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中国精品科技期刊2020

南珠贝壳珍珠层源抗氧化肽的制备及对酪氨酸酶的抑制活性

徐嘉欣, 罗哲, 何安, 黄潘钿, 沈金鹏, 郭俊斌, 苗建银

徐嘉欣,罗哲,何安,等. 南珠贝壳珍珠层源抗氧化肽的制备及对酪氨酸酶的抑制活性[J]. 食品工业科技,2025,46(6):242−251. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024040262.
引用本文: 徐嘉欣,罗哲,何安,等. 南珠贝壳珍珠层源抗氧化肽的制备及对酪氨酸酶的抑制活性[J]. 食品工业科技,2025,46(6):242−251. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024040262.
XU Jiaxin, LUO Zhe, HE An, et al. Preparation of Antioxidant Peptides Derived from Nacre of Nanzhu Shell and Their Inhibitory Activity against Tyrosinase[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(6): 242−251. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024040262.
Citation: XU Jiaxin, LUO Zhe, HE An, et al. Preparation of Antioxidant Peptides Derived from Nacre of Nanzhu Shell and Their Inhibitory Activity against Tyrosinase[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(6): 242−251. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024040262.

南珠贝壳珍珠层源抗氧化肽的制备及对酪氨酸酶的抑制活性

基金项目: 广西重点研发计划项目(桂科AB21220065)。
详细信息
    作者简介:

    徐嘉欣(2000−),女,硕士研究生,研究方向:食品新原料与功能性食品,E-mail:1540895598@qq.com

    通讯作者:

    苗建银(1981−)(ORCID:0000−0002−4785−3196),男,博士,副教授,研究方向:食品科学,E-mail:miaojy8181@scau.edu.cn

  • 中图分类号: TS201.1

Preparation of Antioxidant Peptides Derived from Nacre of Nanzhu Shell and Their Inhibitory Activity against Tyrosinase

  • 摘要: 本研究旨在制备南珠贝壳珍珠层源抗氧化肽,评价其抗氧化和酪氨酸酶抑制活性,并对其氨基酸组成成分进行分析。以从南珠贝壳珍珠层中提取的蛋白为原料,采用DPPH自由基清除率作为评价指标,通过酶的筛选、单因素和响应面试验得到最优酶解工艺,并对其酶解物进行了氨基酸组成分析、体外抗氧化和酪氨酸酶抑制活性研究。南珠贝壳珍珠层源抗氧化肽的最优酶解工艺为:以胰蛋白酶为水解酶,酶解温度37 ℃、pH7.0、酶解时间3 h、酶底比0.32%,所得酶解物DPPH自由基清除率为76.34%±0.24%。在此条件下制备得到的珍珠层抗氧化肽具有优异的ABTS+自由基清除率(IC50=0.1735 mg/mL)、DPPH自由基清除率(IC50=2.342 mg/mL)和氧自由基清除能力(ORAC值=1124.86 μmol TE/g冻干粉)。此外,珍珠层抗氧化肽还可通过混合型可逆抑制的方式抑制酪氨酸酶活力,具有良好的酪氨酸酶抑制活性,其抑制率的IC50值为12.38 mg/mL。本研究结果表明珍珠层抗氧化肽在食品或化妆品领域具有良好的应用前景,为贝壳珍珠层的高值化利用提供了理论依据。
    Abstract: The aim of this study was to prepare antioxidant peptides derived from nacre of Nanzhu shell, evaluate their antioxidant and tyrosinase inhibitory activities, and analyze their amino acid components. Using the protein from nacre of Nanzhu shell as raw material, DPPH free radical clearance rate as evaluation index, the optimal enzymatic hydrolysis process was obtained by sieve enzyme, single factor and response surface experiments. The amino acid composition, antioxidant and tyrosinase inhibitory activities of the enzymatic hydrolysis products were analyzed in vitro. The optimal enzymatic hydrolysis of the nacre of Nanzhu shell source antioxidant peptide was as follows: Using trypsin as hydrolase, hydrolysis temperature 37 ℃, pH7.0, enzymolysis time 3 h, enzymolysis ratio 0.32%, the DPPH free radical scavenging rate of the enzymolysis product was 76.34%±0.24%. The nacre antioxidant peptide prepared under these conditions had excellent ABTS+ free radical scavenging rate (IC50=0.1735 mg/mL), DPPH free radical scavenging rate (IC50=2.342 mg/mL) and oxygen free radical scavenging ability (ORAC value=1124.86 μmol TE/g lyophilized powder). In addition, nacre antioxidant peptides could also inhibit tyrosinase activity by mixed reversible inhibition, and had good tyrosinase inhibitory activity, the inhibitory rate of IC50 value was 12.38 mg/mL. The results of this study indicate that nacre antioxidant peptides have a good application prospect in the field of food and cosmetics, and provide a theoretical basis for the high-value utilization of shell nacre.
  • 氧化应激是自由基的过度累积造成的。在外界或内部环境的压力下,如紫外线辐射、环境污染、电子辐射等,活性氧的产生会显著增加,导致细胞死亡和组织损伤,从而引起一系列慢性疾病,如衰老、炎症、癌症、动脉粥样硬化等[1]。同时,氧化应激还会激活酪氨酸酶活性,从而促使黑色素细胞产生过量的黑色素,导致多种皮肤疾病,如雀斑、老年斑、黄褐斑,甚至是恶性黑色素瘤[2]。常用的合成抗氧化剂丁基羟基茴香醚和没食子酸等,有效果好、价格低廉等优点,但是由于其潜在毒性限制了在食品工业中的应用[3],因此,开发天然、安全、高效的抗氧化剂成为了近年来的研究热点。抗氧化肽由于其结构相对简单,分子量小易于吸收,且没有免疫反应,因此,开发高活性抗氧化肽是当前的研究趋势,在食品和健康医学应用中具有很大的潜力[4]。目前,已在厚壳贻贝肽[5]、海参肽[6]和大西洋鳕鱼骨胶原蛋白肽[7]的研究中均发现了良好的抗氧化活性。

