Analysis of Bacterial Communities and Prediction of Functions and Phenotypes in the Preparation of High Temperature Daqu Using Different Methods
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摘要: 为比较分析人工踩曲和机械压曲制备高温大曲细菌菌群结构的异同，本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术解析了2 种成曲方式制备高温大曲样品的细菌菌群组成，并预测了细菌的基因功能及表型。通过α多样性发现，人工踩曲和机械压曲制备的高温大曲样品中细菌的多样性和丰富度均无显著差异（P>0.05）；通过β多样性发现，2 种成曲方式制备高温大曲样品的细菌菌群之间存在非常显著的结构差异（P<0.01），且机械压曲制备的高温大曲组间差异较小；通过细菌菌群结构解析发现，较之人工踩曲，机械压曲制备高温大曲样品中Lentibacillus的含量显著偏多（P<0.001），而Weissella、Brevibacterium和Pediococcus的含量相对偏少（P>0.05）；通过线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）发现，放热线菌科（Thermoactinomycetaceae）是人工踩曲制备高温大曲的生物标志物，芽孢杆菌科（Bacillaceae）是机械压曲制备高温大曲的生物标志物；通过基因功能预测发现，相较于人工踩曲，机械压曲制备的高温大曲中细菌类群在信号传导机制上显著偏高，在细胞内运输、分泌和囊泡运输上显著偏低（P<0.05）；通过表型预测发现，人工踩曲制备的高温大曲中细菌的氧化胁迫耐受的能力更强（P<0.05），而机械压曲制备的高温大曲中革兰氏阳性菌的含量更丰富（P<0.05）。由此可见，人工踩曲和机械压曲制备高温大曲的细菌菌群结构具有显著差异，并进一步影响其细菌的功能和表型，该研究可为推进酱香型白酒制曲工艺的发展提供基础理论和学科依据。Abstract: To compare and analyze the similarities and differences in the bacterial community structure of high temperature Daqu prepared by artificial starter-making and mechanical starter-making, this study used Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology to analyze the bacterial community composition of two types of high temperature Daqu samples, and predicted the genetic function and phenotype of the bacteria. Through α-diversity found that there was no significant difference in the diversity and richness of bacteria between artificial and mechanical starter-making samples (P>0.05). The β-diversity showed that there were significant structural differences between the two types of high temperature Daqu samples (P<0.01), and the difference of the bacterial flora of the mechanical starter-making samples was relatively smaller. The analysis of bacterial community structure showed that compared with artificial starter-making samples, the content of Lentibacillus from mechanical starter-making samples was significantly higher (P<0.001), while the content of Weissella, Brevibacterium and Pediococcus was relatively lower (P>0.05). Through LEfSe analysis, it was found that Thermoactinomycetaceae was the biomarker of foot bending, and Bacillaceae was the biomarker of mechanism bending. Through gene function prediction, it was found that compared with artificial starter-making, the signal transduction mechanism of the bacteria in the high-temperature Daqu prepared by mechanical starter-making was significantly higher, and the intracellular transport, secretion and vesicle transport were significantly lower (P<0.05). Through phenotype prediction, it was found that the content of gram-positive bacteria in the mechanical starter-making samples was more abundant (P<0.05), while the ability of oxidative stress tolerance in the artificial starter-making samples was stronger (P<0.05). It could be seen that there were significant differences in the bacterial flora structure between the artificial and mechanical starter-making Daqu, which further affected the function and phenotype of the bacteria. This study can provide basic theory and disciplinary basis for promoting the development of Maotai-flavor Baijiu starter-making samples technology.
