Structural Characterization of Large Yellow Tea Polysaccharides and Its Inhibitory Effects on the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes
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摘要: 本文探究黄大茶多糖的结构特征和降脂活性，为夏秋茶资源的开发利用提供依据。以霍山黄大茶为试验材料提取黄大茶多糖，对其结构进行表征，分别采用高效液相凝胶渗透色谱（High-performance gel-permeation chromatography, HPGPC）、离子色谱（Ion chromatography, IC）、气质联用色谱（Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）、傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer, FTIR）、扫描电镜（Scanning electron microscope, SEM）等分析方法测定黄大茶多糖的纯度、分子质量、单糖组成、化学键组成以及糖苷键结构；同时基于3T3-L1前脂肪细胞构建成熟脂肪细胞分化模型，研究黄大茶多糖干预对3T3-L1细胞分化和脂滴累积的影响。结果表明，黄大茶多糖经水提醇沉以及DE-52纤维素阴离子交换层析柱和Sephadex G-100凝胶柱纯化分离获得LYP-W1组分，HPGPC、IC和GC-MS分析结果显示，LYP-W1的分子量为1.25×105 Da，单糖组成为Ara:Rha:Gal:Glc:Man:GalA:GlcA为22.22:8.20:27.59:14.88:5.90:4.09，糖苷键主要由Rhap-(→1、 Araf-(1→、→2)-Rhap-(1→、Glcp-(1→、GlcpA-(1→、Galp-(→1、→5)-Araf-(1→、→2,4)-Rhap-(1→、→4)-Galp-(→1、→4)-GalpA-(1→、→4)-Glcp-(1→、→3,4)-Manp-(1→、→3,6)-Galp-(1→等连接方式构成。FTIR结合SEM分析结果显示，LYP-W1中具有β-型吡喃糖环，表面光滑致密，呈不规则片层薄膜状分布。细胞实验结果显示，LYP-W1在50~200 μg/mL浓度范围内呈剂量依赖性显著抑制3T3-L1细胞的分化并降低其脂质沉积（P<0.05），表明黄大茶多糖具有天然降脂的潜力。本研究可为其它茶多糖的提取、纯化及生物活性研究提供参考。Abstract: To provide a basis for the development and utilization of summer and autumn tea resources, the structural characteristics and lipid-lowering activity of polysaccharides from large-leaf yellow tea were investigated. The polysaccharides were extracted from Huoshan large-leaf yellow tea, which structural characteristics including purity, molecular weight, monosaccharide composition, functional groups and glycosidic bond types were characterized by high performance gel permeation chromatography (HPGPC), ion chromatography (IC), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), fourier transform infrared spectrometer (FTIR), and scanning electron microscope (SEM). Concurrently, a mature adipocyte differentiation model was established using 3T3-L1 pre-adipocytes to investigate the effects of large-leaf yellow tea polysaccharide intervention on the differentiation and lipid droplet accumulation in 3T3-L1 cells. A homogeneous polysaccharide fraction (LYP-W1) was obtained from large-leaf yellow tea by water extraction, ethanol precipitation, and purification using DE-52 cellulose and Sephadex G-100 chromatography. Structure analysis indicated that LYP-W1 was composed of Ara:Rha:Gal:Glc:Man:GalA:GlcA=22.22:8.20:27.59:14.88:5.90:4.09 with a molecular weight of 1.25×105 Da, and its repeat unit of the glycosidic linkages were consisted of Rhap-(→1, Araf-(1→, →2)-Rhap-(1→, Glcp-(1→, GlcA-(1→, Galp-(→1, →5)-Araf-(1→, →2,4)-Rhap-(1→, →4)-Galp-(→1,→4)-GalpA-(1→, →4)-Glcp-(1→, →4) →, →3,4)-Manp-(1→, and →3,6)-Galp-(1→. Meanwhile, FTIR and SEM analysis revealed that LYP-W1 contained β-type pyranose rings, with a smooth and compact surface and an irregular lamellar film-like distribution. In addition, LYP-W1 at dose of 50~200 μg/mL can significantly inhibit the differentiation of preadipocytes lipid deposition in 3T3-L1 cells in in a dose-dependent manner, which suggests that LYP-W1 has good lipid-lowering activity (P<0.05). These results provided a scientific basis for the extraction, purification, and investigation of the biological activities of polysaccharides from other tea sources.
