Effects of Pre-Freezing and Vacuum Freeze-drying on Physicochemical Properties and Gelling Characteristics of Myofibrillar Protein from Nemipterus virgatus
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摘要: 为研究真空冷冻干燥对鱼糜粉品质的影响，以金线鱼肌原纤维蛋白为研究对象，分别研究真空冷冻干燥的预冻处理和真空冷冻干燥对肌原纤维蛋白（myofibrillar protein, MP）理化性质的影响，并探究谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase, TG酶）协同下肌原纤维蛋白凝胶特性的变化规律。结果显示，与未处理组相比，经预冻和真空冷冻干燥处理后的肌原纤维蛋白浊度和粒径显著增加（P<0.05），溶解度分别降低32.3%和42.0%，表明蛋白质在处理过程中出现聚集变性；总巯基含量分别降低17.3%和41.9%，羰基含量分别增加112.2%和181.5%，证实其发生氧化变性；α-螺旋结构含量降低和最大内源荧光强度下降（从4903下降到4789、1425），揭示蛋白质有序结构遭到破坏和微环境发生改变。肌原纤维蛋白经预冻处理与真空干燥处理均导致储能模量G′下降，其中真空冷冻干燥组的G′值最小，但添加TG酶可以在一定程度上提高G′值；凝胶微观结构显示，未处理组的凝胶微观网状结构清晰，而预冻组和真空冷冻干燥组的凝胶结构变得不均匀或未见明显凝胶网状结构，添加TG酶则促使肌原纤维蛋白凝胶网状结构变得致密均匀。综上可知，真空冷冻干燥处理中的预冻阶段与干燥阶段均会对肌原纤维蛋白理化性质和凝胶特性造成影响，其中预冻阶段引起的冷冻变性对蛋白聚集和氧化影响更大，而干燥阶段的脱水变性则对蛋白结构造成更大影响，TG酶可以提升经预冻和真空冷冻干燥之后的肌原纤维蛋白凝胶特性。Abstract: To investigate the effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on the properties of frozen surimi powder, myofibrillar protein (MP) from Nemipterus virgatus was taken as the research object. The changes of physicochemical properties of MP during the processes of pre-freezing and vacuum freeze-drying, and the effect of transglutaminase (TGase) on the gelling characteristics of MP were investigated. The results showed that compared with the untreated group, the turbidity and particle size of MP treated by pre-freezing and vacuum freeze-drying increased significantly (P<0.05) with the decreased solubility by 32.3% and 42.0%, indicating that proteins aggregation occurred during the processing. The decreased total sulfhydryl content by 17.3% and 41.9%, and the increased carbonyl content by 112.2% and 181.5%, respectively, showing that oxidative denaturation occurred. The content of α-helix structure decreased and the maximum endogenous fluorescence intensity of MP treated by pre-freezing and vacuum freeze-drying decreased from 4903 to 4789 and 1425, respectively, revealing that the ordered structure of protein was destroyed and the microenvironment was changed. The gels prepared by the untreated group had the highest storage modulus G′ value, followed by the pre-freezing treatment group and then the vacuum freeze-drying group. The addition of TGase could improve the rheological properties of MP. The gel network structure of MP was clearly visible in the untreated group, and the uneven network structure appeared in the pre-freezing group, while the vacuum freeze-drying group could not form gel network structure. The addition of TGase promoted the formation of denser and more uniform gel network structure of MP. In summary, the pre-freezing stage and the drying stage in the vacuum freeze-drying could affect the physicochemical properties and gelling characteristics of MP, in which the freezing denaturation of MP caused by the pre-freezing treatment had a significant impact on the aggregation and oxidation of MP, while the dehydration denaturation of MP during the drying phase had a more pronounced effect on the structure of MP. Furthermore, the addition of TGase could improve the gelling characteristics of MP after the pre-freezing and vacuum freeze-drying treatments.
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冷冻鱼糜是指将去皮去骨的鱼肉经过漂洗、精滤、脱水后添加一定的抗冻剂，并进行冷冻保存的产品，是当前鱼糜制品加工最常用的预处理原料[1]。冷冻鱼糜在运输往鱼糜制品加工厂过程中通常需要保持低温环境，其运输成本较高。由于冷冻鱼糜要制成鱼糜制品，需要进一步的解冻、加盐擂溃、成型等，其加工工序复杂，产品形式单一，且其在运输过程中又需要冷冻环境，能耗高。相比之下，以粉末形式存在的真空冷冻干燥鱼糜粉具有储运成本低（常温保存）、易于工业生产应用（无需解冻切割）以及产品多样化等优点，已逐渐成为鱼糜领域的研究热点之一[2−3]。
