酿酒酵母L3蛋白酶对哈尔滨风干肠品质特性和风味的影响

刘新平; 田佳奇; 王琳; 孙方达; 孔保华

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2024030358

酿酒酵母L3蛋白酶对哈尔滨风干肠品质特性和风味的影响

东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030

基金项目: 国家自然科学基金（32372373）；国家自然科学基金青年项目（32101999）；中国博士后科学基金特别资助项目（2023T160091）；黑龙江省优秀青年基金（YQ2022C022）。

详细信息

作者简介:
刘新平（1999−），女，硕士研究生，研究方向：畜产品加工，E-mail：liuxinping330@163.com

通讯作者:
孙方达（1987−），男，博士，副教授，研究方向：畜产品加工，E-mail：sunfangda@neau.edu.cn。

孔保华（1963−），女，博士，教授，研究方向：畜产品加工，E-mail：kongbh@163.com。

中图分类号: TS251.5
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出版历程
- 收稿日期: 2024-03-24
- 网络出版日期: 2024-12-30
- 刊出日期: 2025-02-28

Effect of Saccharomyces cerevisiae L3 Protease on Quality Characteristics and Flavor of Harbin Dry Sausages

School of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

摘要

摘要: 为探究酿酒酵母L3蛋白酶对发酵肉制品的品质特性和风味的影响，本实验探讨了不同添加量的酿酒酵母L3蛋白酶对风干肠发酵过程中的蛋白水解、脂质氧化和理化特性的影响，并利用气相色谱法-质谱法联用（Gas chromatograohy-mass spectrometry，GC-MS）技术和感官评定对哈尔滨风干肠进行了分析。结果表明，添加酿酒酵母L3蛋白酶能够加速风干肠pH的降低。与自然发酵的风干肠相比，随着蛋白酶添加量的提高，加快了风干肠的水分含量和水分活度的降低，同时红度值（a^*）和剪切力显著升高（P<0.05）。另外，酿酒酵母L3蛋白酶降低了风干肠发酵过程中的脂质氧化程度。添加酿酒酵母L3蛋白酶后，风干肠中的总游离氨基酸含量增加，同时促进了风味物质的形成。感官评价结果表明，添加1.0 g/kg的酿酒酵母L3蛋白酶对风干肠的气味和鲜味的改善效果最佳，总体可接受度最好。综上所述，酿酒酵母L3蛋白酶对改善发酵肉制品的品质和风味具有积极作用。
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- 品质特性 /
- 风味
Abstract: This experiment aimed to examine how varying levels of Saccharomyces cerevisiae L3 protease impact protein hydrolysis, lipid oxidation, and the physicochemical traits of dry sausage during fermentation. The study also involved analyzing the quality of dry sausage using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and sensory evaluation techniques. The study found that S. cerevisiae L3 protease accelerated pH reduction in dry sausages. Compared with naturally fermented dry sausages, it accelerated the decrease in water content and water activity with increasing protease addition. At the same time, redness values (a^*) and shear were significantly higher when protease was added (P<0.05). In addition, S. cerevisiae L3 protease reduced lipid oxidation during fermentation of dry sausage. With the addition of S. cerevisiae L3 protease, the total free amino acid contents of dry sausage increased, while the formation of flavor substances was promoted. The results of sensory evaluation showed that the addition of 1.0 g/kg of S. cerevisiae L3 protease had the best improvement in odor and freshness of dry sausage and the best overall acceptability. In conclusion, S. cerevisiae L3 protease had a positive effect on improving the quality and flavor of fermented meat products.
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哈尔滨风干肠是在微生物的作用下，形成具有独特的色泽、质地及风味的发酵肉制品，深受消费者喜爱^[1]。在发酵过程中，主要依靠原料肉中的内源酶和有益微生物来改善其风味和品质特性，然而内源酶数量有限，同时会受到发酵环境的影响减弱其作用^[2]，而外源添加适量蛋白酶能够在保证产品质量的前提下，促进产品风味物质含量的提高。因此，对外源酶等发酵剂的研发和应用越来越广泛。

蛋白酶通过水解作用使肉蛋白分解成肽以及游离氨基酸等物质，其中部分游离氨基酸是形成风味物质的来源^[3]。刘天红等^[4]研究发现风味蛋白酶和动物蛋白酶水解沙蚕的过程中，多肽的鲜味较为明显，且鲜味氨基酸含量较高。Tang等^[5]采用多种蛋白酶（中性蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶）对肉骨残渣进行水解，发现风味物质增多。另外，目前微生物作为发酵剂应用于食品中较为广泛，其中芽孢杆菌具有较强的产蛋白酶和脂肪酶的能力^[6]，Shan等^[7]发现添加蜡样芽孢杆菌DM423可以大大增强香肠的蛋白水解、脂肪分解和风味产生，可见该菌株在代谢过程中产生了足够的蛋白酶。Li等^[8]发现植物乳杆菌会促进罗非鱼鱼糜的挥发性风味物质的增多。微生物在发酵过程中风味物质的形成途径中发挥着重要作用，这主要是由于其具有产蛋白酶的能力。

酿酒酵母通常应用于面包、啤酒等的生产过程中。但目前有研究表明分离自意大利萨拉米香肠的酿酒酵母具有蛋白水解活性^[9]，且可以影响发酵香肠中氨基酸和挥发性化合物的组成，具有菌株依赖性。因此在发酵过程中，酿酒酵母能够通过产生蛋白酶促进肉制品中的蛋白水解，从而对产品的风味品质具有一定的促进作用。但目前对酿酒酵母蛋白酶应用的针对性研究较为缺乏。实验室前期实验中从哈尔滨风干肠中分离得到了一株酿酒酵母L3，并经分离纯化得到了其纯化胞外蛋白酶，经测定其活性为17.51 U/mg。因此，本研究选择酿酒酵母L3蛋白酶进行实验，探讨不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠的品质特性、蛋白水解、挥发性风味物质和感官特性的影响，旨在了解该蛋白酶在哈尔滨风干肠中的水解作用以及对其风味品质的影响，为蛋白酶制剂的开发提供理论基础。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

选用前期实验室从哈尔滨风干肠中分离的酵母菌，经鉴定与酿酒酵母具有亲缘关系，并命名为酿酒酵母L3。将活化后的酿酒酵母L3进行发酵适宜时间，结束后离心得到含有粗蛋白酶的上清液。将该蛋白酶大量收集后经硫酸铵沉淀、透析、离子交换层析和凝胶过滤后，得到纯化较高的蛋白酶，其活性为17.51 U/mg。将得到的纯化蛋白酶收集后冻干，于4 ℃保存备用；新鲜大白×杜洛克杂交猪肉（肥肉:瘦肉为1:9）、猪小肠衣、食盐、大曲酒、味素、香辛料　哈尔滨香坊区好又多超市；三氯乙酸（TCA）、2-硫代巴比妥酸（TBA）、Tris、溴酚蓝、甲醇、冰醋酸、考马斯亮蓝　黑龙江忆冉科技开发有限公司；实验用水均为去离子水。

