Antibacterial Stability and Antioxidant Activity of Essential Oils from Cymbopogon citratus
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摘要: 目的：研究柠檬草精油的化学成分和抗氧化活性，并讨探加工储藏条件对其抑菌稳定性的影响。方法：采用水蒸气蒸馏法提取精油，气相色谱-质谱法（GC-MS）分析成分，滤纸片法测定精油的抑菌活性以及温度、紫外线、pH和CaCl2对抑菌活性的影响，采用ABTS+·、DPPH·、O2−·清除率和Fe3+还原力评估抗氧化活性。结果：柠檬草精油中共鉴定出49种化合物，含量大于1%的有12种，占总成分的88.11%，主要成分为香叶醛（26.73%）、橙花醛（18.57%）和β-月桂烯（9.30%）。柠檬草精油对3种常见腐败菌均有较强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径（25.43±0.24 mm）显著（P<0.05）高于大肠杆菌（23.54±0.67 mm）和枯草芽孢杆菌（18.33±0.03 mm）。柠檬草精油具有良好的紫外稳定性，温度和pH对精油的抑菌效果影响较大，低温和酸性条件下其抑菌活性较强，CaCl2可增加柠檬草精油的抑菌效果。柠檬草精油具有良好的抗氧化活性，对ABTS+·、DPPH·、O2−·的清除能力和Fe3+的还原能力随着精油浓度升高显著增强（P<0.05），对ABTS+·、DPPH·、O2−·的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为4.36、7.09、3.13 mg/mL，是抗坏血酸的6.92、10.58和5.05倍。结论：柠檬草精油具有良好的抑菌活性和抗氧化活性，在储藏和加工过程中应避免高温和碱性条件。Abstract: Objective: To study the chemical components and antioxidant activity of Cymbopogon citratus essential oil and investigate the effect of processing and storage conditions on its antibacterial stability. Methods: The essential oil was extracted by steam distillation, and its chemical components were analyzed by GC-MS. The effects of temperature, ultraviolet rays, pH, and CaCl2 on the antibacterial activity were determined by filter-paper method and the antioxidant activity was determined by the ABTS+·, DPPH· and O2−· radical-scavenging assay and the reducing capacity for Fe3+. Results: A total of 49 compounds were identified, and 12 compounds with contents greater than 1%, accounting for 88.11%, with citral (26.73%), neral (18.57%), and β-myrcene (9.30%) as the main components. The essential oil of Cymbopogon citratus showed strong antibacterial activity. The inhibitory effect against Staphylococcus aureus (25.43±0.24 mm) was better than that of Escherichia coli (23.54±0.67 mm) and Bacillus subtilis (18.33±0.03 mm) (P<0.05). The antibacterial activity of the essential oil were stable under ultraviolet rays, but were unstable under different temperature and pH. The antibacterial activity was stronger at low temperatures and acidic conditions, and CaCl2 could increases the antibacterial effect. The essential oil showed good antioxidant activity, the scavenging ability of ABTS+·, DPPH·, O2−· and the reducing ability of Fe3+ increased with the concentration of essential oil (P<0.05), the IC50 of ABTS+·, DPPH·, O2−· were 4.36, 7.09, 3.13 mg/mL, respectively, which were 6.92, 10.58 and 5.05 times of ascorbic acid. Conclusion: The essential oil of Cymbopogon citratus has good antibacterial activity and antioxidant activity, high temperatures and alkaline conditions should be avoided during storage and processing.
