Inverse Virtual Screening, Recombinant Expression, and Activity Characterization of Purine Degrading Enzymes
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摘要: 为开发可用于食品领域的新型嘌呤降解酶，本研究采用反向虚拟筛选技术和分子对接技术，筛选具有潜在嘌呤降解活性的酶，对该酶进行克隆表达、纯化及活性验证，并探究其降解嘌呤的最优反应条件。结果表明，由反向虚拟筛选平台PharmMapper筛选得到的二氢乳清酸酶和腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤的对接结合能分别为−7.3、−6.9、−7.6、−8.8 kcal/mol，对接结果最好。经克隆表达获得分子量为41 kDa的二氢乳清酸酶，其催化鸟嘌呤降解的最适条件为pH8.0，25 ℃，在Zn2+（0.5 mmol/L）催化下，可降解46.1%的鸟嘌呤。因此，本研究发现二氢乳清酸酶具有一定的鸟嘌呤降解活性，并确定了其降解鸟嘌呤的最佳反应条件，为其在食品嘌呤降解中的应用奠定基础。Abstract: To develop a novel purine degrading enzyme that can be used in the food industry, this study aimed to screen an enzyme with potential purine degradation activity using inverse virtual screening technology and molecular docking technology, clone express, purify, and validate the activity of this enzyme, and explore the optimal reaction conditions for its degradation of purines. The results showed that the docking binding energies of dihydroorotase screened by the inverse virtual screening platform PharmMapper with adenine, guanine, hypoxanthine, and xanthine were −7.3, −6.9, −7.6, and −8.8 kcal/mol, respectively, which had the optimum docking result. The dihydroorotase with a molecular weight of 41 kDa was obtained with cloning expression. The optimal conditions for catalyzing the degradation of guanine were pH8.0, 25 ℃, and under the catalysis of Zn2+ (0.5 mmol/L), guanine could be degraded at a ratio of 46.1%. Therefore, it found that dihydroorotase had the degradation activity for guanine, and the optimal reaction conditions for guanine degradation were determined, which laid foundation for the application in degradation of food purine.
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Keywords:
- inverse virtual screening /
- molecular docking /
- cloning expression /
- guanine /
- degradation
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嘌呤是一类含氮的杂环芳香化合物，主要包括腺嘌呤、鸟嘌呤以及两种次生代谢产物次黄嘌呤和黄嘌呤，能够作为含氮碱基构成嘌呤核苷酸。人体中的嘌呤主要来源于内源代谢产生和外源饮食摄入，且4种嘌呤在人体中的代谢终产物均为尿酸[1−2]，而尿酸会经肾脏排泄或在肠道内分解[3]。一旦这种平衡被打破，就可能引发高尿酸血症和痛风。近年来，我国高尿酸血症患病率超过13.3%[4]，有年轻化趋势[5−6]。高嘌呤饮食习惯是导致高尿酸血症和痛风的一个重要原因[7−9]，且食品中嘌呤含量过多会加重患者的病情。尽管有自身嘌呤含量低的食品可供选择，但高嘌呤食品往往也是高蛋白食品，限制性饮食会导致营养受限，不能满足人们对多元化食品的选择，因此对高嘌呤食品进行脱嘌呤处理是有必要的。
