布的影响
图3a为不同条件处理后的SPI颗粒粒径分布曲线。由图可知，所有的曲线都呈现出双峰分布，说明SPI溶液中存在两种尺寸大小的蛋白颗粒[18]。未处理组的大粒径峰可能是形成了较大尺寸的蛋白聚集体，小粒径峰可能是部分蛋白未参与分子间的聚集。经过pH11偏移处理后，大粒径主峰的位置发生了明显朝左侧的移动，并伴随着峰强度的降低和峰宽度的增大，在约40 nm处还出现了一个肩峰，说明溶液中存在更多粒径更小的蛋白聚集体。SPI在pH11的环境下，表现为分子结构的解折叠以及部分亚基的解离，回调至中性后，解离的亚基重新聚集形成小尺寸的聚集体，即在40 nm处的肩峰，解折叠的蛋白分子则重新折叠聚集，在164 nm的最大峰强度下出现主峰。将pH偏移和PEF技术组合处理后，观察到主峰的强度降低并伴随着朝右侧更大粒径处的偏移，40 nm处的肩峰则不断增大并形成更为对称的粒径峰型，其中PEF联合pH偏移组变化最为明显，小粒径峰强度甚至更高。在pH11条件下引入PEF作用后，可能会有更多的亚基发生解离，随着pH回调，亚基重聚会形成更多的小尺寸聚集体，因此小粒径峰强度增大。而对于解离后的SPI分子，电场的极化作用可能会使得pH11下的蛋白结构进一步展开和更多带负电氨基酸的暴露，即便回调至中性，SPI分子会因分子间较强的静电排斥力阻碍其恢复到最初的构象，此时蛋白结构趋向于部分展开，导致水化半径增大，使得主峰的粒径朝右侧更大尺寸的偏移[19]。通过测定平均粒径值大小，见图3b，所有处理组的平均粒径差异并不显著，PEF联合pH偏移处理组最小，为63.5 nm，相比于原始SPI的平均粒径（180.4 nm）降低了64.8%。
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图 3 未处理和不同条件处理后SPI的粒径分布（a）和平均粒径（b）Figure 3. Particle size distribution (a) and average particle size (b) of untreated and treated SPI2.3 PEF和pH偏移处理对SPI表面电位的影响
对经过不同PEF和pH偏移组合处理后SPI的ζ-电位进行测定，结果如图4所示。经过pH偏移后，SPI的绝对ζ-电位值为41.4 mV，相比未处理组有显著提高（P<0.05），引入PEF处理后，数值进一步增大，其中联合处理下ζ-电位绝对值最大，为44.4 mV。PEF和pH偏移的联合处理引起了SPI结构的破坏，表现为部分解折叠状态，使更多原本在分子内部的电荷积聚在外部侧链上。蛋白分子间的静电排斥力更大，越发不容易发生聚集，溶液胶体稳定性得到提升[20]。结合上述实验结果，可以得出结论：PEF联合pH偏移的处理是一种有效的降低SPI分子间聚集作用的改性方法，且效果要比单一pH偏移和两者先后处理更好。
2.4 PEF和pH偏移处理对SPI二级、三级结构的影响
利用圆二色谱和荧光光谱等光谱学手段对处理前后SPI的结构变化进行表征。图5可知，pH偏移处理后，SPI在195 nm处代表α-螺旋的正吸收峰强度降低并消失，伴随着205~220 nm处负槽区域强度的增大和蓝移，这些变化通常反映了稳定蛋白二级结构的α-螺旋和β-折叠的丢失以及无规结构的出现[21]。采用杨氏方程计算后，相比于未处理组，pH偏移后SPI的α-螺旋和β-折叠含量显著降低（P<0.05），β-转角含量不变，无规卷曲含量显著升高（P<0.05），这与光谱上的变化结果相一致。在pH偏移后的蛋清蛋白以及紫苏分离蛋白中都有类似的二级结构变化[22]。蛋白质的折叠结构在酸碱处理（解折叠）后回调至中性的过程中通常难以完全恢复，呈现出部分展开的状态，结构稳定性也有所降低。
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图 5 未处理和不同条件处理后SPI的圆二色谱图（a）及二级结构含量分布图（b）Figure 5. CD spectra (a) and secondary structure content distribution (b) of untreated and treated SPI引入PEF处理后，无论是先PEF还是pH偏移，两种方法的组合处理并没有带来二级结构的显著变化。在pH11的条件下，电导率的增加提高了PEF的输出能量，更强的极化作用诱导原本已展开的SPI进一步的展开，最终的结构维持在较为充分的解折叠状态，再回调至中性时，大部分SPI在重新折叠的过程中，分子间较强的静电排斥力阻碍了其恢复到原始构象，结构呈现部分折叠的状态，处于变性和未变性的中间态，即“熔球态”。因此使得PEF联合pH偏移后的SPI二级结构中α-螺旋和β-折叠含量继续降低，无规卷曲含量达到40.4%，较未处理组表现出更大程度的构象改变。