    贝壳的结构从外到里分别是角质层、棱柱层和珍珠层[8]。通过处理南珠生产过程中产生的贝壳,得到去角质层和棱柱层后的壳,即为南珠贝壳珍珠层。珍珠层与珍珠同为外套膜上皮细胞分泌的大量珍珠质而来[9],同质同源,组成成分除了其主要成分碳酸钙之外,还有许多的功能活性物质,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、微量元素、维生素等[911]。目前,关于珍珠层源功能活性物质的研究主要是成骨活性[11],其抗氧化与酪氨酸酶抑制活性的研究甚少。珍珠层与珍珠同质同源,它们有着相似的组成成分和活性。研究表明珍珠具有抗氧化、抗衰老、美白、修复、抑菌、抗炎以及保湿等功效[12],常被用于护肤品和保健品的开发[9]。但由于珍珠是一种珍贵饰品,成本高,因此,珍珠层源功能活性物质有望在保健品和化妆品中作为珍珠的功能替代物,在降低成本的同时,还能实现贝壳的高值化利用。

    本研究以从南珠贝壳珍珠层中提取的蛋白为原料,采用DPPH自由基清除率为指标,优化酶解工艺,以最优酶解条件制备得到珍珠层抗氧化肽,再对其进行了氨基酸组成成分分析,评估了其抗氧化和酪氨酸酶抑制活性。珍珠层抗氧化肽的研究有助于贝壳的高值化利用,为珍珠层资源的开发利用提供新的思路。

    南珠贝壳珍珠层 来自广西北海市;木瓜蛋白酶(8×105 U/g)、中性蛋白酶(2×105 U/g)、碱性蛋白酶(2×105 U/g)、菠萝蛋白酶(6×105 U/g)、胃蛋白酶(3000NF U/g)和胰蛋白酶(2500USP U/g) 南宁庞博生物工程有限公司;1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、2,2'-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、荧光素钠、L-酪氨酸 上海麦克林生化科技股份有限公司;2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH) 上海瑞永生物科技有限公司;过硫酸钾 天津市百世化工有限公司;酪氨酸酶 上海源叶生物科技有限公司。

    ME204型万分之一电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;PHS-3D型pH计 上海三信沛瑞仪器科技有限公司;RD-50DTZ型低速离心机 上海卢湘仪离心机有限公司;HH-6型恒温水浴锅 常州朗越仪器制造有限公司;FD-1型冷冻干燥机 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;VersaMax光栅型酶标仪、SpectraMax i3x连续波长多功能微孔板检测平台 美国Molecular Devices公司;S433D型全自动氨基酸分析仪 德国SyKam公司。

    将南珠贝壳珍珠层粉碎后,用200目筛网过筛,得到珍珠层粉。取珍珠层粉按照1(g):3(mL)的固液比与0.3 mol/L的盐酸溶液混合,室温静置12 h后,进行高压处理(121 ℃,20 min),待冷却至室温后,4000 r/min离心10 min,弃去上清液,得到酸化高压后的珍珠层粉。随后,向珍珠层粉中按照1(g):5(mL)的固液比加入1%的氢氧化钠溶液,55 ℃水浴3 h后,抽滤得到上清液。接着,用盐酸溶液将上清液pH调至等电点3.7,放入4 ℃冰箱静置24 h。将静置分层的珍珠层蛋白提取液以转速4000 r/min离心10 min,收集沉淀进行冷冻干燥,得到的冻干粉即为珍珠层蛋白,将其密封后放置−20 ℃待后续实验使用。

    根据胰蛋白酶(pH8.5,温度37 ℃)、木瓜蛋白酶(pH6,温度55 ℃)、中性蛋白酶(pH6.5,温度55 ℃)、碱性蛋白酶(pH9,温度55 ℃)、菠萝蛋白酶(pH7,温度55 ℃),胃蛋白酶(pH2,温度45 ℃)的最适酶解条件,对珍珠层蛋白进行酶解,加酶量为底物的0.3%,酶解体系底物浓度为3%,恒温水浴酶解3 h。酶解结束时,将样品放入95 ℃水浴锅灭酶15 min,冷却后,在4000 r/min条件下离心20 min取上清液。稀释5倍后测定DPPH自由基清除率。

    结合1.2.2.1的结果,根据胰蛋白酶厂商给出的酶解条件,分别考察酶解温度(27、32、37、42、47 ℃)、酶解时间(1、2、3、4、5 h)、酶解pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)和酶底比(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)对酶解液抗氧化能力的影响,在考察不同浓度梯度时,酶解温度固定为37 ℃,酶解时间固定为3 h,酶解pH固定为8.0,酶底比固定为0.3%。得到酶解液后,稀释5倍测定DPPH自由基清除率。

    结合1.2.2.2单因素实验结果,根据Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken实验设计原理,设计3因素3水平的响应面试验,试验参数如表1所示。