DELTA 320 pH计　美国Mettler Toledo公司；DHP-9272电热恒温干燥箱　上海一恒科技有限公司；HWS-70BX恒温恒湿箱　天津市泰斯特仪器有限公司；AquaLab智能水分活度仪　美国Decagon Devices公司；GCMS-QP 2020 NX GC-MS仪　日本岛津公司；ZE6000色差计　日本色电工业株式会社；Hitachi L-8800氨基酸自动分析仪　日本日立有限公司；TA-XT plus型质构分析仪　英国Stable Micro System公司。

1.2 实验方法

1.2.1 哈尔滨风干肠的制作

传统风干肠的发酵工艺周期为9 d，添加蛋白酶制剂等会对其发酵周期产生影响，甚至会在较短的发酵时间内即可达到发酵要求。参照Sun等^[10]的方法并进行一定修改，将分离自酿酒酵母L3的蛋白酶（17.51 U/mg）以0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/kg肉的添加量分别接种至原料肉中，分别记为S 0、S 0.5、S 1.0、S 1.5和S 2.0组。并按照下述配方进行风干肠的制作：猪背最长肌9000 g、猪背膘1000 g、盐250 g、绵白糖500 g、味素30 g、亚硝酸盐0.9 g、玉泉大麯100 mL、水500 mL、混合调料（包括桂皮、大料、茴香、砂仁、胡椒粉、小豆蔻、丁香等）30.0 g。将灌制好的风干肠置于25±2 ℃下风干24 h，随后置于恒温恒湿培养箱自然发酵8 d，其发酵条件为相对湿度为75%~80%，相对温度为25±2 ℃。分别在第0、3、6、9 d取样对各组进行相关指标的测定，其中第0 d记为C 0。

1.2.2 pH、水分含量和水分活度的测定

参照Wang等^[11]的方法测定S 0、S 0.5、S 1.0、S 1.5和S 2.0组风干肠在不同发酵时间的pH、水分含量和水分活度。取5.0 g切碎的风干肠置于45 mL去离子水中，4 ℃振荡30 min，过滤取上清液测定pH。参照GB/T 5009.3-2016中的恒温干燥法测定风干肠的水分含量。在室温下去除风干肠肠衣，将其剪碎并铺满色差杯底部，置于水分活度仪内待仪器稳定后读数。

1.2.3 色差的测定

参照Wang等^[12]的方法测定风干肠的色差。检测前将仪器校准，光源采用D65/2。取切碎的风干肠均匀铺满样品盒底部进行测量。测定时将样品盒沿一个方向旋转三次，测定三次，分别记录样品的亮度值（L^*）、红度值（a^*）和黄度值（b^*）。

1.2.4 剪切力测定

将风干肠置于蒸锅上蒸煮15 min，于室温下冷却。将风干肠置于载物台上并采用A/MORS探头进行测定，测试前速率1.5 mm/s，测试速率1.5 mm/s，测试后速率5.0 mm/s，于每根肠的不同位置测定十次，并计算其平均剪切力值，表示为N^[1]。

1.2.5 脂质氧化测定

依据Chen等^[13]的方法测定风干肠中硫代巴比妥酸（TBARS）含量。取5 g风干肠匀浆，与25 mL TCA（7.5%，v/v）混合，振荡30 min后过滤，取相同体积的滤液与TBA（0.02 mol/L）混匀，沸水浴40 min，冷却后取上清液分别读取在532 nm和600 nm处的吸光值。结果以mg MDA/100 g肉表示，并按照公式（1）进行计算：

$\mathrm{T}\mathrm{B}\mathrm{A}\mathrm{R}\mathrm{S}=\frac{{\mathrm{A}}_{532}-{\mathrm{A}}_{600}}{155}\times \frac{1}{10}\times 72.06\times 100$

(1)

式中：155为在532 nm处丙二醛溶液（1 mmol/L）的光密度；72.06为丙二醛的分子量。

1.2.6 SDS-PAGE的测定

依据Dong等^[14]的方法稍作修改后，对风干肠中的蛋白质通过SDS-PAGE进行观察。SDS-PAGE电泳胶为12%的分离胶和5%的浓缩胶。称取1 g切碎的风干肠置于10 mL 20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液，振荡均匀后于4 ℃，10000×g离心10 min，收集上清液，将蛋白浓度调整为2 mg/mL后，与SDS-PAGE溶解液（由pH6.8的0.25 mmol/L Tris-HCl、10% SDS、0.5%溴酚蓝和50%甘油组成）按照1:1的比例混合均匀，于沸水浴中处理5 min，冷却后上样，进行电泳。样品在浓缩胶时用80 V电压，待样品进入分离胶后改为120 V电压。电泳结束后经染色液（50%甲醇，6.8%冰醋酸和1 mg/mL考马斯亮蓝）染色20 min，脱色液（5%甲醇和7.5%的冰醋酸）脱至透明后对结果进行拍照。

1.2.7 TCA-可溶性肽含量的测定

依据Sun等^[10]的方法从风干肠中进行肽的提取。将5 g切碎的风干肠加入25 mL的磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，在4 ℃下，10000 r/min均质1 min。然后在4℃静置2 h后，于4 ℃下，10000×g离心20 min，用滤纸过滤上清液，收集滤液。参照Li等^[15]的方法测定TCA-可溶性肽含量。取上述滤液和同体积的15% TCA（w/v）混合均匀静置30 min，于10000×g离心10 min收集上清液并采用双缩脲法测定肽的含量。

1.2.8 游离氨基酸含量的测定

参照Ju等^[16]的方法，称取5.0 g切碎的风干肠置于25 mL 0.1 mol/L HCl溶液（w/v），于5000 r/min条件下均质30 min后过夜，然后于4 ℃下10000×g离心20 min，上清液经0.22 μm水相滤膜过滤，取20 µL滤液加入氨基酸自动分析仪以测定游离氨基酸的含量。

1.2.9 挥发性化合物的测定

依据Wen等^[17]的方法测定风干肠中的挥发性风味物质。取3 g切碎的样品置于20 mL SPME小瓶中，并用聚四氟乙烯/硅橡胶隔膜封口。将1,2-二氯苯（100 mg/g甲醇溶剂，4 μL）作为内标添加到样品中，在50 ℃水浴中平衡45 min后，将涂有聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳氧烷（PDMS/DVB/CAR）的萃取头插入SPME小瓶中，并使其石英纤维头暴露于小瓶内的上部。在50 ℃水浴中萃取45 min后，将石英纤维头退回并拔出，立即插入GC-MS进样器中解析5 min。气相色谱仪配有DB-5毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.20 μm）和火焰离子化检测器，以He为载气，流速1.0 mL/min。程序初始温度为35 ℃保持5 min，然后以4 ℃/min的速度升温至150 ℃保持2 min，再以20 ℃/min速度升温至250 ℃，保持10 min。质谱在电子碰撞模式下运行，源温度为250 ℃，电离电压为70 eV，扫描范围50~550 amu。选择结果中的相似度>90%的化合物，通过与质谱库（NIST 17s）中的数据比较鉴定化合物种类，根据化合物的面积对其含量进行计算，见式（2）：

$\mathrm{风}\mathrm{味}\mathrm{物}\mathrm{质}\mathrm{的}\mathrm{含}\mathrm{量}\left({\mathrm{n}\mathrm{g}}/{\mathrm{g}}\right)=\frac{400}{3}\times \frac{\mathrm{A}_1}{\mathrm{A}_2}$

(2)