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植物精油又称挥发油，是一类易挥发且多具有独特而强烈气味的油性液体，属于植物源次生代谢物[1]。大多数植物精油对真菌和细菌都具有一定的抑制作用，可用作天然的防腐剂和保鲜剂，延长食品的保质期[2−4]。柠檬草（Cymbopogon citratus（D.C.）Stapf）隶属禾本科香茅属，是一种药食兼用资源和常用香辛料，又名香茅草、大风草、香麻、柠檬香茅等，在我国大多栽培于云南、广西、海南、广东、福建、浙江等热带和亚热带地区[5]。柠檬草可直接用作烹饪调料、保健茶、药枕填充物和园林绿化植物等，也可提取其茎叶中的精油用于食品加工、日化用品、果蔬保鲜等方面[6−7]。柠檬草精油的成分、含量、抑菌活性和抗氧化活性受到产地、提取方式、提取部位等因素的影响，欧阳婷等[8−9]研究表明，5个产地的柠檬草精油主要成分为香叶醛、橙花醛、β-月桂烯、香叶醇等，但含量有提取部位和地域差异，抑菌效果亦存在地域差异，浙江柠檬草精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、桔青霉的抑菌效果最佳，抑菌圈直径在19.92~21.28 mm，广东柠檬草精油对痢疾杆菌和黑曲霉、海南柠檬草精油对伤寒杆菌、湖南柠檬草精油对白色念珠菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直径分别为24.65~27.93 mm、24.00 mm和28.55 mm，此外，抗氧化活性也存在地域差异。赵建芬等[10]通过测定香茅草精油的抗氧化活性，发现超临界CO2提取物对DPPH·、O2−·、OH·的清除能力强于水蒸气蒸馏提取物。
云南省保山市潞江坝是典型的亚热带干热河谷，是重要的热区作物种植区，柠檬草种植历史悠久，但关于潞江坝柠檬草精油的成分、抑菌活性和抗氧化活性未见相关深入研究，温度、光照、酸碱性、金属离子等条件是否会影响柠檬草精油的抑菌稳定性亦未见报道。本研究采用水蒸气蒸馏法提取柠檬草茎叶精油，采用气相色谱-质谱法（GC-MS）分析其精油成分。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌3种常见腐败菌为供试菌种，以抑菌圈直径为指标，分析温度、紫外线照射、酸碱性和CaCl2处理对柠檬草精油抑菌活性和稳定性的影响。此外，还探讨了柠檬草精油对常见自由基的清除能力及对Fe3+的还原能力，旨在为柠檬草精油作为植物源防腐剂和抗氧化剂的开发利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
柠檬草 采自保山市隆阳区潞江坝；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC25922） 保山学院微生物实验室提供；2,2-联氮-双-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH） 上海麦克林生化科技有限公司；牛肉膏 广东环凯微生物有限公司；蛋白胨 北京奥博星生物科技有限责任公司；琼脂条 石狮市环球琼胶工业有限公司；氯化钠、二甲基亚砜、结晶氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾 天津市风船化学试剂科技有限公司；柠檬酸 如皋市化学试剂厂；氢氧化钠 上海山海工学团实验二厂；盐酸、抗坏血酸、对氨基三氯甲烷 四川西陇科学有限公司；无水硫酸钠 西陇化工股份有限公司；邻苯三酚 天津市兴复细化工研究所；三氯乙酸 天津市科密欧化学试剂科技有限公司。
7890A-5975C型气质联用仪 美国安捷伦；SW-CJ-1D单人单面垂直净化工作台 苏州净化设备有限公司；LCS精密石墨恒温电热板 上海力辰西仪器科技有限公司；SHA-C恒温振荡器 常州国华电器有限公司；UV-5500PC紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌锅、DK-8AX型电热恒温水槽 上海一恒科学仪器有限公司；CP114型电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司；SPX型生化培养箱 宁波东南仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 精油的提取
称取30 g干燥的柠檬草，剪成1~2 cm的小段，放入圆底烧瓶中，按料液比1:20（g/mL）加入蒸馏水，浸泡2 h后开始加热，提取时间为2.5 h，收集上层油水混合物，用无水Na2SO4干燥后得到柠檬草精油。取一部分得到的精油，用二甲基亚砜配制成体积分数为50%的精油溶液，将精油和精油溶液放置棕色玻璃瓶中，4 ℃保存。