    表  1  响应面试验水平设计
    Table  1.  Box-Behnken level parameters
    因素 编码值 水平
    −1 0 1
    酶解时间(h) A 2 3 4
    酶解温度(℃) B 32 37 42
    酶底比(%) C 0.2 0.3 0.4
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    参照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的方法对珍珠层抗氧化肽进行前处理。称取珍珠层抗氧化肽23.4 mg于水解管中,加入10 mL浓度为6 mol/L的盐酸溶液,氮吹2 min后,迅速封口;在110±1 ℃烘箱放置22 h后拿出冷却到室温,将其定容至50 mL后过滤;取1 mL滤液于100 mL烧杯中,置于60 ℃烘箱蒸干溶液,再加一级水1 mL蒸干,重复2次后,加入2 mL浓度为0.02 mol/L盐酸溶解,过0.22 μm滤膜,转移至离心管备用。

    使用S433D全自动氨基酸分析仪进行氨基酸组成测定,将处理后的珍珠层抗氧化肽加载到LCA K06/Na色谱柱上,装载体积为50 μL,标准氨基酸浓度为100 µmol/L。流动相包括A液(柠檬酸钠,pH3.45)和B液(柠檬酸钠,pH10.85),洗脱泵流速为0.45 mL/min,衍生泵流为0.25 mL/min,检测波长为570 nm和440 nm,58~74 ℃梯度升温。

    参考黄潘钿等[13]的方法,用无水乙醇配制浓度为0.000078 g/mL DPPH溶液,现配现用。分别吸取不同浓度的样品水溶液100 μL于96孔板中,加入100 μL浓度为0.000078 g/mL的DPPH溶液,混匀,在室温下避光反应30 min后,于517 nm下测定吸光值At。同时测定100 μL样品溶液与100 μL无水乙醇混合溶液吸光值Ar,100 μL DPPH溶液与100 μL无水乙醇混合溶液吸光值A0。每组测定设计三个平行,以相同浓度的还原型谷胱甘肽为阳性对照。计算公式见式(1)。

    DPPH(%)=(1AtArA0)×100 (1)

    式中,At:100 μL样品溶液+100 μL DPPH溶液的吸光值;Ar:100 μL样品溶液+100 μL无水乙醇溶液的吸光值;A0:100 μL无水乙醇溶液+100 μL DPPH溶液的吸光值。

    参考黄潘钿[13]的方法,配制浓度为0.0378 g/mL过硫酸钾溶液为A液,浓度为0.00384 g/mL ABTS溶液为B液。取A液0.088 mL与B液5 mL混合,在室温下避光静置过夜(12 h)得到ABTS储存液。测定前将储备液用一级水稀释至734 nm下吸光度为0.7±0.02。分别吸取不同浓度样品水溶液100 μL于96孔板中,加入100 μL ABTS工作液,混匀,在室温下避光反应10 min后,于734 nm下测定吸光值At。同时测定100 μL样品溶液与100 μL一级水混合溶液吸光值Ar,100 μL ABTS工作液与100 μL一级水混合溶液吸光值A0。每组测定设计三个平行,以相同浓度的还原型谷胱甘肽为阳性对照。

    ABTS+(%)=(1AtArA0)×100 (2)

    式中:At:100 μL样品溶液+100 μL ABTS工作液的吸光值;Ar:100 μL样品溶液+100 μL一级水的吸光值;A0:100 μL一级水+100 μL ABTS工作液的吸光值。

    参考李原[14]的方法略作修改,分别吸取不同浓度样品溶液50 μL于黑色96孔板中,加入浓度为0.96 μmol/L的荧光素钠溶液100 μL,37 ℃保温10 min后,迅速加入浓度为153 mmol/L的AAPH溶液50 μL启动反应,以激发波长485 nm,发射波长538 nm进行测定,仪器温度保持在37 ℃,总测定时长为120 min,期间每2 min,一共测定61次,记为样品组(sample)。同时测定以50 μL缓冲溶液代替样品溶液的+AAPH组,以100 μL缓冲溶液代替样品溶液和AAPH溶液的−AAPH组(表2)。每组测定设计三个平行。Trolox溶液(25、50、75、100、125 μmol/L)作为标准参考物,并计算标准曲线:Y=0.3696X+3.934(R2=0.9923)。以上溶液均用磷酸盐缓冲液(75 mmol/L,pH7.4)配制。

    表  2  ORAC实验组
    Table  2.  Experimental group of ORAC
    组别 反应体系
    样品组 50 μL样品+100 μL荧光素钠+50 μL AAPH
    +AAPH组 50 μL缓冲溶液+100 μL荧光素钠+50 μL AAPH
    −AAPH组 100 μL缓冲溶液+100 μL荧光素钠
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    将所有组记录的61次荧光值除以同时间下−AAPH的荧光值,得到相对荧光值FRUx。

    根据荧光曲线下面积(AUC)和相对面积(NetAUC)计算ORAC值。

    AUC=1+RFU1RFU0+RFU2RFU0+RFU3RFU0++RFU59RFU0+RFU60RFU0 (3)

    式中,RFU0:0 min的相对荧光值;RFUx:x min的相对荧光值(例如,RFU5是5 min时的相对荧光值);AUC:荧光曲线下面积;NetAUC:样品组(sample)与+AAPH组的相对荧光曲线下面积;NetAUC=AUCsample−AUC+AAPH

    将NetAUC带入标准曲线得出X值(μmol/L),以微摩尔每升Trolox当量(TE)或每克样品的TE(μmol TE/g或μmol TE/L)表示ORAC值。

    参考黄潘钿等[13]的方法稍作修改。分别吸取不同浓度样液40 μL于96孔板中,加入40 μL浓度为125 U/mL的酪氨酸酶溶液,再加入80 μL PBS(50 mmol/L,pH6.8),37 ℃保温10 min,再加入浓度为0.0002 g/mL的底物(L-酪氨酸或多巴),37 ℃反应30 min后,于475 nm处测定吸光值A1,同时测定A2、A3、A4组。以上溶液均用PBS配制。每组测定三个平行。