式中：400为4 μL 1,2-二氯苯的重量（ng）；3为样品重量（g）；A₁为化合物峰面积，A₂为内标物质的峰面积。

1.2.10 感官评定

评定小组由15名具有食品感官评价经验的成员组成，其中男女比例为1:2，年龄范围为20~40岁。为了让小组成员熟悉评分系统，在感官评价前对小组成员进行“热身”训练。选取第9 d的风干肠进行蒸制20 min，并切成均匀厚度随机放置于白色托盘内，并随机选用3位数字进行编号。感官评定在感官评定室进行，且小组成员在对每个样品进行品评前均需用饮用水漱口。评定指标包括色泽、嫩度、气味、鲜味和总体可接受度。感官属性的评分范围从1（低强度）到7（高强度）^[18]。对于色泽，1分为颜色暗黑无发霉，7分为颜色红润有光泽；对于嫩度，1分为肉嫩，7分为肉质非常硬；对于气味，1分为无发酵香味，7分为具有浓郁的发酵香味；对于鲜味，1分为鲜味较淡，7分为鲜味浓郁；对于总体可接受度，1分为品质差，无法接受，7分为品质好，可接受性高。

1.3 数据处理

实验数据采用IBM SPSS 27 软件进行分析。本研究进行3次独立实验，所有实验内容均进行3次测定。所有数据均以平均值±标准差（x±s）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）和LSD检验来分析各组数据的显著性（P<0.05），并采用Origin 2021软件绘图。

2. 结果与分析

2.1 不同添加量蛋白酶对风干肠pH、水分含量和水分活度值的影响

由图1A可知，随着发酵的进行，S 0组风干肠的pH显著降低（P<0.05），这是由于体系中本身存在的微生物可以通过代谢产生乳酸引起的^[19]。添加酿酒酵母L3蛋白酶后，与S 0组相比，其余各组的pH均有所下降。S 0.5、S 1.0、S 1.5和S 2.0组的pH随着发酵的进行均呈现下降趋势，但相同发酵时间下添加蛋白酶的4组之间无显著差异（P>0.05），这表明添加适量的酿酒酵母L3蛋白酶促进风干肠产酸并一定程度上维持其稳定。在较低的pH体系中，风干肠中的致病性微生物和腐败微生物均能够有效受到抑制，产品的安全性也会得到提高^[20]。可以发现，添加适量的酿酒酵母L3蛋白酶在一定程度上可以降低风干肠的pH，这说明添加酿酒酵母L3蛋白酶后可能会抑制某些有害微生物的生长；但pH的降低会影响产品的感官品质，因此在实际生产中应该根据需求适量添加蛋白酶。

图 1 不同添加量酿酒酵母L3蛋白酶对风干肠发酵过程中pH（A）、水分含量（B）和水分活度（C）的影响

注：不同大写字母代表在同一时间下不同添加量蛋白酶的体系间存在显著差异性（P<0.05）；不同小写字母代表相同蛋白酶添加量不同发酵时间的体系间存在显著差异性（P<0.05）；图2~图3、图5同。

Figure 1. Effect of different additions of S. cerevisiae L3 protease on pH (A), moisture content (B) and water activity (C) during fermentation of dry sausages

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S 0组在发酵第9 d时的水分含量从第0 d的64.39%显著降低到了39.09%（P<0.05）（图1B）。添加酿酒酵母L3蛋白酶后，随着发酵的进行各处理组的水分含量均有所下降，且在相同发酵时间下加入蛋白酶的处理组的水分含量均低于S 0组。水分活度与水分含量之间的变化均为非线性的，但水分含量的变化几乎总是伴随着水分活度的变化。由图1C可知，随着酿酒酵母L3蛋白酶添加量的升高，水分活度值逐渐降低，且含蛋白酶组的风干肠与不含蛋白酶组相比具有显著性变化（P<0.05）。水分活度和水分含量的变化主要与pH的变化有关，发酵过程中pH的降低导致肉蛋白结构变化，导致蛋白质的持水能力下降^[21]。Sun等^[10]发现添加木糖葡萄球菌蛋白酶后，哈尔滨风干肠的水分含量、水分活度和pH均有所降低，这与本研究结果一致。综上所述，添加蛋白酶后会导致产品的pH、水分含量和水分活度有所下降，因此在实际生产中应结合该蛋白酶的特性，通过适量添加蛋白酶，尽量减少对pH、水分含量和水分活度造成较大的影响。

2.2 不同添加量蛋白酶对风干肠色泽的影响

由表1可知，随着发酵过程的进行，各处理组的风干肠的亮度值（L^*）和黄度值（b^*）均呈显著性降低趋势，红度值（a^*）显著提高（P<0.05）。这可能是由于形成了亚硝基肌红蛋白，使得红色色素累积^[22]，同时发酵过程中水分含量降低，使得风干肠亮度降低，红色更为明显。随着酿酒酵母L3蛋白酶添加量的增多，风干肠的亮度值（L^*）均低于S 0组，其中S 2.0组的亮度值（L^*）最低；另外，红度值（a^*）随着蛋白酶添加量的提高呈显著性升高的趋势（P<0.05）。因此，该蛋白酶对哈尔滨风干肠的色泽具有改善作用。龚小会^[23]同样指出亮度值（L^*）和水分活度的变化呈正相关，并且发现加入发酵剂后，干腌肉块的红色较为明显，产生了较为诱人的色泽。

表 1 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠色泽的影响

Table 1. Effect of different additions of protease on the color of Harbin dry sausage

色泽	发酵时间（d）	S 0	S 0.5	S 1.0	S 1.5	S 2.0
L^*	0	45.83±0.18^Aa	45.83±0.18^Aa	45.83±0.18^Aa	45.83±0.18^Aa	45.83±0.18^Aa
	3	44.75±0.23^Ab	44.26±0.17^Bb	44.11±0.24^Cb	43.79±0.41^Db	43.57±0.23^Eb
	6	43.95±0.26^Ac	43.66±0.20^Bc	43.49±0.21^Cc	42.57±0.37^Dc	41.22±0.32^Ec
	9	43.05±0.14^Ad	42.12±0.34^Bd	43.10±0.43^Ad	41.37±0.07^Cd	40.96±0.38^Dd
a^*	0	12.14±0.19^Ad	12.14±0.19^Ad	12.14±0.19^Ad	12.14±0.19^Ad	12.14±0.19^Ad
	3	12.82±0.17^Ec	13.03±0.14^Dc	13.29±0.17^Cc	13.69±0.48^Bc	13.93±0.51^Ac
	6	13.60±0.19^Db	13.85±0.22^Cb	14.03±0.15^Cb	14.43±0.21^Bb	14.99±0.52^Ab
	9	14.35±0.50^Ea	14.75±0.65^Da	15.45±0.37^Ca	15.67±0.15^Ba	15.93±0.24^Aa
b^*	0	13.05±0.29^Aa	13.05±0.29^Aa	13.05±0.29^Aa	13.05±0.29^Aa	13.05±0.29^Aa
	3	12.96±0.12^Aa	12.54±0.32^Bb	12.15±0.21^Cb	12.09±0.16^CDb	12.02±0.37^Db
	6	12.28±0.23^Ab	12.06±0.19^Bc	11.99±0.21^Cb	11.73±0.17^Dc	11.59±0.14^Ec
	9	11.93±0.59^Ac	11.78±0.34^Bd	11.65±0.61^Bc	11.45±0.38^Cd	11.32±0.30^Cd
注：不同大写字母代表在同一时间下不同添加量蛋白酶的体系间存在显著差异性（P<0.05）；不同小写字母代表相同添加量蛋白酶时不同时间下体系间存在显著差异性（P<0.05）。

