Fortification Technology and Quality Evaluation of β-Nicotinamide Mononucleotide in Fermented Coix Seed
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摘要: 为研制富含β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide，β-NMN）的发酵食品，以薏苡仁为原料，探究发酵菌种、发酵时间、B族维生素添加量对发酵薏苡仁中β-NMN含量的影响，在单因素实验基础上，采用均匀设计试验对B族维生素添加量进行优化，并对发酵薏苡仁的品质及生物活性进行评价。结果表明，米根霉是最优发酵菌种，最佳发酵时间是54 h；优化的B族维生素添加量为：烟酰胺150 mg/kg，烟酸50 mg/kg，维生素B1为50 μg/kg。此条件下发酵薏苡仁具有良好的风味，β-NMN含量可达20.07 μg/g，还原糖含量达到19.6 g/100 g，有机酸含量0.37 g/kg，酒精含量2.5%vol，γ-氨基丁酸、S-腺苷甲硫氨酸和总酚含量分别提高1.24、256和4.7倍，ABTS+·清除能力、FRAP、·OH清除能力和DPPH·清除能力分别提高14.37、2.40、4.55和4.67倍，为富含β-NMN的薏苡仁功能性食品研究提供新的思路和参考。Abstract: The aim of this study was to develop a fermented food rich in β-nicotinamide mononucleotide (β-NMN). The influence of fermentation strain, fermentation time, and addition of B-group vitamins on the β-NMN content of fermented Coix (Coix lacryma-jobi) seed was investigated. Based on the results of single-factor experiments, a standardized experimental design was subsequently adopted to optimize the amount of B-group vitamins added, and to evaluate the quality and bioactivity of the fermented Coix seed. The results showed that Rhizopus oryzae was the optimal fermentation strain and the optimal fermentation time was 54 h. The optimal addition amounts of the various B-group vitamins were as follows: Nicotinamide: 150 mg/kg, niacin: 50 mg/kg, vitamin B1: 50 μg/kg. Under these conditions, the fermented Coix seed exhibited good flavor and a β-NMN content of up to 20.07 μg/g. It also contained a reducing sugar content of 19.6 g/100 g, organic acid content of 0.37 g/kg, and alcohol content of 2.5%vol. The contents of γ-aminobutyric acid, S-adenosylmethionine, and total phenols increased by 1.24, 256, and 4.7 times, respectively. The ABTS+· scavenging capacity, FRAP, ·OH scavenging capacity and DPPH· scavenging capacity increased by 14.37, 2.40, 4.55, and 4.67 times, respectively. The study provides a novel approach and valuable reference for future research on β-NMN-rich Coix functional foods.
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Keywords:
- β-nicotinamide mononucleotide (β-NMN) /
- Coix seed /
- fermentation /
- R. oryzae /
- biological activity