    (%)=(1A1A2A3A4)×100 (4)

    式中,A1:40 μL样品+40 μL酶+80 μL PBS+40 μL底物;A2:40 μL样品+40 μL酶+120 μL PBS;A3:40 μL酶+120 μL PBS+40 μL底物;A4:40 μL酶+160 μL PBS。

    酶抑制机理分为可逆性抑制和不可逆性抑制,参照郭璟煊等[15]的方法稍作修改,固定底物L-酪氨酸的浓度为1.1 mmol/L,在酶浓度为125、150和200 U/mL的条件下,分别添加浓度为0、5、10和15 mg/mL的珍珠层抗氧化肽,按照1.2.7.1的方法每隔30 s测定一次吸光值。以酶浓度为横坐标,酶反应初速率为纵坐标作散点图,绘制拟合曲线,探究不同浓度珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶的催化活性与酶浓度的关系。根据交点位置判断珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶的抑制作用机理。

    酶抑制作用类型分别为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制。参照彭思琪[16]的方法稍作修改,固定酶浓度为125 U/mL,在底物L-酪氨酸浓度为0.55、1.1和2.2 mmol/L的条件下,分别添加浓度为0、5、10和15 mg/mL的珍珠层抗氧化肽,按照之前的方法每隔30 s测定一次吸光值。以底物浓度的倒数为横坐标,酶反应初速率的倒数为纵坐标,结合Lineweaver-Burk双倒数作图法作图,根据交点位置判断抑制类型。

    各个实验均进行3次平行实验,采用SPSS软件进行数据处理,P<0.05具有统计学差异,Design-Expert 8.0.6进行响应面分析,Origin 2021和Grahpad Prism 8绘图。

    由于不同种类蛋白酶的专一性和作用位点各不相同,因此不同蛋白酶酶解同一蛋白底物时,水解程度不相同,所产生多肽的结构和分子量大小也会有一定的区别,随之所得酶解产物的抗氧化能力会有所差异[17]。以6种蛋白酶酶解南珠贝壳珍珠层蛋白,其酶解物的DPPH自由基清除率如图1所示。由图可知,采用胰蛋白酶酶解制得的珍珠层酶解液DPPH自由基清除率最高,因此选择胰蛋白酶作为后续实验的水解酶。

    图  1  六种蛋白酶对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响
    注:不同字母表示组间存在显著性差异,P<0.05,图2~图5图9~图12同。
    Figure  1.  Effects of six kinds of proteases on the scavenging rate of DPPH free radicals in the hydrolysate of nacre

    温度会影响底物与酶的结合,由图2所示,当温度在27~37 ℃范围内时,珍珠层酶解液的DPPH自由基清除率随酶解温度的升高而增大,在37 ℃时达到最大值,为72.88%±0.44%,而当温度大于37 ℃时,DPPH自由基清除率随着温度的升高而降低。其原因在于,当温度低于37 ℃时,温度的升高有利于激活酶的活性位点,从而促进底物与酶的结合[18];而当温度高于37 ℃后,会导致蛋白酶分子结构的次级键解离,导致蛋白酶变性,酶活性降低[19]。结合实验结果初步选定酶解温度为37 ℃左右。

    图  2  酶解温度对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  2.  Effect of enzymatic hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图3所示,当酶解时间低于3 h时,珍珠层酶解液的DPPH自由基清除率随酶解时间的增加而增大,在3 h时达到峰值,为72.28%±0.62%,但酶解时间超过3 h时,珍珠层酶解液的DPPH自由基清除率随着时间的增长而减小。其原因可能是当酶解时间较短时,部分底物没有被酶解,此时处于低抗氧化活性的大分子蛋白质状态,而随着酶解时间的延长,大分子的蛋白质被继续酶解,生成具有较高活性的小分子肽段[20]。但酶解时间过长,会导致底物过度水解,多肽的氨基酸组成和构象会发生改变,从而造成多肽抗氧化活性的降低[21]。因此,选择酶解时间为3 h左右作为后续工艺优化条件。

    图  3  酶解时间对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  3.  Effect of enzymatic hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图4所示,当反应体系中酶底比从0.1%逐渐升高至0.3%时,珍珠层酶解液的DPPH自由基清除率有显著的提高(P<0.05),酶底比为0.3%时达到最大值,为70.81%±0.53%;而将底物浓度继续扩大直至0.5%时,DPPH自由基清除率逐渐降低。其原因可能是当酶浓度较低时,底物与酶的结合少,蛋白质水解程度低,所产生的具有抗氧化活性的肽段也相对较少,因此随着酶量的增加,蛋白质被充分酶解,具有抗氧化活性的肽含量也随之增加[22]。但反应体系中酶浓度过高的话,部分酶会与已生成的多肽接触,使其水解成分子量更小的肽段甚至是游离氨基酸,造成具有抗氧化活性的肽段含量降低,因此导致体系DPPH自由基清除率下降[22]。结合实验结果,选取酶底比为0.3%作为后续响应面优化试验参数。

    图  4  酶底比对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  4.  Effect of enzyme to substrate ratio on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图5可知,当pH为7时珍珠层酶解液的DPPH自由基清除率最大,为75.28%±0.67%,pH大于7时,DPPH自由基清除率随之减小。其原因是由于蛋白酶的催化能力与所处反应体系的pH密切相关,反应体系的pH会影响蛋白酶活性部位的构象及酶-底物复合物的解离,从而影响蛋白酶的稳定性、酶与底物的结合以及酶解产物,最终影响酶的催化效率[23]。因此,选择pH7作为后续实验的酶解pH。