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黄大茶属黄茶，主产于安徽省霍山、金寨、岳西等地，是我国特色茶类之一，干茶外形叶大、梗长[1]，制作原料多以夏秋茶为主，资源丰富。此外，其茶汤除了具有独特的锅巴香[2]，还有多种保健功能。大量研究表明，茶多糖是茶叶发挥抗氧化[3]、抗炎[4]、免疫调节[5]和保肝[6]等多种生物活性的主要功能成分，尤其是茶多糖在降血脂[7−8]、降血糖[9−10]、控制肥胖[11−12]等代谢综合征方面的研究颇受关注。由于不同的茶叶种类、加工工艺和提取方法对茶多糖的结构都有显著影响，因此不同品种茶多糖的生物活性存在差异。本研究利用团队研制的黄大茶“三闷三烘”标准化加工技术制成的干茶水提物已被证明具有降糖降脂活性，但其黄大茶多糖的降脂活性尚无系统研究。
近期研究发现，黄大茶水提物中的多糖含量较红茶、绿茶、黑茶中高，其茶汤可显著降低高脂饮食小鼠的空腹血糖水平，并且能够显著改善胰岛素抵抗的效应，提高胰岛素的敏感性[13]。课题组前期研究证明，黄大茶水提物作为膳食补充剂可通过抑制糖尿病db/db小鼠脂肪积累[14]以及巨噬细胞对脂肪组织的炎性浸润[15]进而改善糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗[16]，但其水提物中发挥活性功能的物质基础尚不清楚，因此，黄大茶中多糖的主要活性组分及其理化性质和功效关系亟待明确。
本文在黄大茶前期研究的基础上，通过单因素实验结合正交试验优化黄大茶多糖的提取工艺参数，进一步通过DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-100凝胶柱分离纯化黄大茶多糖，并对其进行精细结构解析和降脂活性评价，以期为黄大茶多糖发挥降脂活性的构效关系奠定理论基础，同时为黄大茶多糖降脂相关的膳食补充剂和功能食品的开发提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
黄大茶 抱儿钟秀茶叶有限公司；3T3-L1前脂肪细胞 上海生命科学研究院细胞资源中心；DEAE-52纤维素 索莱宝科技有限公司；葡聚糖凝胶Sephadex G-100 合肥博美生物科技有限公司；葡萄糖等单糖标准品 成都德思特生物技术有限公司；CCK-8试剂盒 江苏碧云天生物有限公司；高糖DMEM培养基、胎牛血清 美国Gibco公司；Dextran葡聚糖标准品、地塞米松（Dexamethasone，DEX）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine，IBMX） 美国Sigma公司。
RV8旋转蒸发仪 德国IKA集团；RA8低温循环水浴 德国LAUDA公司；371二氧化碳培养箱、Nicolette傅里叶红外光谱仪、S4800场发射扫描电子显微镜 日立有限公司；DelsaMaxPro纳米粒径分析仪 贝克曼库尔特有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黄大茶多糖的分离纯化
1.2.1.1 黄大茶多糖的提取
参照Gu等[17]方法，将黄大茶烘干、粉碎、过60目筛网后，加入10倍体积的无水乙醇浸泡24 h，抽滤，收集沉淀，烘干得脱色脱脂的茶粉末备用；称取10 g脱色脱脂后的茶粉，按照料液比1:30 加入蒸馏水，90 ℃条件下浸提2.5 h，抽滤，收集滤液，重复2次提取滤渣，收集3次所得的茶浸提液，经真空浓缩后加入4倍体积的无水乙醇，静置24 h后，离心收集醇沉物，加入Sevage试剂（氯仿:正丁醇=4:1）脱蛋白至无沉淀产生，收集糖溶液，去除残留有机试剂，流水透析48 h，冷冻干燥得黄大茶多糖。
1.2.1.2 黄大茶多糖得率的测定
根据刘冰[18]的方法，配制0.1 mg/mL的葡萄糖水溶液，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL葡萄糖母液于不同试管中，均补充蒸馏水至1.0 mL，向每个试管中加入25 μL的80%苯酚溶液，再加入2.5 mL浓硫酸快速摇匀，在37 ℃水浴锅中反应30 min，于490 nm处测定吸光值。以葡萄糖溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为y=16.077x−0.0292（R2=0.999）。
称取5 mg黄大茶多糖于10 mL容量瓶定容，取1 mL于试管中，按照测定葡萄糖标准曲线的方法测定糖含量，并按式（1）计算黄大茶多糖的得率。
黄大茶多糖得率(%)=c×v×nm×100 (1) 式中，c为黄大茶多糖的浓度（mg/mL），v为黄大茶多糖溶液的体积（mL），n为稀释倍数，m表示黄大茶干茶质量（mg）。
1.2.1.3 单因素实验
分别设置提取黄大茶多糖的料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL）、时间（1、1.5、2、2.5、3 h）、温度（60、70、80、90、100 ℃）等因素，以黄大茶多糖的得率为指标，考察各因素变量对黄大茶多糖得率的影响，确定最佳提取工艺参数。
1.2.1.4 正交试验
根据单因素实验结果，以黄大茶多糖得率为指标，采用三因素三水平正交试验进行提取工艺优化，正交实验设计的水平因素如表1。
表 1 正交试验水平因素设计Table 1. Level and factors of orthogonal test水平 料液比（g/mL） 提取温度（℃） 提取时间（h） 1 1:20 80 2.0 2 1:30 90 2.5 3 1:40 100 3.0 1.2.1.5 黄大茶多糖的分离纯化