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2.3 不同添加量蛋白酶对风干肠剪切力的影响

食品的嫩度是影响消费者选择的一个非常重要的指标。不同添加量酿酒酵母L3蛋白酶对风干肠剪切力的影响如图2所示。在整个发酵期间，S 0组风干肠的剪切力从第0 d的10.79 N显著升高到了第9 d的44.47 N（P<0.05），这主要是由于在发酵过程中水分逐渐流失，嫩度逐渐降低^[24]。添加酿酒酵母L3蛋白酶后，第9 d风干肠的剪切力随着蛋白酶添加量的增多而显著升高（P<0.05），这可能是由于蛋白酶的加入破坏了蛋白的结构，导致产品的水分流失程度变大，使得产品的硬度提高，但硬度较高会影响产品的可接受度，因此应根据蛋白酶的特性及实际生产需求，在风干肠生产过程中添加适量的蛋白酶。综上所述，酿酒酵母L3蛋白酶会促进风干肠在发酵过程中的嫩度的变化。Sun等^[25]发现在毕赤酵母中成功表达的天冬氨酸蛋白酶对猪肌肉具有较好的嫩化作用。这与本研究结果存在不一致，可能是由于菌株不同，其所产蛋白酶具有不同的特异性。

图 2 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠剪切力的影响

Figure 2. Effect of different additions of proteases on the shearing force of Harbin dry sausage

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2.4 不同添加量蛋白酶对风干肠脂质氧化的影响

风干肠在发酵过程中会因体系中的脂肪酶和酯酶导致脂肪水解，这会进一步发生脂肪氧化^[26]。硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）主要用于评价脂质二次氧化的程度，主要反映脂质氧化形成的丙二醛化合物的量，氧化程度越低，TBARS值越低^[27]。不同添加量酿酒酵母L3蛋白酶对风干肠脂质氧化程度的影响如图3所示。可以发现，在发酵第0 d时各处理组的TBARS值均较低。未添加酿酒酵母L3蛋白酶时，随着发酵过程的进行，S 0组的TBARS水平显著增加（P<0.05），表明在自然发酵条件下风干肠中的脂类物质会逐渐氧化，形成如醛、酮、醇、酯等风味前体物质^[28]。添加酿酒酵母L3蛋白酶后，随着发酵时间的进行，S 0.5、S 1.0和S 1.5组的TBARS值均显著升高（P<0.05），而S 2.0组在第3 d和第6 d的TBARS值无显著性差异（P>0.05）。发酵第9 d时，S 0.5组与S 0组之间差异不显著（P>0.05），而S 1.0、S 1.5和S 2.0组的TBARS值显著低于S 0组（P<0.05）。这表明酿酒酵母L3蛋白酶在一定程度上对风干肠中的脂质氧化具有抑制作用，并且随着蛋白酶添加量的升高，抑制作用增强。此外，在水解过程中可能生成某些抗氧化肽，可防止氧化并避免在食品中形成不良物质^[29]。Yu等^[30]将高蛋白酶活性的混合发酵剂（植物乳杆菌CD101和Staphylococcus simulans NJ201）接种于干香肠中，发现其抗氧化性大大提高，并且可以延缓产品的氧化。

图 3 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠脂质氧化的影响

Figure 3. Effect of different additions of proteases on TBARS of Harbin dry sausage

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2.5 不同添加量蛋白酶对风干肠蛋白降解的影响

2.5.1 SDS-PAGE

不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠中蛋白组成的SDS-PAGE电泳图谱如图4所示。在发酵第9 d时，与C组相比，S 0、S 0.5、S 1.0、S 1.5和S 2.0组的100、48和35 kDa处的条带颜色依次变浅甚至消失，而分子量低于25 kDa的蛋白条带颜色变深。这可能是添加了酿酒酵母L3蛋白酶后促进了肌肉蛋白的降解，以及促进了小分子量蛋白的累积。

图 4 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠中蛋白组成的SDS-PAGE电泳图谱的影响

注：C：发酵第0 d的风干肠中的蛋白；M：SDS-PAGE标准蛋白。

Figure 4. Effect of different additions of proteases on SDS-PAGE electrophoretic profiles of protein composition in Harbin dry sausages

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2.5.2 不同添加量蛋白酶对风干肠中TCA-可溶性肽含量的影响

如图5所示，随着发酵时间的进行，各组的TCA-可溶性肽含量均呈现显著性增多的趋势（P<0.05）。这表明在发酵体系中，酿酒酵母L3蛋白酶参与了肉蛋白的水解。即使存在内源酶，但易受到各种因素的影响，因此在添加酿酒酵母L3蛋白酶后，体系中持续进行水解反应。并且随着酿酒酵母L3蛋白酶添加量的增加，能够进一步促进对肉蛋白的水解，使得体系中的肽含量增多。另外可以发现在发酵第3、6和9 d，体系中TCA-可溶性肽含量随着酿酒酵母L3蛋白酶添加量的升高而显著升高（P<0.05）。当加入2.0 g/kg酿酒酵母L3蛋白酶发酵9 d后，体系中TCA-可溶性肽含量增加到了25.73 mg/g。在发酵过程中，风干肠内部的蛋白质被蛋白酶水解，导致小肽和氨基酸的数量增加，其中小肽也是主要风味成分^[31]，这表明酿酒酵母L3蛋白酶在发酵期间能够将肉类蛋白降解为水溶性肽，从而促进香肠中其他反应的进行。Timón等^[32]发现添加米曲霉蛋白酶能够促进香肠中的蛋白水解，促进了水解产物的积累。

图 5 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠中TCA-可溶性肽的影响

Figure 5. Effects of different additions of proteases on TCA-soluble peptides in Harbin dry sausages

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2.5.3 不同添加量蛋白酶对风干肠中游离氨基酸的影响

经不同添加量酿酒酵母L3蛋白酶处理后的风干肠中游离氨基酸的种类和含量如表2所示。整个体系中共检测出20种游离氨基酸。发酵9 d后，未添加蛋白酶组即S 0组中有13种游离氨基酸的含量均显著提高（P<0.05），其中Gln的变化较为明显，从第0 d的0.07 mg/g上升至第9 d后2.07 mg/g，这说明在自然发酵的条件下风干肠的某些特征滋味已在体系内有所形成。有3种游离氨基酸未能测出，包括Glu、The和Cys。添加酿酒酵母L3蛋白酶后，总游离氨基酸的含量随蛋白酶添加量的增加而显著增加（P<0.05）。在发酵第9 d，与S 0组相比，Thr、Ser、Glu、Ile、Leu、Phe、Arg和Pro的含量随着蛋白酶添加量的增多而显著增多，其中S 2.0组中Glu含量最高。Glu是鲜味氨基酸^[33]，这表明随着酿酒酵母L3蛋白酶添加量的提高，风干肠的鲜味在一定程度上得到了提升。因此，可以通过添加适量酿酒酵母L3蛋白酶提高风干肠的鲜香味。Santos等^[34]发现从香肠中得到的Debaryomyces hansenii菌株具有蛋白酶活性，能够水解猪肌浆蛋白，提高游离氨基酸含量。