    图  5  酶解pH对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  5.  Effect of enzymatic hydrolysis pH on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    在单因素实验基础上,选取酶解时间(A)、酶解温度(B)和酶底比(C)作为自变量,以珍珠层酶解液的DPPH自由基清除率作为响应值(Y),设计3因素3水平的响应面试验,优化酶解工艺,实验设计与结果见表3

    表  3  响应面试验设计及结果
    Table  3.  Box-behnken design and results for response surface analysis
    试验号 A
    酶解时间
    B
    酶解温度
    C
    酶底比
    Y
    DPPH自由基清除率(%)
    1 1 0 1 70.99
    2 0 0 0 75.88
    3 1 1 0 71.07
    4 −1 0 1 66.38
    5 −1 1 0 70.77
    6 0 −1 1 71.41
    7 −1 0 1 69.26
    8 0 −1 1 68.96
    9 0 0 0 76.43
    10 0 1 1 69.14
    11 0 0 0 77.10
    12 0 1 1 71.62
    13 1 0 1 67.21
    14 0 0 0 76.67
    15 −1 −1 0 70.53
    16 1 −1 0 70.82
    17 0 0 0 75.00
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    运用Design-Expert 8.0.6软件对表4数据进行拟合分析后,得二次回归方程为:

    表  4  方差分析
    Table  4.  Variance analysis
    方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性
    模型 173.6367 9 19.2930 38.8548 <0.0001 ***
    A-酶解时间 1.2392 1 1.2392 2.4956 0.1582
    B-酶解温度 0.0959 1 0.0959 0.1932 0.6735
    C-酶底比 16.8042 1 16.8042 33.8426 0.0007 **
    AB 0.0000 1 0.0000 0.0001 0.9943
    AC 0.2052 1 0.2052 0.4133 0.5408
    BC 0.0001 1 0.0001 0.0003 0.9877
    A2 55.2302 1 55.2302 111.2301 <0.0001 ***
    B2 13.6626 1 13.6626 27.5156 0.0012 **
    C2 71.9509 1 71.9509 144.9047 <0.0001 ***
    残差 3.4758 7 0.4965
    失拟项 0.8566 3 0.2855 0.4360 0.7394 不显著
    纯误差 2.6192 4 0.6548
    总和 177.1125 16
    注:P<0.05,差异显著,以*表示;P<0.01,差异极显著,以**表示;P<0.0001,差异极显著,以***表示;P>0.05,差异不显著。
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    Y=76.22+0.39A+0.11B+1.45C+2.62AB+0.23AC+5.63BC−3.62A2−1.8B2−4.13C2

    表4方差分析可知:模型F值为38.8548,P值<0.0001,表明该设计模型具有极显著差异,试验方法可信度高;失拟项值为0.7394,大于0.05,不显著,表明该模型的试验值与预测值线性相关,具有较好的拟合度[24]。相关系数R2=0.9804>0.9,表明该模型相关度好。校正系数R2adj=0.9551,说明有95.51%的响应值变化可用于珍珠层酶解液的DPPH自由基清除率的分析与检测。由图6~图8可知,酶解时间、酶解温度和酶底比三因素交互作用对于珍珠层酶解液DPPH自由基清除率的影响均呈先上升后下降的趋势,说明在试验范围内存在最大值。三因素交互作用的响应曲面弯曲程度越大,则两因素的交互作用对珍珠层酶解液DPPH自由基清除率的影响越大[25]。此外,模型因素F值越大,对于试验结果的影响也越大。结合表4方差分析结果可知,交互项不具有显著性,酶解时间与酶底比的交互影响对于酶解物DPPH自由基清除率影响最大,酶解温度和酶底比的影响次之,酶解时间和酶解温度的影响最弱,而单个因素对于响应值的影响为酶底比>酶解时间>酶解温度。

    图  6  酶解时间和酶解温度对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  6.  Effects of enzymatic hydrolysis time and temperature on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate
    图  8  酶解温度和酶底比对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  8.  Effects of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic substrate ratio on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    通过Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行分析,模型预测最佳酶解工艺为酶解时间3.06 h、酶解温度37.15 ℃、酶底比0.32%,预测在此条件下所得到的酶解液的DPPH自由基清除率为76.36%。结合实验室实际情况,将酶解条件修整为时间3 h,温度37 ℃,酶底比0.32%。最终在此条件下制备的酶解液DPPH自由基清除率为76.34%±0.24%,与预测结果相近,无显著性差异(P>0.05),说明该模型优化结果较为准确。将最优酶解工艺制备得到的珍珠层酶解液冻干得到固体,即为珍珠层抗氧化肽。

    图  7  酶解时间和酶底比对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  7.  Effects of enzymatic hydrolysis time and enzymatic substrate ratio on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    南珠贝壳珍珠层抗氧化肽的氨基酸组成分析结果如表5所示,其中疏水性氨基酸高达33.9%,酸性氨基酸和碱性氨基酸分别占总氨基酸的29.58%和18.36%,芳香族氨基酸占比19.48%。相关研究表明,疏水性氨基酸是活性肽自由基抑制能力的关键因素[26],其结构中的脂肪烃侧链容易与自由基结合[27],这也是珍珠层抗氧化肽自由基清除率高的原因之一。同时,珍珠层抗氧化肽中的酸性氨基酸能够通过提供质子来猝灭未配对电子或自由基[2728],从而影响其自由基清除能力。不仅如此,芳香族氨基酸和碱性氨基酸也是有效的自由基清除剂[2830]。因此,在这四种类型氨基酸的共同作用下,珍珠层抗氧化肽表现出了良好的抗氧化活性。