常见的食品脱嘌呤方法有吸附法、盐析-吸附法、外加酶法等[10−11]。目前，吸附法和盐析-吸附法研究较广泛。谢微[12]使用吸附剂吸附豆浆中的嘌呤类物质，使其含量降低，再进行喷雾干燥得到低嘌呤豆腐粉；李慧慧[13]利用盐析-吸附法脱除豆浆中的嘌呤，虽嘌呤脱除效果较好，但采用这两种方法往往需要多重吸附达到预期效果，且活性炭的吸附作用不具备特异性，多次吸附也可能会使食品的风味、色素和营养成分有较大的损失[14]。外加酶法是通过将酶添加到食品中，达到降低食品中嘌呤含量的目的。利用酶法脱除食品中的嘌呤具有专一、高效等优点，且操作简便。有研究者利用嘌呤降解途径中的关键酶，仿造生物体内嘌呤类物质天然代谢途径，降解食品中嘌呤类物质的含量。嘌呤代谢途径中的酶，如鸟嘌呤脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶、黄嘌呤氧化酶等经构建和重组表达后，应用至牛肉汤等食物中，能够使食物中的嘌呤含量显著减少[15−17]。因此，合理使用外加酶脱除食品中的嘌呤有相对理想的应用。然而，目前对外加酶法降解嘌呤的研究较少，可被用于脱除食品中嘌呤的酶种类较为单一，且通常需要多种酶组成酶系，或与其他方法联合使用。因此需要开发新的嘌呤降解酶，为酶法脱除食品中的嘌呤提供参考。
本研究采用反向虚拟筛选技术，筛选获得具有潜在嘌呤降解活性的酶，再通过基因工程技术得到该酶，进行嘌呤降解活性的验证及反应条件的优化，最终获得嘌呤降解酶，丰富嘌呤降解酶的种类，为后续低嘌呤食品的开发提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤标准品（色谱纯） 上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯） ACS恩科化学；冰乙酸（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；四丁基氢氧化铵（25%）（色谱纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）（分析纯）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（P1200）、彩虹130广谱蛋白Marker 上海索莱宝生物科技有限公司；氯化钠、盐酸、咪唑 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；DNA Marker（2000 Da） 北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖（分析纯） 上海贝晶生物技术有限公司；PET-28a质粒、大肠杆菌BL21（DE3）、DH5α 北京擎科生物科技股份有限公司。
Agilent 1260高效液相色谱系统（配有紫外检测器） 美国安捷伦科技有限公司；色谱柱InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 岛津公司；AKTA蛋白纯化系统（连接镍离子亲和柱HisTrap™HP柱（1 cm×1 cm）） GE医疗；超滤管（10 kDa） 默克密理博。
1.2 实验方法
1.2.1 反向虚拟筛选
1.2.1.1 嘌呤结构文件的获取
从数据库PubChem中下载腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤SDF格式的结构文件，其PubChem CID分别为190、135398634、135398638、1188。
1.2.1.2 反向虚拟筛选
利用反向虚拟筛选平台PharmMapper进行嘌呤降解酶的反向虚拟筛选[18−20]。在平台的Submit Job模块分别上传腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤SDF格式的结构文件，在参数设置中药效团映射模块，选择目标集All Targets，其他采用默认参数。得到的结果根据酶的功能、来源进行分类，进一步筛选出对五元环、六元环或含氮环有裂解或修饰作用的酶，作为初筛结果。本研究所用数据库及平台的网址见表1。
表 1 反向虚拟筛选所用数据库及平台Table 1. Database and platform for inverse virtual screening数据库 网址 PharmMapper http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ PubChem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ RCSB PDB（Protein Data Bank） https://www.rcsb.org/ UniProt https://www.uniprot.org/ Protein-Ligand Interaction Profiler https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ Venny https://bioinfogp.cnb.csic.es/ 1.2.1.3 分子对接验证