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薏苡仁（Coix lachryma-jobi L.），又称薏米，含有丰富的营养物质，包括淀粉、蛋白质、脂类和膳食纤维，还含有钙镁元素、维生素E、植物多酚类、内酰胺类和植物甾醇等。薏苡仁既属于谷物，也是我国传统药食同源物质，具有健脾渗湿、抗氧化、抗炎、免疫调节等功效[1−2]。在我国，除青海、宁夏和甘肃等地区外，其余省份均有薏苡种植[3]。据2019年产业蓝皮书调查显示，我国薏苡种植面积已达110万亩。薏苡仁质地较为坚硬，含有的淀粉较难糊化，目前主要以原粮及粗加工产品进入市场，精深加工产品还较少[4−5]。随着人们健康意识的提高，市场消费不断升级，薏苡仁的精深加工及高值化开发利用愈发显得重要[5]。
微生物发酵是一种能提高谷物营养价值、风味、质地和功能成分的既有效又经济的方法[6−7]。如红曲霉发酵薏苡仁，可提高其蛋白质、总游离氨基酸和总酚含量[8]，促进α-生育酚富集[9]，产生洛伐他汀[10]。米根霉发酵脱脂薏苡仁麸皮，可显著改善底物中酚类物质、黄酮等物质的含量，提高产品的抗氧化能力[11]。酵母发酵脱脂薏苡仁可提高γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、游离氨基酸和总酚含量，增强其抗氧化能力[12]，改善其香气成分[13]。这说明通过微生物发酵，有助于改善薏苡仁的营养品质，增强其功能性成分[5]。
β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide，β-NMN）是一种天然存在的生物活性核苷酸，通过介导生物体内辅酶I—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的生物合成而发挥生理作用[14]。与烟酰胺核糖、烟酰胺和烟酸等可以转化成NAD+的其他前体物质相比，β-NMN可通过一步催化反应即转化为NAD+，因此是NAD+最直接高效的前体物质，能补充机体内85%的NAD+[15]。近年来，β-NMN在抗衰老、治疗神经退行性疾病、保护心脏、改善血管功能、保护肾损伤、改善肌肉功能、改善胰岛素抵抗等多方面表现出优异的药理活性[16]。据报道，能通过发酵自然合成β-NMN的微生物主要包括嗜果糖芽孢杆菌属产乳酸菌[17]、成都肠杆菌（Enterobacter chengduensis 2021T4.7）[18]和酵母菌[19]。在前期研究过程中，研究组通过代谢组学技术检测发现米根霉发酵薏苡仁中含有较丰富的代谢物β-NMN—这对于开发富含β-NMN的功能性薏苡仁食品具有潜在的意义。由于米根霉与酵母菌同属于传统食品发酵用酵曲中的优势真菌[20]，其他食品发酵用真菌如曲霉、毛霉等，是否也能通过发酵薏苡仁合成β-NMN，还有待进一步研究。
因此，本研究以薏苡仁为发酵底物，通过考查发酵菌种、发酵时间、烟酰胺等B族维生素对发酵薏苡仁中β-NMN含量的影响，筛选最佳菌种，优化最佳发酵工艺，并分析了薏苡仁发酵前后感官品质、营养成分，以及生物活性的变化，为进一步开发功能性薏苡仁食品提供理论依据和技术参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
薏苡仁 产地贵州省；米根霉（CICC 40316） 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；酵母菌（安琪活性干酵母） 安琪酵母股份有限公司；米曲霉（孢子含量≥150亿/g）、毛霉（孢子含量≥100亿/g） 济宁祥园生物科技有限公司；红曲 福建古田红鑫酒粬有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、β-烟酰胺单核苷酸（纯度≥95%） 美国Sigma-Aldrich公司；甲酸 色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；氨水 分析纯，四川西陇科学有限公司；S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAMe）、γ-氨基丁酸 纯度≥98%，北京谱析标准技术有限公司；没食子酸 纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 纯度≥97%，福州飞净生物科技有限公司；福林酚、碳酸钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、无水乙醇、乙酸铵、甲酸铵 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）、总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法） 碧云天生物技术有限公司；植物总酚试剂盒 合肥莱尔生物科技有限公司。
1290-6470 LC-QT液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪 美国Agilent公司；AB Sciex API 4000 LC/MS/MS三重四级杆质谱仪 美国SCIEX（Scientific Export）公司；Infinte200Pro酶标仪 瑞士帝肯（Tecan）公司；HT190R台式低温冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MS105DU分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；SW-CJ-2D超净工作台 苏州净化设备有限公司；UV2700i紫外/可见分光光度计 日本岛津公司；高压灭菌锅 雅马拓科技贸易（上海）有限公司；UPT-II-20T超纯水机 四川优普超纯科技有限公司；HY113ATC折光仪 杭州恒仪仪表科技有限公司；LRH-150生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；SMF2002粉碎机 浙江苏泊尔股份有限公司；DHG-101-2A电热鼓风干燥箱、HH-S4水浴锅 上海舜制仪器制造有限公司；BILON-5000FDA冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 原料处理及发酵工艺流程