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“12987工艺”作为酱香型白酒独特且复杂的酿造技术，在长达一年的生产周期内，制曲、投料、蒸煮和取酒等工艺对于人工的需求量较大且耗时较长[1]。此外，传统白酒的制作对于工人的经验要求较高，但由于不同酿酒师傅的判断存在差异，导致不同批次生产出白酒品质的不一致[2]。目前，越来越多的企业在积极推动酿酒的机械化发展。在白酒的酿造中，作为糖化发酵剂的大曲是决定白酒风味品质好坏的关键点，因此对于大曲的研究显得尤为重要[3]。高温大曲的制作工艺主要包括小麦加水研磨、成型和发酵三个阶段，其中成型阶段是制曲的关键步骤，可有效保存微生物及代谢产物[4]。在传统工艺上，成型阶段为人工踩曲，主要通过身材适中的踩曲工人在反复脚踩中根据经验控制曲块的质量，使曲块达到外紧内松的效果[5]。然而，人工踩曲的耗时较长且曲块的品质难以控制，目前已有部分制曲企业开始使用机械压曲的方式生产。有研究表明，与人工踩曲相比，机械压曲在减少劳动力和生产时间的同时有利于大曲质量的稳定[6]，但不同制曲方式对于大曲中微生物生长繁殖和代谢环境所产生的影响还有待研究。
采用三代测序技术，唐佳代等[7]比较了不同压曲工艺对高温大曲中微生物群落结构的影响，发现相较于人工踩曲，机械压曲制备的高温大曲中细菌和真菌的多样性和丰富度均显著偏高。通过高通量测序技术，ZUO等[4]发现人工踩曲和机械压曲制备的高温大曲中优势细菌属组成无明显差异，均为根瘤菌属（Rhizobium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、魏斯氏菌属（Weissella）、乳杆菌属（Lactobacillus）和糖多孢菌属（Saccharopolyspora）等。细菌是酱香型白酒酿造过程中重要的产香功能微生物，能够分泌代谢蛋白质及淀粉的水解酶类，对酒体的风味质量有着极大贡献并且起着关键调控作用[8]。由此可见，对比分析人工踩曲和机械压曲这2 种成曲方式制备高温大曲中细菌菌群结构的异同可丰富对大曲生产的了解，为后续高温大曲的制作提供部分理论依据。高通量测序技术使用16S rDNA测序确定细菌的多样性与分类，具有准确度高、测序通量高和结果稳定等优点[9]，现有大量研究人员使用该技术解析大曲的细菌菌群结构[10]。故而，使用该技术可达到解析2 种成曲方式制备高温大曲中细菌菌群组成的目的。
本研究从山东省梁山县某制曲公司采集了人工踩曲和机械压曲制作的高温大曲各29块，基于Illumina MiSeq高通量测序技术对其细菌类群进行了解析，并进一步预测了样品中细菌的基因功能和表型，通过比对分析2 种成曲方式制备高温大曲细菌群落结构的差异，以期为高温大曲制曲工艺的发展提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
QIAGEN DNeasy mericon Food Kit基因组提取试剂盒 德国QIAGEN公司；正/反向引物338F/806R（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 武汉天一辉远生物科技有限公司；DNA聚合酶、dNTPs mix、r Taq酶、DL 2000 Marker和10×PCR缓冲液 宝生物工程大连有限公司；PCR产物清洁试剂盒 艾思进生物技术（杭州）公司；Illumina MiSeq测序配套试剂 美国Illumina公司。
LD-Y300A高速万能粉碎机 上海顶帅电器有限公司；Veriti 96孔梯度聚合酶链式反应仪 美国ABI公司；164-5050基础电泳仪 美国Bio-rad公司；UVPCDS8000凝胶成像分析系统 美国Protein Simple公司；MiSeq PE300高通量测序平台 美国Illumina公司；R930机架式服务器 美国DELL公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品收集
高温大曲样品采集于山东省梁山县某制曲公司。所有样品均以小麦为主要原料，润粮粉碎后曲模成型，入仓堆积发酵40 d以上，随后置于库房中储存。该厂高温大曲制作中成型方式分为人工踩曲和机械压曲2 种（除成型方式不同外，其余制曲条件均相同），曲模大小为37 cm×18 cm×7 cm，制曲顶温温度在65 ℃左右，所有样品在库房中的储存时间均大于3 个月。本研究采集同一时间生产的人工踩曲和机械压曲2 种方式制备的高温大曲样品各29块，分别记为F1~F29（人工踩曲）和M1~M29（机械压曲）。将整块大曲粉碎后分装于50 mL离心管中，置于−20 ℃冰箱备用。
1.2.2 宏基因组DNA的提取、PCR扩增和MiSeq高通量测序
使用QIAGEN DNeasymericon Food Kit试剂盒提取了人工踩曲和机械压曲制得高温大曲样品的宏基因组DNA，参考CAI等[11]的方法进行了16S rRNA V3~V4区的PCR扩增，将经过琼脂糖凝胶电泳检测的扩增产物寄往上海美吉生物医药科技有限公司进行了Illumina MiSeq高通量测序。测序的具体流程主要分为文库准备和测序2 部分。其中，文库准备是将提取的DNA进行片段化处理后在待测片段的两端连接测序接头随后进行再扩增，测序则是基于MiSeq PE300平台的边合成边测序技术完成的[12]。
1.2.3 生物信息学分析