    表  5  氨基酸组成分析
    Table  5.  Analysis of amino acids contents
    氨基酸种类 相对含量(%)
    Asp(天冬氨酸) 19.34
    Thr(苏氨酸) 0.92
    Ser(丝氨酸) 1.89
    Glu(谷氨酸) 10.23
    Gly(甘氨酸) 6.93
    Ala(丙氨酸) 4.48
    *Cys(胱氨酸) 1.61
    Val(缬氨酸) 1.96
    Met(蛋氨酸) 1.65
    Ile(异亮氨酸) 2.07
    Leu(亮氨酸) 6.76
    Tyr(酪氨酸) 13.74
    Phe(苯丙氨酸) 5.73
    *His(组氨酸) 8.59
    *Lys(赖氨酸) 2.23
    *Arg(精氨酸) 7.53
    Pro(脯氨酸) 4.31
    EAA/TAA(%) 21.33
    HAA/TAA(%) 33.9
    ARAA/TAA(%) 19.48
    AAA/TAA(%) 29.58
    BAA/TAA(%) 18.36
    注:EAA:必需氨基酸;*:半必需氨基酸;TAA:总氨基酸;AAA:酸性氨基酸(Asp、Glu);BAA:碱性氨基酸(His、Arg、Lys);HAA:疏水性氨基酸(Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Gly);ARAA:芳香族氨基酸(Trp、Tyr、Phe);由于氨基酸分析采用酸水解法处理样品,所得检测结果中色氨酸全部破坏。
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    此外,珍珠层抗氧化肽中的亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和半胱氨酸有助于抑制酪氨酸酶的活性[31],这8种氨基酸在珍珠层抗氧化肽中占比达到30.88%,为珍珠层抗氧化肽的酪氨酸酶抑制能力奠定了物质基础。

    图9所示,在珍珠层抗氧化肽和还原型谷胱甘肽浓度为0.1~4 mg/mL范围时,其DPPH自由基清除率随着浓度的增大而增大,呈现出良好的量效关系,在浓度为4 mg/mL时分别达到62.43%±0.53%和97.72%±1.09%。在这6个浓度下,阳性对照的DPPH自由基清除能力远远高于珍珠层抗氧化肽。相关研究表明,珍珠蚌多肽DPPH自由基清除率的IC50为3.140 mg/mL[32],而本实验珍珠层抗氧化肽DPPH自由基清除率的IC50为2.342 mg/mL,清除效果明显高于珍珠蚌多肽。由此可见,珍珠层抗氧化肽具有良好的DPPH自由基清除能力。

    图  9  不同浓度珍珠层抗氧化肽和还原型谷胱甘肽的DPPH自由基清除率
    Figure  9.  DPPH radical scavenging rates of nacre antioxidant peptides and GSH in different concentrations

    图10可知,珍珠层抗氧化肽和还原型谷胱甘肽的ABTS+自由基清除率随着其浓度的增大而增大,呈现出良好的线性关系,且珍珠层抗氧化肽的ABTS+自由基清除率在浓度为2 mg/mL时为99.97%±1.22%,优于阳性对照的98.07%±0.07%,清除率接近100%。Yu等[33]的研究表明,太平洋牡蛎超分子多肽自组装材料(CAPs)浓度为5 mg/mL时,ABTS+自由基清除率约为50%,而本实验制备得到的珍珠层抗氧化肽ABTS+的IC50值为0.1735 mg/mL,显著低于CAPs。因此,珍珠层抗氧化肽具有很好的ABTS+自由基清除能力。

    图  10  不同浓度珍珠层抗氧化肽和还原型谷胱甘肽的ABTS+自由基清除率
    Figure  10.  ABTS+ radical scavenging rates of nacre antioxidant peptides and GSH in different concentrations

    图11A可知,与空白+AAPH组相比,珍珠层抗氧化肽的添加可以明显缓解荧光素荧光信号的衰减,曲线下面积(AUC)越大,抗氧化活性越强,因此,多浓度的珍珠层抗氧化肽均表现出良好的抗氧化活性,并且呈一定的量效关系。将标准参考物Trolox代替样品进行实验,得到了标准曲线Y=0.3696X+3.934(R2=0.9923),其中“X”代表Trolox浓度,“Y”代表Net AUC。根据标准曲线得出的数据作柱状图11B,即表示相同Net AUC下,不同浓度的珍珠层抗氧化肽所对应的Trolox浓度。由图11B可知,浓度为50~90 μg/mL的珍珠层抗氧化肽所对应的Trolox浓度为50.36±2.58~105.36±1.33 μmol/L,以该数据计算得到的Trolox当量表示珍珠层抗氧化肽的ORAC值,即为1124.86 μmol TE/g冻干粉。相关研究表明[34]金枪鱼蛋白水解物(TPH)的ORAC值为576.15±1.77 μmol/L TE/g蛋白,远低于珍珠层抗氧化肽,由此说明珍珠层抗氧化肽有很好的氧自由基吸收能力。

    图  11  珍珠层抗氧化肽荧光衰退曲线(A)和相同Net AUC下珍珠层抗氧化肽物对应的Trolox浓度(B)
    Figure  11.  Fluorescence decay curve of the optimal digest hydrolysate of nacre antioxidant peptides (A) and Trolox concentration corresponding to the optimal digest hydrolysate of nacre antioxidant peptides under the same Net AUC (B)