参考文献中的方法进行[21]。称取适当薏苡仁，淘洗干净后浸泡过夜，将薏苡仁粉碎后进行蒸制，至米粒无白心，再按照1:0.9（w/w）比例加入凉开水搅拌均匀（该样品称为蒸制薏苡仁），再按照0.6%（w/w）加入发酵菌种搅拌均匀（该样品称为未发酵薏苡仁），放置于生化培养箱中发酵，发酵温度为菌种说明书指定温度30 ℃，发酵时间依据实验设计进行设置，发酵结束后进行样品制备（该样品称为发酵薏苡仁）与指标检测。
1.2.2 发酵菌种筛选
米根霉发酵菌种的制备：将米根霉接种于PDA斜面培养基中，置于30 ℃条件下培养7~8 d后，将菌苔刮入50 mL无菌水中，制成孢子悬浮液，调节孢子浓度至1×106 个/mL。米曲霉、红曲霉、毛霉和酵母菌种直接使用。菌种按照0.6%（w/w）的比例接入蒸制薏苡仁中，放入30 ℃培养箱中培养48 h即得到发酵样品。测定并比较不同发酵样品的β-NMN含量，选择合成β-NMN含量较高的菌种进行下一步实验。
1.2.3 发酵时间优化
筛选出发酵菌种后，通过改变发酵时间，分别发酵36、48、54、60和72 h，研究不同发酵时间对发酵薏苡仁中β-NMN含量的影响，以确定最佳的发酵时间。
1.2.4 B族维生素添加量的单因素实验
以薏苡仁质量为基准，分别向发酵底物中添加不同含量的烟酰胺（40、60、80、100、120和150 mg/kg），烟酸（5、10、20、30、40和50 mg/kg）和维生素B1（12.5、18.75、25、31.25、37.5和50 μg/kg），以发酵产物中β-NMN含量作为考查指标，开展单因素实验。
1.2.5 均匀设计试验
在单因素实验结果基础上，利用均匀设计试验对发酵底物配方进行优化。B族维生素添加量范围为：维生素B1（18.75~50 μg/kg），烟酰胺（40~150 mg/kg）和烟酸（5~50 mg/kg），采用U6（64）均匀设计表，根据其使用表，选择1~3列开展均匀设计试验[22]。均匀设计试验因素水平表如表1所示。
表 1 均匀设计试验因素水平Table 1. Factor level of uniform design test水平 因素 X1（VB1）（μg/kg） X2（烟酰胺）（mg/kg） X3（烟酸）（mg/kg） 1 18.75 40 5 2 25.00 60 10 3 31.25 80 20 4 37.50 100 30 5 43.75 120 40 6 50.00 150 50 1.2.6 发酵薏苡仁中β-NMN的测定
1.2.6.1 样品制备
样品前处理方法参考文献[23]并略作修改。取发酵薏苡仁样品（包含底物薏苡仁和发酵醪液），用匀浆机制成匀浆，称取约2.0 g（精确到0.0001 g）匀浆试样于50 mL具塞离心管中，加入50%乙腈溶液25 mL，涡旋混匀，于30 ℃水浴超声20 min，冷却至室温后，于4800 r/min离心10 min，将上清液转移至50 mL容量瓶中；于残渣中加入50%乙腈溶液20 mL，涡旋混匀后超声20 min，冷却至室温后，于4800 r/min离心10 min，将上清液转移至同一个50 mL容量瓶中，并用50%乙腈溶液定容至刻度，混匀。取适量上清液用0.22 μm有机滤膜过滤，用于液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪分析。
1.2.6.2 液相色谱条件
采用超高液相色谱仪对样品进行分离。色谱柱：SHIM-PACK WAX-2（4.0 mm×50 mm，5 μm）。流动相A为5 mmol/L甲酸铵水溶液（含0.4%甲酸，v/v），流动相B为甲醇。梯度洗脱程序：0~4 min，50%A；4~5 min，50%~90%A；5~6 min，90%~50%A，平衡时间2 min。柱温30 ℃，进样量5 μL，流速0.25 mL/min[23]。
1.2.6.3 质谱条件
离子源：电喷雾离子源，在正离子模式下选用多反应离子监测（multiple reaction monitoring，MRM）扫描模式进行定量分析。干燥气温度350 ℃；干燥气流速11 L/min；鞘气温度250 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压3500 V。定量离子对m/z 335.0/123.0，定性离子对m/z 335.0/97.0，去簇电压110 V，碰撞能量33 V[23]。
1.2.6.4 β-NMN含量的计算
将β-NMN标准品配制成浓度为10、50、100、200、300、500和1000 ng/mL的标准溶液，按照上述条件测定得到峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，标准方程为Y=47.118X-291.7293（R2=0.9998）。样品中β-NMN的含量计算如公式（1）：