配制20 mg/mL的黄大茶多糖溶液，使用DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱，分别用蒸馏水和0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为5 mL/min，通过苯酚-硫酸比色法[18]在紫外分光光度计490 nm波长处测定梯度洗脱液的吸光度，以蒸馏水为空白对照组，洗脱管数作为横坐标，相应的吸光度作为纵坐标，绘制洗脱曲线。收集含糖洗脱峰，经透析（3500 Da, 24 h）、减压浓缩（35 r/min，55 ℃，0.09～0.10 MPa）、冷冻干燥（−50 ℃，10 Pa，48 h），得到黄大茶多糖。
收集水洗组分黄大茶多糖溶液，使用Sephadex G-100凝胶柱进一步纯化，用蒸馏水按0.2 mL/min流速洗脱，通过苯酚-硫酸比色法检测洗脱液中多糖含量，收集含多糖洗脱液，经减压浓缩（35 r/min，55 ℃，0.09～0.10 MPa）、透析脱盐（3500 Da, 24 h）、真空冷冻干燥（−50 ℃，10 Pa，48 h），得纯化的黄大茶多糖LYP-W1。分别采用硫酸苯酚法、硫酸咔唑法和考马斯亮蓝法测定LYP-W1的中性糖、糖醛酸和蛋白质含量[19]。
1.2.2 LYP-W1的结构鉴定
1.2.2.1 LYP-W1的分子量测定
采用高效凝胶渗透色谱法（High-performance gel-permeation chromatography, HPGPC）测定LYP-W1的相对分子量[20]。分别将5、25、80、150、420、670 kDa的葡聚糖标准品配成浓度为1 mg/mL的溶液，根据标准品的出峰时间和相对分子量绘制分子量标准曲线。根据标准曲线和黄大茶多糖样品的出峰时间计算其相对分子量。检测条件：Waters Arc HPLC系统，2414示差检测器，TSK G5000 PWxl （7.8 mm×300 mm）和TSK G4000 PWxl （7.8 mm×300 mm）色谱柱串联；流动相：蒸馏水；柱温：35 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。
1.2.2.2 LYP-W1的紫外光谱分析
配制0.1 mg/mL的LYP-W1溶液，采用紫外分光光度计在200~400 nm波长范围内进行扫描。
1.2.2.3 LYP-W1的特征基团分析
将2 mg的LYP-W1粉末和200 mg溴化钾粉末混合均匀，烘干至恒重，经充分研磨、干燥、固定后压成薄片，置于傅里叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer, FTIR）上扫描分析，扫描范围4000~400 cm−1。
1.2.2.4 LYP-W1的离子色谱分析
采用离子色谱法（Ion chromatography, IC）测定LYP-W1的单糖组成[21]。称取5 mg的LYP-W1，加入3 mol/L三氟乙酸2 mL，120 ℃水解3 h，反应结束后充入氮气至吹干，加入5 mL去离子水涡旋混匀，12000 r/min离心5 min，经0.22 μm滤膜过滤后备用。称取单糖标品各5 mg，包括岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸和甘露糖醛酸，配制不同浓度梯度的单糖混合标准溶液，测定不同单糖质量，计算各单糖摩尔比。
1.2.2.5 LYP-W1的甲基化分析
采用气相色谱-质谱联用分析LYP-W1的糖苷键类型[22]。配制20 mg/mL的LYP-W1溶液，加入1 mmol/L的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺试剂在37 ℃下反应2 h，加入HCl调节pH使其始终保持在4.7左右。然后加入2 mol/L的硼氢化钠溶液20 mL反应1 h，调节pH使其始终保持在7.0左右。反应结束后，将溶液透析并冷冻干燥，即得到羰基还原的多糖。称取还原后的多糖，经DMSO充分溶解，加入NaOH粉末，磁力搅拌反应3 h，冰浴条件下加入无水碘甲烷，避光反应2 h，反应结束后加适量蒸馏水中止反应，反应液经干燥后加入4 mol/L三氟乙酸溶液，100 ℃水解8 h，加入硼氘化钠还原，乙酸酐衍生，经0.22 μm有机滤膜过滤后，上机测定分析。
1.2.2.6 LYP-W1的刚果红分析
配制2 mg/mL的LYP-W1溶液，加入刚果红溶液，混匀后加入不同终浓度的NaOH溶液（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/mL），以不含LYP-W1溶液的混合溶液作为对照，室温静置反应10 min，在紫外400~600 nm的波长范围内扫描，测定刚果红-黄大茶多糖复合物的最大吸收波长。
1.2.2.7 LYP-W1的粒径分析
配制1 mg/mL的LYP-W1溶液，经0.22 μm水系膜过滤，利用纳米粒径分析仪在25 ℃、633 nm波长、90°散射角条件下测量其粒径。
1.2.2.8 LYP-W1的扫描电镜分析
取适量LYP-W1粉末，粘附于样品台上，置真空喷镀仪内，镀一层导电膜（金）后，在扫描电子显微镜下观察。
1.2.3 LYP-W1的体外降脂活性
1.2.3.1 LYP-W1对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响