表 2 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠中游离氨基酸的影响（mg/g 风干肠）

Table 2. Effect of different additions of proteases on free amino acids in Harbin dry sausages (mg/g dry sausage)

游离氨基酸	0 d	9 d
游离氨基酸	C 0	S 0	S 0.5	S 1.0	S 1.5	S 2.0
Asp	n.d.	0.07±0.01^a	0.11±0.01^a	0.14±0.02^a	0.19±0.02^a	0.13±0.01^a
Thr	0.06±0.01^e	0.15±0.03^d	0.48±0.04^c	0.71±0.05^b	0.80±0.04^b	1.36±0.12^a
Ser	0.05±0.01^f	0.21±0.03^e	0.79±0.05^d	0.92±0.01^c	1.00±0.01^b	1.40±0.10^a
Glu	0.07±0.01^d	n.d.	0.70±0.11^c	3.75±0.24^b	3.82±0.22^b	5.93±0.45^a
Gln	0.07±0.01^e	2.07±0.06^b	2.00±0.05^c	2.19±0.08^a	1.67±0.01^d	1.97±0.08^c
The	0.35±0.03^a	n.d.	0.20±0.04^b	0.17±0.03^b	0.16±0.05^b	0.15±0.03^b
Gly	0.04±0.01^e	0.18±0.04^d	0.72±0.05^b	1.01±0.04^a	0.98±0.06^a	0.67±0.04^c
Ala	0.05±0.01^f	0.58±0.04^e	1.74±0.08^c	2.24±0.08^a	2.02±0.07^b	1.42±0.05^d
Val	0.06±0.01^f	0.16±0.01^e	1.13±0.07^c	1.52±0.05^a	1.42±0.06^b	0.93±0.04^d
Cys	0.12±0.01	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
Met	0.08±0.01^c	0.08±0.01^c	0.55±0.04^b	0.58±0.06^b	0.83±0.04^a	0.90±0.05^a
Ile	0.07±0.01^e	0.14±0.01^e	1.05±0.04^d	1.59±0.06^b	1.36±0.06^c	1.92±0.08^a
Leu	0.07±0.01^f	0.22±0.01^e	2.01±0.06^d	3.25±0.04^c	3.76±0.08^b	3.95±0.09^a
Tyr	0.09±0.01^c	0.11±0.01^c	0.65±0.05^b	0.97±0.04^a	0.88±0.04^a	0.60±0.03^b
Phe	0.08±0.01^d	0.12±0.01^d	0.84±0.06^c	0.89±0.04^c	1.22±0.05^b	1.41±0.04^a
Lys	0.07±0.01^e	0.26±0.01^d	1.62±0.04^c	2.36±0.07^a	2.11±0.05^b	2.30±0.06^a
His	n.d.	0.08±0.01^d	0.50±0.04^b	0.67±0.03^a	0.65±0.02^a	0.40±0.04^c
Arg	0.09±0.01^f	0.18±0.01^e	1.25±0.06^d	1.94±0.06^c	2.09±0.05^b	2.49±0.08^a
Asn	0.07±0.01^d	1.36±0.05^c	1.40±0.04^bc	1.50±0.04^b	1.45±0.03^b	1.69±0.04^a
Pro	0.06±0.01^f	0.12±0.01^e	0.54±0.05^d	0.65±0.05^c	0.75±0.07^b	0.92±0.06^a
总含量	1.55±0.03^e	6.09±0.08^d	18.28±0.12^c	27.05±0.13^b	27.16±0.11^b	30.54±0.14^a
注：不同小写字母代表同一行的不同组之间的氨基酸含量存在显著差异性（P<0.05）；n.d.：未检测到。

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2.6 不同添加量蛋白酶对风干肠中挥发性风味物质的影响

由表3可知，在发酵0 d时，共检测出31种物质，这主要是由于在加工过程中添加的香辛料和大曲酒。发酵9 d后，S 0组共检测出48种挥发性风味物质，其中包括醇类8种、烯烃类7种、醛类6种、酯类6种、酸类6种、酮类5种、烷烃类4种以及其他物质6种。这些挥发性化合物通常源于碳水化合物代谢、氨基酸分解代谢、细菌酯化、香辛料的使用和脂质氧化等过程^[35]。

表 3 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠中挥发性化合物的影响（ng/g）

Table 3. Effect of different additions of proteases on volatile compounds in Harbin dry sausages (ng/g)