β-NMN含量(μg/g)=C×V1m×1000 (1) 式中，C为根据标准曲线方程计算得到的检测样品中的β-NMN浓度，ng/mL；V1为定容体积，mL；m为样品质量，g。
1.2.7 感官定量描述分析
利用感官定量描述分析（sensory quantitative description analysis，SQDA）对蒸制薏苡仁样品和发酵薏苡仁样品进行感官评价。依据国家标准GB/T 16291.2-2010[24]培训和筛选品评员，建立包含12名品评员的感官评定分析小组（男女比例5:7）。参考屠婷瑶等[25]评价发酵型米酒感官风味特征的术语体系，讨论确定包括香气特征（包含谷物香、曲香、甜香、酒香和酸香）、口感特征（酸、甜、鲜）及酒体特征（醇厚感、爽净度）的主要感官风味描述语。使用0~5标度法对感官评分强度进行定量描述，数值0、1、2、3、4和5分别代表感官强度无、弱、稍弱、中等、稍强和强。
1.2.8 营养成分含量的测定
1.2.8.1 理化指标的测定
薏苡仁按照前述1.2.1方法处理，分别取未发酵薏苡仁和发酵薏苡仁样品，利用匀浆机进行匀浆，然后取适量匀浆样品开展营养成分的测定。还原糖、蛋白质、酒精度和总酸的测定分别依据GB 5009.7-2016第一法[26]、GB 5009.5-2016第一法[27]、GB 5009.225-2016第二法[28]和GB 12456-2021第一法[29]进行。
1.2.8.2 GABA的测定
未发酵薏苡仁和发酵薏苡仁样品中GABA含量的测定参考文献方法略作修改[30]。准确称取约0.1 g匀浆试样，加入5 mL 6 mol/L HCl，于已预热的105 ℃烘箱中水解24 h。水解后加入6 mol/L NaOH调节pH至中性，振荡混合均匀，再4000 r/min离心10 min，吸取0.5 mL水解液于棕色离心管中，分别加入pH9.0碳酸氢钠缓冲溶液和0.01 mol/L的2,4-二硝基氟苯（FDNB）各0.5 mL，放入60±0.5 ℃水浴中避光反应60 min。取出冷却，加入pH7.0磷酸缓冲液3.5 mL，继续室温避光孵育15 min使反应完全，4000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待测定。用标准品配制浓度为0.05、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/L的标准溶液，待测。液相色谱条件：VWD C18色谱柱（250×4.6 mm，0.5 μm）。流动相A为乙腈:甲醇=90:10，流动相B为0.02 mol/L的磷酸二氢钠+磷酸氢二钠。梯度洗脱程序：0~39 min，14%~40%A；39~44 min，40%~70%A；44~44.01 min，70%~14%A；44.01~49 min，14%A。测定波长360 nm，进样量20 μL，流速1 mL/min，柱温38 ℃。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作出标准曲线，得到标准方程为Y=182.03X+3.9207（R2=0.9997）。根据标准曲线方程计算样品中GABA含量。
1.2.9 SAMe的测定
1.2.9.1 样品制备
首先将样品用匀浆机制成匀浆，准确称取10.0 g（精确到0.0001 g）样品匀浆于50 mL棕色容量瓶，加入40 mL超纯水，振荡均匀，冰浴超声提取60 min，然后定容至刻度。样品转移至棕色离心管，于4 ℃，13000 r/min离心10 min。取适量上清液过0.22 μm滤膜上机测定。样品中S-腺苷甲硫氨酸利用AB Sciex API 4000 LC/MS/MS三重四级杆质谱仪进行检测。
1.2.9.2 液相色谱条件
S-腺苷甲硫氨酸的测定方法参考文献的方法进行适当修改[31−32]。色谱柱：Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0~0.1 min，95%A；0.1~2 min，95%~80%A；2~4 min，80%~20%A；4~4.5 min，20%A；4.5~5 min，20%~95% A。柱温40 ℃，进样量10 μL，流速0.3 mL/min。
1.2.9.3 质谱条件
离子喷雾电压+/−5500/4500 V，正离子模式ESI+，离子源温度450 ℃，气帘气35 arb，碰撞气7 arb，IonSource Gas1 40 arb，IonSource Gas2：50 arb。定量离子对为m/z 399.4/250.0，定性离子对m/z 399.4/298.4。
1.2.9.4 SAMe含量的计算
将SAMe标准品配制成浓度为20、50、100、200、500、2000和10000 ng/mL的溶液，按照上述条件测定得到峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，标准方程为Y=82.254X−11591（R2=0.9987）。样品中SAMe的含量计算如公式（2）：
SAMe含量(μg/g)=C×V1m×1000 (2) 式中，C为根据标准曲线方程计算得到的检测样品中的SAMe浓度，ng/mL；V1为定容体积，mL；m为样品质量，g。
1.2.10 总多酚的测定