真空冷冻干燥（vacuum freeze-drying）又称冻干，是将物料在低温下冻结成固态，然后在真空条件下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术，能较好保持物料的形态与品质，是目前制备鱼糜粉的主要方法之一[4]。肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）作为鱼糜的主要组成成分，在鱼糜凝胶形成过程中发挥着至关重要的作用。也有研究报道指出冻干会导致MP变性，进而影响其蛋白功能特性，如Niu等[5]发现冻干会导致MP表面疏水性增加，溶解度和Ca2+-ATPase活性降低，从而影响其乳化性；Chen等[6]从热风干燥、热泵干燥和冻干后的金鲳鱼中提取MP，发现冻干虽然较热风和热泵干燥更能维持MP的天然结构，但依旧会导致MP羰基含量增加，蛋白质发生氧化变性；Yang等[7]研究发现MP冻干后凝胶性弱于天然蛋白，表明冻干影响MP凝胶特性。肌原纤维蛋白的真空冷冻干燥需要经过预冻和真空干燥两个阶段，由于蛋白所处的环境不同，其在冷冻与干燥过程中发生变性的程度以及变性的内在机理可能也存在明显差异。系统研究分析肌原纤维蛋白在预冻与真空干燥这两个阶段分别发生蛋白变性的规律与内在机理，对有效防止真空冷冻干燥蛋白的变性具有重要的理论研究意义。而当前国内外研究主要集中在冻干前后的蛋白变化，MP在预冻和干燥阶段理化性质的具体变化迄今为止未见报道，亟待进一步阐明。
TG酶能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-（γ-谷酰胺）-赖氨酸的异型肽键，促使蛋白质分子内交联，蛋白质分子间交联以及蛋白质和氨基酸之间的交联，从而改变蛋白质的功能性质[8]。鱼糜生产过程中通常加入TG酶来促进肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）发生交联，进而改善凝胶性质，如提高凝胶强度、持水性、硬度等[9−10]。Guo等[3]在冷冻鱼糜和冻干鱼糜粉中添加TG酶，发现TG酶的加入可以促进肌球蛋白交联，从而改善冻干鱼糜粉的凝胶质构特性。但是目前关于TG酶对真空冷冻干燥中不同阶段的肌原纤维蛋白凝胶性质的作用效果还未见报道。
金线鱼（Nemipterus virgatus）属于白色肉鱼类，其肉质细嫩、蛋白含量高且脂肪含量较低，具有较高的营养价值，是常见冷冻鱼糜及鱼糜制品的重要原料[11]。本文以金线鱼肌原纤维蛋白为研究对象，测定其在真空冷冻干燥中的预冻阶段和干燥阶段的理化性质变化，并探究TG酶对真空冷冻干燥中不同阶段的肌原纤维蛋白凝胶特性的影响，旨在探明预冻阶段和干燥阶段对肌原纤维蛋白的具体影响，为冻干鱼糜粉的品质控制提供一定的理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
金线鱼（300~400 g/条） 福建省厦门市夏商水产批发市场；TG酶 南宁庞博生物工程有限公司；Ellman′s试剂 中国Thermo Scientific公司；8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammoniumsalt，ANS） 美国Sigma公司；Ca2+-ATPase试剂盒 南京建成生物工程研究所；SDS-PAGE标准蛋白 Thermo Fisher Scientific公司（美国）；十二烷基硫酸钠（SDS，电泳纯）、丙烯酰胺 美国Bio-Rad公司；氯化钠等其他试剂均为国产分析纯。
搅拌机LZ233 中国Midea公司；Avanti J-26S XP大型台式高速冷冻离心机 美国Beckman公司；Alpha 1-4 LDplus真空冷冻干燥机 中国无锡沃信仪器制造有限公司；759 s紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；Nano ZS90马尔文粒度仪 英国Mallvern公司；Chirascan圆二色光谱仪、Phenom Pro台式扫描电子显微镜 荷兰Phenom-World Pr公司；WB-14恒温水浴锅 英国Memmert公司；FP-8200荧光分光光度计 日本Jasco公司；Mini-PROTEAN蛋白质电泳装置 美国Bio-Rad公司；G:BOX凝胶成像仪 英国Syngene公司；DHR-2流变仪 美国TA仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 肌原纤维蛋白的提取
肌原纤维蛋白的提取参考Jiang等[12]的方法并作适当修改，无特殊说明，以下实验均在4 ℃条件下进行。将金线鱼洗净后，去头，去内脏，收集背部骨骼肌部分。加入5倍体积的预冷buffer A（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）的缓冲液，混匀后进行组织捣碎。将匀浆液在8000×g转速下离心10 min，取沉淀，重复上述操作三次。最后一次取沉淀的上层柔软部分，并加入5倍体积的预冷buffer A，匀浆混匀后用两层纱布进行过滤。得到的滤液在上述离心条件下离心，取沉淀的上层柔软部分，所得即为新鲜肌原纤维蛋白。以牛血清蛋白为标准，采用Bradford法测定蛋白质浓度。将肌原纤维蛋白储存在4 ℃环境中，并于48 h内使用。
1.2.2 肌原纤维蛋白的处理
为考察真空冷冻干燥过程中肌原纤维蛋白的具体变化情况，分别制备三种肌原纤维蛋白样品：未处理的肌原纤维蛋白为空白组，命名为MP；肌原纤维蛋白于−60 ℃冰箱中预冻12 h为预冻组，命名为FMP，使用前于4 ℃解冻12 h，并于48 h内使用；肌原纤维蛋白于−60 ℃冰箱中预冻12 h，再真空冷冻干燥48 h为冻干组，命名为FDMP，干燥后放入塑封袋于4 ℃下储存，并于48 h内使用。
1.2.3 肌原纤维蛋白凝胶的制备
将MP、FMP、FDMP溶解于buffer B（20 mmol/L Tris-HCl，0.6 mol/L NaCl，pH8.0），并调整蛋白质浓度为50 mg/mL。为考察TG酶对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响，另在MP、FMP、FDMP三组样品中分别加入1% TG酶（w/w），并命名为MP-TG、FMP-TG、FDMP-TG。将以上6组溶胶样品采用二段加热（40 ℃加热30 min后90 ℃加热30 min）制备凝胶。
1.2.4 肌原纤维蛋白理化性质测定
1.2.4.1 溶解度
参考Du等[13]的方法并作适当修改，将三组（MP、FMP和FDMP）蛋白样品溶解于buffer B，采用Bradford法测定离心（10000×g，15 min）前和离心后上清蛋白质浓度，溶解度以上清液中蛋白质浓度与离心前的蛋白质浓度的比率来表示。
1.2.4.2 浊度
参照Liu等[14]的方法并作适当修改，将三组蛋白样品用buffer B稀释至0.1 mg/mL，使用紫外分光光度计在340 nm处测定吸光度，即为肌原纤维蛋白的浊度值。
1.2.4.3 粒径和粒径分布
参照Li等[15]的方法并作适当修改，将三组蛋白样品稀释至0.1 mg/mL，使用纳米粒度仪对样品粒径进行测量，将1 mL样品装载于塑料比色皿中，环境温度25 ℃，检测角90°。
1.2.4.4 总巯基
参照Liu等[16]的方法并作适当修改，用buffer B调整三组蛋白样品浓度为1 mg/mL，0.5 mL的蛋白溶液加2 mL的含8 mol/L尿素，10 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），振荡混匀后加入0.5 mL 10 mmol/L 5,5-二硫代二硝基苯甲酸（DTNB），室温避光25 min，以buffer B为空白，使用紫外分光光度计在412 nm处测定吸光度，其中摩尔消光系数为13600 L/（mol.cm）。
1.2.4.5 羰基
参照Levine等[17]的方法并作适当修改，用buffer B调整三组蛋白浓度为1 mg/mL，0.5 mL的蛋白溶液加0.5 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼（含2 mol/L HCl），空白组加2 mol/L HCl，室温避光1 h，每隔10 min振荡一次。反应结束后加0.5 mL 20%三氯乙酸，混匀后10000 r/min，离心10 min取沉淀。沉淀加1 mL乙醇:乙酸乙酯（v/v=1），混匀后10000 r/min，离心10 min取沉淀，重复此操作至沉淀无色。沉淀加2 mL 6 mol/L盐酸胍，混匀后于37 ℃水浴20 min，最后10000 r/min，离心10 min，上清液在370 nm处测定吸光度，其中摩尔消光系数为22000 L/（mol﹒cm）。
1.2.4.6 圆二色光谱（CD）
使用圆二色光谱仪测定蛋白质的二级结构，参考Cao等[18]的方法并作适当修改。将三组蛋白样品稀释至0.2 mg/mL，并以buffer B为空白扫描，扫描范围为200~260 nm，扫描速度为10 nm/min。
1.2.4.7 表面疏水性