风味物质	0 d	9 d
风味物质	C 0	S 0	S 0.5	S 1.0	S 1.5	S 2.0
醛类
糠醛	7.91±0.16^a	2.90±0.11^b	n.d.	n.d.	n.d.	2.68±0.08^b
己醛	n.d.	18.42±0.58^a	17.72±0.66^b	15.40±0.54^d	16.04±0.59^c	14.27±0.41^e
壬醛	n.d.	18.84±0.49^a	9.45±0.31^c	12.91±0.32^b	8.61±0.29^cd	8.92±0.22^cd
苯甲醛	n.d.	10.87±0.33^d	17.04±0.64^a	16.03±0.58^b	15.80±0.62^b	15.25±0.61^bc
肉桂醛	n.d.	10.14±0.36^a	6.37±0.21^c	9.98±0.36^a	7.74±0.39^b	5.35±0.26^d
（E）-2-庚烯醛	n.d.	14.49±0.54^a	7.04±0.29^b	4.20±0.27^c	3.44±0.56^cd	2.23±0.31^e
酮类
苯乙酮	8.70±0.38^a	2.17±0.24^b	n.d.	2.35±0.19^b	1.72±0.18^bc	1.34±0.15^c
2-戊酮	n.d.	16.67±0.68^a	15.48±0.62^b	13.85±0.45^c	12.92±0.51^d	11.78±0.55^e
2,3-辛二酮	n.d.	20.58±0.49^a	18.90±0.45^b	19.37±0.39^b	17.75±0.58^c	17.58±0.46^c
2-壬酮	n.d.	32.61±0.65^d	35.51±0.62^bc	36.46±0.58^b	37.75±0.84^a	35.80±0.75^bc
胡椒酮	n.d.	2.17±0.19^a	1.31±0.10^b	2.35±0.18^a	n.d.	2.23±0.21^a
酯类
己酸甲酯	80.70±0.78^f	122.45±1.04^e	188.72±1.12^d	198.99±1.25^c	208.93±1.18^a	200.72±1.16^b
辛酸乙酯	10.28±0.68^f	23.19±0.75^b	21.02±0.66^e	22.65±0.73^bc	25.83±0.76^a	21.86±0.49^d
己酸乙酯	86.23±0.99^f	325.74±1.88^e	381.12±1.75^d	409.51±2.12^c	459.43±2.05^b	471.10±2.53^a
乳酸乙酯	7.12±0.24^e	20.29±0.54^cd	20.50±0.62^cd	21.02±0.46^c	25.49±0.53^a	22.04±0.49^b
γ-丁内酯	11.87±0.24^a	2.17±0.12^c	1.57±0.09^d	2.93±0.15^b	3.01±0.20^b	1.78±0.11^cd
乙酸龙脑酯	19.78±0.47^d	26.08±0.38^a	22.34±0.42^b	22.31±0.46^b	17.65±0.19^e	20.96±0.24^c
酸类
乙酸	27.69±0.58^e	48.55±0.85^c	47.01±0.79^d	48.72±0.77^c	61.12±0.95^b	68.24±0.84^a
丁酸	n.d.	9.42±0.26^d	12.60±0.35^c	12.33±0.42^c	16.36±0.48^a	13.83±0.44^b
己酸	45.66±0.67^f	47.83±0.89^d	46.46±0.75^e	55.76±0.79^b	53.81±0.68^c	61.55±0.93^a
壬酸	56.96±0.76^a	25.36±0.48^e	28.11±0.65^d	29.96±0.88^c	25.07±0.77^e	31.60±0.82^b
辛酸	22.15±0.64^a	12.32±0.35^c	7.61±0.58^f	13.50±0.66^b	9.04±0.42^d	8.03±0.48^e
棕榈酸	193.04±1.12^a	78.23±0.88^b	72.34±0.92^c	63.98±0.89^d	21.95±0.53^e	n.d.
醇类
乙醇	136.87±1.94^a	128.95±0.88^b	115.77±0.75^d	118.74±0.85^c	109.06±0.77^e	106.95±0.69^f
己醇	8.70±0.35^b	10.77±0.62^a	4.46±0.37^f	6.46±0.58^d	7.75±0.78^c	5.80±0.45^de
2-乙基己醇	12.66±0.69^a	5.07±0.52^c	6.30±0.49^b	5.87±0.48^bc	3.44±0.42^e	4.91±0.46^cd
1-辛烯-3-醇	n.d.	10.29±0.42^d	16.04±0.68^c	16.69±0.63^c	18.18±0.66^b	19.39±0.74^a
2,3-丁二醇	n.d.	3.62±0.35^a	2.89±0.41^b	2.93±0.38^b	3.29±0.29^ab	3.57±0.45^a
芳樟醇	19.78±0.35^a	18.84±0.47^b	15.76±0.62^c	16.44±0.49^c	13.77±0.52^d	15.61±0.48^c
（-）-4-萜品醇	n.d.	32.61±0.68^a	31.06±0.59^b	30.52±0.79^b	23.24±0.91^d	29.44±0.84^c
丙二醇	n.d.	10.14±0.35^b	10.36±0.28^b	10.57±0.41^b	13.01±0.39^a	12.93±0.42^a
烯烃
月桂烯	4.75±0.23^e	55.07±0.69^a	52.56±0.54^b	52.83±0.68^b	46.49±0.72^d	49.96±0.59^c
γ-松油烯	18.19±0.46^e	55.79±0.75^c	57.04±0.63^b	59.33±0.68^a	54.33±0.59^d	55.31±0.55^c
D-柠檬烯	12.79±0.22^d	50.75±0.48^c	53.97±0.57^a	54.45±0.62^a	53.13±0.59^ab	50.93±0.54^c
苯乙烯	10.28±0.19^f	141.97±0.73^e	149.88±0.78^d	184.90±1.08^c	238.77±1.89^b	245.76±1.93^a
β-石竹烯	95.73±0.69^a	41.30±0.46^c	41.84±0.52^c	43.63±0.56^b	38.75±0.47^d	33.45±0.38^e
α-律草烯	10.28±0.37^a	4.35±0.26^bc	3.67±0.27^c	4.70±0.32^b	4.74±0.35^b	4.01±0.29^bc
β-蒎烯	n.d.	6.52±0.18^a	6.79±0.21^a	6.93±0.26^a	6.41±0.17^a	6.34±0.16^a
烷烃
正己烷	7.12±0.19^c	7.98±0.16^ab	8.05±0.18^ab	8.26±0.13^a	8.61±0.25^a	7.85±0.10^ab
正十六烷	27.69±0.32^a	10.27±0.18^c	9.93±0.10^c	11.74±0.25^b	10.94±0.17^c	10.01±0.12^c
正十八烷	n.d.	11.59±0.28^a	9.94±0.19^c	10.32±0.21^b	9.47±0.19^c	8.50±0.14^d
正二十一烷	4.65±0.08^e	15.50±0.24^a	11.55±0.18^d	12.89±0.19^c	12.49±0.25^c	14.91±0.12^b
其他
茴香脑	224.68±0.92^a	113.02±0.32^d	106.57±0.52^e	108.96±0.67^e	129.57±0.43^c	161.91±0.63^b
D-樟脑	n.d.	100.86±0.63^a	96.17±0.62^c	97.44±0.59^b	94.37±0.52^d	93.67±0.35^de
异丙基苯	45.89±0.43^e	77.53±0.25^a	77.01±0.38^a	54.59±0.42^d	66.29±0.38^b	59.32±0.27^c
左旋龙脑	26.11±0.25^a	17.25±0.16^b	14.72±0.20^d	17.63±0.34^b	15.60±0.16^c	17.14±0.24^b
黄樟素	23.73±0.24^a	15.80±0.19^b	13.67±0.21^d	14.70±0.23^c	13.44±0.22^d	13.57±0.15^d
丁香酚	92.56±0.48^f	121.00±0.35^e	129.80±1.04^b	127.92±0.82^d	130.60±1.30^a	128.94±0.28^c
注：不同小写字母代表同一行的不同组的挥发性风味物质的含量存在显著性差异（P<0.05）；n.d.：未检测到。

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醛类是脂肪味的主要来源，主要来自不饱和脂肪酸氧化，这表明其含量的增加可能归因于发酵过程中脂质的自氧化^[36]。糠醛能够为产品提供辛辣、甜味、面包味、焦糖味和杏仁味^[7]，己醛和壬醛能够为风干肠提供草香、脂肪味和香橙味。添加酿酒酵母L3蛋白酶后，除了苯甲醛的其他醛类物质均显著性降低（P<0.05），这与TBRAS结果相一致。

酮类主要是通过氨基酸的降解或不饱和脂肪酸的氧化而形成^[37]。酮类物质在发酵肉制品中通常具有奶油，果味和辛辣味。添加蛋白酶后2-壬酮的含量均高于S 0组，为体系提供更多的奶酪香，而其他酮类均呈现出不同程度的降低趋势。

酯类通常是发酵肉制品中最重要的风味贡献者，能够赋予甜味并掩盖难闻的气味^[38]。可以发现，发酵9 d后的酯类物质的含量显著高于发酵第0 d（P<0.05）。随着酿酒酵母L3蛋白酶添加量的增多，与S 0组相比，己酸甲酯含量呈现出不同程度的增加趋势，己酸乙酯含量显著性升高（P<0.05），其他酯类物质的含量变化不显著。这说明添加酿酒酵母L3蛋白酶后产品中的花香和果味因己酸甲酯和己酸乙酯的含量增加而更明显。

另外，当添加酿酒酵母L3蛋白酶后，与S 0组相比，乙酸和丁酸的含量有所增加；除了S 0.5组外，己酸的含量均高于S 0组；而其他酸类均呈降低趋势。这说明酿酒酵母L3蛋白酶在一定程度上能够促进酸类物质的形成，改变产品体系的pH。同时由于乙酸等具有刺鼻气味，若含量过高则会影响消费者对产品的接受度。