将未发酵薏苡仁和发酵薏苡仁样品于冷冻干燥机中冻干24 h，粉碎后过40目筛，取筛下物备用。总多酚含量测定采用试剂盒法，测定步骤依据试剂盒说明书实施。总酚含量按样品重量计算，单位为mg/g。
1.2.11 ABTS+·清除能力和铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）的测定
采用试剂盒法测定总抗氧化能力，包括ABTS+·清除能力和FRAP。利用匀浆机对未发酵薏苡仁和发酵薏苡仁进行匀浆，称取约2.0 g（精确到0.0001 g）匀浆样品，加入18 mL PBS（0.1 mol/L，m/v）溶解，旋涡混合均匀，于13000 r/min离心5 min，取上清液测定。样品总抗氧化能力的测定步骤依据试剂盒说明书实施。总抗氧化能力以Trolox等效抗氧化能力（trolox-equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示，单位为mmol TEAC/L。
1.2.12 羟基自由基（·OH）清除能力的测定
称取1.2.11所述匀浆样品约5.00 g（精确到0.0001 g），按照1:2（w/w）的比例加入蒸馏水进行稀释，然后13000 r/min离心5 min，得到上清液备用。羟基自由基清除能力的测定参考文献方法略作修改[33]。吸取0.5 mL上清液，依次加入1.5 mL蒸馏水，2 mL浓度均为6 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液和水杨酸溶液，振荡均匀后置于37 ℃水浴锅中保温反应30 min，然后12000 r/min离心5 min，取上清液测定，以蒸馏水调零，在510 nm处测得样品吸光度（A1）。以蒸馏水代替H2O2溶液，测定得到样品本底管吸光度（A2）。以蒸馏水代替样品，测定得到空白对照管吸光度（A0）。羟基自由基清除能力的计算如公式（3）：
羟基自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (3) 1.2.13 DPPH自由基清除能力的测定
DPPH自由基清除能力的测定方法参考文献方法略作修改[34]。吸取1.2.12中的上清液0.5 mL，加蒸馏水补足2 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL，混合均匀，室温避光反应30 min。以无水乙醇调零，测定517 nm处吸光度（A1）。以无水乙醇代替DPPH溶液，测定样品本底管吸光度（A2）；以无水乙醇代替样品和蒸馏水，测定空白管吸光度（A0）。DPPH自由基清除能力的计算如公式（4）：
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (4) 1.3 数据处理
所有实验重复至少3次。采用Microsoft office Excel 2010软件对实验数据进行统计和计算， GraphPad Prism 8.2软件进行作图，SPSS Statistics 27软件对数据进行单因素ANOVA检验，数据显著性差异水平P<0.05。
2. 结果与分析
2.1 不同菌种发酵对β-NMN合成的影响
五种不同的真菌，米曲霉、米根霉、红曲霉、毛霉和酵母菌，分别用于发酵薏苡仁底物。发酵产物中的β-NMN含量如图1所示。米曲霉、红曲霉和毛霉发酵薏苡仁中β-NMN含量为0.18~0.23 μg/g，而米根霉发酵薏苡仁中产生的β-NMN含量最高（8.18 μg/g），远高于其他菌种发酵生成的β-NMN含量。利用米根霉发酵生成β-NMN的研究目前还鲜有报道。由结果可知，酵母菌发酵后也可产生少量β-NMN（0.82 μg/g）。据文献报道，酵母细胞中存在β-NMN合成所需的底物烟酰胺核糖（nicotinamide riboside，NR）的转运体Nrt1[35]，以及存在β-NMN合成的关键限速酶——烟酰胺核苷激酶（nicotinamide riboside kinase，NRK）[36]。推测米根霉细胞中也可能存在类似的转运体或NRK。比较不同菌种发酵产生β-NMN的结果可知，米根霉是合成β-NMN的最佳菌种。
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2.2 不同发酵时间对β-NMN合成的影响
米根霉发酵不同时间后发酵薏苡仁中β-NMN含量如图2所示。发酵时间在36~54 h范围内时，产物中β-NMN含量随发酵时间延长逐渐升高，发酵54 h时达到最高值8.46 μg/g。随着发酵时间进一步延长，β-NMN含量呈逐渐下降趋势。研究组前期研究也发现，米根霉发酵薏苡仁54 h后，得到的产品风味最好、理化指标较高，说明此时菌体代谢能力较强[21]。随着发酵时间进一步延长，菌体逐渐老化[37]。为了维持细胞内正常的氧化还原反应，在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶作用下，β-NMN转化为NAD+，进一步被还原为NADH，以维持胞内正常还原力[14−16]，从而β-NMN逐渐被消耗，导致产物中的含量越来越低。类似的结果与基因工程大肠杆菌异源表达酵母NRK编码基因合成β-NMN的规律相似，菌体发酵50 min后，随着发酵时间进一步延长，β-NMN积累呈下降趋势[38]。因此，选择发酵时间为54 h开展后续实验。