参照Riebroy等[19]的方法并作适当修改，用buffer B将三组蛋白样品稀释成0.0125~0.05 mg/mL。为考察MP在加热形成凝胶过程中表面疏水性的变化，设置加热组（40 ℃加热30 min后90 ℃加热30 min），冰水冷却后备用。分别在2 mL样品中加入20 μL 8 mmol/L的ANS，混匀后避光反应20 min，在激发波长374 nm，发射波长485 nm的条件下测定荧光强度。
1.2.4.8 内源荧光
参照Walayat等[20]的方法并作适当修改，将三组蛋白样品浓度调整为1 mg/mL，利用荧光分光光度计进行测量，设置激发波长280 nm，发射波长300~500 nm。
1.2.4.9 Ca2+-ATPase活性
按照超微量Ca2+-ATPase试剂盒说明书测定三组蛋白样品的Ca2+-ATPase活性，结果以U/mg表示。
1.2.4.10 肌原纤维蛋白及其凝胶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
参照Laemmli等[21]方法并作适当修改，三组蛋白样品调整浓度为1 mg/mL，进行SDS-PAGE分析。用Image J软件对条带进行灰度分析。
1.2.5 肌原纤维蛋白凝胶特性测定
1.2.5.1 肌原纤维蛋白凝胶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
参照Laemmli等[21]方法并作适当修改，六组凝胶样品加入2倍体积的蛋白质溶解液（含20 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素、1% SDS、2% β-巯基乙醇，pH8.0），均质离心后取上清液进行SDS-PAGE分析。用Image J软件对条带进行灰度分析。
1.2.5.2 流变学特性
参照Fan等[22]的方法并作适当修改，取1.2.3中六组50 mg/mL溶胶样品置于碎冰上储存备用。使用40 mm的铝制平板，夹具间隙为1 mm。在剪切速率为0.1~100 s−1范围内记录表观黏度与剪切速率之间的关系；以2 ℃/min的升温速率，0.1 Hz的振荡频率，1%的应变，测定20~90 ℃温度范围内储能模量的变化。并用硅油进行密封，防止加热过程中水分蒸发；在0.01~10 Hz振荡频率范围内，以1%的应变（线性黏弹区范围内），测定溶胶样品在25 ℃条件下的频率扫描曲线。
1.2.5.3 扫描电子显微镜（SEM）
参照Sun等[23]的方法并作适当修改，将六组肌原纤维蛋白凝胶样品经过脱水脱脂，切片喷金后进行扫描电镜观察。
1.3 数据处理
实验数据经Microsoft Office Excel和Origin 2021软件处理后制图，采用IBM SPSS Statistics 26软件通过邓肯多重检验方法在P<0.05的显著性水平上评估显著性。实验数据均至少重复三次，数据以平均值±标准偏差表示。
2. 结果与分析
2.1 预冻和冻干对肌原纤维蛋白理化性质的影响
2.1.1 肌原纤维蛋白溶解度和浊度的变化
蛋白质溶解度反映蛋白质变性和聚集程度，并与分子间力有关，包括二硫键、疏水作用等[13]。如图1A所示，与MP相比，FMP与FDMP的蛋白溶解度分别从71.6%±2.2%下降到48.5%±5.8%和41.6%±2.2%。在冻干中的预冻阶段，溶液中的水冻结产生冰晶，对肌原纤维蛋白结构造成一定程度的物理损伤[24]。此外，因水分冻结，肌原纤维蛋白的浓度增加，蛋白质与蛋白质分子间的相互作用增加，而蛋白质-水的相互作用相应减弱，因此更容易发生聚集变性，进而导致蛋白的溶解度下降[25]。而在冻干中的干燥阶段，肌原纤维蛋白经过升华干燥和解析干燥两个阶段后，蛋白质中冻结成冰的水和通过范德华力、氢键等弱分子力与蛋白质结合的水都被除去，蛋白质的结构遭到破坏，进而溶解度降低[26]。
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浊度是评估肌原纤维蛋白聚集的指标之一，浊度的增加则表明蛋白质发生聚集[27]。与MP相比，经过冻干预冻阶段的FMP浊度值增加了95.3%，冻干后的FDMP增加了150.5%（图1B），说明冻干中的预冻阶段和干燥阶段均会导致肌原纤维蛋白发生聚集变性。其中肌原纤维蛋白在冻干的预冻阶段浊度值增加幅度大于干燥阶段，这可能是因为真空冷冻干燥过程是将物料冻结成冰，水分经升华直接变成气态而被除掉，肌原纤维蛋白在干燥时倾向于维持原有空间位置，不会因水分损失而产生浓缩聚集现象，蛋白质之间的相互作用弱于预冻过程，因此发生聚集变性程度相对较小。此结果与溶解度（图1A）一致，肌原纤维蛋白在预冻阶段发生聚集的程度大于干燥阶段，使得蛋白在预冻阶段溶解度下降幅度大于干燥阶段的下降幅度。
2.1.2 肌原纤维蛋白粒径和粒径分布的变化
由图2A可知，与MP相比，FMP与FDMP的粒径均显著增加（P<0.05），从397.1±7.3 nm分别增加到544.7±26.2 nm和610.5±10.1 nm。粒径分布趋势与平均粒径变化相同，经预冻和冻干后，粒径分布逐渐右移（图2B）。MP和FMP粒径呈单峰分布，说明其分布均匀且稳定，而FDMP呈现双峰分布，表明其受冻干中预冻阶段和干燥阶段的双重影响导致其均匀性和稳定性都有了一定程度的降低[28]。粒径结果与浊度（图1B）一致，都表明肌原纤维蛋白经冻干的预冻阶段和干燥阶段会增强蛋白质-蛋白质相互作用，导致肌原纤维蛋白发生聚集变性，从而降低其溶解性（图1A），且预冻过程产生的冷冻变性影响效果强于干燥过程导致的脱水变性。
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图 2 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白平均粒径（A）和粒径分布（B）的影响Figure 2. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on average particle size (A) and particle size distribution (B) of myofibrillar protein of N. virgatus2.1.3 肌原纤维蛋白总巯基和羰基的变化
蛋白质中巯基的形成是半胱氨酸被自由基单电子氧化的结果，蛋白巯基含量反映蛋白质氧化的程度[6]。如图3A所示，与MP相比，FMP和FDMP的总巯基含量显著降低（P<0.05），分别降低27.3%和45.35%，表明肌原纤维蛋白在冻干的预冻阶段和干燥阶段都发生氧化。此外，羰基化也是肌原纤维蛋白发生氧化的显著特征之一，常用来评价蛋白质氧化程度[29]。由图3B可知，与MP相比，FMP和FDMP羰基含量显著增加（P<0.05），羰基含量从2.7±0.2 nmol/mg增加到5.7±0.6 nmol/mg和7.6±1.0 nmol/mg。与总巯基结果一致，都表明在冻干的预冻阶段和干燥阶段均会加剧肌原纤维蛋白氧化。MP组发生氧化可能是肌原纤维蛋白在提取过程中蛋白质氧化。肌原纤维蛋白在预冻阶段和干燥阶段中极性氨基酸残基的羰基化可能会减弱蛋白质和水分子之间的相互作用，从而导致FMP和FDMP溶解度降低[30]（图1A）。Bao等[25]分别从新鲜猪肉和冷冻猪肉提取肌原纤维蛋白进行理化性质比较，结果显示猪肉经冷冻后总巯基含量降低，羰基含量增加。Lee等[31]的研究也表明猪肉蛋白经过冷冻干燥，其羰基值增加。肌原纤维蛋白在预冻过程中发生氧化可能是因为在冷冻过程中，由于水分冻结导致蛋白质浓度增加，更多的氨基酸残基暴露于冷冻浓缩的溶质中，为肌原纤维蛋白氧化创造了有利条件[32]。肌原纤维蛋白在干燥过程中的氧化则是因为在干燥过程中，尤其是在解析干燥过程，为除去部分结合水，环境温度上升，进而促进了蛋白的氧化[31−33]。FDMP组经过完整的预冻和干燥阶段，除去预冻阶段的氧化变性，干燥阶段总巯基降低和羰基增加的幅度均弱于预冻阶段，由此说明冷冻对肌原纤维蛋白氧化影响更大，推测可能是由于在真空条件下进行干燥，氧气含量极低，进而减缓蛋白氧化。
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图 3 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白总巯基（A）和羰基（B）的影响Figure 3. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on the total sulfhydryl (A) and carbonyl (B) of myofibrillar protein of N. virgatus2.1.4 肌原纤维蛋白二级结构的变化