参照郭壮等[13]的方法对测序序列进行了质控，通过QIIME（v1.9.1）平台[14]对序列进行对齐[15]，使用UCLUST方法构建了分类操作单元（operational taxonomic units，OTU）[16]，比对OTU序列以明确微生物的分类学地位[17]，通过计算比较了2 种成曲方式制备高温大曲中细菌类群的α-多样性，并基于非加权UniFrac距离的主坐标（principal coordinates analysis，PCoA）分析和相似性（analysis of similarities，ANOSIM）分析对比了2 种成曲方式制备高温大曲中细菌类群的β多样性，使用线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）对2种成曲方式制备高温大曲的生物标志物进行了甄别，最后参照蛋白质直系同源簇数据库（clusters of orthologous groups of proteins，COGs）[18]并使用PICRUSt软件注释了细菌的潜在基因功能[19]，同时通过BugBase网站（https://bugbase.cs.umn.edu/）预测了2 种成曲方式制备高温大曲的细菌表型结果[20]。
1.3 数据处理
使用R（v4.1.2）软件绘制α-多样性的小提琴图、β-多样性的PCoA分析图和ANOSIM分析图，使用Origin 2018软件绘制柱状图和箱型图，使用Galaxy在线网站（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）绘制LEfSe图，使用STAMP（v2.1.3）软件绘制功能基因的差异分析图，使用Past3软件中的Mann-Whitney检验对2 种成曲方式制备高温大曲样品的菌群结构进行了显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲的细菌α-多样性分析
本研究基于Illumina MiSeq测序技术对2 种成曲方式制备高温大曲的细菌菌群结构进行了解析，58 个样品共产生2518382条序列，经质控后共得到2517229条高质量序列。本研究对2 种成曲方式制备高温大曲中细菌菌群的α-多样性进行了比较分析，结果如图1所示。
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由图1可知，人工踩曲制备高温大曲样品的发现物种数和香农指数虽均略高于机械压曲，但结合Mann-Whitney检验发现差异均不显著（P>0.05）。由此可见，基于α-多样性发现2种成曲方式制备高温大曲样品所蕴含细菌菌群的丰富度和多样性均无显著性差异（P>0.05）。
2.2 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲的细菌β-多样性分析
本研究进一步基于非加权的PCoA对2 种成曲方式制备高温大曲的细菌类群进行了β-多样性解析，结果如图2所示。
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图 2 基于非加权UniFrac距离的PCoA分析（A）和ANOSIM分析（B）Figure 2. PCoA analysis (A) and ANOSIM analysis (B) based on unweighted UniFrac distance由图2A可知，2 种成曲方式制备的样品在坐标系中分布存在较为明显的分离趋势，其中人工踩曲制备的样品主要分布在三、四象限，而机械压曲制备的样品主要分布在一、二象限，这表明人工踩曲和机械压曲2 种成曲方式制备高温大曲的细菌菌群组间差异较大。值得一提的是，29 个人工踩曲制备高温大曲样品的分布较为分散，表明其细菌菌群结构的相似性较低，而29 个机械压曲制备高温大曲样品的分布较为聚集，表明其细菌菌群结构的相似性较高。这证明了较之人工踩曲，机械压曲制得的高温大曲中细菌菌群结构的稳定性相对更高。由图2B可知，ANOSIM分析中R值为0.171大于0，表明人工踩曲和机械压曲样品中细菌菌群的组间差异大于它们的组内差异。其中，P值为0.001小于0.01，表明组间和组内差异均具有统计学意义，且人工踩曲和机械压曲样品的细菌菌群之间存在非常显著的结构差异（P<0.01）。由此可见，基于β多样性分析证明了制曲方式的不同对高温大曲中细菌的菌群结构具有较大影响，且机械压曲制备的高温大曲样品之间细菌菌群结构的相似性较高。
2.3 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲的细菌菌群含量分析
本研究挑出2 种成曲方式制备高温大曲样品中相对含量大于1.0%的细菌门和属绘制了柱状图，如图3所示。
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图 3 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中相对含量大于1.0%的细菌门（A）和属（B）Figure 3. Bacteria phylum (A) and genus (B) with a relative content greater than 1.0% in artificial and mechanical starter-making high-temperature Daqu由图3A可知，人工踩曲制备高温大曲中细菌门主要由厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）组成，相对含量分别为75.19%、19.50%和4.25%。机械压曲制备高温大曲中细菌门亦主要由Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria组成，相对含量分别为67.44%、28.06%和2.23%。