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图 2 不同发酵时间对发酵薏苡仁中β-NMN含量的影响Figure 2. Effect of different fermentation time on β-NMN content in the fermented Coix seed2.3 不同维生素B对β-NMN合成的影响
在底物蒸制薏苡仁中分别添加烟酰胺、烟酸和VB1，发酵产物中β-NMN含量的变化如图3所示。烟酰胺添加量为60~100 mg/kg范围时，发酵薏苡仁中β-NMN含量较高（图3A）。单独添加烟酰胺较高浓度时（>120 mg/kg），产物β-NMN的含量反而降低。这可能是由于单独添加烟酰胺到一定浓度时，对真菌具有抑制作用。如陈显振等[39]发现烟酰胺对烟曲霉具有抑制作用，廖泽彬[40]发现烟酰胺对白色念珠菌、热带念珠菌等真菌具有抑制作用。但由于烟酰胺是β-NMN生物合成最直接的底物[15−16]，可能在较宽的范围内影响β-NMN的生成，因此选择40~150 mg/kg开展进一步试验。烟酸添加量低于40 mg/kg范围时，发酵薏苡仁中β-NMN含量随烟酸添加量增加而增加（图3B）。当烟酸添加量达到50 mg/kg时，发酵薏苡仁中β-NMN含量呈下降趋势。这可能是由于较高浓度的烟酸通过Preiss-Handler途径提高细胞中NAD+的水平，降低了从β-NMN转变为NAD+的需求，因而使得β-NMN产量反而降低[14]。因此，选择烟酸添加量5~50 mg/kg开展进一步试验。当VB1添加量小于31.25 μg/kg时，发酵薏苡仁中β-NMN含量随VB1添加量增加而增加。VB1添加量从37.5 μg/kg增加至50 μg/kg时，β-NMN含量显著下降（P<0.05）（图3C）。这可能是由于VB1的活性形式硫胺素焦磷脂是糖代谢中丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体的重要辅因子[41]，VB1含量在较低范围内可提高细胞中三羧酸循环的酶促反应效率，消耗NAD+，因而提高了对其前体物质β-NMN的需求，使得β-NMN的合成得到加强。但是单独添加较高浓度的VB1反而可能会对真菌菌丝体生长有抑制作用，如培养基中较高浓度的VB1可显著抑制大型真菌羊肚菌菌丝体的生长[42]，但其具体的分子调控机制还有待进一步研究。生物体内不同物质的代谢可通过共同的调控网络来实现物质代谢之间的相互平衡[43]，本研究选择VB1添加量18.75~50 μg/kg开展进一步的优化试验。
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图 3 添加不同维生素对发酵薏苡仁中β-NMN含量的影响Figure 3. Effects of different vitamins on β-NMN content in fermented Coix seed2.4 均匀设计试验对发酵工艺的优化结果
结合单因素实验结果，以不同维生素添加量为自变量，β-NMN含量为因变量，开展均匀设计试验，结果如表2所示。根据实验水平数，建立包含4个变量的二次型回归模型，采用逐步回归法对变量进行筛选[22]，得到回归统计和方差分析结果。如表3所示，回归统计的复相关系数R和拟合系数R2均接近1。方差分析结果显示（表4），显著性结果P=0.006<0.05，说明多项式回归模型拟合度较好。回归方程为Y=19.93803+0.001077X1X2+0.001963X2X3−0.0857X2−0.16964X3。采用方程运算法对多项式回归模型进行验证，将试验参数带入模型中计算，得到预测结果与试验结果的相对误差范围为−0.06%~0.05%，表明回归模型可靠。进一步通过多项式回归模型“规划求解”得到预测的最佳添加量：维生素B1为50 μg/kg、烟酰胺为150 mg/kg、烟酸为50 mg/kg，预测发酵薏苡仁中β-NMN的最高含量为21.40 μg/g。进一步在预测的最佳条件下开展验证实验，检测发酵薏苡仁中β-NMN含量为20.07 μg/g，接近预测值，说明在该条件下发酵，能使β-NMN含量达到到较高的水平。
表 2 均匀设计试验结果Table 2. Results of the uniform design test试验号 因素 β-NMN含量
（μg/g）VB1（μg/kg） 烟酰胺（mg/kg） 烟酸（mg/kg） 1 18.75 60 20 14.98 2 25.00 100 50 15.39 3 31.25 150 10 13.38 4 37.50 40 40 14.48 5 43.75 80 5 16.78 6 50.00 120 30 18.1 表 3 回归统计结果Table 3. Results of regression statistics指标 结果 Multiple R 0.99999248 R2 0.99998496 Adjusted R2 0.999924799 标准误差 0.014621103 观测值 6 表 4 方差分析结果Table 4. Results of variance analysis方差来源 自由度 平方和 均方 F P 回归 4 14.213 3.553 16621.869 0.006 残差 1 0.001 0.001 总计 5 14.214 2.5 薏苡仁发酵前后感官特征评价结果