蛋白质内源荧光的强度和峰位置对蛋白质的三级结构的变化具有较高的敏感性[23]。不同条件处理后的SPI内源荧光光谱如图6所示，随着pH偏移的处理，SPI的内源荧光强度发生了明显的升高，并伴随着最大荧光峰位置的红移（330 nm到332 nm），说明SPI发生三级结构的展开，位于疏水侧链的色氨酸残基外露，并迁移至更亲水的环境。PEF组合处理使得荧光强度进一步提高，相比圆二色谱的变化更为明显，这与PEF对SPI三级结构相比二级结构影响程度更大有关，即电场的拉拽作用使得侧链延伸，从而暴露更多的发色基团。联合处理组荧光强度最大，并发生更明显的红移至334 nm，这可能是联合作用对SPI内部二级结构的修饰，蛋白分子的展开程度更大，更多位于分子内部的色氨酸残基暴露至溶剂中。
2.5 PEF和pH偏移处理对SPI表面疏水性的影响
蛋白质的表面疏水性和蛋白质分子的展开程度通常成正比关系[24]。利用ANS探针结合荧光法测定疏水性后，发现处理组都表现出更强的表面疏水性，其中联合处理后的PSH数值达到410.3，是未处理组的3.39倍（图7）。通常来说，具有高疏水性的蛋白质更容易突破屏障并吸附到界面上，因此具有更好的界面活性，从而实现对油水界面、空气水界面的稳定[25]。因此经过处理后的SPI可能具有更优的乳化性和起泡性能，将在后续进一步展开研究。
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图 7 未处理和不同条件处理后SPI的表面疏水性Figure 7. Surface hydrophobicity of untreated and treated SPI2.6 PEF和pH偏移处理对SPI乳化性的影响
SPI具有一定的乳化性，可通过降低油水界面张力和在油滴表面形成粘弹性界面膜来稳定乳液，但天然SPI相对致密的聚集态结构限制了其在乳液界面的充分展开和吸附，在油水界面会产生较强的空间位阻，使得乳化性能不佳[26]。天然SPI制备的乳液静置30 min后，观察到明显的分层现象（图8c）。因此通常需要对SPI进行适当改性，提高其界面活性。如图8a所示，经过各种条件的改性处理后，SPI表现出更高的乳化性（EAI），其中PEF联合pH偏移处理的效果最好，相比未处理组提高了1.19倍，另外，改性处理后形成的SPI乳液还具有更好的稳定性，乳化稳定性（ESI）从45.22%提高至74.54%（图8b），静置30 min后乳液也较为稳定，未出现分层现象。早期的研究指出，蛋白溶解性、表面疏水性以及构象灵活性的提高都有利于其乳化性能的提升[27]，在联合处理的SPI中这几种性质都是最优的。因此，PEF联合pH偏移处理是一种有效的提升SPI乳化性的改性方法。
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图 8 未处理和不同条件处理后SPI制备的乳液的EAI（a）和ESI（b）及静置30 min后的外观（c）注：（c）图中1和2分别为未处理和PEF联合pH偏移处理后SPI形成的乳液。Figure 8. EAI (a), ESI (b), and appearance after standing for 30 min (c) of untreated and treated SPI prepared emulsions2.7 PEF和pH偏移处理对SPI起泡性的影响
除了乳化性，起泡性也是SPI重要的功能特性之一[28]。SPI通过形成绵密细微的气泡来赋予食品良好的质构和感官特性。如图9c所示，经过高速剪切机打发后，天然SPI形成了一定量的泡沫，而经过PEF联合pH偏移处理后，生成的泡沫量更多。通过计算起泡活性（FA）也发现联合处理的FA值要显著大于未处理组（P<0.05），相比于天然SPI提高了59.03%（图9a）。联合处理的SPI由于具有更高的表面疏水性和更灵活的结构（无规卷曲含量更高），因此蛋白质分子转移至气液界面的速率更快、能更高效地降低界面张力，从而有利于气泡的形成[29]。但是联合处理并未提高泡沫的稳定性，30 min后大量气泡消散，泡沫稳定性（FS）也未见显著性差异（图9b）。在其他物理改性处理中，也观察到类似的现象，经过超声改性的卵清蛋白和pH偏移改性的鹰嘴豆蛋白在泡沫稳定性的提升上也不明显[30]。这可能是因为改性导致SPI的更多疏水基团和区域暴露在表面，随着时间的延长，大部分从气液界面脱落的SPI分子可能会通过疏水相互作用聚集，蛋白质的界面活性降低，泡沫难以稳定[31]。
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图 9 未处理和不同条件处理后SPI的FA（a）和FS（b）以及SPI样品制备的泡沫转移到玻璃量筒后2 min和30 min时泡沫的外观（c）注：（c）图中1和2分别为未处理和PEF联合pH偏移处理后的SPI制备的泡沫。Figure 9. FA (a) and FS (b) of SPI after treatment with different combinations of PEF and pH shifting and appearance of the foam prepared from SPI samples at 2 min and 30 min after transfer to glass cylinders (c)2.8 PEF和pH偏移处理对SPI小分子结合能力的影响