1.2.2 化学成分分析
参照欧阳婷等[8]的方法并稍加修改。用乙酸乙酯配制体积分数为2%的柠檬草精油溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤后用于后续分析。GC条件：HP-5MS型色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气：He，流速1.0 mL/min，进样口温度230 ℃。升温程序：起始温度50 ℃，4 min后以5 ℃/min升温到70 ℃，再以20 ℃/min升温到120 ℃，10 ℃/min升温到170 ℃，5 ℃/min升温到200 ℃，最后以40 ℃/min升温到280 ℃。MS条件：离子源为EI，电离能70 eV，离子源温度250 ℃。
1.2.3 抑菌活性测定
吸取200 μL供试菌种的菌悬液（OD600 nm约为1.60）均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上。吸取5 μL精油或精油溶液（体积分数50%）滴于6 mm无菌滤纸片上，再将滤纸片置于涂布好的培养基上，每皿3片，以二甲基亚砜为对照，37 ℃下倒置培养24 h（金黄色葡萄球菌48 h）后采用十字交叉法测量培养皿中各抑菌圈直径。
1.2.4 抑菌活性稳定性测定
1.2.4.1 热稳定性测定
将精油溶液（体积分数50%）在40、80、120、160、200 ℃下处理20 min，待冷却到室温后，按1.2.3的方法测定抑菌活性，对照组为未加热的精油溶液。
1.2.4.2 紫外稳定性测定
将精油溶液（体积分数50%）在紫外灯下处理20、40、60、80、100 min，功率15 W，垂直距离20 cm，按1.2.3的方法测定抑菌活性，对照组为未经紫外处理的精油溶液。
1.2.4.3 酸碱稳定性
用NaOH溶液（质量分数2%）和柠檬酸溶液（体积分数50%）调节精油溶液（体积分数50%）pH至3、4、5、6、7、8、9、10，按1.2.3的方法测定抑菌活性，对照组为相同pH的纯水。
1.2.4.4 CaCl2对抑菌稳定性的影响
取1 mL精油和一定量的CaCl2溶液（50 g/L，二甲基亚砜配制）置于2 mL容量瓶中，二甲基亚砜溶液定容，配制成精油浓度相同（体积分数50%）、CaCl2浓度不同（5、10、15、20、25 g/L）的溶液，按1.2.3的方法测定抑菌活性，对照组为不加精油的CaCl2溶液。
1.2.5 抗氧化活性
1.2.5.1 ABTS+自由基清除能力测定
参考李晓娇等[11]的方法并稍加修改，将ABTS溶液（7.4 mmol/L）和K2S2O8溶液（2.6 mmol/L）等体积混合，室温避光放置12 h后待用。上述溶液用无水乙醇稀释至吸光度为0.68~0.72（734 nm）。将3.9 mL ABTS稀释液分别与0.1 mL不同浓度的精油样品溶液（2.5、5、10、20、40 mg/mL）混合均匀，室温黑暗反应30 min于波长734 nm处测定吸光度。以抗坏血酸为阳性对照。按公式（1）计算清除率：
ABTS+自由基清除率(%)=A2−A1A2×100 (1) 式中：A1为精油样品溶液所测吸光度；A2为无水乙醇代替精油样品所测吸光度。
1.2.5.2 DPPH自由基清除能力测定
参考杨丽华等[12]的方法，将2 mL的DPPH溶液（0.2 mg/mL）与2 mL不同浓度的精油样品（5、10、20、40、80 mg/mL）混合均匀，室温黑暗反应30 min后于波长517 nm处测定吸光度。以抗坏血酸为阳性对照。按公式（2）计算清除率：
DPPH自由基清除率(%)=(1−A2−A1A0)×100 (2) 式中：A2为精油样品溶液与DPPH溶液混合后所测吸光度；A1为无水乙醇和精油样品溶液混合后所测吸光度；A0为DPPH溶液和无水乙醇混合后所测吸光度。
1.2.5.3 超氧阴离子自由基清除能力测定
参考程琤等[13]的方法，取4.5 mL pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（0.05 mol/L）于试管中，25 ℃预热20 min后依次加入1 mL不同浓度的精油样品溶液（2.5、5、10、20、40 mg/mL）和0.5 mL的邻苯三酚溶液（25 mmol/L），混合均匀后于25 ℃下加热5 min，再用1 mL HCl（8 mol/L）终止反应，在425 nm处测定其吸光度。以抗坏血酸为阳性对照。按公式（3）计算清除率：
超氧阴离子自由基清除率(%)=A2−A1A2×100 (3) 式中：A2为Tris-HCl缓冲溶液代替精油样品溶液所测吸光度；A1为精油样品溶液吸光度。