直接取蒸制薏苡仁和发酵薏苡仁样品，应用SQDA方法进行感官分析，定量描述统计结果如图4所示。蒸制薏苡仁具有明显的谷物香和轻微的甜味（图4虚线黑色方块所示）。经发酵以后，发酵薏苡仁在气味方面表现出较好的曲香、酒香和甜香味，略有酸香味。滋味方面，发酵薏苡仁的甜味较为明显，其次是酸味，有一定的爽净度和醇厚感，鲜味不明显，口感较为清甜。说明米根霉发酵有助于改善薏苡仁的感官品质。
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图 4 薏苡仁发酵前后的香气和滋味剖面图Figure 4. Aroma and flavor profile of Coix seed before and after fermentation2.6 薏苡仁发酵前后营养成分分析
未发酵薏苡仁及发酵薏苡仁中各营养成分的测定结果如表5所示。发酵薏苡仁中蛋白质含量提高了1.13倍，这可能与米根霉利用发酵底物中的糖代谢物质合成自身氨基酸有关[21]。还原糖含量上升非常显著，提高了5.16倍，这是由于米根霉富含淀粉酶和纤维素酶[44]，可将薏苡仁中的淀粉和纤维素降解，提高还原糖含量，同时赋予发酵薏苡仁明显的甜味（图4）。总酸含量为0.37 g/kg，乙醇浓度为2.5%vol，这与发酵薏苡仁感官评价具有一定酸味和爽净度是一致的。此外，发酵薏苡仁中两种生物活性物质—GABA和SAMe的含量明显提高，GABA含量比发酵前提高了1.24倍，SAMe含量提高了256倍。GABA具有许多生理功能，包括降低血压、增强记忆力、抗炎症、预防肥胖、增强免疫力、减少失眠等[45]。类似的结果在酵母发酵薏苡仁中也观察到，发酵后GABA增加了6倍[12]。而SAMe是一种关键的生物多效性分子，参与三种类型的细胞反应：转甲基化、转硫化和转氨丙化[46]。已证明SAMe可增强干扰素的抗病毒作用，补充SAMe可恢复肝谷胱甘肽（GSH）沉积，减轻肝损伤，治疗关节炎和抑郁症，减少黄疸[47]。目前研究报道自然合成SAMe的微生物主要为酵母，包括假丝酵母和酿酒酵母，其次是利用诱变技术和代谢工程改造的菌种，包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌，解淀粉芽孢杆菌等[46]。米根霉发酵可自然合成大量SAMe，显示在SAMe研究应用上具有巨大的潜力。发酵薏苡仁中游离总酚含量从0.82 mg/g提高至3.84 mg/g。在谷物中，酚类化合物主要通过与细胞壁组分（如纤维素、半纤维素、果胶和结构蛋白等）呈共价结合态形式存在[48]。米根霉发酵可破坏谷物的细胞壁结构，从而促进这种共价键的断裂，使得结合酚类物质转变为游离状态[44]。
表 5 薏苡仁发酵前后的营养成分含量Table 5. Contents of nutritional compounds of Coix seed before and after fermentation样品名称 蛋白质
（g/100 g）还原糖（以葡萄糖计）
（g/100 g）总酸（以乳计）
（g/kg）乙醇浓度
（%vol）GABA
（mg/g）SAMe
（μg/g）总多酚
（mg/g）未发酵
薏苡仁5.56±0.08 3.80±0.62 − − 3.64±0.07 0.56±0.04 0.82±0.12 发酵
薏苡仁6.27±0.95 19.60±0.30*** 0.37±0.03 2.5 4.51±0.09** 143.47±11.63*** 3.84±0.77* 注：*表示发酵薏苡仁与未发酵薏苡仁相比，该项检测结果具有统计学差异（P<0.05），**表示具有显著统计学差异（P<0.01）， ***表示具有极显著统计学差异（P<0.001），图5同。 2.7 薏苡仁发酵前后抗氧化能力的变化
薏苡仁发酵前后总抗氧化能力（ABTS+·清除能力和FRAP）、羟基自由基（·OH）清除能力和DPPH·清除能力的测定结果如图5所示，结果表明米根霉发酵可显著改善薏苡仁的抗氧化能力。未发酵薏苡仁水提物中的ABTS+·清除能力和FRAP分别为0.41和4.33 mmol TEAC/L。发酵后，发酵薏苡仁水提物的ABTS+·清除能力和FRAP分别提高至5.89和10.38 mmol TEAC/L，分别提高了14.37和2.40倍。研究结果与文献报道一致。米根霉发酵脱脂薏米麸皮可显著提高水提取物中的FRAP和ABTS+·清除能力[11]。·OH清除能力和DPPH·清除能力也有极显著提升（P<0.001），分别从18.27%和15.03%提高至83.06%和70.19%，分别提高了4.55和4.67倍。文献报道，米根霉与植物乳杆菌协同发酵燕麦，可提高·OH清除能力和DPPH·清除能力1.99倍和2.04倍[34]。米根霉发酵提高薏苡仁抗氧化性能力，可能与游离总酚含量增加有关[42]。
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图 5 薏苡仁发酵前后抗氧化能力的变化Figure 5. Changes of antioxidant properties of Coix seed before and after fermentation3. 结论