    图12可知,在珍珠层抗氧化肽浓度为5~25 mg/mL时,其酪氨酸酶抑制率随着浓度的增加而增大,呈现出良好的量效关系。有研究报道,海地瓜胶原蛋白多肽在浓度为40 mg/mL时,对酪氨酸酶的抑制率为50%左右[35],而珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶抑制率的IC50值为12.38 mg/mL,远低于海地瓜胶原蛋白多肽,说明其具有良好的酪氨酸酶抑制能力。

    图  12  不同浓度珍珠层抗氧化肽的酪氨酸酶抑制率
    Figure  12.  Tyrosinase inhibition rates of nacre antioxidant peptides in different concentrations

    以酶浓度为横坐标,酶反应初速率为纵坐标作图如下,由图13可知,这是一组交于原点的直线,酶浓度越大时,酶反应初速率越大;但随着珍珠层抗氧化肽浓度的增加,酶反应初速率随之变小,斜率变小。在酶的可逆反应中,抑制剂的浓度改变,斜率也随之改变,且直线相交于原点;但在不可逆反应中,即使抑制剂的浓度改变,斜率依然不变,并且相互平行,不会相交[36]。因此,珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶的抑制机理属于可逆反应,说明其主要通过与酶发生非共价相互作用来抑制酶的活性,不会使酶发生永久性失活[37]

    图  13  珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶抑制作用机理
    Figure  13.  Mechanism of inhibition of tyrosinase by nacre antioxidant peptides

    以底物浓度的倒数为横坐标,酶反应初速率的倒数为纵坐标做Lineweaver-Burk双倒数曲线图,得到一组斜率为Km/Vm,截距为1/Vm的直线。结果如图14所示,直线相交于第三象限,且随着珍珠层抗氧化肽浓度的增大,Km和Vm随之减小,符合竞争性和非竞争性混合型抑制类型[38],此时,抑制剂既能与游离的酶结合,又能与酶-底物络合物结合,从而达到抑制效果[39]。珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶抑制动力学参数如表6所示,其中,Lineweaver-Burk方程里“X”代表底物浓度的倒数,“Y”代表反应初速率的倒数。

    图  14  珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶的抑制作用类型
    Figure  14.  Types of inhibition of tyrosinase by nacre antioxidant peptides
    表  6  珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶抑制动力学参数
    Table  6.  Kinetic parameters of inhibition of tyrosinase by nacre antioxidant peptides
    珍珠层抗氧化肽浓度
    (mg/mL)
    Lineweaver-Burk
    方程
    Km
    (mmol/L)
    Vm
    (A/min)
    0 Y=237.69X+96.64 2.46 0.0103
    5 Y=279.63X+124.64 2.24 0.0080
    10 Y=320.46X+148.99 2.15 0.0067
    15 Y=378.76X+182.87 2.07 0.0054
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    本研究以从南珠贝壳珍珠层中提取的蛋白为原料,通过酶解得到珍珠层抗氧化肽。通过氨基酸组成分析可知,与抗氧化能力相关的四种氨基酸:疏水性氨基酸(33.90%)、芳香族氨基酸(19.48%)、酸性氨基酸(29.58%)和碱性氨基酸(18.36%),在总氨基酸含量中占比较高,在这四种类型氨基酸的共同作用下,珍珠层抗氧化肽表现出了良好自由基清除活性。同时,有助于酪氨酸酶抑制能力的氨基酸占比为30.88%,表明珍珠层抗氧化肽具备开发成美白剂的物质基础,实验得出珍珠层抗氧化肽通过混合型可逆抑制的方式抑制酪氨酸酶活力,并具有良好的酪氨酸酶抑制活性。因此珍珠层抗氧化肽有望被开发成具有双重功效的新型抗氧化剂和美白剂,为实现南珠贝壳珍珠层的高值化利用,带动经济发展奠定了理论基础。由于珍珠层抗氧化肽与其抗氧化和酪氨酸酶抑制活性之间的构效关系尚不清楚,后续我们将对珍珠层抗氧化肽进行分离纯化与鉴定,深入探究其抗氧化和酪氨酸酶抑制活性机制。

  • 图  1   六种蛋白酶对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响

    注:不同字母表示组间存在显著性差异,P<0.05,图2~图5图9~图12同。

    Figure  1.   Effects of six kinds of proteases on the scavenging rate of DPPH free radicals in the hydrolysate of nacre

    图  2   酶解温度对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  2.   Effect of enzymatic hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图  3   酶解时间对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  3.   Effect of enzymatic hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图  4   酶底比对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  4.   Effect of enzyme to substrate ratio on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图  5   酶解pH对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  5.   Effect of enzymatic hydrolysis pH on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图  6   酶解时间和酶解温度对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  6.   Effects of enzymatic hydrolysis time and temperature on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图  8   酶解温度和酶底比对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  8.   Effects of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic substrate ratio on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图  7   酶解时间和酶底比对珍珠层酶解液DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  7.   Effects of enzymatic hydrolysis time and enzymatic substrate ratio on DPPH radical scavenging rate of nacre enzymatic hydrolysate

    图  9   不同浓度珍珠层抗氧化肽和还原型谷胱甘肽的DPPH自由基清除率

    Figure  9.   DPPH radical scavenging rates of nacre antioxidant peptides and GSH in different concentrations

    图  10   不同浓度珍珠层抗氧化肽和还原型谷胱甘肽的ABTS+自由基清除率

    Figure  10.   ABTS+ radical scavenging rates of nacre antioxidant peptides and GSH in different concentrations