1.2.5.4 Fe3+还原能力测定
参考刘璐等[14]的方法并稍加修改，移取1.2 mL精油样品溶液（2.5、5、10、20、40 mg/mL），加入3 mL磷酸盐缓冲溶液（0.2 mol/L，pH6.6），3 mL K3[Fe（CN）6]溶液（1%），50 ℃加热20 min。待冷却后加入 3 mL三氯乙酸溶液（10%），3000 r/min下离心10 min。取2 mL上清液与2 mL蒸馏水混合，加入0.5 mL FeCl3溶液（0.1%），反应5 min后于波长700 nm处测定吸光度。吸光度值越大，表明样品的还原能力越强。以抗坏血酸为阳性对照。
1.3 数据处理
除精油成分分析外，所有试验均重复三次，结果以平均值±标准差表示。采用Microsoft Excel 2013作图。使用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行IC50值（半抑制浓度，half maximal inhibitory concentration）计算，通过单因素方差分析（ANOVA）和S-N-K多重比较进行显著性分析，当P<0.05时表明数据间存在显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 精油的化学成分
柠檬草精油中共有49种化合物，占总成分的100%。其中，相对含量在1%以上的成分有12个，占总成分的88.11%，主要为萜类、醛类、醇类、酯类（表1）。其中，香叶醛（26.73%）和橙花醛（18.57%）的含量最高，共计45.3%。香叶醛为反式柠檬醛a，橙花醛为顺式柠檬醛b，二者互为同分异构体，天然柠檬醛为二者的混合物。柠檬醛是一种广泛使用的香精香料，具有抑制细菌真菌生长、抗炎抗癌、抗氧化、杀虫等活性[9]。此外，含量较高的有β-月桂烯，相对含量为9.30%，具有祛痰、镇咳等作用[15]。
表 1 柠檬草精油的化学成分Table 1. Composition of C. citratus essential oil序号 化合物 CAS号 分子式 保留时间（min） 相对含量（%） 1 β-月桂烯 000123-35-3 C10H16 10.0867 9.30 2 对薄荷-1,3,8-三烯 018368-95-1 C10H14 10.6866 2.90 3 芳樟醇 000078-70-6 C10H18O 11.6807 2.70 4 2,6,6-三甲基-1,4-环己二烯-1-甲醛 162376-82-1 C10H14O 11.916 2.23 5 7-甲基-3-亚甲基-6-辛烯醛 055050-40-3 C10H16O 12.2806 4.05 6 新橙花醛 1000414-18-0 − 12.5277 5.27 7 3,7-二甲基-3,6-辛二烯醛 055722-59-3 C10H16O 12.7571 7.42 8 水杨酸甲酯 000119-36-8 C8H8O3 12.9865 3.35 9 2-甲基-5-异丙烯基-环戊-1-烯甲醛 1000190-36-8 C11H16O 13.2747 3.19 10 橙花醛 000106-26-3 C10H16O 13.5511 18.57 11 香叶醇 000106-24-1 C10H18O 13.6511 2.40 12 香叶醛 005392-40-5 C10H16O 13.9276 26.73 本研究结果与VERONIKA等[7]、欧阳婷等[8]、石小翠等[16]报道的柠檬草精油主成分相同，均为橙花醛和香叶醛，但含量有所差异；许智萍等[15]对云南6个产地的柠檬草精油的主要化学成分进行分析后发现，临沧、芒市、西双版纳、元谋4个产地的主成分为橙花醛和香叶醛，而盈江、红河两地的主成分为香茅醛、不含橙花醛和香叶醛；而张洪军等[17]、牛彪等[18]在研究柠檬草精油时发现香茅醛为含量最高的物质，赵琳静等[19]的研究中含量最高的物质为香茅醇，罗婷等[20]采用不同方法提取的柠檬草精油中香叶醇含量最高，与本研究结果均有差异。柠檬草精油的主要成分和含量与前人的研究相比有差异，可能是由于柠檬草的品种、产地、提取方法、检测仪器、栽培环境等不同造成的。
2.2 柠檬草精油的抑菌活性
由表2可见，柠檬草精油和柠檬草精油溶液对3种供试菌种均有较强的抑制效果，三者差异显著（P<0.05）。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对柠檬草精油高度敏感，对体积分数50%的柠檬草精油溶液敏感；枯草芽孢杆菌对柠檬草精油敏感，对体积分数50%的柠檬草精油则为中度敏感，说明精油的抑菌活性与浓度相关。在本实验中，柠檬草精油和精油溶液对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于大肠杆菌，可能是由于革兰氏阳性菌的细胞壁只是单层的肽聚糖结构，而革兰氏阴性菌的细胞壁结构包括外膜蛋白、外膜和肽聚糖层等，其复杂的结构使精油不容易进入菌体细胞。同时，精油活性的发挥还受到细菌性状的影响，杆菌比球菌更容易受抑制[21]。