使用AutoDock Vina对接软件对反向虚拟筛选初筛结果中的酶和4种嘌呤分别进行分子对接[21−22]。从RCSB PDB数据库中下载酶的PDB结构文件，使用PyMol软件分别对蛋白和嘌呤进行预处理，利用AutoDock Vina运行分子对接。运行结束后输出分子对接结合能，借助Protein-Ligand Interaction Profiler网站和PyMol软件进行相互作用力的分析，作出分子对接图。根据分子对接结果，结合各个酶的功能，筛选出一个最优酶对其是否具有嘌呤降解活性进行实验验证。
1.2.2 酶的克隆、表达及纯化
1.2.2.1 酶的克隆
筛选出的最优酶通过大肠杆菌进行克隆表达。二氢乳清酸酶基因的完整编码序列从PDB数据库中获得，PDB编号为1J79。由北京擎科生物科技股份有限公司合成并将其连接至PET-28a质粒中。将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）和DH5α中，挑取阳性单克隆设计引物进行菌落PCR，上游引物P1为5'-ggatccACCGCTCCAAG-3'，下游引物P2为5'-ctcgagCTGTTTAACGGACC-3'，参考南京诺唯赞生物科技有限公司推荐的PCR反应体系（表2）进行目的基因扩增，在95 ℃预变性5 min后，进入循环过程，包括95 ℃变性15 s，52 ℃复性15 s，72 ℃延伸11 s，共循环30次，最后在72 ℃下彻底延伸5 min，4 ℃下终止并储藏，并通过琼脂糖凝胶核酸电泳进行验证。验证正确后，经北京擎科生物科技股份有限公司进行测序，进一步验证转化是否成功。
表 2 菌落PCR反应体系Table 2. Colony PCR reaction system溶液名称 加样量 2×Rapid Taq Master Mix 25.0 μL 引物P1 2.0 μL 引物P2 2.0 μL 模板DNA 50~100 ng ddH2O 补足到50.0 μL 1.2.2.2 酶的表达
转化成功的大肠杆菌BL21（DE3）重组菌株进行液体培养，添加IPTG（1 mmol/L），16 ℃诱导表达20 h。6500 r/min离心10 min收集菌体，将菌体重新悬浮于结合缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，pH8.0）后，进行冰上超声破碎，条件为：功率210 W，超声3 s，间隔3 s，时间30 min，菌液由粘稠的乳液状转变为澄清状态。12000 r/min离心30 min取上清液，作为粗酶液。
1.2.2.3 酶的纯化
粗酶液经0.45 μm孔径的过滤器过滤后，上样于经过结合缓冲液预平衡后的AKTA蛋白纯化系统，以0~500 mmol/L咪唑溶液进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min。收集峰洗脱液，使用超滤管（10 kDa）进行超滤脱盐，超滤管使用前4 ℃预冷，离心时转速为4332 r/min，浓缩至1 mL左右，重复3次，得到纯化的二氢乳清酸酶（DHOase）酶液，将酶液冷冻干燥后储存在-80 ℃下备用。通过SDS-PAGE分析酶的表达及纯化效果，凝胶制备操作步骤参考SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书，其中分离胶浓度为12%。
1.2.3 嘌呤的检测条件及嘌呤降解率的计算
采用配备紫外检测器的高效液相色谱系统（HPLC-VWD）测定嘌呤含量。参考曲欣[23]嘌呤检测的方法，稍作修改，流动相为A相（超纯水:甲醇:冰乙酸:25%四丁基氢氧化铵（882:100:15:3，v/v）），以50%比例与B相（超纯水）混合。在30 ℃条件下，以0.8 mL/min流速洗脱，检测波长为254 nm，上样量20 μL。在上柱前，所有试剂和样品都经孔径为0.22 µm过滤器过滤。嘌呤的降解率由公式计算。
γ(%)=A0−A1A0×100 式中：γ为降解率（%）；A0为未经酶处理对照组的嘌呤浓度（mg/L）；A1表示酶处理组的嘌呤浓度（mg/L）。
1.2.4 DHOase降解嘌呤反应条件的筛选
1.2.4.1 金属离子种类对DHOase降解嘌呤的影响
在反应体系中分别添加金属离子Mg2+、Fe3+、Ca2+、Cu2+、Zn2+，测定不同金属离子对DHOase降解嘌呤的影响。反应在Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中进行，体系共250 μL，其中酶液终浓度为0.8 mg/mL，嘌呤终浓度为160 mg/mL，MgCl2、FeCl3、CaCl2、CuSO4和ZnCl2溶液（对照组不添加金属离子溶液）终浓度为0.5 mmol/L。在25 ℃下振荡降解24 h。样品经0.22 μm孔径过滤器过滤后进行高效液相色谱检测，计算嘌呤的降解率。
1.2.4.2 Zn2+浓度对DHOase降解嘌呤的影响