在蛋白质二级结构中，α-螺旋结构是蛋白质的有序结构，具有高度稳定性，因此可用于衡量蛋白质的结构稳定性[34]。如图4所示，所有样品均在208 nm和222 nm波长处出现两个代表α-螺旋结构的特征吸收峰，为典型的肌原纤维蛋白圆二色谱峰型[35]。当肌原纤维蛋白经过预冻和冻干之后，FMP和FDMP的圆二色谱峰出现显著的负衰减，表明α-螺旋结构含量降低。Bao等[25]通过研究发现冷冻猪肉中肌原纤维蛋白的α-螺旋含量显著低于新鲜猪肉中的肌原纤维蛋白，并指出α-螺旋含量降低是冷冻过程肌原纤维蛋白发生氧化导致的。本研究中FMP和FDMP α-螺旋含量降低可能也是因为肌原纤维蛋白在预冻和干燥阶段发生氧化（图3），改变蛋白质结构，从而导致α-螺旋结构降低。α-螺旋结构主要依靠蛋白质分子中的氢键维持，而预冻和干燥过程会因水分丧失而破坏氢键，进而导致α-螺旋结构被破坏[36]。同时，结果表明FDMP剔除预冻造成的影响后，可以得出干燥对肌原纤维蛋白二级结构的影响更大。可能是冷冻过程肌原纤维蛋白发生聚集，蛋白质之间的相互作用反而保护肌原纤维蛋白的天然构象；而干燥过程，冰晶升华导致蛋白质丧失支撑，从而发生坍塌，致使其结构发生严重变化。
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图 4 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白二级结构的影响Figure 4. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on the secondary structure of myofibrillar protein of N. virgatus2.1.5 肌原纤维蛋白表面疏水性和内源荧光的变化
肌原纤维蛋白在加热前后的表面疏水性如图5A所示。加热前，与MP相比，FMP和FDMP表面疏水性显著增加（P<0.05）。预冻12 h后，蛋白质发生冷冻变性，促进了之前埋藏在内部区域的疏水氨基酸残基的暴露，从而引发蛋白质表面疏水区域的变化，导致表面疏水性增加[37]。干燥过程中除去自由水和部分结合水，蛋白质进一步变性，暴露更多蛋白质疏水基团，表面疏水性进一步增加[38]。为考察肌原纤维蛋白在加热凝胶化过程中的变化，进一步将样品进行二段加热，其表面疏水性的变化与加热前一致，FMP和FDMP表面疏水性显著高于MP（P<0.05），且加热后的表面疏水性大于加热前。可能是因为加热后蛋白质结构展开，暴露出更多的疏水基团。干燥过程对表面疏水性的影响大于预冻过程的影响，可能是因为冷冻时肌原纤维蛋白因蛋白质-蛋白质相互作用发生聚集，从而掩埋部分疏水性基团，而干燥过程这种蛋白质相互聚集的效果弱于预冻过程（图1、2），所以暴露的疏水性基团更多，进而表面疏水性强度大于预冻过程。
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图 5 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白表面疏水性（A）和内源荧光（B）的影响Figure 5. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on the surface hydrophobicity (A) and endogenous fluorescence (B) of myofibrillar protein of N. virgatus芳香族氨基酸如色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）具有吸收紫外入射光而发射荧光的特性，因此可通过荧光光谱来分析蛋白质空间构象的变化[6]。如图5B所示，经过预冻和冻干后，肌原纤维蛋白的内源荧光强度发生不同程度的下降，与MP相比，FMP和FDMP最大内源荧光强度分别从4903下降到4789和1425，发生荧光猝灭现象，其中肌原纤维蛋白在干燥阶段内源荧光强度下降幅度更大。这可能是因为肌原纤维蛋白在冻干中的预冻阶段和干燥阶段发生聚集和氧化作用，破坏其天然结构，发生解折叠，芳香族氨基酸分子的侧链基团逐渐暴露，所处环境的极性逐渐增加，发生荧光猝灭[39]。λmax红移的程度可以反映蛋白质构象变化的程度，红移程度越大则表明氨基酸所处微环境极性增加越大，肌原纤维蛋白的构象更易发生变化[40]。与MP相比，FMP和FDMP最大荧光峰发生轻微红移，表明蛋白质微环境的极性逐渐增大，蛋白构象发生改变。本实验中，预冻和干燥处理都会引起肌原纤维蛋白的内源荧光强度减弱，与上表面疏水性结果一致，表明肌原纤维蛋白中的氨基酸残基及其微环境发生变化，三级结构发生改变。
2.1.6 肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的变化
Ca2+-ATPase活性可以反映肌球蛋白头部完整性，是表征肌原纤维蛋白结构变化和变性程度的重要指标[41]。其活性与肌球蛋白头部的巯基氧化、蛋白质的交联、pH下降、温度变化等因素有关[42]。由图6可知，预冻和冻干均会导致Ca2+-ATPase活性下降，分别下降22.4%和40.7%。本研究中肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活性降低可能是巯基氧化（图3A）导致肌球蛋白头部发生变性，同时变性的肌球蛋白头部易发生聚集，是肌原纤维蛋白冷冻和干燥后聚集度增加的原因之一。此外，经过冻干，肌原纤维蛋白仍然具备Ca2+-ATPase活性，说明肌球蛋白依然保留部分天然状态的空间结构，而肌球蛋白作为肌原纤维蛋白凝胶形成的主要蛋白质之一[43]，其结构完整性有利于冻干肌原纤维蛋白加热形成凝胶。
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图 6 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的影响Figure 6. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein of N. virgatus2.1.7 肌原纤维蛋白的SDS-PAGE分析
如图7所示，金线鱼肌原纤维蛋白主要由以下蛋白组成，分别为肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）、副肌球蛋白（paramyosin，PM）、肌动蛋白（actin，AC）、原肌球蛋白（tropomyosin，TM）与肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）[44]。对MHC条带进行灰度分析，从泳道1到泳道3，灰度值依次是229277、208332和195126。表明与MP相比，FMP和FDMP的MHC条带强度略微减弱，可能是FMP和FDMP的肌原纤维蛋白经过预冻和冻干发生聚集（图1、2），分子量过大而聚集在上样孔，导致MHC条带减弱。
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图 7 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白的SDS-PAGE影响注：M为Marker、1为MP、2为FMP、3为FDMPFigure 7. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on SDS-PAGE of myofibrillar protein of N. virgatus2.2 预冻、冻干及TG酶对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响
2.2.1 肌原纤维蛋白凝胶的SDS-PAGE分析
肌原纤维蛋白凝胶的电泳如图8所示，对MHC条带进行灰度分析，从泳道1到泳道6灰度值依次是92035、111960、116379、46997、60118和633676。与未加热肌原纤维蛋白（图7）相比，MHC条带变浅，这是因为MHC加热发生交联形成大分子复合物，聚集在凝胶上样孔，从而导致MHC条带变浅。其中MP凝胶泳道的MHC条带浅于FMP凝胶和FDMP凝胶，说明MP凝胶组的MHC形成大分子复合物的能力更好，而FMP凝胶组和FDMP凝胶组因预冻和冻干导致蛋白质变性，从而降低MHC的凝胶形成能力。通过添加TG酶后各组MHC条带都明显变浅，这是因为TG酶催化肌原纤维蛋白形成ε-（γ-谷酰胺）-赖氨酸的异型肽键，形成大分子聚合物，从而导致MHC条带更浅。由此说明TG酶可以很好的促进肌原纤维蛋白凝胶化[8]。