表 2 柠檬草精油对3种菌种的抑菌活性Table 2. Antibacterial activity of C. citratus essential oils against three tested bacteria菌种 抑菌直径（mm） 判定结果 抑菌直径（mm） 判定结果 抑菌直径（mm） 判定结果 金黄色葡萄球菌 25.43±0.24a 高度敏感 17.40±0.07a 敏感 6.00±0.00 不敏感 大肠杆菌 23.54±0.67b 高度敏感 16.84±0.18b 敏感 6.00±0.00 不敏感 枯草芽孢杆菌 18.33±0.03c 敏感 13.86±0.04c 中度敏感 6.00±0.00 不敏感 注：同一列的不同字母代表有显著差异（P<0.05）；供试菌种对精油敏感程度的判定标准为：抑菌圈直径大于20 mm为高度敏感，在14~20 mm之间为敏感，8~14 mm之间为中度敏感，小于8 mm为不敏感[12]。 2.3 柠檬草精油的抑菌稳定性分析
2.3.1 热稳定性
由图1可知，柠檬草精油溶液对三种供试菌的抑菌圈直径随着温度的升高而显著减小（P<0.05），当温度为200 ℃时抑菌作用非常弱。柠檬草精油中的主要成分中，香叶醛、橙花醇、香叶醇、水杨酸甲酯、7-甲基-3-亚甲基-6-辛烯醛的沸点在214~229 ℃，芳樟醇、对薄荷-1,3,8-三烯、β-月桂烯等成分的沸点低于200 ℃，40~200 ℃的热处理会使柠檬草精油中的部分抑菌成分挥发或失去活性，从而导致抑菌活性降低。因此，在使用柠檬草精油时，应避免高温导致的抑菌活性降低。
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2.3.2 紫外稳定性
由图2可知，紫外线分别照射20、40、60、80、100 min后，与未经紫外线处理的对照相比，柠檬草精油溶液对三种供试菌种抑菌活性未发生显著变化（P>0.05），该结果与禚宇等[22]研究的紫外线对黑皮松松针精油稳定性的影响的结果一致。这表明柠檬草精油对紫外线具有较高的稳定性，其原因主要是柠檬草精油中的主要成分为香叶醛、橙花醛、β-月桂烯、对薄荷-1,3,8-三烯、芳樟醇等，这些化合物在紫外线处理时较稳定，结构上不易发生改变。因此，柠檬草精油应用于食品加工时，可以结合紫外线进行杀菌处理。
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图 2 紫外线处理对抑菌稳定性的影响Figure 2. Antibacterial stability of C. citratus essential oil after UV treatment2.3.3 酸碱稳定性
由图3可知，柠檬草精油溶液pH对三种常见腐败菌的抑菌活性影响显著（P<0.05）。不同pH的纯水对供试菌种均无抑制作用，说明柠檬草精油抑菌活性的改变是由于pH使精油中的抑菌成分发生了变化。当精油溶液的pH为3~8时，随着pH的增大，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径逐渐减小；当pH>8时，随着pH的增大两者的抑菌圈直径先增大（pH9）后减小（pH10）。当pH由3增大到10时，枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径逐渐减小。在酸性条件下，精油中的活性成分与H+发生协同作用，使得精油更易于与细菌的细胞膜和脂蛋白结合。在pH10时，精油对三种供试菌种的抑制效果最差，其原因可能是碱性条件破坏或抑制了精油的抑菌成分。因此，将柠檬草精油应用于食品保鲜时，应选择酸性条件。
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图 3 不同pH的柠檬草精油对抑菌稳定性的影响Figure 3. Antibacterial stability of C. citratus essential oil with different pH当pH为10时，柠檬草精油溶液对三种供试菌种的抑菌能力最弱，这与禚宇等[22]、段伟丽等[23]、包怡红等[24]的研究结果相近。艾薇等[25]、李娅男等[26]的研究则表明，pH为酸性时，供试菌种的生长完全被抑制，这种差异是由于上述作者改变的是培养基的pH而非精油的pH，从而导致供试菌种无法在酸性培养基上正常生长。