但通过Mann-Whitney检验发现，2 种成曲方式制备高温大曲样品在上述细菌门中相对含量的差异均不显著（P>0.05）。由图3B可知，人工踩曲制备高温大曲中含量较高的细菌属为隶属于Firmicutes的克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）和片球菌属（Pediococcus），相对含量分别为37.15%、14.34%、8.81%、6.23%、2.84%和1.11%，以及隶属于Actinobacteria的糖多孢菌属（Saccharopolyspora）和短杆菌属（Brevibacterium），相对含量分别为16.57%和1.51%。机械压曲制备高温大曲中含量较高的细菌属为隶属于Firmicutes的Kroppenstedtia、慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）、Bacillus、Staphylococcus和Thermoactinomyces，相对含量分别为25.91%、13.35%、11.39%、6.61%和3.54%，以及隶属于Actinobacteria的Saccharopolyspora，其相对含量为25.04%。通过对比发现，相较于人工踩曲，机械压曲制备高温大曲样品中Lentibacillus的含量显著偏多（P<0.001），而Weissella、Brevibacterium和Pediococcus的含量相对偏少（P>0.05），其相对含量仅为0.30%、0.26%和0.20%。王宇良等[21]采用MiSeq测序技术从广东豉香型白酒小曲中亦发现Weissella和Pediococcus在机械压曲制得高温大曲样品中的含量明显低于传统制曲，究其原因可能是由于机械压曲时采用大型鼓风机控湿，鼓风机将大量空气吹入使得散曲能够充分与环境中的氧气接触，而Weissella和Pediococcus分别是厌氧和兼性厌氧菌，因此在机械压曲样品中受到抑制，由此亦可推断这可能是引起本研究中Weissella和Pediococcus在人工踩曲制备的高温大曲样品中含量更高的一个重要原因。WAUTERS等[22]的研究表明Brevibacterium可从人体中分离鉴定出，因此其在人工踩曲制备的高温大曲样品中含量相对更多，可能是源于人体携带进入大曲。本研究结果与之类似，基于PacBio SMRT三代测序技术，谢丹等[23]发现贵州习酒的成品人工曲和机械曲中均以Kroppenstedtia（76.52%、60.25%）为主要菌属，其次是Lentibacillus（6.19%、35%）。Lentibacillus虽然是具有活跃氨基酸代谢的优势降解菌，可以分泌多种利于白酒风味品质形成的蛋白酶[24]，但其在本研究的人工踩曲样品中含量亦相对较少，仅为0.06%。由此可见，高温大曲成曲方式对其细菌菌群具有较大的影响。
为了揭示2 种方式制备高温大曲在细菌菌群结构上的差异，本研究进一步使用LEfSe对两者中具有显著差异的细菌菌群进行了比较分析，结果如图4所示。
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图 4 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中细菌类群的LEfSe分析注：A为进化分支图；B为LDA分布直方图。Figure 4. LEfSe analysis of bacterial groups in artificial and mechanical starter-making high-temperature Daqu由图4可知，当LDA值大于3.5时，共检测到5个分类单元在2 种成曲方式制备高温大曲样品中存在显著差异（P<0.05）。由图4A可知，热放线菌科（Thermoactinomycetaceae）是在人工踩曲制备高温大曲样品中起重要作用的优势细菌（P<0.05），芽胞杆菌科（Bacillaceae）、慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）、梭菌纲（Clostridia）和梭菌目（Clostridiales）是在机械压曲制备高温大曲样品中起重要作用的优势细菌（P<0.05）。由图4B可知，柱状图的柱长代表差异物种的影响值大小，人工踩曲样品中Thermoactinomycetaceae的LDA值最高，而机械压曲样品中Bacillaceae的LDA值最高，可见Thermoactinomycetaceae和Bacillaceae分别是2 种成曲方式制备高温大曲的生物标志物。
本研究进一步基于OTU水平解析了2 种成曲方式制备高温大曲的细菌类群，通过剔除嵌合体OTU后，发现人工踩曲制备的高温大曲中共存在27364个OTU，其中相对含量大于1.0%的OTU有12个，而机械压曲制备的高温大曲中共存在22111个OTU，其中相对含量大于1.0%的OTU有7个。谢丹等[23]研究发现机械制曲和人工曲在发酵过程中优势细菌菌群组成之间存在差异，但伴随着发酵的进行，2 种成品曲中优势细菌的菌群结构趋于相同。因此，本研究在解析了2 种成曲方式制备高温大曲中细菌菌群差异的基础上，进一步对其菌群的相似性进行了分析，挑取了在所有样品中均存在的OTU绘制箱型图，如图5所示。