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图 8 预冻、冻干及TG酶对金线鱼肌原纤维蛋白凝胶的SDS-PAGE影响注：M为Marker、1为MP凝胶、2为FMP凝胶、3为FDMP凝胶、4为MP-TG凝胶、5为FMP-TG凝胶、6为FDMP-TG凝胶Figure 8. Effects of pre-freezing, vacuum freeze-drying and TGase on SDS-PAGE of myofibrillar protein gel of N. virgatus2.2.2 肌原纤维蛋白凝胶流变学特性的变化
2.2.2.1 表观黏度和温度斜坡分析
如图9A所示，所有样品的表观黏度随剪切速率的增加先急剧下降后趋于平缓，表现出剪切稀化的现象。在同一剪切速率下，MP的表观黏度值最高，FDMP最低。添加TG酶可以提高肌原纤维蛋白溶胶体系的表观黏度值。肌原纤维蛋白溶胶表观黏度随剪切速率增加而降低，是因为肌原纤维蛋白中的肌球蛋白具有α-螺旋状的尾部，在剪切作用下容易重排定向化，从而削弱摩擦力，使表观黏度值下降[45]。经预冻和冻干之后，肌原纤维蛋白发生不同程度的聚集和氧化变性，其中FDMP蛋白天然结构丧失最严重，对肌球蛋白的影响最大，所以表观黏度值最低。Zhao等[46]研究表明肌原纤维蛋白凝胶体系的表观黏度会随凝胶网络结构的形成而增加。本研究中，添加TG酶均可增加MP、FMP和FDMP的表观黏度，表明TG酶可以催化谷氨酰胺和赖氨酸残基发生酰基转移反应，加强肌原纤维蛋白之间交联，形成高黏性的凝胶网络结构[47]。
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图 9 预冻、冻干及TG酶对金线鱼肌原纤维蛋白表观黏度（A）和储能模量（B）的影响Figure 9. Effects of pre-freezing, vacuum freeze-drying and TGase on apparent viscosity (A) and storage modulus (B) of myofibrillar protein of N. virgatus在20~90 ℃温度范围内，肌原纤维蛋白的储能模量（G′）的变化如图9B所示。所有样品的储能模量变化曲线相似，均在20~90 ℃间出现两次明显的上升，第一次储能模量值上升在35 ℃左右，第二次上升在50 ℃左右。第一次上升是因为肌球蛋白头部开始发生聚集，形成结构稀疏松弛的凝胶网络，是凝胶形成的初始阶段；第二次上升是因为随着温度的升高，肌球蛋白发生不可逆的热变性，形成具有一定强度的凝胶网络结构[48]。90 ℃时，MP储能模量最高，FMP次之，FDMP最低。FMP和FDMP经过预冻和冻干后，肌原纤维蛋白G′值较MP急剧下降，说明预冻和冻干严重破坏了肌原纤维蛋白的凝胶性能。预冻阶段的冷冻变性和干燥阶段的脱水变性使得肌原纤维蛋白聚集成团，结构改变，活性基团被掩埋，从而减弱肌原纤维蛋白凝胶性能。Zhou等[49]研究与本实验结果一致，肌原纤维蛋白氧化导致凝胶性能下降。添加TG酶之后，各组的储能模量值得到不同程度的提高，其中对FDMP的提升效果最好。TG酶的加入显著增加G′值，是因为TG酶诱导的肌原纤维蛋白中谷氨酰胺和赖氨酸残基的共价交联，增加蛋白质分子间相互作用，使肌原纤维蛋白凝胶的共价键数量增加提升分子之间的稳定性[50]。TG对FDMP G′值增加效果更好是因为FDMP经过预冻和干燥，蛋白天然结构发生改变，部分蛋白质结构展开，暴露了与TG酶作用的底物，促进了交联反应[27]。
2.2.2.2 频率扫描分析
如图10所示，所有样品的储能模量和损耗模量都随频率的增大而增大，且储能模量（图10A）始终大于损耗模量（图10B），表明肌原纤维蛋白溶胶以弹性行为为主导[51]。其中MP-TG的储能模量值最大，FDMP值最小，这与温度扫描结果（图9B）一致。肌原纤维蛋白的黏弹性和流动性的变化是由于剪切应力引起的颗粒尺寸和样品均化的变化，这反过来影响了颗粒和可溶性分子之间的相互摩擦和惯性阻力，导致储能模量和损耗模量的变化[52−53]。Li等[54]研究表明，经过高压的肌原纤维蛋白频率扫描中的储能模量低于未处理肌原纤维蛋白，是因为高压处理引起化学键的变化，改变肌原纤维蛋白的结构，从而影响其流变学性质。本研究中，肌原纤维蛋白经过预冻和冻干，蛋白因发生聚集和氧化致使其丧失部分天然结构，进而降低储能模量和损耗模量。TG酶的添加使肌原纤维蛋白溶胶的储能模量和损耗模量上升，推测是因为TG酶催化肌原纤维蛋白共价交联，使分子的聚集程度增强，提高分子之间的稳定性。杨领[50]将冷冻金线鱼鱼糜中添加不同剂量的TG酶，发现鱼糜的储能模量和损耗模量都增加，且呈剂量依赖，TG酶添加越多，增加效果越明显，与本研究的结果一致。以上结果表明，TG酶不仅可以提升冷冻鱼糜的流变学性质，也可以提升冻干鱼糜的流变学性质。
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图 10 预冻、冻干及TG酶对金线鱼肌原纤维蛋白频率扫描的影响Figure 10. Effects of pre-freezing, vacuum freeze-drying and TGase on frequency scans of myofibrillar protein of N. virgatus2.2.3 肌原纤维蛋白凝胶微观结构的变化
如图11所示，MP凝胶呈现相互交联的网状结构；FMP凝胶网状结构不均匀，蛋白质束发生断裂；FDMP未见明显的肌原纤维蛋白凝胶网状结构，出现片状结构。添加TG酶之后，MP-TG的凝胶网状结构变得更加致密均匀；FMP-TG蛋白质束断裂情况得到改善，网状结构变得连续均匀；FDMP-TG则出现凝胶网状结构。以上结果表明，预冻和冻干会降低肌原纤维蛋白的凝胶特性，而添加TG酶则能改善其凝胶特性。肌原纤维蛋白在加热过程中，部分疏水基团和活性位点因蛋白质结构被破坏和舒展而暴露，促使蛋白质分子发生聚集，形成具有一定黏弹性的三维网状结构[55]。肌原纤维蛋白经过预冻和冻干，蛋白质的天然结构遭到破坏，影响其在加热过程中的凝胶形成能力。巯基在凝胶形成过程中可以转变为二硫键，而二硫键是维持肌原纤维蛋白凝胶的主要化学作用力之一，因此巯基的存在可以增强凝胶网络结构[56]，FMP和FDMP总巯基含量较MP发生不同程度的下降（图3A），从而导致二者形成的凝胶网络结构变差。添加TG酶可以改善凝胶的微观结构，是因为TG酶可以促进MHC交联，增强凝胶性。Cao等[48]研究结果也表明TG酶可以改善冷冻损伤的肌原纤维蛋白凝胶微观结构，使其变得更加致密均匀。在本研究中FDMP-TG凝胶网络结构依然显著差于MP凝胶，说明肌原纤维蛋白凝胶网络的形成主要依靠其自身天然结构的完整性，外源性添加TG酶只能部分改善其凝胶形成，无法从根源解决肌原纤维蛋白因真空冷冻干燥蛋白质变性导致的凝胶特性下降。
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图 11 预冻、冻干及TG酶对金线鱼肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响Figure 11. Effects of pre-freezing, vacuum freeze-drying and TGase on the microstructure of myofibrillar protein gel of N. virgatus3. 结论
本实验探讨金线鱼肌原纤维蛋白在真空冷冻干燥中的预冻和真空干燥两个阶段中的理化性质及凝胶特性的变化规律，并研究了TG酶对其凝胶特性的影响。结果表明，真空冷冻干燥虽然作为公认的保持蛋白质天然结构最好的干燥方法，但此过程肌原纤维蛋白依然会发生变性，其中预冻阶段的蛋白变性主要源于冷冻引起的蛋白聚集效应与氧化作用，导致浊度和粒径增加，溶解度降低，同时伴随总巯基含量减少和羰基含量增加。而干燥阶段的蛋白变性主要是由于脱水过程水分升华而导致肌原纤维蛋白空间结构发生改变，更多疏水性基团暴露，进一步诱发蛋白的氧化变性与聚集，具体包括蛋白质的α-螺旋结构含量降低，表面疏水性增加和内源荧光强度降低。TG酶可以促进MHC交联，在一定程度上能提升变性后肌原纤维蛋白的凝胶特性。蛋白冷冻后不同的解冻方式也会影响蛋白的理化性质及其功能特性。在本研究中，虽然相对缓慢的解冻方式（4 ºC过夜解冻）相较于冷冻引起的强烈变性，不会对本研究的结果造成显著性影响，但在解冻过程中蛋白在理化性质上可能发生的变化依旧值得在后续研究中进一步探讨。本研究的结果可为冻干鱼糜粉的生产与品质控制提供理论参考。
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图 2 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白平均粒径（A）和粒径分布（B）的影响