选取对数生长期的细胞，消化后调整细胞浓度至1×105个/mL，以每孔100 μL的量接种于96孔板，培养至对数生长期，弃去上清液加PBS润洗，再加入终浓度分别为0、25、50、100、200、400、800、1200、1600 μg/mL的黄大茶多糖，孵育24 h后，弃去培养液，每孔加入含10 μL CCK8的新培养液，37 ℃摇床孵育2 h，利用酶标仪在450 nm条件下测定吸光值。细胞活力按CCK8试剂盒说明书计算。
1.2.3.2 3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化
参考Teng等[23]的方法，选取对数生长期的细胞，以每孔1×106个/mL接种于12孔板中，贴壁接触抑制培养48 h后，弃去旧培养基，每孔加入2 mL含不同浓度多糖溶液（50、100、200 μg/mL）的诱导液Ⅰ（含终浓度为0.25 mol/L DEXA、0.5 mmol/L IBMX、10 μg/mL胰岛素的完全培养基），培养48 h后，弃去诱导液Ⅰ，每孔加入2 mL含不同浓度多糖溶液加入诱导液Ⅱ（含终浓度为10 μg/mL胰岛素的完全培养基）培养48 h。最后弃去诱导液Ⅱ，加入含不同浓度多糖溶液的完全培养基继续培养6~8 d。分别设置不加诱导液和多糖溶液的为对照组，只加诱导液不加多糖溶液的为模型组。
1.2.3.3 油红O染色
3T3-L1细胞诱导分化结束后，加入PBS润洗后，立即加4%多聚甲醛组织固定液，固定细胞30 min，再用蒸馏水清洗3次。配制油红O染色液（油红O:水=3:2），每孔加入1 mL染色工作液，染色30 min后除去，蒸馏水清洗3次；在显微镜下观察细胞状态和脂滴积累程度并拍照。最后每孔中加入1 mL异丙醇，摇床振荡15 min后在酶标仪492 nm处测量吸光值。
1.3 数据处理
实验所得数据通过Excel 2019计算分析，利用GraphPad Prism 8.5和Origin2022进行数据统计作图。所有数据均以平均值±标准差（mean±SD）表示，两组数据之间比较采用T-test，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 LYP-W1的分离纯化
2.1.1 单因素实验结果
如图1A所示，随着料液比的增加，黄大茶多糖得率呈现上升的趋势，在料液比为1:30 g/mL时达到了最高值，但随着料液比持续升高，多糖得率开始下降。分析原因可能是在一定热量的条件下，固相与液相之间会有浓度差，所加的水越多，茶叶里细胞内外的多糖浓度差就越大，多糖扩散到溶剂中的量就会增加，茶多糖的得率就会上升[24]；但是随着水的持续增加，分子间的吸附作用增强从而导致多糖得率下降[25]。综合考虑，选取料液比1:20～1:40 g/mL 进行后续实验。
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图 1 料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）对黄大茶多糖得率的影响注：不同小写字母代表差异显著，P<0.05。Figure 1. Effects of material-liquid ratio (A), extraction temperature (B) and extraction time (C) on the yield of large yellow tea polysaccharide如图1B所示，随着提取时间的增加，多糖得率呈先升后降的趋势，当时间为2.5 h时，黄大茶多糖的得率达到最大。原因可能是当提取时间较短时，茶多糖未能充分溶解在水中，但如果提取时间过长，茶多糖的稳定性会降低，多糖结构会被破坏进而影响得率[26]，故选择提取时间2～3 h进行后续实验。
如图1C所示，当提取温度在60～90 ℃之间时，黄大茶多糖得率呈上升趋势，并且在90 ℃时最大，但当温度超过90 ℃后，黄大茶多糖得率却开始下降。原因可能是随着温度的升高，溶质分子运动加快，有利于多糖从细胞内部溶解析出[27]，但如果温度过高，溶质分子结构遭到破坏，导致多糖分解从而得率下降[27]。因此选取温度80～100 ℃进行后续实验。
2.1.2 正交试验结果
通过表2正交试验直观分析结果可知，3个因素中对黄大茶多糖得率的影响大小顺序为提取温度>料液比>提取时间。对因素A料液比来说，当料液比为1:30 g/mL时K均值最大；对因素B提取温度来说，当温度为100 ℃时K均值最大；对因素C提取时间来说，当时间为3 h时K均值最大。由此得出黄大茶多糖最佳提取工艺组合为A2B3C3，即料液比：1:30 g/mL，提取温度：100 ℃，提取时间：3 h。由表3正交试验方差分析结果可知，在进行黄大茶多糖的提取试验过程中，温度显著影响黄大茶多糖的得率，而料液比和时间对黄大茶多糖的得率影响均不显著。
表 2 正交试验结果Table 2. Results of orthogonal experiments试验号 A料液比（g/mL） B提取温度（℃） C提取时间（h） 得率（%） 1 1:20 80 2.0 10.96±0.58 2 1:20 90 2.5 12.65±0.21 3 1:20 100 3.0 16.05±1.05 4 1:30 80 2.5 11.78±0.64 5 1:30 90 3.0 15.44±0.43 6 1:30 100 2.0 17.72±1.18 7 1:40 80 3.0 12.69±0.18 8 1:40 90 2.0 12.95±0.21 9 1:40 100 2.5 17.53±0.14 K1 13.223 11.813 13.877 K2 14.982 13.681 13.988 K3 14.392 17.103 14.731 R 1.759 5.290 0.854 表 3 正交试验方差分析Table 3. Analysis of variance of orthogonal tests因素 偏差平方和 自由度 F值 显著性 料液比 4.807 2 0.376 温度 43.225 2 3.384 * 时间 1.285 2 0.101 误差 51.09 8 注：表中*表示差异显著，P<0.05。 2.1.3 LYP-W1的分离纯化