在反应体系中添加不同浓度的Zn2+，测定Zn2+对DHOase降解嘌呤的影响。反应体系中添加Zn2+（终浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0 mmol/L），具体步骤同1.2.4.1。计算嘌呤的降解率，确定DHOase发挥最优嘌呤降解效果时需添加Zn2+的浓度。
1.2.4.3 反应pH对DHOase降解嘌呤的影响
将酶液（8 mg/mL）置于不同pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）的Tris-HCl缓冲液中，添加最佳浓度的Zn2+，具体步骤同1.2.4.1。计算嘌呤的降解率，以此确定DHOase降解嘌呤的最适反应pH。
1.2.4.4 反应温度对DHOase降解嘌呤的影响
在1.2.4.3测得的最适反应pH的条件下，20~45 ℃温度范围内，每5 ℃设置一个梯度，酶液中添加最佳浓度的Zn2+，具体步骤同1.2.4.1。计算嘌呤的降解率，以此确定DHOase降解嘌呤的最适反应温度。
1.3 数据处理
在所有实验中，测定三个平行样品，其数据表示为平均值±标准偏差。使用IBM SPSS Statistics 25软件进行Duncan’s ANOVA的统计分析，不同字母表示各组间差异显著（P<0.05）。采用Origin 2018软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 反向虚拟筛选
将腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤的结构文件提交至反向虚拟筛选平台PharmMapper进行反向虚拟筛选，各输出300条结果，将结果中的非酶蛋白删除后，利用Venny网站将其取交集，剩余49条结果，通过查阅相关文献及搜索数据库，从中筛选出对五元环、六元环或含氮环有修饰或裂解作用的6个候选酶（表3），作为初筛结果。
表 3 反向虚拟筛选初筛结果Table 3. Inverse virtual screening preliminary screening results序号 PDB编号 拟合分数 标准化拟合分数 z'分数 名称 功能 UniProt编号 1 1JUY 2.474 0.309 −0.633 腺苷琥珀酸合成酶 核苷酸运输和代谢 P0A7D4 2 1X7N 2.789 0.465 0.823 葡萄糖-6-磷酸异构酶 碳水化合物运输和代谢 P83194 3 1J79 2.471 0.412 0.026 二氢乳清酸酶 核苷酸运输和代谢 P05020 4 1GTE 3.116 0.445 0.159 二氢嘧啶脱氢酶 氨基酸运输和代谢 Q12882 5 1DE5 2.44 0.407 −0.012 L -鼠李糖异构酶 参与l -鼠李糖异构酶活性 P32170 6 1F76 2.923 0.5846 1.791 二氢乳清酸脱氢酶 核苷酸运输和代谢 P0A7E1 以上6个酶的作用位点是五元环、六元环或含氮环，可起到断裂C-C键或修饰环的作用，因此可能对嘌呤环有潜在的破坏作用。
2.2 分子对接验证
通过PDB数据库下载酶的三维结构文件，分别与原配体和4种嘌呤进行分子对接，输出对接结合能（表4和表5）。与原配体的对接结合能相比较，二氢乳清酸酶与4种嘌呤的对接结果最好。二氢乳清酸酶（PDB编号：1J79）晶体结构中有两个小分子配体，分别为N-氨甲酰-L-天冬氨酸（NCD）和乳清酸（ORO）。通常来说，对接结合能小于−5.0 kcal/mol，即认为对接结果是可行的，分子对接输出的结合能打分越低，则代表蛋白受体和配体结合越稳定[24−25]。该酶与嘌呤的对接结合能均小于−6.5 kcal/mol，并接近甚至小于与原配体NCD和ORO的结合能，证明酶与嘌呤有较好的结合作用。图1为1J79与4种嘌呤的分子对接图，其中红色虚线表示二氢乳清酸酶与嘌呤之间形成的氢键，ASP250、LEU222、ASN44、ALA266是两者之间形成氢键的关键残基，4种嘌呤和原配体ORO在结合口袋中的位置和姿态具有一定的相似性。
表 4 酶与腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤的分子对接结果Table 4. Molecular docking results of enzyme with adenine, guanine, hypoxanthine and xanthine序号 名称 PDB ID 金属离子 辅酶 与嘌呤的对接结合能（kcal/mol） 腺嘌呤 鸟嘌呤 次黄嘌呤 黄嘌呤 1 二氢乳清酸酶 1J79 Zn2+ − −7.3 −6.9 −7.6 −8.8 2 二氢嘧啶脱氢酶 1GTE 无 FMN、FAD −4.8 −5.5 −5.7 −6.3 3 L -鼠李糖异构酶 1DE5 Zn2+ − −4.9 −7.1 −5.1 −5.6 4 腺苷琥珀酸合成酶 1JUY Mg2+ − −4.9 −4.6 −5.1 −5.1 5 葡萄糖-6-磷酸异构酶 1X7N Mn2+ − −4.8 −5.3 −4.8 −4.9 6 二氢乳清酸脱氢酶 1F76 无 − −5.2 −4.9 −6.2 −6.9 注：FMN为黄烷单核苷酸，FAD为黄素腺嘌呤二核苷酸。 