醇类化合物主要是在发酵过程中通过烷烃类、脂质和氨基酸代谢等途径形成的^[39]。加入酿酒酵母L3蛋白酶后，与S 0组相比，乙醇和己醇含量呈现显著性降低（P<0.05），这说明随着发酵的进行，风干肠中由于加入大曲酒产生的酒香气逐渐变弱，同时又通过碳水化合物代谢会产生乙醇等部分醇类，能够维持产品的酒香。而当加入酿酒酵母L3蛋白酶后，1-辛烯-3-醇的含量显著性升高（P<0.05），这可能是在发酵过程中酿酒酵母L3蛋白酶促进了烷烃类和烯烃等物质氧化从而生成更多的醇类。1-辛烯-3-醇通常由脂肪酸氧化产生，可以使风干肠具有强烈的蘑菇气味^[40]。Wang等^[41]发现草菇内源酶（EESM）能够促进主要风味化合物的生成。Wang等^[12]发现添加肉糖葡萄球菌蛋白酶可以促进一些酮类、酸类和酯类等关键风味物质的生成。

2.7 感官评定

感官评定是最直接反应食品品质优劣的一种方法。对发酵周期结束的风干肠进行感官评定，能够直接表现出不同添加量蛋白酶对风干肠品质、风味和总体可接受度的影响。由表4可知，与S 0组相比，添加酿酒酵母L3蛋白酶后，风干肠的气味、鲜味和总体可接受性均表现出不同程度的提高。S 1.0组的色泽与对照组差异不显著（P>0.05），但其气味、鲜味和总体可接受度得分最高。随着蛋白酶添加量的继续增多，风干肠的嫩度呈现降低的趋势，这表明由于添加大量蛋白酶后导致水分含量和水分活度降低，使其硬度增大，导致消费者的接受度降低。因此，添加适量的酿酒酵母L3蛋白酶可以有效改善哈尔滨风干肠的感官特性。D. hansenii具有产蛋白酶的能力，有助于干发酵香肠的风味形成， Gong等^[42]发现直接接种D. hansenii，能够有效改善干腌五花肉的营养特性和感官品质。因此，酵母菌蛋白酶在改善发酵肉品质方面具有重要作用。

表 4 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠感官评价的影响

Table 4. Effect of different additions of proteases on the sensory evaluation of Harbin dry sausages

指标	S 0	S 0.5	S 1.0	S 1.5	S 2.0
色泽	5.75±0.16^a	5.69±0.14^ab	5.64±0.13^ab	5.47±0.12^b	4.97±0.22^c
嫩度	5.77±0.18^a	5.63±0.08^ab	5.25±0.17^c	5.05±0.16^cd	4.91±0.10^d
气味	4.81±0.13^c	5.13±0.11^b	5.50±0.14^a	5.25±0.12^b	5.39±0.09^ab
鲜味	4.60±0.15^d	4.90±0.09^c	5.59±0.11^a	5.44±0.15^a	5.32±0.12^ab
总体可接受度	4.64±0.07^e	5.13±0.06^d	6.10±0.15^a	5.50±0.17^b	5.37±0.16^c
注：不同小写字母代表不同处理组之间存在显著性差异（P<0.05）。

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3. 结论

本试验研究了酿酒酵母L3蛋白酶添加量（0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/kg）对哈尔滨风干肠品质特性及风味的影响。结果表明，不同蛋白酶添加量均会对风干肠的pH产生影响，且随着蛋白酶添加量的提高，可明显加速水分的损失以及硬度的变化，同时产生诱人的色泽。其次，该蛋白酶对风干肠的脂质氧化程度具有抑制作用，减少了不良物质的形成。此外，添加酿酒酵母L3蛋白酶能够影响风干肠中游离氨基酸和挥发性化合物的组成和含量，改善了风干肠的风味特征。结合感官评价可知，添加1.0 g/kg酿酒酵母L3蛋白酶的风干肠的总体可接受度最好，气味和鲜味明显提高。综上所述，酿酒酵母L3蛋白酶能够改善风干肠的品质特性和风味，为蛋白酶制剂的研发提供了思路。

图 1 不同添加量酿酒酵母L3蛋白酶对风干肠发酵过程中pH（A）、水分含量（B）和水分活度（C）的影响

Figure 1. Effect of different additions of S. cerevisiae L3 protease on pH (A), moisture content (B) and water activity (C) during fermentation of dry sausages

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图 2 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠剪切力的影响

Figure 2. Effect of different additions of proteases on the shearing force of Harbin dry sausage

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图 3 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠脂质氧化的影响

Figure 3. Effect of different additions of proteases on TBARS of Harbin dry sausage

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图 4 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠中蛋白组成的SDS-PAGE电泳图谱的影响

注：C：发酵第0 d的风干肠中的蛋白；M：SDS-PAGE标准蛋白。

Figure 4. Effect of different additions of proteases on SDS-PAGE electrophoretic profiles of protein composition in Harbin dry sausages

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图 5 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠中TCA-可溶性肽的影响

Figure 5. Effects of different additions of proteases on TCA-soluble peptides in Harbin dry sausages

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表 1 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠色泽的影响

Table 1 Effect of different additions of protease on the color of Harbin dry sausage

色泽	发酵时间（d）	S 0	S 0.5	S 1.0	S 1.5	S 2.0
L^*	0	45.83±0.18^Aa	45.83±0.18^Aa	45.83±0.18^Aa	45.83±0.18^Aa	45.83±0.18^Aa
	3	44.75±0.23^Ab	44.26±0.17^Bb	44.11±0.24^Cb	43.79±0.41^Db	43.57±0.23^Eb
	6	43.95±0.26^Ac	43.66±0.20^Bc	43.49±0.21^Cc	42.57±0.37^Dc	41.22±0.32^Ec
	9	43.05±0.14^Ad	42.12±0.34^Bd	43.10±0.43^Ad	41.37±0.07^Cd	40.96±0.38^Dd
a^*	0	12.14±0.19^Ad	12.14±0.19^Ad	12.14±0.19^Ad	12.14±0.19^Ad	12.14±0.19^Ad
	3	12.82±0.17^Ec	13.03±0.14^Dc	13.29±0.17^Cc	13.69±0.48^Bc	13.93±0.51^Ac
	6	13.60±0.19^Db	13.85±0.22^Cb	14.03±0.15^Cb	14.43±0.21^Bb	14.99±0.52^Ab
	9	14.35±0.50^Ea	14.75±0.65^Da	15.45±0.37^Ca	15.67±0.15^Ba	15.93±0.24^Aa
b^*	0	13.05±0.29^Aa	13.05±0.29^Aa	13.05±0.29^Aa	13.05±0.29^Aa	13.05±0.29^Aa
	3	12.96±0.12^Aa	12.54±0.32^Bb	12.15±0.21^Cb	12.09±0.16^CDb	12.02±0.37^Db
	6	12.28±0.23^Ab	12.06±0.19^Bc	11.99±0.21^Cb	11.73±0.17^Dc	11.59±0.14^Ec
	9	11.93±0.59^Ac	11.78±0.34^Bd	11.65±0.61^Bc	11.45±0.38^Cd	11.32±0.30^Cd
注：不同大写字母代表在同一时间下不同添加量蛋白酶的体系间存在显著差异性（P<0.05）；不同小写字母代表相同添加量蛋白酶时不同时间下体系间存在显著差异性（P<0.05）。