黄大茶粗多糖经DEAE-52纤维素离子交换色谱柱分离纯化，依次用蒸馏水和0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，得到五个组分，分别命名为LYP-W1、LYP-S1、LYP-S2、LYP-S3、LYP-S4（图2A）。本研究主要收集含量较高的洗脱组分LYP-W1，对其进行Sephadex G-100再次纯化，纯化后的LYP-W1呈现出单一对称的峰（图2B）。经测定，LYP-W1中糖含量为43.96%±0.43%；糖醛酸含量为38.04%±1.40%；蛋白质含量为1.44%±0.49%。表明LYP-W1的分离效果较好，纯度较高，可以用于后续结构分析。
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图 2 黄大茶多糖的分级纯化洗脱曲线注：A：DEAE-52纤维素离子交换层析柱洗脱曲线；B：葡聚糖凝胶Sephadex G-100层析柱洗脱曲线。Figure 2. Elution curves of large yellow tea polysaccharides2.2 LYP-W1的结构鉴定
2.2.1 LYP-W1的分子量
利用HPGPC 法测定LYP-W1的相对分子质量，如图3所示，LYP-W1为单一对称峰，说明LYP-W1经分离纯化后为均一性多糖。LYP-W1的保留时间为36.58 min，根据标准品分子量曲线，计算出LYP-W1的分子量为1.25×105 Da。
2.2.2 LYP-W1的紫外光谱和红外光谱分析
已知核酸的紫外吸收峰是260 nm，蛋白质的紫外吸收峰是280 nm，如图4A，LYP-W1在260 nm处无吸收峰，在280 nm处有微弱吸收峰，说明在LYP-W1中不含核酸，蛋白质含量很低。
LYP-W1的FTIR结果显示如图4B，3400 cm−1处的吸收峰归属于糖分子内或分子间O-H伸缩振动的结果；2900 cm−1处的吸收峰是糖类物质C-H伸缩振动导致的结果；1400 cm−1处的吸收峰是糖类C-H变角振动引起的[28]；以上这三类吸收峰均是糖类物质的特征峰。此外，1640 cm−1处的吸收峰是-COOH中的羰基（C=O）引起的，这说明LYP-W1中含有糖醛酸[29]，与之前理化性质测定的结果相吻合。1100 cm−1处的吸收峰对应着吡喃糖环中C-O-C和C-O-H两种伸缩振动，也是葡聚糖典型的红外光谱信号[30]；900~800 cm−处的峰归属于吡喃糖环的弯曲振动，表明LYP-W1中具有吡喃糖环的骨架。Wang等[28]和Chen等[29]分别用超声和超高压提取黄大茶多糖，在分子量、单糖组成和糖苷键连接方式上与LYP-W1有显著差异，但红外光谱扫描的结果与本文相比较，多糖类物质典型的主吸收峰没有发生变化，说明水提、超声和高压辅助提取都没有改变黄大茶多糖的基本官能团。
2.2.3 LYP-W1的单糖组成
采用带脉冲安培检测器的IC对LYP-W1黄大茶多糖的单糖组成进行分析，如图5所示，通过与单糖标准品的谱图比对，LYP-W1主要由阿拉伯糖Ara、鼠李糖Rha、半乳糖Gal、葡萄糖Glc、甘露糖Man、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖醛酸GlcA组成，其摩尔比分别为Ara:Rha:Gal:Glc:Man:GalA:GlcA=22.22:8.20:27.59:14.88:5.90:4.09。LYP-W1的单糖组成与已发表文献所报道的茶多糖的单糖组成具有相似性[28]，但具体组成摩尔比例有显著差异，这可能与不同茶类的加工方式和提取方法有关。
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图 5 LYP-W1的单糖组成分析注：A：单糖混合标准品；B：LYP-W1。Figure 5. Analysis of monosaccharide composition of LYP-W12.2.4 LYP-W1的糖苷键组成和连接方式
为了确定LYP-W1的糖苷键类型，将LYP-W1甲基化后，通过水解和衍生获得甲基化的糖醇乙酸酯（PMAA）产物，结果如表4所示，根据甲基化的糖醇乙酸酯的裂解规律和碎片质谱峰，对照标准谱库，推测出LYP-W1中的糖苷键主要有Rhap-（→1、 Araf-（1→、→2）-Rhap-（1→、 Glcp-（1→、 GlcpA-（1→、 Galp-（→1、 →5）-Araf-（1→、 →2,4）-Rhap-（1→、 →4）-Galp-（→1、 →4）-GalpA-（1→、 →4）-Glcp-（1→、 →3,4）-Manp-（1→、 →3,6）-Galp-（1→等13种连接方式。