表 5 酶与原配体的分子对接结果Table 5. Molecular docking results of the enzyme and the original ligand序号 名称 与原配体的对接结合能 （kcal/mol） 配体1 配体2 配体3 1 二氢乳清酸酶 −8.2（ORO） −7.1（NCD） − 2 二氢嘧啶脱氢酶 −6.8（IUR） − − 3 L-鼠李糖异构酶 −5.7（RNT） − − 4 腺苷琥珀酸合成酶 −7.9（GDP） −7.8（H5P） −5.7（HDA） 5 葡萄糖-6-磷酸异构酶 −6.3（PA5） − − 6 二氢乳清酸脱氢酶 −9.5（ORO） − − 注：ORO为乳清酸，NCD为N-氨甲酰-L-天冬氨酸，IUR为5-碘尿嘧啶，RNT为L-鼠李糖醇，GDP为鸟苷-5'-二磷酸，H5P为海当西定-5'-磷酸，HDA为N-羟-N-甲酰甘氨酸，PA5为5 -磷酸阿拉伯糖酸。 ![]()
图 1 1J79和腺嘌呤（a）、鸟嘌呤（b）、次黄嘌呤（c）、黄嘌呤（d）的相互作用Figure 1. Interaction between 1J79 and adenine (a), guanine (b), hypoxanthine (c), xanthine (d)通过查阅文献可知，二氢乳清酸酶在酸性条件下催化N-氨基甲酰-L-天冬氨酸脱水环化形成L-二氢乳清酸，是嘧啶合成途径中的关键酶，在碱性条件下则催化L-二氢乳清酸水解开环形成N-氨基甲酰-L-天冬氨酸[26]。L-二氢乳清酸与嘌呤结构有一定的相似性，二氢乳清酸酶可能在碱性条件下同样能降解嘌呤，因此确定其作为实验对象，通过实验验证其是否具有嘌呤降解活性。
2.3 二氢乳清酸酶的克隆、表达及纯化
将重组质粒转化至E. coli BL21 （DE3）化学感受态细胞和DH5α化学感受态细胞中，用于二氢乳清酸酶的表达和重组质粒的储存。进行菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图2所示，条带位于1000 bp左右，其大小与二氢乳清酸酶基因（存在N、C末端的12个His-tag标签）（1053 bp）的大小基本一致，符合重组质粒的应有特征，结合测序结果，证实重组质粒中插入的片段序列与二氢乳清酸酶的序列一致，且转化成功。
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图 2 转化后的E. coli BL21和E. coli DH5α菌落PCR验证注：泳道M：Marker 2000 Da，泳道1~4：E. coli BL21的阳性转化子验证，泳道5~8：E. coli DH5α的阳性转化子验证。Figure 2. Colony PCR verification of transformed E. coli BL21 and E. coli DH5α strains构建的表达菌株E. coli BL21经培养及诱导表达后得到粗酶液。根据图3（a）所示的SDS-PAGE结果，可以看出细胞裂解后的上清液（粗酶液）中含有目的蛋白条带，表明其表达成功。图3（b）为粗酶液经过AKTA镍柱亲和层析纯化过程中的洗脱曲线，获得纯化后的二氢乳清酸酶，SDS-PAGE结果如图3（a）所示，蛋白质的理论分子量为39.2 kDa，实际分子量约为41.0 kDa，原因可能是重组蛋白在N端和C端分别添加了6×His标签，以便于蛋白的纯化。目的蛋白主要存在于100 mmol/L和200 mmol/L咪唑洗脱液中。此时已得到纯化的重组二氢乳清酸酶。
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图 3 DHOase诱导表达及纯化的SDS-PAGE结果（a）和AKTA纯化洗脱曲线（b）注：（a）中泳道M：Marker 130 kDa，泳道1：粗酶液，泳道2~15：AKTA纯化洗脱液（洗脱缓冲液比例分别为4%、4%、10%、10%、20%、20%、40%、40%、60%、60%、80%、80%、100%、100%）。Figure 3. Results of SDS-PAGE after induced expression and purification of DHOase (a) and AKTA purification elution curve (b)2.4 嘌呤标准品及样品的高效液相色谱分离效果
如图4所示，在检测条件下，4种嘌呤分离效果较好，出峰顺序依次为腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤。
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图 4 嘌呤标准品（a）及样品（b）的高效液相色谱图Figure 4. High performance liquid chromatography chromatograms of purine standard (a) and sample (b)2.5 反应条件对DHOase降解嘌呤的影响
2.5.1 金属离子对DHOase降解嘌呤的影响