Figure 2. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on average particle size (A) and particle size distribution (B) of myofibrillar protein of N. virgatus
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图 3 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白总巯基（A）和羰基（B）的影响
Figure 3. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on the total sulfhydryl (A) and carbonyl (B) of myofibrillar protein of N. virgatus
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图 4 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白二级结构的影响
Figure 4. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on the secondary structure of myofibrillar protein of N. virgatus
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图 5 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白表面疏水性（A）和内源荧光（B）的影响
Figure 5. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on the surface hydrophobicity (A) and endogenous fluorescence (B) of myofibrillar protein of N. virgatus
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图 6 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的影响
Figure 6. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein of N. virgatus
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图 7 预冻和冻干对金线鱼肌原纤维蛋白的SDS-PAGE影响
注：M为Marker、1为MP、2为FMP、3为FDMP
Figure 7. Effects of pre-freezing and vacuum freeze-drying on SDS-PAGE of myofibrillar protein of N. virgatus
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图 8 预冻、冻干及TG酶对金线鱼肌原纤维蛋白凝胶的SDS-PAGE影响
注：M为Marker、1为MP凝胶、2为FMP凝胶、3为FDMP凝胶、4为MP-TG凝胶、5为FMP-TG凝胶、6为FDMP-TG凝胶
Figure 8. Effects of pre-freezing, vacuum freeze-drying and TGase on SDS-PAGE of myofibrillar protein gel of N. virgatus
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图 9 预冻、冻干及TG酶对金线鱼肌原纤维蛋白表观黏度（A）和储能模量（B）的影响
Figure 9. Effects of pre-freezing, vacuum freeze-drying and TGase on apparent viscosity (A) and storage modulus (B) of myofibrillar protein of N. virgatus
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图 10 预冻、冻干及TG酶对金线鱼肌原纤维蛋白频率扫描的影响
Figure 10. Effects of pre-freezing, vacuum freeze-drying and TGase on frequency scans of myofibrillar protein of N. virgatus
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[1] 刘艺杰. 鳙鱼(Aristichthys nobilis)和秘鲁鱿鱼(Dosidicus gigas)肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究[D]. 青岛:中国海洋大学, 2007. [LIU Y J. Study on the protein character and gel property of bighead carp and gaint squid[D]. Qingdao:Ocean University of China, 2007.] LIU Y J. Study on the protein character and gel property of bighead carp and gaint squid[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2007.
[2] NURUL H, AMINAH A, BABJI A S. Functional properties of surimi powder from three Malaysian marine fish[J]. International Journal of Food Science & Technology,2001,36:401−406.
[3] GUO X J, SHI L, XIONG S B, et al. Gelling properties of vacuum-freeze dried surimi powder as influenced by heating method and microbial transglutaminase[J]. LWT - Food Science and Technology,2019,99:105−111. doi: 10.1016/j.lwt.2018.09.050
[4] 毕金峰, 冯舒涵, 金鑫, 等. 真空冷冻干燥技术与产业的发展及趋势[J]. 核农学报,2022,36(2):414−421. [BI J F, FENG S H, JIN X, et al. Current status and development trend of freeze drying technology and industry[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2022,36(2):414−421.] doi: 10.11869/j.issn.100-8551.2022.02.0414 BI J F, FENG S H, JIN X, et al. Current status and development trend of freeze drying technology and industry[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2022, 36（2）: 414−421. doi: 10.11869/j.issn.100-8551.2022.02.0414
[5] NIU J Z, ZHAO B F, GUO X J, et al. Effects of vacuum freeze-drying and vacuum spray-drying on biochemical properties and functionalities of myofibrillar proteins from silver carp[J]. Journal of Food Quality,2019,2019:1−8.