表 4 LYP-W1的甲基化分析数据Table 4. Methylation analysis of LYP-W1序号 连接方式 衍生物名称 保留时间（min） 相对摩尔比（%） 1 t-Rha（p） 1,5-di-O-acetyl-6-deoxy-2,3,4-tri-O-methyl rhamnitol 5.703 3.612 2 t-Ara（f） 1,4-di-O-acetyl-2,3,5-tri-O-methyl arabinitol 5.969 12.955 3 2-Rha（p） 1,2,5-tri-O-acetyl-6-deoxy-3,4-di-O-methyl rhamnitol 8.778 3.265 4 t-Glc（p） 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl glucitol 8.933 3.521 5 t-Glc（p）-UA 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl glucitol 8.933 1.509 6 t-Gal（p） 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl galactitol 9.927 11.058 7 5-Ara（f） 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3-di-O-methyl arabinitol 10.58 4.619 8 2,4-Rha（p） 1,2,4,5-tetra-O-acetyl-6-deoxy-3-O-methyl rhamnitol 12.414 4.424 9 4-Gal（p） 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl galactitol 13.792 15.882 10 4-Gal（p）-UA 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl galactitol 13.792 15.882 11 4-Glc（p） 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl glucitol 14.076 4.740 12 3,4-Man（p） 1,3,4,5-tetra-O-acetyl-2,6-di-O-methyl mannitol 15.12 3.327 13 3,6-Gal（p） 1,3,5,6-tetra-O-acetyl-2,4-di-O-methyl galactitol 18.928 4.111 2.2.5 LYP-W1的构象和微观结构
刚果红能与三股螺旋多糖结合形成络合物，改变多糖的最大吸收波长，刚果红-多糖络合物的最大吸收波长会产生红移[31]。因此可利用刚果红试剂来判断多糖中是否存在三股螺旋结构。如图6A所示，随着NaOH浓度的增加，刚果红与LYP-W1络合物的最大吸收波长减小，最后趋于稳定，表明LYP-W1不具有三股螺旋结构。
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图 6 LYP-W1的构象和微观结构注：A：LYP-W1与刚果红在不同浓度NaOH下的最大吸收波长；B：LYP-W1的粒径分布图；C~D：LYP-W1扫描电镜图，C图放大倍数为500倍，D 图放大倍数为1000倍。Figure 6. Conformation and microstructure of LYP-W1粒径是描述溶液中聚合物大小的重要参数之一，其影响多糖在生物体内的代谢，粒径减小，有利于多糖发挥生物活性[32]。利用纳米粒径分析仪测定LYP-W1的粒径大小，如图6B所示，LYP-W1的粒径大小主要集中在10~1000 nm，LYP-W1的平均粒径是39.52 nm。
为进一步研究LYP-W1的微观结构，利用扫描电镜观察LYP-W1表面微观形态。如图6C~图6D所示，在高倍镜下，LYP-W1呈不规则片层薄膜状分布，边缘有不规则层片状堆叠，表面光滑致密。
2.3 黄大茶多糖LYP-W1对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的抑制作用
2.3.1 LYP-W1对3T3-L1细胞活力的影响
采用CCK8法检测LYP-W1对3T3-L1前脂肪细胞的活性影响。如图7所示，与对照组相比，LYP-W1在25~200 μg/mL浓度范围内对3T3-L1细胞的活力无显著影响，说明0~200 μg/mL浓度范围内LYP-W1对细胞没有毒性。但当浓度在400~1200 μg/mL时，LYP-W1显著抑制了3T3-L1细胞的活力（P<0.01）。根据细胞活力实验，选择50、100和200 μg/mL的LYP-W1进行后续实验。
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图 7 LYP-W1对3T3-L1细胞活性的影响注： **P<0.01差异十分显著；***P<0.001差异极显著。Figure 7. Effects of LYP-W1 on the viability of 3T3-L1 cells2.3.2 LYP-W1对3T3-L1细胞分化和脂滴积累的影响
油红O是一种脂溶性染料，能特异性地与脂肪组织和细胞内的中性甘油三脂、脂质以及脂蛋白产生吸附作用从而使脂肪染色[23]。成熟脂肪细胞除了分泌的脂滴会被染成红色，其他的细胞结构不会与油红O染料结合，因此可根据油红O染色进行判定脂肪细胞在成熟分化过程中的脂质沉积情况[33]。如图8A所示，与对照组相比，模型组和不同浓度的LYP-W1干预组细胞的油红O染色程度明显，LYP-W1在50~200 μg/mL浓度范围内均能减少细胞内的脂滴生成量，并呈剂量依赖性抑制作用。