如表6所示，当反应体系中不含金属离子时，DHOase对4种嘌呤无降解作用。因某些酶需要借助金属离子激活才能催化反应，因此向反应体系中添加常见的金属离子，探究其是否需要借助金属离子催化嘌呤降解活性。添加金属离子Fe3+、Cu2+时，DHOase对4种嘌呤均无降解效果；添加Mg2+和Ca2+时，嘌呤含量虽略有减少，但嘌呤降解率较低；而反应体系中存在Zn2+时，DHOase显示出一定的鸟嘌呤降解活性，降解率为19.4%。因此，证实了DHOase具有鸟嘌呤降解活性，且需要Zn2+激活反应。
表 6 金属离子种类对DHOase嘌呤降解活性的影响Table 6. Effects of metal ion species on the purine degradation activity of DHOase金属离子种类 嘌呤降解率（%） 腺嘌呤 鸟嘌呤 次黄嘌呤 黄嘌呤 无 − − − − Zn2+ − 19.4±2.7a − − Mg2+ 3.0±1.3a 5.8±2.1b 2.9±1.3a 2.7±1.4a Fe3+ − − − − Ca2+ 2.2±1.5a 6.1±1.2b 2.0±1.5a 1.6±1.6a Cu2+ − − − − 注：同列不同字母表示各组间差异显著（P<0.05）。 2.5.2 Zn2+浓度对DHOase降解嘌呤的影响
结果如图5所示，反应体系中Zn2+的浓度过高或过低，DHOase对鸟嘌呤均无明显的降解效果，而当Zn2+浓度为0.5 mmol/L时，DHOase可降解19.4%的鸟嘌呤，此时降解效果最好。在体系中，催化反应所需的金属离子浓度过低，不能达到催化的效果，而浓度过高，则会对反应起抑制作用[27−28]。因此，DHOase发挥最优鸟嘌呤降解活性需要添加Zn2+浓度为0.5 mmol/L。
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2.5.3 反应pH对DHOase降解嘌呤的影响
由图6可知，在pH7.0~10.0范围内，DHOase对鸟嘌呤的降解率随pH升高呈先升高后降低的趋势，在pH为8.0时降解效果最好，此时能够降解鸟嘌呤约46.1%，因此该酶发挥嘌呤降解活性的最适反应pH为8.0，当pH小于7.5，高于8.5时，DHOase对鸟嘌呤的降解率迅速下降，在9.0~10.0时DHOase基本无活性，说明该酶较适合在弱碱性环境发挥嘌呤降解活性。目前关于二氢乳清酸酶的报道中，二氢乳清酸酶催化二氢乳清酸降解的反应pH均为碱性。如多诺瓦利什曼原虫中二氢乳清酸酶催化二氢乳清酸降解的最适反应pH为8.0[29]，金黄色葡萄球菌中为9.0[30]。由于二氢乳清酸和嘌呤均为环状结构，具有一定的相似性，且已报道的二氢乳清酸酶催化二氢乳清酸开环的反应是在碱性条件下进行，因此，有理由推测本研究中DHOase催化鸟嘌呤降解的反应也是在碱性条件下进行。
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图 6 pH对DHOase嘌呤降解活性的影响Figure 6. Effects of pH on the purine degradation activity of DHOase2.5.4 反应温度对DHOase降解嘌呤的影响
如图7所示，在20~45 ℃之间，DHOase对鸟嘌呤的降解率随温度升高呈先升高后降低的趋势，当反应温度为25 ℃时，鸟嘌呤降解率最高，因此确定该酶发挥嘌呤降解活性的最适反应温度为25 ℃。当温度大于30 ℃后DHOase对鸟嘌呤的降解率开始骤减。重组酶反应的温度较低，在一些不允许高温反应的食品加工中具有一定的优势，这一特性在保持食品的营养价值和风味方面发挥了巨大作用[31]。
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图 7 温度对DHOase嘌呤降解活性的影响Figure 7. Effects of temperature on the purine degradation activity of DHOase2.5.5 DHOase在最适反应条件下对鸟嘌呤的降解效果
如图8所示，在最适反应条件下，即反应体系中添加Zn2+，且浓度为0.5 mmol/L，反应pH为8.0，反应温度为25 ℃时，DHOase对鸟嘌呤的降解率为46.1%。在目前的研究中，已有研究者尝试使用嘌呤降解酶脱除食品中的嘌呤，利用黄嘌呤氧化酶介导的嘌呤分解代谢途径中的酶[32]，组合成为酶系，共同添加至食品中，最终使嘌呤分解成为尿酸的下一步分解产物——尿囊素，从而达到脱除嘌呤的效果。有研究者结合人工神经网络和遗传基因技术，在体外重构嘌呤代谢途径，将食物中的嘌呤物质降解为天然功能性尿囊素，有效减少了啤酒、牛肉和酵母提取物中嘌呤含量，降解率高达58%、67%和64%[33]。本研究发现二氢乳清酸酶具有鸟嘌呤降解活性，虽不及前述酶系对嘌呤的降解率高，但使用单一酶即可使鸟嘌呤的降解率达到46.1%，无需同时添加多种酶，且不需要结合吸附法等其他方法。后续可对其进行优化改造，提高降解嘌呤的能力，并对降解产物进行进一步分析。