[6] CHEN P, QIU Y J, CHEN S J, et al. Insights into the effects of different drying methods on protein oxidation and degradation characteristics of golden pompano (Trachinotus ovatus)[J]. Frontiers in Nutrition,2022,9:1063836. doi: 10.3389/fnut.2022.1063836
[7] YANG H J, CHEN Z Z, WANG H F, et al. Uncovering the rheological properties basis for freeze drying treatment-induced improvement in the solubility of myofibrillar proteins[J]. Current Research in Food Science,2024,8:100651. doi: 10.1016/j.crfs.2023.100651
[8] SANTHI D, KALAIKANNAN A, MALAIRAJ P, et al. Application of microbial transglutaminase in meat foods:A review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2017,57(10):2071−2076. doi: 10.1080/10408398.2014.945990
[9] CHIN K B, GO M Y, XIONG Y L. Konjac flour improved textural and water retention properties of transglutaminase-mediated, heat-induced porcine myofibrillar protein gel:Effect of salt level and transglutaminase incubation[J]. Meat Science,2009,81(3):565−572. doi: 10.1016/j.meatsci.2008.10.012
[10] 冯倩. 转谷氨酰胺酶改性对白鲢鱼肌原纤维蛋白凝胶特性及体外消化特性的影响[D]. 上海:上海海洋大学, 2023. [FENG Q. Effects of transglutaminase modification on gel properties and in vitro digestibility of myofibrillar protein of silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)[D]. Shanghai:Shanghai Ocean University, 2023.] FENG Q. Effects of transglutaminase modification on gel properties and in vitro digestibility of myofibrillar protein of silver carp （Hypophthalmichthys molitrix）[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University, 2023.
[11] 钟坦君. 没食子酸的添加对金线鱼鱼糜凝胶特性的影响及体外消化产物活性研究[D]. 湛江:广东海洋大学, 2022. [ZHONG T J. Effect of gallic acid addition on gel properties and the activity of digesting products in vitro of Nemipterus virgatus surimi gel[D]. Zhanjiang:Guangdong Ocean University, 2022.] ZHONG T J. Effect of gallic acid addition on gel properties and the activity of digesting products in vitro of Nemipterus virgatus surimi gel[D]. Zhanjiang: Guangdong Ocean University, 2022.
[12] JIANG X J, ZHANG Z J, CAI H N, et al. The effect of soybean trypsin inhibitor on the degradation of myofibrillar proteins by an endogenous serine proteinase of crucian carp[J]. Food Chemistry,2006,94(4):498−503. doi: 10.1016/j.foodchem.2004.11.046
[13] DU X, ZHAO M N, PAN N, et al. Tracking aggregation behaviour and gel properties induced by structural alterations in myofibrillar protein in mirror carp (Cyprinus carpio) under the synergistic effects of pH and heating[J]. Food Chemistry,2021,362:130222. doi: 10.1016/j.foodchem.2021.130222
[14] LIU R, ZHAO S M, YANG H, et al. Comparative study on the stability of fish actomyosin and pork actomyosin[J]. Meat Science,2011,88(2):234−240. doi: 10.1016/j.meatsci.2010.12.026
[15] LI J, DAI Z C, CHEN Z H, et al. Improved gelling and emulsifying properties of myofibrillar protein from frozen shrimp (Litopenaeus vannamei) by high-intensity ultrasound[J]. Food Hydrocolloids,2023,135:108188. doi: 10.1016/j.foodhyd.2022.108188
[16] LIU G, XIONG Y L, BUTTERFIELD D A. Chemical, physical, and gel-forming properties of oxidized myofibrils and whey- and soy-protein isolates[J]. Journal of Food Science,2000,65(5):811−818. doi: 10.1111/j.1365-2621.2000.tb13592.x
[17] LEVINE R L, GARLAND D, OLIVER C N, et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins[J]. Methods in Enzymology,1990,186:464−478.
[18] CAO Y G, XIONG Y L. Chlorogenic acid-mediated gel formation of oxidatively stressed myofibrillar protein[J]. Food Chemistry,2015,180:235−243. doi: 10.1016/j.foodchem.2015.02.036
[19] RIEBROY S, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Acid-induced gelation of natural actomyosin from Atlantic cod (Gadus morhua) and burbot (Lota lota)[J]. Food Hydrocolloids,2009,23(1):26−39. doi: 10.1016/j.foodhyd.2007.11.010
[20] WALAYAT N, TANG W, NAWAZ A, et al. Influence of Konjac oligo-glucomannan as cryoprotectant on physicochemical and structural properties of silver carp surimi during fluctuated frozen storage[J]. LWT - Food Science and Technology,2022,164:113641. doi: 10.1016/j.lwt.2022.113641
[21] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature,1970,227(5259):680−5. doi: 10.1038/227680a0
[22] FAN M C, HUANG Q L, ZHONG S Y, et al. Gel properties of myofibrillar protein as affected by gelatinization and retrogradation behaviors of modified starches with different crosslinking and acetylation degrees[J]. Food Hydrocolloids,2019,96:604−616. doi: 10.1016/j.foodhyd.2019.05.045
[23] SUN L C, LIN Y C, LIU W F, et al. Effect of pH shifting on conformation and gelation properties of myosin from skeletal muscle of blue round scads (Decapterus maruadsi)[J]. Food Hydrocolloids,2019,93:137−145. doi: 10.1016/j.foodhyd.2019.02.026
[24] UTRERA M, MORCUENDE D, ESTÉVEZ M. Temperature of frozen storage affects the nature and consequences of protein oxidation in beef patties[J]. Meat Science,2014,96(3):1250−1257. doi: 10.1016/j.meatsci.2013.10.032
[25] BAO P Q, CHEN L, HU Y, et al. L-Arginine and L-lysine retard aggregation and polar residue modifications of myofibrillar proteins:Their roles in solubility of myofibrillar proteins in frozen porcine Longissimus lumborum[J]. Food Chemistry,2022,393:133347. doi: 10.1016/j.foodchem.2022.133347
[26] 孔令圆. 干切牛肉冷冻干燥中低能耗高速率干燥条件的动态研究[D]. 银川:宁夏大学, 2015. [KONG L Y. Dynamic study on operation conditions for low energy consumption and high drying rate during freezing drying of cooked beef slice[D]. Yinchuan:Ningxia University, 2015.] KONG L Y. Dynamic study on operation conditions for low energy consumption and high drying rate during freezing drying of cooked beef slice[D]. Yinchuan: Ningxia University, 2015.
[27] AN Y Q, YOU J, XIONG S B, et al. Short-term frozen storage enhances cross-linking that was induced by transglutaminase in surimi gels from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)[J]. Food Chemistry,2018,257:216−222. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.02.140
[28] 李可, 张俊霞, 王欣瑶, 等. 不同超声波功率处理对类PSE鸡肉肌原纤维蛋白结构和乳化稳定性的影响[J]. 食品科学,2023,44(13):23−31. [LI K, ZHANG J X, WANG X Y, et al. Effects of ultrasound treatment at different powers on the structure and emulsifying properties of PSE-Like chicken myofibrillar protein[J]. Food Science,2023,44(13):23−31.] doi: 10.7506/spkx1002-6630-20220624-269 LI K, ZHANG J X, WANG X Y, et al. Effects of ultrasound treatment at different powers on the structure and emulsifying properties of PSE-Like chicken myofibrillar protein[J]. Food Science, 2023, 44（13）: 23−31. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20220624-269
[29] FU Q Q, LIU R, WANG H O, et al. Effects of oxidation in vitro on structures and functions of myofibrillar protein from beef muscles[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2019,67(20):5866−5873. doi: 10.1021/acs.jafc.9b01239
[30] DESCALZO A M, SANCHO A M. A review of natural antioxidants and their effects on oxidative status, odor and quality of fresh beef produced in Argentina[J]. Meat Science,2008,79(3):423−436. doi: 10.1016/j.meatsci.2007.12.006
[31] LEE S, CHOI Y S, JO K, et al. Processing characteristics of freeze-dried pork powder for meat emulsion gel[J]. Food Science of Animal Resources,2021,41(6):997−1011. doi: 10.5851/kosfa.2021.e51
[32] LEYGONIE C, BRITZ T J, HOFFMAN L C. Meat quality comparison between fresh and frozen/thawed ostrich M. iliofibularis[J]. Meat Science,2012,91(3):364−368. doi: 10.1016/j.meatsci.2012.02.020
[33] TANG X L, PIKAL M J. Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals:practical advice[J]. Pharmaceutical Research,2004,21(2):191−200. doi: 10.1023/B:PHAM.0000016234.73023.75
[34] 蔡联辉, 曾虹燕, 蔡西玲, 等. 莲子蛋白组分二级结构的研究[J]. 光谱学与光谱分析,2011,31(9):2394−2398. [CAI L H, ZENG H Y, CAI X L, et al. Second structure of the protein factions from lotus seeds[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis,2011,31(9):2394−2398.] CAI L H, ZENG H Y, CAI X L, et al. Second structure of the protein factions from lotus seeds[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2011, 31（9）: 2394−2398.