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图 8 LYP-W1对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的抑制作用注：A：3T3-L1细胞的油红O染色；B：3T3-L1细胞的分化率；*P<0.05差异显著；**P<0.01差异十分显著。Figure 8. Inhibitory effects of LYP-W1 on adipogenic differentiation of 3T3-L1 preadipocytes进一步利用异丙醇溶解与细胞内脂质结合的油红O，在波长为510 nm的条件下，检测分析LYP-W1对3T3-L1前脂肪细胞的分化程度。结果如图8B所示，与对照组相比，模型组吸光值显著增加，说明3T3-L1前脂肪细胞被成功诱导为成熟脂肪细胞。与模型组相比，随着LYP-W1给药浓度的增加，细胞分化率均呈显著下降趋势（P<0.05），当LYP-W1浓度达到200 μg/mL时，LYP-W1对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制率达到38.42%。说明LYP-W1可显著抑制3T3-L1细胞的分化，减少细胞内脂质积累，并且呈剂量依赖性抑制作用。降血脂作为多糖最显著的活性之一，李娟等[34]比较了绿茶、红茶和乌龙茶多糖3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制作用，结果发现三种茶多糖均能显著抑制3T3-L1的分化，其中绿茶多糖的抑制效果最好，并且通过激活AMPK信号通路调控相关脂肪细胞因子的表达，最终抑制TG的合成。这可能和绿茶多糖中的糖醛酸含量明显高于其他两种多糖有关，糖醛酸在减肥和降脂方面发挥着重要作用[35]。
3. 结论
黄大茶多糖最佳提取工艺为：料液比1:30 g/mL，提取温度100 ℃，提取时间3 h。在该提取条件下分离纯化的黄大茶多糖LYP-W1的分子量为1.25×105 Da，粒径为39.52 nm，单糖组成为Ara:Rha:Gal:Glc:Man:GalA:GlcA=22.22:8.20:27.59:14.88:5.90:4.09，糖苷键主要由Rhap-（→1、 Araf-（1→、→2）-Rhap-（1→、Glcp-（1→、GlcpA-（1→、Galp-（→1、→5）-Araf-（1→、→2,4）-Rhap-（1→、→4）-Galp-（→1、→4）-GalpA-（1→、→4）-Glcp-（1→、→3,4）-Manp-（1→、→3,6）-Galp-（1→组成，属于含有β构型的吡喃多糖，表面光滑致密，呈不规则片层薄膜状分布。LYP-W1能够显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化和脂滴积累，具有良好的降脂活性，但有关LYP-W1抑制前脂肪细胞成脂分化的分子机制还有待进一步研究。本研究旨在为夏秋茶资源的充分利用提供技术支撑，同时为黄大茶多糖的构效关系研究提供一定的物质基础参考。
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图 1 料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）对黄大茶多糖得率的影响
注：不同小写字母代表差异显著，P<0.05。
Figure 1. Effects of material-liquid ratio (A), extraction temperature (B) and extraction time (C) on the yield of large yellow tea polysaccharide
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图 2 黄大茶多糖的分级纯化洗脱曲线
注：A：DEAE-52纤维素离子交换层析柱洗脱曲线；B：葡聚糖凝胶Sephadex G-100层析柱洗脱曲线。
Figure 2. Elution curves of large yellow tea polysaccharides
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图 5 LYP-W1的单糖组成分析
注：A：单糖混合标准品；B：LYP-W1。
Figure 5. Analysis of monosaccharide composition of LYP-W1
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图 6 LYP-W1的构象和微观结构
注：A：LYP-W1与刚果红在不同浓度NaOH下的最大吸收波长；B：LYP-W1的粒径分布图；C~D：LYP-W1扫描电镜图，C图放大倍数为500倍，D 图放大倍数为1000倍。
Figure 6. Conformation and microstructure of LYP-W1
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图 7 LYP-W1对3T3-L1细胞活性的影响
注： **P<0.01差异十分显著；***P<0.001差异极显著。
Figure 7. Effects of LYP-W1 on the viability of 3T3-L1 cells