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图 8 最适反应条件下DHOase对鸟嘌呤的降解效果Figure 8. Degradation effect of DHOase on guanine under the optimum reaction conditions3. 结论
本研究以腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤为候选底物，结合反向虚拟筛选技术和分子对接技术等，筛选出了具有潜在嘌呤降解活性的酶——二氢乳清酸酶，通过基因工程技术实现二氢乳清酸酶的克隆、表达及纯化，优化金属离子浓度、pH和温度等反应条件，发现其可在25 ℃、Zn2+催化以及碱性条件下，催化鸟嘌呤降解，降解率最高为46.1%。本研究将反向虚拟筛选技术和基因工程技术相结合，证明了计算机辅助筛选技术在嘌呤降解酶筛选中的可行性；另外，通过筛选得到的二氢乳清酸酶具有一定的鸟嘌呤降解活性，虽不及已报道嘌呤降解酶的降解率高，但无需与其它酶同时使用达到嘌呤降解的目的，未来还可针对其进行改造，优化反应条件，提高酶的嘌呤降解活性，应用至食品体系中，为其在低嘌呤食品的开发应用奠定基础。
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图 1 1J79和腺嘌呤（a）、鸟嘌呤（b）、次黄嘌呤（c）、黄嘌呤（d）的相互作用
Figure 1. Interaction between 1J79 and adenine (a), guanine (b), hypoxanthine (c), xanthine (d)
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图 2 转化后的E. coli BL21和E. coli DH5α菌落PCR验证
注：泳道M：Marker 2000 Da，泳道1~4：E. coli BL21的阳性转化子验证，泳道5~8：E. coli DH5α的阳性转化子验证。
Figure 2. Colony PCR verification of transformed E. coli BL21 and E. coli DH5α strains
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图 3 DHOase诱导表达及纯化的SDS-PAGE结果（a）和AKTA纯化洗脱曲线（b）
注：（a）中泳道M：Marker 130 kDa，泳道1：粗酶液，泳道2~15：AKTA纯化洗脱液（洗脱缓冲液比例分别为4%、4%、10%、10%、20%、20%、40%、40%、60%、60%、80%、80%、100%、100%）。
Figure 3. Results of SDS-PAGE after induced expression and purification of DHOase (a) and AKTA purification elution curve (b)
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图 4 嘌呤标准品（a）及样品（b）的高效液相色谱图
Figure 4. High performance liquid chromatography chromatograms of purine standard (a) and sample (b)
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图 6 pH对DHOase嘌呤降解活性的影响
Figure 6. Effects of pH on the purine degradation activity of DHOase
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图 7 温度对DHOase嘌呤降解活性的影响
Figure 7. Effects of temperature on the purine degradation activity of DHOase
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图 8 最适反应条件下DHOase对鸟嘌呤的降解效果
Figure 8. Degradation effect of DHOase on guanine under the optimum reaction conditions
表 1 反向虚拟筛选所用数据库及平台
Table 1 Database and platform for inverse virtual screening
数据库 网址 PharmMapper http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ PubChem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ RCSB PDB（Protein Data Bank） https://www.rcsb.org/ UniProt https://www.uniprot.org/ Protein-Ligand Interaction Profiler https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ Venny https://bioinfogp.cnb.csic.es/ 