2.3.4 金属离子稳定性
如图4、图5所示，单独使用CaCl2对3种供试菌有一定的抑菌作用，但抑菌作用较弱。随着CaCl2浓度的增加，抑菌圈直径逐渐增大，当CaCl2浓度为25 g/L时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为7.62±0.01、7.46±0.05和6.83±0.08 mm。当CaCl2和柠檬草精油结合使用时，对三种供试菌种的抑菌效果明显增强，而且随着Ca2+浓度的增加，抑菌圈直径显著增大（P<0.05）。这与段伟丽等[23]的研究结果相似。其原因可能是Ca2+本身会对细菌细胞壁造成破坏，从而导致细菌死亡，以及Ca2+与精油中的活性成分发生了螯合作用，加速细菌细胞凋亡，提升了精油的抑菌效果。禚宇等[22]、段伟丽等[23]、杨艾华等[27]的研究表明，Fe3+、Fe2+、K+、Na+等也能增强精油的抑菌效果。因此，柠檬草精油应用于食品保鲜时，应考虑食品本身或包装中所含的金属离子种类和浓度。
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图 5 CaCl2对柠檬草精油抑菌稳定性的影响Figure 5. Antibacterial stability of CaCl2 on C. citratus essential oil2.4 抗氧化活性
由图6可知，随着柠檬草精油质量浓度的增加，其对ABTS+·、DPPH·、O2−·的清除率和对Fe3+的还原能力逐渐上升，但能力不如相同浓度的抗坏血酸强。当柠檬草精油质量浓度为40 mg/mL时，其对ABTS+·、O2−·和Fe3+的清除率与同浓度的抗坏血酸相当；当质量浓度达到80 mg/mL，其对DPPH·的清除力与同浓度的抗坏血酸相当。抗坏血酸对ABTS+·、DPPH·、O2−·的IC50值分别为0.63、0.67、0.62 mg/mL，而柠檬草精油对三者的IC50值分别为4.36、7.09、3.13 mg/mL，是抗坏血酸的6.92、10.58和5.05倍。半抑制浓度（IC50值）越小，表示其清除自由基的能力越强。从IC50值来看，本研究中柠檬草精油对三种自由基的清除能力大小依次为：O2−·>ABTS+·>DPPH·。杨欣等[28]研究发现柠檬草精油具有较强的清除O2−·、·OH和总抗氧化能力，并得出柠檬醛为精油中起抗氧化能力的成分，因此推测本试验中起到抗氧化作用的成分主要为香叶醛（26.73%）和橙花醛（18.57%）。
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图 6 柠檬草精油的抗氧化活性注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 6. Antioxidant activity of C. citratus essential oil在柠檬草精油的抗氧化活性评价中，DPPH·法运用较多，石小翠等[16]、赵琳静等[19]研究发现柠檬草精油对DPPH自由基的IC50分别为3.48 mg/mL、3.7 mg/mL。梁芳等[29]研究发现不同产地的柠檬草精油的DPPH自由基清除率不同，IC50在1.914~3.178 mg/mL之间，欧阳婷等[9]的研究也证实了这一点，五个不同产地的柠檬草精油对DPPH·的IC50在10.49~14.87 mg/mL之间，对·OH的IC50在16.48~22.78 mg/mL之间。赵建芬等[10]研究发现超临界CO2提取的柠檬草精油对DPPH·、O2−·和·OH的IC50分别为3.237、0.2724、0.6615 mg/mL，清除能力为O2−·>·OH>DPPH·。以上研究中，柠檬草精油对各种自由基都具有清除能力，且清除能力呈明显的量效关系，但IC50值与本研究均存在差异，其原可能是精油成分和含量存在差异。
3. 结论
本文以云南保山产柠檬草新鲜茎叶为原料，采用水蒸气蒸馏法提取精油，得率为0.72%，从该精油中鉴定得到49种成分，占总成分的100%，主要成分为香叶醛（26.73%）、橙花醛（18.57%）和β-月桂烯（9.32%）。柠檬草精油和精油溶液（体积分数50%）对革兰氏阴性菌和阳性菌均有良好的抑制效果，抑菌圈直径为：金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌（P<0.05）。对柠檬草精油溶液进行了温度、紫外线照射、pH与Ca2+处理后抑菌稳定性测试，结果表明：室温、酸性环境、Ca2+浓度较大时，柠檬草精油具有较好的抑菌稳定性；紫外照射时间对柠檬草精油的抑菌稳定性无影响，这种较好的稳定性有利于精油的开发利用。抗氧化实验结果表明，柠檬草精油对体外自由基的清除能力和对Fe3+的还原能力呈量效关系，其对自由基的清除能力为：O2−·>ABTS+·>DPPH·。