[35] CHENG J R, ZHU M J, LIU X M. Insight into the conformational and functional properties of myofibrillar protein modified by mulberry polyphenols[J]. Food Chemistry,2020,308:125592. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.125592
[36] CHEN X, XU X L, HAN M Y, et al. Conformational changes induced by high-pressure homogenization inhibit myosin filament formation in low ionic strength solutions[J]. Food Research International,2016,85:1−9. doi: 10.1016/j.foodres.2016.04.011
[37] WANG Z M, HE Z F, GAN X, et al. The effects of lipid oxidation product acrolein on the structure and gel properties of rabbit meat myofibrillar proteins[J]. Food Biophysics,2018,13(4):374−386. doi: 10.1007/s11483-018-9543-6
[38] GONG K J, SHI A M, LIU H Z, et al. Emulsifying properties and structure changes of spray and freeze-dried peanut protein isolate[J]. Journal of Food Engineering,2016,170:33−40. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2015.09.011
[39] SHI J, ZHANG L T, LU H, et al. Protein and lipid changes of mud shrimp (Solenocera melantho) during frozen storage:Chemical properties and their prediction[J]. International Journal of Food Properties,2017,20(sup2):2043−2056.
[40] ZOU Y, YANG H, ZHANG M H, et al. The influence of ultrasound and adenosine 5'-monophosphate marination on tenderness and structure of myofibrillar proteins of beef[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2019,32(10):1611−1620. doi: 10.5713/ajas.18.0780
[41] ZHANG R R, XIONG S B, YOU J, et al. Effects of ozone treatments on the physicochemical changes of myofibrillar proteins from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) during frozen storage[J]. Journal of Food Quality,2017,2017:1−9.
[42] VATE N K, BENJAKUL S. Combined effect of squid ink tyrosinase and tannic acid on heat induced aggregation of natural actomyosin from sardine[J]. Food Hydrocolloids,2016,56:62−70. doi: 10.1016/j.foodhyd.2015.12.009
[43] WANG G, LIU M M, CAO L W, et al. Effects of different NaCl concentrations on self-assembly of silver carp myosin[J]. Food Bioscience,2018,24:1−8. doi: 10.1016/j.fbio.2018.05.002
[44] YANG Y, LIU X Y, XUE Y, et al. The process of heat-induced gelation in Litopenaeus vannamei[J]. Food Hydrocolloids,2020,98:105260. doi: 10.1016/j.foodhyd.2019.105260
[45] GUO Z B, LI Z Y, WANG J Y, et al. Gelation properties and thermal gelling mechanism of golden threadfin bream myosin containing CaCl2 induced by high pressure processing[J]. Food Hydrocolloids,2019,95:43−52. doi: 10.1016/j.foodhyd.2019.04.017
[46] ZHAO Y Y, HOU Q, CAO S M, et al. Effect of regenerated cellulose fiber on the properties and microstructure of emulsion model system from meat batters[J]. Food Hydrocolloids,2019,87:83−89. doi: 10.1016/j.foodhyd.2018.07.044
[47] DEJONG G A H, KOPPELMAN S J. Transglutaminase catalyzed reactions:Impact on food applications[J]. Journal of Food Science,2002,67(8):2798−2806. doi: 10.1111/j.1365-2621.2002.tb08819.x
[48] CAO Y G, HAN X R, YUAN F, et al. Effect of combined treatment of L-arginine and transglutaminase on the gelation behavior of freeze-damaged myofibrillar protein[J]. Food & Function,2022,13(3):1495−1505.
[49] ZHOU F B, ZHAO M M, ZHAO H F, et al. Effects of oxidative modification on gel properties of isolated porcine myofibrillar protein by peroxyl radicals[J]. Meat Science,2014,96(4):1432−1439. doi: 10.1016/j.meatsci.2013.12.001
[50] 杨领. TG酶-木薯淀粉对金线鱼鱼糜3D打印特性的影响[D]. 锦州:渤海大学, 2020. [YANG L. Effects of transglutamianse and cassava starch on 3D printing characteristics of Nemipterus virgatus surimi[D]. Jingzhou:Bohai University, 2020.] YANG L. Effects of transglutamianse and cassava starch on 3D printing characteristics of Nemipterus virgatus surimi[D]. Jingzhou: Bohai University, 2020.
[51] BORDERÍAS A J, TOVAR C A, DOMÍNGUEZ-TIMÓN F, et al. Characterization of healthier mixed surimi gels obtained through partial substitution of myofibrillar proteins by pea protein isolates[J]. Food Hydrocolloids,2020,107:105976. doi: 10.1016/j.foodhyd.2020.105976
[52] GUL O, SARICAOGLU F T, MORTAS M, et al. Effect of high pressure homogenization (HPH) on microstructure and rheological properties of hazelnut milk[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2017,41:411−420.
[53] LEITE T S, AUGUSTO P E D, CRISTIANINI M. Processing frozen concentrated orange juice (FCOJ) by high pressure homogenization (HPH) technology:Changes in the viscoelastic properties[J]. Food Engineering Reviews,2015,7(2):231−240. doi: 10.1007/s12393-014-9082-y
[54] LI G S, CHEN Y T, XUAN S F, et al. Rheological properties and structure of myofibrillar protein extracted from Oratosquilla oratoria muscle as affected by ultra-high pressure[J]. International Journal of Food Properties,2019,22(1):1310−1321. doi: 10.1080/10942912.2019.1642915
[55] WU M G, CAO Y, LEI S M, et al. Protein structure and sulfhydryl group changes affected by protein gel properties:Process of thermal-induced gel formation of myofibrillar protein[J]. International Journal of Food Properties,2019,22(1):1834−1847. doi: 10.1080/10942912.2019.1656231
[56] INGADOTTIR B, KRISTINSSON H G. Gelation of protein isolates extracted from tilapia light muscle by pH shift processing[J]. Food Chemistry,2010,118(3):789−798. doi: 10.1016/j.foodchem.2009.05.064
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