    图  11   珍珠层抗氧化肽荧光衰退曲线(A)和相同Net AUC下珍珠层抗氧化肽物对应的Trolox浓度(B)

    Figure  11.   Fluorescence decay curve of the optimal digest hydrolysate of nacre antioxidant peptides (A) and Trolox concentration corresponding to the optimal digest hydrolysate of nacre antioxidant peptides under the same Net AUC (B)

    图  12   不同浓度珍珠层抗氧化肽的酪氨酸酶抑制率

    Figure  12.   Tyrosinase inhibition rates of nacre antioxidant peptides in different concentrations

    图  13   珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶抑制作用机理

    Figure  13.   Mechanism of inhibition of tyrosinase by nacre antioxidant peptides

    图  14   珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶的抑制作用类型

    Figure  14.   Types of inhibition of tyrosinase by nacre antioxidant peptides

    表  1   响应面试验水平设计

    Table  1   Box-Behnken level parameters

    因素 编码值 水平
    −1 0 1
    酶解时间(h) A 2 3 4
    酶解温度(℃) B 32 37 42
    酶底比(%) C 0.2 0.3 0.4
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    表  2   ORAC实验组

    Table  2   Experimental group of ORAC

    组别 反应体系
    样品组 50 μL样品+100 μL荧光素钠+50 μL AAPH
    +AAPH组 50 μL缓冲溶液+100 μL荧光素钠+50 μL AAPH
    −AAPH组 100 μL缓冲溶液+100 μL荧光素钠
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    表  3   响应面试验设计及结果

    Table  3   Box-behnken design and results for response surface analysis

    试验号 A
    酶解时间
    B
    酶解温度
    C
    酶底比
    Y
    DPPH自由基清除率(%)
    1 1 0 1 70.99
    2 0 0 0 75.88
    3 1 1 0 71.07
    4 −1 0 1 66.38
    5 −1 1 0 70.77
    6 0 −1 1 71.41
    7 −1 0 1 69.26
    8 0 −1 1 68.96
    9 0 0 0 76.43
    10 0 1 1 69.14
    11 0 0 0 77.10
    12 0 1 1 71.62
    13 1 0 1 67.21
    14 0 0 0 76.67
    15 −1 −1 0 70.53
    16 1 −1 0 70.82
    17 0 0 0 75.00
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    表  4   方差分析

    Table  4   Variance analysis

    方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性
    模型 173.6367 9 19.2930 38.8548 <0.0001 ***
    A-酶解时间 1.2392 1 1.2392 2.4956 0.1582
    B-酶解温度 0.0959 1 0.0959 0.1932 0.6735
    C-酶底比 16.8042 1 16.8042 33.8426 0.0007 **
    AB 0.0000 1 0.0000 0.0001 0.9943
    AC 0.2052 1 0.2052 0.4133 0.5408
    BC 0.0001 1 0.0001 0.0003 0.9877
    A2 55.2302 1 55.2302 111.2301 <0.0001 ***
    B2 13.6626 1 13.6626 27.5156 0.0012 **
    C2 71.9509 1 71.9509 144.9047 <0.0001 ***
    残差 3.4758 7 0.4965
    失拟项 0.8566 3 0.2855 0.4360 0.7394 不显著
    纯误差 2.6192 4 0.6548
    总和 177.1125 16
    注:P<0.05,差异显著,以*表示;P<0.01,差异极显著,以**表示;P<0.0001,差异极显著,以***表示;P>0.05,差异不显著。
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    表  5   氨基酸组成分析

    Table  5   Analysis of amino acids contents

    氨基酸种类 相对含量(%)
    Asp(天冬氨酸) 19.34
    Thr(苏氨酸) 0.92
    Ser(丝氨酸) 1.89
    Glu(谷氨酸) 10.23
    Gly(甘氨酸) 6.93
    Ala(丙氨酸) 4.48
    *Cys(胱氨酸) 1.61
    Val(缬氨酸) 1.96
    Met(蛋氨酸) 1.65
    Ile(异亮氨酸) 2.07
    Leu(亮氨酸) 6.76
    Tyr(酪氨酸) 13.74
    Phe(苯丙氨酸) 5.73
    *His(组氨酸) 8.59
    *Lys(赖氨酸) 2.23
    *Arg(精氨酸) 7.53
    Pro(脯氨酸) 4.31
    EAA/TAA(%) 21.33
    HAA/TAA(%) 33.9
    ARAA/TAA(%) 19.48
    AAA/TAA(%) 29.58
    BAA/TAA(%) 18.36
    注:EAA:必需氨基酸;*:半必需氨基酸;TAA:总氨基酸;AAA:酸性氨基酸(Asp、Glu);BAA:碱性氨基酸(His、Arg、Lys);HAA:疏水性氨基酸(Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Gly);ARAA:芳香族氨基酸(Trp、Tyr、Phe);由于氨基酸分析采用酸水解法处理样品,所得检测结果中色氨酸全部破坏。
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    表  6   珍珠层抗氧化肽对酪氨酸酶抑制动力学参数

    Table  6   Kinetic parameters of inhibition of tyrosinase by nacre antioxidant peptides

    珍珠层抗氧化肽浓度
    (mg/mL)
    Lineweaver-Burk
    方程
    Km
    (mmol/L)
    Vm
    (A/min)
    0 Y=237.69X+96.64 2.46 0.0103
    5 Y=279.63X+124.64 2.24 0.0080
    10 Y=320.46X+148.99 2.15 0.0067
    15 Y=378.76X+182.87 2.07 0.0054
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-04-21
  • 网络出版日期:  2025-01-07
  • 刊出日期:  2025-03-14

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