本研究以药食同源物质薏苡仁为发酵底物，筛选出米根霉为发酵生成β-NMN的最佳菌种。米根霉发酵薏苡仁54 h可使β-NMN含量达到最高。经单因素实验和均匀设计试验优化三种B族维生素的添加量，得到最佳添加量分别为：烟酰胺150 mg/kg、烟酸50 mg/kg、维生素B1 50 μg/kg。此工艺条件下得到的发酵薏苡仁中，β-NMN含量可达20.07 μg/g。发酵薏苡仁中还原糖含量达到19.6 g/100 g，总酸含量0.37 g/kg，酒精含量2.5%vol，改善了薏苡仁的感官品质。此外，发酵薏苡仁中生物活性物质GABA和SAMe含量分别提高1.24倍和256倍，总酚含量提高4.7倍，ABTS+·清除能力、FRAP、·OH清除能力和DPPH·清除能力分别提高14.37、2.40、4.55和和4.67倍，显示米根霉发酵对提高薏苡仁功能性具有较大潜力。未来研究应结合转录组学、代谢组学等多组学技术及分子生物学技术，进一步研究B族维生素调控米根霉合成β-NMN的生物学机制。本研究为富含β-NMN的功能性产品研发提供新的思路，为薏苡仁等谷物类原料精深加工提供依据和参考。
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图 2 不同发酵时间对发酵薏苡仁中β-NMN含量的影响
Figure 2. Effect of different fermentation time on β-NMN content in the fermented Coix seed
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图 3 添加不同维生素对发酵薏苡仁中β-NMN含量的影响
Figure 3. Effects of different vitamins on β-NMN content in fermented Coix seed
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图 4 薏苡仁发酵前后的香气和滋味剖面图
Figure 4. Aroma and flavor profile of Coix seed before and after fermentation
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图 5 薏苡仁发酵前后抗氧化能力的变化
Figure 5. Changes of antioxidant properties of Coix seed before and after fermentation
表 1 均匀设计试验因素水平
Table 1 Factor level of uniform design test
水平 因素 X1（VB1）（μg/kg） X2（烟酰胺）（mg/kg） X3（烟酸）（mg/kg） 1 18.75 40 5 2 25.00 60 10 3 31.25 80 20 4 37.50 100 30 5 43.75 120 40 6 50.00 150 50 
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表 2 均匀设计试验结果
Table 2 Results of the uniform design test
试验号 因素 β-NMN含量
（μg/g）VB1（μg/kg） 烟酰胺（mg/kg） 烟酸（mg/kg） 1 18.75 60 20 14.98 2 25.00 100 50 15.39 3 31.25 150 10 13.38 4 37.50 40 40 14.48 5 43.75 80 5 16.78 6 50.00 120 30 18.1
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表 3 回归统计结果
Table 3 Results of regression statistics
指标 结果 Multiple R 0.99999248 R2 0.99998496 Adjusted R2 0.999924799 标准误差 0.014621103 观测值 6
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表 4 方差分析结果
Table 4 Results of variance analysis
方差来源 自由度 平方和 均方 F P 回归 4 14.213 3.553 16621.869 0.006 残差 1 0.001 0.001 总计 5 14.214
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表 5 薏苡仁发酵前后的营养成分含量
Table 5 Contents of nutritional compounds of Coix seed before and after fermentation
样品名称 蛋白质
（g/100 g）还原糖（以葡萄糖计）
（g/100 g）总酸（以乳计）
（g/kg）乙醇浓度
（%vol）GABA
（mg/g）SAMe
（μg/g）总多酚
（mg/g）未发酵
薏苡仁5.56±0.08 3.80±0.62 − − 3.64±0.07 0.56±0.04 0.82±0.12 发酵
薏苡仁6.27±0.95 19.60±0.30*** 0.37±0.03 2.5 4.51±0.09** 143.47±11.63*** 3.84±0.77* 注：*表示发酵薏苡仁与未发酵薏苡仁相比，该项检测结果具有统计学差异（P<0.05），**表示具有显著统计学差异（P<0.01）， ***表示具有极显著统计学差异（P<0.001），图5同。
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