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图 5 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中共有OTU的箱型图注：A为OTU30618；B为OTU37484；C为OTU58918。Figure 5. Box type diagram of OTU shared by artificial and mechanical starter-making high-temperature Daqu由图5可知，在58个高温大曲样品中均存在的OTU仅有3 个，分别为隶属于Saccharopolyspora的OTU30618、隶属于Thermoactinomyces的OTU37484和隶属于Kroppenstedtia的OTU58918，其在人工踩曲制备高温大曲中相对含量分别为10.58%、17.94%和8.86%，在机械压曲制备高温大曲中相对含量分别为17.78%、20.87%和2.12%。但基于Mann-Whitney检验发现，这3 个共有OTU的相对含量在2 种成曲方式制备高温大曲样品中均无显著差异（P>0.05）。由此可以推测Saccharopolyspora、Thermoactinomyces和Kroppenstedtia在所有样品中均存在的原因与成曲方式的关系不大，其可能主要来源于制曲的原料或环境等方面。ZHANG等[25]的研究表明高温大曲的原料小麦上附着的Saccharopolyspora和Kroppenstedtia等细菌群落参与了大曲微生物群的演替，并且进一步导致了成熟大曲内部和外部群落结构的相似与稳定。Saccharopolyspora是酱香型大曲的优势属，可产生耐热的α-淀粉酶，将淀粉水解为葡萄糖和麦芽糖等物质[26]，Kroppenstedtia可以利用多种碳源和氮源，合成己酸乙酯、吡嗪和乙酸等重要的风味成分[27]。而Thermoactinomyces在高温大曲生产的高温环境（60~70 ℃）中生长具有一定的优势，其不仅具有分泌淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等的能力，并且能够产生具有酱香的吡嗪类物质和其他挥发性化合物[5]。由此可见，虽然2 种成曲方式制备高温大曲的细菌菌群组成存在较大差异，但它们共有的Saccharopolyspora、Thermoactinomyces和Kroppenstedtia对于大曲品质的形成可能是至关重要的。
2.4 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲细菌菌群的功能及表型预测
在比较分析了2 种成曲方式制备高温大曲细菌菌群的异同后，本研究进一步对其基因功能进行了预测，发现所有序列共注释到4302个COG，隶属于23个功能大类，绘制功能基因在2 种成曲方式制备高温大曲样品中的差异图，如图6所示。
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图 6 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中功能基因的差异分析图注：T为信号传导机制；U为细胞内运输、分泌和囊泡运输；L为复制、重组和修复；J为转录、核糖体结构和生物发生；N为细胞运动；Z为细胞骨架；O为翻译后修饰、蛋白质转换、伴随蛋白；H为辅酶转运和代谢；K为转录；R为一般功能预测；F为核苷酸运输和代谢；Q为次生代谢物的生物合成、运输和分解代谢；A为RNA处理和修饰；B为染色质结构和动力学；M为细胞壁/膜/包膜生物发生；E为氨基酸运输和代谢；G为碳水化合物运输和代谢；D为细胞周期控制、分裂和染色体分配；I为脂质转运与代谢；C为能量生产和转换；P为无机离子专业和代谢；S为未知功能；V为防御机制；*表示差异显著（P<0.05），图7同。Figure 6. Difference analysis of functional genes in the high-temperature Daqu of artificial and mechanical starter-making由图6可知，较之人工踩曲，机械压曲制备的高温大曲细菌类群在信号传导机制上显著偏高（P<0.05），在细胞内运输、分泌和囊泡运输上显著偏低（P<0.05），而在转录、氨基酸及碳水化合物的运输和代谢等21个功能大类上差异不显著（P>0.05）。2 种成曲方式制备高温大曲均具有较强的氨基酸转运和代谢的能力，这可能是由于高温大曲中富含的Bacillus具有产蛋白酶的能力，可以代谢蛋白质生成多种游离氨基酸[28]，这些氨基酸在制曲的高温环境中可以与碳水化合物发生美拉德反应，赋予了高温大曲独特的酱香味。ZHAO等[29]的研究表明，大曲中的乳酸菌可以利用碳水化合物生成乳酸，加强了对碳源的利用率，进而提高了碳水化合物运输和代谢的丰度。综上所述，2 种成曲方式制备高温大曲的细菌菌群在谷物原料的降解和风味化合物代谢方面可能均具有较大的贡献，并且较之人工踩曲，机械压曲制备高温大曲中细菌在信号传导机制上具有较高表达而在细胞内运输、分泌和囊泡运输上显著偏低（P<0.05）。
本研究进一步使用BugBase对2 种成曲方式制备高温大曲样品细菌表型进行了预测，结果如图7所示。