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表 2 菌落PCR反应体系
Table 2 Colony PCR reaction system
溶液名称 加样量 2×Rapid Taq Master Mix 25.0 μL 引物P1 2.0 μL 引物P2 2.0 μL 模板DNA 50~100 ng ddH2O 补足到50.0 μL
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表 3 反向虚拟筛选初筛结果
Table 3 Inverse virtual screening preliminary screening results
序号 PDB编号 拟合分数 标准化拟合分数 z'分数 名称 功能 UniProt编号 1 1JUY 2.474 0.309 −0.633 腺苷琥珀酸合成酶 核苷酸运输和代谢 P0A7D4 2 1X7N 2.789 0.465 0.823 葡萄糖-6-磷酸异构酶 碳水化合物运输和代谢 P83194 3 1J79 2.471 0.412 0.026 二氢乳清酸酶 核苷酸运输和代谢 P05020 4 1GTE 3.116 0.445 0.159 二氢嘧啶脱氢酶 氨基酸运输和代谢 Q12882 5 1DE5 2.44 0.407 −0.012 L -鼠李糖异构酶 参与l -鼠李糖异构酶活性 P32170 6 1F76 2.923 0.5846 1.791 二氢乳清酸脱氢酶 核苷酸运输和代谢 P0A7E1
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表 4 酶与腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤的分子对接结果
Table 4 Molecular docking results of enzyme with adenine, guanine, hypoxanthine and xanthine
序号 名称 PDB ID 金属离子 辅酶 与嘌呤的对接结合能（kcal/mol） 腺嘌呤 鸟嘌呤 次黄嘌呤 黄嘌呤 1 二氢乳清酸酶 1J79 Zn2+ − −7.3 −6.9 −7.6 −8.8 2 二氢嘧啶脱氢酶 1GTE 无 FMN、FAD −4.8 −5.5 −5.7 −6.3 3 L -鼠李糖异构酶 1DE5 Zn2+ − −4.9 −7.1 −5.1 −5.6 4 腺苷琥珀酸合成酶 1JUY Mg2+ − −4.9 −4.6 −5.1 −5.1 5 葡萄糖-6-磷酸异构酶 1X7N Mn2+ − −4.8 −5.3 −4.8 −4.9 6 二氢乳清酸脱氢酶 1F76 无 − −5.2 −4.9 −6.2 −6.9 注：FMN为黄烷单核苷酸，FAD为黄素腺嘌呤二核苷酸。
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表 5 酶与原配体的分子对接结果
Table 5 Molecular docking results of the enzyme and the original ligand
序号 名称 与原配体的对接结合能 （kcal/mol） 配体1 配体2 配体3 1 二氢乳清酸酶 −8.2（ORO） −7.1（NCD） − 2 二氢嘧啶脱氢酶 −6.8（IUR） − − 3 L-鼠李糖异构酶 −5.7（RNT） − − 4 腺苷琥珀酸合成酶 −7.9（GDP） −7.8（H5P） −5.7（HDA） 5 葡萄糖-6-磷酸异构酶 −6.3（PA5） − − 6 二氢乳清酸脱氢酶 −9.5（ORO） − − 注：ORO为乳清酸，NCD为N-氨甲酰-L-天冬氨酸，IUR为5-碘尿嘧啶，RNT为L-鼠李糖醇，GDP为鸟苷-5'-二磷酸，H5P为海当西定-5'-磷酸，HDA为N-羟-N-甲酰甘氨酸，PA5为5 -磷酸阿拉伯糖酸。
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表 6 金属离子种类对DHOase嘌呤降解活性的影响
Table 6 Effects of metal ion species on the purine degradation activity of DHOase
金属离子种类 嘌呤降解率（%） 腺嘌呤 鸟嘌呤 次黄嘌呤 黄嘌呤 无 − − − − Zn2+ − 19.4±2.7a − − Mg2+ 3.0±1.3a 5.8±2.1b 2.9±1.3a 2.7±1.4a Fe3+ − − − − Ca2+ 2.2±1.5a 6.1±1.2b 2.0±1.5a 1.6±1.6a Cu2+ − − − − 注：同列不同字母表示各组间差异显著（P<0.05）。
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