本研究对柠檬草精油进行了精油成分、抑菌活性及稳定性、抗氧化活性的分析，为柠檬草精油作为植物源防腐剂和抗氧化剂的开发利用提供了理论依据和技术参考。由于柠檬草精油成分较为复杂，后续将继续对柠檬草精油的安全性、抑菌机制和抗氧化机制进行研究。
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图 2 紫外线处理对抑菌稳定性的影响
Figure 2. Antibacterial stability of C. citratus essential oil after UV treatment
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图 3 不同pH的柠檬草精油对抑菌稳定性的影响
Figure 3. Antibacterial stability of C. citratus essential oil with different pH
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图 5 CaCl2对柠檬草精油抑菌稳定性的影响
Figure 5. Antibacterial stability of CaCl2 on C. citratus essential oil
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图 6 柠檬草精油的抗氧化活性
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 6. Antioxidant activity of C. citratus essential oil
表 1 柠檬草精油的化学成分
Table 1 Composition of C. citratus essential oil
序号 化合物 CAS号 分子式 保留时间（min） 相对含量（%） 1 β-月桂烯 000123-35-3 C10H16 10.0867 9.30 2 对薄荷-1,3,8-三烯 018368-95-1 C10H14 10.6866 2.90 3 芳樟醇 000078-70-6 C10H18O 11.6807 2.70 4 2,6,6-三甲基-1,4-环己二烯-1-甲醛 162376-82-1 C10H14O 11.916 2.23 5 7-甲基-3-亚甲基-6-辛烯醛 055050-40-3 C10H16O 12.2806 4.05 6 新橙花醛 1000414-18-0 − 12.5277 5.27 7 3,7-二甲基-3,6-辛二烯醛 055722-59-3 C10H16O 12.7571 7.42 8 水杨酸甲酯 000119-36-8 C8H8O3 12.9865 3.35 9 2-甲基-5-异丙烯基-环戊-1-烯甲醛 1000190-36-8 C11H16O 13.2747 3.19 10 橙花醛 000106-26-3 C10H16O 13.5511 18.57 11 香叶醇 000106-24-1 C10H18O 13.6511 2.40 12 香叶醛 005392-40-5 C10H16O 13.9276 26.73 
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表 2 柠檬草精油对3种菌种的抑菌活性
Table 2 Antibacterial activity of C. citratus essential oils against three tested bacteria
菌种 抑菌直径（mm） 判定结果 抑菌直径（mm） 判定结果 抑菌直径（mm） 判定结果 金黄色葡萄球菌 25.43±0.24a 高度敏感 17.40±0.07a 敏感 6.00±0.00 不敏感 大肠杆菌 23.54±0.67b 高度敏感 16.84±0.18b 敏感 6.00±0.00 不敏感 枯草芽孢杆菌 18.33±0.03c 敏感 13.86±0.04c 中度敏感 6.00±0.00 不敏感 注：同一列的不同字母代表有显著差异（P<0.05）；供试菌种对精油敏感程度的判定标准为：抑菌圈直径大于20 mm为高度敏感，在14~20 mm之间为敏感，8~14 mm之间为中度敏感，小于8 mm为不敏感[12]。
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