研究SPI与小分子活性物质的结合能力，对于开发大豆蛋白生物活性物质输送载体，提高生物活性物质的溶解性、稳定性和生物效价等方面具有重要意义[32]。叶黄素为一种较为典型的活性小分子，采用荧光猝灭实验探究SPI与叶黄素的结合能力[33]。随着叶黄素的加入，SPI的内源荧光强度呈现出规律的降低（图10），叶黄素不断结合到SPI上，而当浓度继续增大时，SPI的荧光的猝灭幅度逐渐减小，说明叶黄素在SPI上的结合趋向于饱和。经过不同条件处理后的SPI与叶黄素的结合，能够从荧光图谱上观察到明显的区别，荧光强度都呈现出更大幅度的下降（图10）。通过对猝灭效率的计算，发现在相同的叶黄素浓度下（3.28×10−5 mol/L），未处理组和PEF联合pH偏移组的猝灭效率分别为80.94%和89.50%。联合处理表现出更明显的猝灭效果。
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图 10 未处理和不同条件处理后SPI与叶黄素的荧光猝灭图（a~e）以及SPI与叶黄素的结合常数（f）Figure 10. Fluorescence quenching plots of SPI with lutein for untreated and treated groups (a~e) and binding constant of SPI with lutein (f)结合公式6，计算得到叶黄素与SPI相互作用的结合常数Ka（图10f）。未处理的SPI与叶黄素的Ka为4.54×104 mol/L，与Yang等[32]的研究数量级相同（1.37×104 mol/L），但要明显弱于乳清分离蛋白（WPI）与叶黄素的Ka值（3.5×105 mol/L），这可能是因为相比于WPI，SPI分子间的聚集作用更强，使得大部分的可用于叶黄素结合的疏水区域隐藏在分子内部[34−35]。而经过不同条件的处理后，SPI趋向于解折叠状态，从而使得原本隐藏的疏水区域暴露，为叶黄素提供了更多的结合位点，Ka值也随之升高。其中PEF联合pH偏移处理效果最为明显，SPI与叶黄素的Ka值达到1.57×105 mol/L，相比于未处理组提高了245.81%。本课题组前期研究结果发现经过PEF处理后的牛血清白蛋白（BSA）具有更强的结合姜黄素的能力，同时由于结合亲和力的提高，姜黄素在BSA上的负载量更多，并能显著增强姜黄素的水溶性和对光、热的稳定性[36]。因此，推测利用PEF联合pH偏移处理可能也是一种构建高负载量和高稳定性的蛋白复合物载药体系的有效方法，将在后续进行进一步系统的研究。
2.9 不同处理方法与SPI聚集结构和功能特性之间的关系
基于上述实验结果，对PEF和pH偏移的不同组合处理后的SPI功能特性改善效果进行排序，顺序如下：PEF联合pH偏移处理>先pH偏移后PEF处理>先PEF后pH偏移处理。对SPI功能特性不同的改善效果与各种处理方式对SPI聚集结构的影响程度有关。如图11所示，对于先PEF后pH偏移处理，虽然优先采取的10 kV/cm的PEF处理诱导了SPI侧链的延伸和三级结构的展开，但由于PEF作用下的结构可逆性，撤出电场后，SPI结构会趋向于恢复到原始的构象，结构的变化并未影响到随后的pH偏移处理，最终蛋白的二级结构与单一的pH偏移相类似[37]。SPI的功能特性在pH偏移处理基础上并未发生明显改变。对于先pH偏移后PEF处理，SPI经过优先的pH偏移处理后，结构发生了一定的解折叠，稳定性降低，这可能更有利于随后的PEF作用，此外，酸碱中和反应会使得溶液中产生一定的盐离子，溶液电导率升高至748 μs/cm，PEF和电导率的协同作用引起了SPI结构进一步的解折叠和无序化，从而暴露更多的亲疏水基团和带负电的氨基酸，SPI分子间的聚集作用得到削弱，功能特性得以改善。对于PEF联合pH偏移处理，在pH11下引入10 kV/cm的PEF作用后，更高溶液电导率下（1215 μs/cm）带来的能量输入引起SPI空间结构的继续展开（伸展态），并伴随更多呈无序状的亚基的解离，回调至中性后，解离的亚基和处于伸展态的SPI分子又重新缔合和部分折叠，形成内部结构松散、外部侧链延伸的，处于变性和未变性中间态的“熔球态”蛋白。SPI分子间的聚集作用也因为更多带负电氨基酸迁移至外部侧链上，发生静电排斥作用得以削弱。处于熔球态的SPI具有更高的表面活性及亲油亲水平衡性（亲疏水基团分布在蛋白质表面），功能特性得以大幅度的增强。SPI经过PEF联合pH偏移处理后，相较于未处理组，其乳化性（EAI）、乳化稳定性（ESI）、起泡活性（FA）以及与叶黄素的结合常数分别提高了119.24%、39.33%、59.03%和245.81%。
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图 11 PEF和pH偏移不同组合处理对SPI聚集结构影响示意图Figure 11. Schematic representation of the effect of different combinations of PEF and pH shifting treatments on the structure of SPI aggregates3. 结论