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图 8 LYP-W1对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的抑制作用
注：A：3T3-L1细胞的油红O染色；B：3T3-L1细胞的分化率；*P<0.05差异显著；**P<0.01差异十分显著。
Figure 8. Inhibitory effects of LYP-W1 on adipogenic differentiation of 3T3-L1 preadipocytes
表 1 正交试验水平因素设计
Table 1 Level and factors of orthogonal test
水平 料液比（g/mL） 提取温度（℃） 提取时间（h） 1 1:20 80 2.0 2 1:30 90 2.5 3 1:40 100 3.0 
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表 2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiments
试验号 A料液比（g/mL） B提取温度（℃） C提取时间（h） 得率（%） 1 1:20 80 2.0 10.96±0.58 2 1:20 90 2.5 12.65±0.21 3 1:20 100 3.0 16.05±1.05 4 1:30 80 2.5 11.78±0.64 5 1:30 90 3.0 15.44±0.43 6 1:30 100 2.0 17.72±1.18 7 1:40 80 3.0 12.69±0.18 8 1:40 90 2.0 12.95±0.21 9 1:40 100 2.5 17.53±0.14 K1 13.223 11.813 13.877 K2 14.982 13.681 13.988 K3 14.392 17.103 14.731 R 1.759 5.290 0.854
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表 3 正交试验方差分析
Table 3 Analysis of variance of orthogonal tests
因素 偏差平方和 自由度 F值 显著性 料液比 4.807 2 0.376 温度 43.225 2 3.384 * 时间 1.285 2 0.101 误差 51.09 8 注：表中*表示差异显著，P<0.05。
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表 4 LYP-W1的甲基化分析数据
Table 4 Methylation analysis of LYP-W1
序号 连接方式 衍生物名称 保留时间（min） 相对摩尔比（%） 1 t-Rha（p） 1,5-di-O-acetyl-6-deoxy-2,3,4-tri-O-methyl rhamnitol 5.703 3.612 2 t-Ara（f） 1,4-di-O-acetyl-2,3,5-tri-O-methyl arabinitol 5.969 12.955 3 2-Rha（p） 1,2,5-tri-O-acetyl-6-deoxy-3,4-di-O-methyl rhamnitol 8.778 3.265 4 t-Glc（p） 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl glucitol 8.933 3.521 5 t-Glc（p）-UA 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl glucitol 8.933 1.509 6 t-Gal（p） 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl galactitol 9.927 11.058 7 5-Ara（f） 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3-di-O-methyl arabinitol 10.58 4.619 8 2,4-Rha（p） 1,2,4,5-tetra-O-acetyl-6-deoxy-3-O-methyl rhamnitol 12.414 4.424 9 4-Gal（p） 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl galactitol 13.792 15.882 10 4-Gal（p）-UA 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl galactitol 13.792 15.882 11 4-Glc（p） 1,4,5-tri-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methyl glucitol 14.076 4.740 12 3,4-Man（p） 1,3,4,5-tetra-O-acetyl-2,6-di-O-methyl mannitol 15.12 3.327 13 3,6-Gal（p） 1,3,5,6-tetra-O-acetyl-2,4-di-O-methyl galactitol 18.928 4.111
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