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图 7 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中细菌的表型对比注：A为好氧菌含量；B为厌氧菌含量；C为移动原件含量；D为兼性厌氧菌含量；E为产生物膜细菌含量；F为革兰氏阳性菌含量；G为具有致病潜力细菌含量；H为具有氧化胁迫耐受能力细菌含量。Figure 7. Phenotypic comparison of bacteria in the high-temperature Daqu of artificial and mechanical starter-making由图7可知，在8 种细菌表型中，仅有2 种表型在2 种成曲方式制备高温大曲样品中存在显著性差异（P<0.05）。较之人工踩曲，机械压曲制备的高温大曲中革兰氏阳性菌的含量更多，而细菌的氧化胁迫耐受的能力偏弱（P<0.05）。其中，革兰氏阳性菌在人工踩曲和机械压曲制备高温大曲样品中的相对含量分别为90.18%和97.26%，而具有氧化胁迫耐受能力的细菌相对含量分别为96.06%和93.87%。此外，虽然2 种成曲方式制备高温大曲样品在需氧菌、厌氧菌、移动原件、产生物膜细菌和具有致病潜力细菌的含量上无显著差异（P>0.05），但均具有较高的表达。
3. 结论
人工踩曲和机械压曲制作高温大曲的细菌菌群组成具有显著差异，且机械压曲制备的高温大曲样品中革兰氏阳性菌的含量更丰富，而其细菌的氧化胁迫耐受能力相对偏弱。与人工踩曲相比，机械压曲制备高温大曲中Lentibacillus的含量显著偏高，而Weissella、Brevibacterium和Pediococcus的含量相对偏低。通过线性判别分析效应量发现，Thermoactinomycetaceae是人工踩曲制备高温大曲的生物标志物，Bacillaceae是机械压曲制备高温大曲的生物标志物。此外，机械压曲制备大曲中的细菌在信号传导机制上具有较高表达，而在细胞内运输、分泌和囊泡运输上表达较弱。综上所述，人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中的细菌除了在菌群组成上存在显著差异外，其部分基因功能和表型亦具有明显不同。由此可见，无论是制曲工艺的传统化保留还是工业化发展对于大曲品质的形成均存在一定影响，本研究可为高温大曲品质的提升与稳定提供部分理论支撑。
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图 2 基于非加权UniFrac距离的PCoA分析（A）和ANOSIM分析（B）
Figure 2. PCoA analysis (A) and ANOSIM analysis (B) based on unweighted UniFrac distance
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图 3 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中相对含量大于1.0%的细菌门（A）和属（B）
Figure 3. Bacteria phylum (A) and genus (B) with a relative content greater than 1.0% in artificial and mechanical starter-making high-temperature Daqu
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图 4 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中细菌类群的LEfSe分析
注：A为进化分支图；B为LDA分布直方图。
Figure 4. LEfSe analysis of bacterial groups in artificial and mechanical starter-making high-temperature Daqu
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图 5 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中共有OTU的箱型图
注：A为OTU30618；B为OTU37484；C为OTU58918。
Figure 5. Box type diagram of OTU shared by artificial and mechanical starter-making high-temperature Daqu
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图 6 人工踩曲和机械压曲制备高温大曲中功能基因的差异分析图
注：T为信号传导机制；U为细胞内运输、分泌和囊泡运输；L为复制、重组和修复；J为转录、核糖体结构和生物发生；N为细胞运动；Z为细胞骨架；O为翻译后修饰、蛋白质转换、伴随蛋白；H为辅酶转运和代谢；K为转录；R为一般功能预测；F为核苷酸运输和代谢；Q为次生代谢物的生物合成、运输和分解代谢；A为RNA处理和修饰；B为染色质结构和动力学；M为细胞壁/膜/包膜生物发生；E为氨基酸运输和代谢；G为碳水化合物运输和代谢；D为细胞周期控制、分裂和染色体分配；I为脂质转运与代谢；C为能量生产和转换；P为无机离子专业和代谢；S为未知功能；V为防御机制；*表示差异显著（P<0.05），图7同。
Figure 6. Difference analysis of functional genes in the high-temperature Daqu of artificial and mechanical starter-making
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