脉冲电场和pH偏移的三种组合方式中，PEF联合pH偏移处理对SPI的结构和功能特性的影响最为显著。该法处理的SPI溶解度从70.15%提升至90.23%，并表现出溶液浊度（从0.320到0.074）和颗粒粒径（从180.4 nm到63.5 nm）的降低。微观结构分析表明，联合处理组SPI的结构整体呈现松散和无序状，由原球状堆积态转换为“熔球态”。处于熔球态的SPI具有更好的表面活性，乳化性能（从28.79 m2/g到63.33 m2/g）和起泡性能（132.3%到210.4%）得以大幅度的增强，同时由于疏水区域的扩展，SPI与叶黄素的结合常数也从原本0.454×105 mol/L提高至1.57×105 mol/L。本研究采用的方法处理条件温和，有助于在不损害蛋白质的感官特性和生物活性的情况下改善SPI功能特性，符合食品“绿色加工”和“最小加工”的加工理念，有望成为未来植物蛋白改性的主流技术手段。后续研究需考虑更多的PEF参数，包括脉冲数、频率和脉宽对SPI的影响，以期实现对SPI聚集结构的精准调控和功能性大豆蛋白产品的定向开发。本研究为脉冲电场和pH偏移组合处理对SPI结构和理化性质产生的影响提供了部分参考，为脉冲电场技术在植物蛋白改性中的合理应用提供了一定理论依据。
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图 1 PEF和pH偏移不同组合处理SPI示意图
Figure 1. Diagram of SPI treated with different combinations of PEF and pH shifting
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图 3 未处理和不同条件处理后SPI的粒径分布（a）和平均粒径（b）
Figure 3. Particle size distribution (a) and average particle size (b) of untreated and treated SPI
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图 5 未处理和不同条件处理后SPI的圆二色谱图（a）及二级结构含量分布图（b）
Figure 5. CD spectra (a) and secondary structure content distribution (b) of untreated and treated SPI
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图 7 未处理和不同条件处理后SPI的表面疏水性
Figure 7. Surface hydrophobicity of untreated and treated SPI
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图 8 未处理和不同条件处理后SPI制备的乳液的EAI（a）和ESI（b）及静置30 min后的外观（c）
注：（c）图中1和2分别为未处理和PEF联合pH偏移处理后SPI形成的乳液。
Figure 8. EAI (a), ESI (b), and appearance after standing for 30 min (c) of untreated and treated SPI prepared emulsions
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图 9 未处理和不同条件处理后SPI的FA（a）和FS（b）以及SPI样品制备的泡沫转移到玻璃量筒后2 min和30 min时泡沫的外观（c）
注：（c）图中1和2分别为未处理和PEF联合pH偏移处理后的SPI制备的泡沫。
Figure 9. FA (a) and FS (b) of SPI after treatment with different combinations of PEF and pH shifting and appearance of the foam prepared from SPI samples at 2 min and 30 min after transfer to glass cylinders (c)
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图 10 未处理和不同条件处理后SPI与叶黄素的荧光猝灭图（a~e）以及SPI与叶黄素的结合常数（f）
Figure 10. Fluorescence quenching plots of SPI with lutein for untreated and treated groups (a~e) and binding constant of SPI with lutein (f)
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