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表 2 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠中游离氨基酸的影响（mg/g 风干肠）

Table 2 Effect of different additions of proteases on free amino acids in Harbin dry sausages (mg/g dry sausage)

游离氨基酸	0 d	9 d
游离氨基酸	C 0	S 0	S 0.5	S 1.0	S 1.5	S 2.0
Asp	n.d.	0.07±0.01^a	0.11±0.01^a	0.14±0.02^a	0.19±0.02^a	0.13±0.01^a
Thr	0.06±0.01^e	0.15±0.03^d	0.48±0.04^c	0.71±0.05^b	0.80±0.04^b	1.36±0.12^a
Ser	0.05±0.01^f	0.21±0.03^e	0.79±0.05^d	0.92±0.01^c	1.00±0.01^b	1.40±0.10^a
Glu	0.07±0.01^d	n.d.	0.70±0.11^c	3.75±0.24^b	3.82±0.22^b	5.93±0.45^a
Gln	0.07±0.01^e	2.07±0.06^b	2.00±0.05^c	2.19±0.08^a	1.67±0.01^d	1.97±0.08^c
The	0.35±0.03^a	n.d.	0.20±0.04^b	0.17±0.03^b	0.16±0.05^b	0.15±0.03^b
Gly	0.04±0.01^e	0.18±0.04^d	0.72±0.05^b	1.01±0.04^a	0.98±0.06^a	0.67±0.04^c
Ala	0.05±0.01^f	0.58±0.04^e	1.74±0.08^c	2.24±0.08^a	2.02±0.07^b	1.42±0.05^d
Val	0.06±0.01^f	0.16±0.01^e	1.13±0.07^c	1.52±0.05^a	1.42±0.06^b	0.93±0.04^d
Cys	0.12±0.01	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
Met	0.08±0.01^c	0.08±0.01^c	0.55±0.04^b	0.58±0.06^b	0.83±0.04^a	0.90±0.05^a
Ile	0.07±0.01^e	0.14±0.01^e	1.05±0.04^d	1.59±0.06^b	1.36±0.06^c	1.92±0.08^a
Leu	0.07±0.01^f	0.22±0.01^e	2.01±0.06^d	3.25±0.04^c	3.76±0.08^b	3.95±0.09^a
Tyr	0.09±0.01^c	0.11±0.01^c	0.65±0.05^b	0.97±0.04^a	0.88±0.04^a	0.60±0.03^b
Phe	0.08±0.01^d	0.12±0.01^d	0.84±0.06^c	0.89±0.04^c	1.22±0.05^b	1.41±0.04^a
Lys	0.07±0.01^e	0.26±0.01^d	1.62±0.04^c	2.36±0.07^a	2.11±0.05^b	2.30±0.06^a
His	n.d.	0.08±0.01^d	0.50±0.04^b	0.67±0.03^a	0.65±0.02^a	0.40±0.04^c
Arg	0.09±0.01^f	0.18±0.01^e	1.25±0.06^d	1.94±0.06^c	2.09±0.05^b	2.49±0.08^a
Asn	0.07±0.01^d	1.36±0.05^c	1.40±0.04^bc	1.50±0.04^b	1.45±0.03^b	1.69±0.04^a
Pro	0.06±0.01^f	0.12±0.01^e	0.54±0.05^d	0.65±0.05^c	0.75±0.07^b	0.92±0.06^a
总含量	1.55±0.03^e	6.09±0.08^d	18.28±0.12^c	27.05±0.13^b	27.16±0.11^b	30.54±0.14^a
注：不同小写字母代表同一行的不同组之间的氨基酸含量存在显著差异性（P<0.05）；n.d.：未检测到。

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表 3 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠中挥发性化合物的影响（ng/g）

Table 3 Effect of different additions of proteases on volatile compounds in Harbin dry sausages (ng/g)

风味物质	0 d	9 d
风味物质	C 0	S 0	S 0.5	S 1.0	S 1.5	S 2.0
醛类
糠醛	7.91±0.16^a	2.90±0.11^b	n.d.	n.d.	n.d.	2.68±0.08^b
己醛	n.d.	18.42±0.58^a	17.72±0.66^b	15.40±0.54^d	16.04±0.59^c	14.27±0.41^e
壬醛	n.d.	18.84±0.49^a	9.45±0.31^c	12.91±0.32^b	8.61±0.29^cd	8.92±0.22^cd
苯甲醛	n.d.	10.87±0.33^d	17.04±0.64^a	16.03±0.58^b	15.80±0.62^b	15.25±0.61^bc
肉桂醛	n.d.	10.14±0.36^a	6.37±0.21^c	9.98±0.36^a	7.74±0.39^b	5.35±0.26^d
（E）-2-庚烯醛	n.d.	14.49±0.54^a	7.04±0.29^b	4.20±0.27^c	3.44±0.56^cd	2.23±0.31^e
酮类
苯乙酮	8.70±0.38^a	2.17±0.24^b	n.d.	2.35±0.19^b	1.72±0.18^bc	1.34±0.15^c
2-戊酮	n.d.	16.67±0.68^a	15.48±0.62^b	13.85±0.45^c	12.92±0.51^d	11.78±0.55^e
2,3-辛二酮	n.d.	20.58±0.49^a	18.90±0.45^b	19.37±0.39^b	17.75±0.58^c	17.58±0.46^c
2-壬酮	n.d.	32.61±0.65^d	35.51±0.62^bc	36.46±0.58^b	37.75±0.84^a	35.80±0.75^bc
胡椒酮	n.d.	2.17±0.19^a	1.31±0.10^b	2.35±0.18^a	n.d.	2.23±0.21^a
酯类
己酸甲酯	80.70±0.78^f	122.45±1.04^e	188.72±1.12^d	198.99±1.25^c	208.93±1.18^a	200.72±1.16^b
辛酸乙酯	10.28±0.68^f	23.19±0.75^b	21.02±0.66^e	22.65±0.73^bc	25.83±0.76^a	21.86±0.49^d
己酸乙酯	86.23±0.99^f	325.74±1.88^e	381.12±1.75^d	409.51±2.12^c	459.43±2.05^b	471.10±2.53^a
乳酸乙酯	7.12±0.24^e	20.29±0.54^cd	20.50±0.62^cd	21.02±0.46^c	25.49±0.53^a	22.04±0.49^b
γ-丁内酯	11.87±0.24^a	2.17±0.12^c	1.57±0.09^d	2.93±0.15^b	3.01±0.20^b	1.78±0.11^cd
乙酸龙脑酯	19.78±0.47^d	26.08±0.38^a	22.34±0.42^b	22.31±0.46^b	17.65±0.19^e	20.96±0.24^c
酸类
乙酸	27.69±0.58^e	48.55±0.85^c	47.01±0.79^d	48.72±0.77^c	61.12±0.95^b	68.24±0.84^a
丁酸	n.d.	9.42±0.26^d	12.60±0.35^c	12.33±0.42^c	16.36±0.48^a	13.83±0.44^b
己酸	45.66±0.67^f	47.83±0.89^d	46.46±0.75^e	55.76±0.79^b	53.81±0.68^c	61.55±0.93^a
壬酸	56.96±0.76^a	25.36±0.48^e	28.11±0.65^d	29.96±0.88^c	25.07±0.77^e	31.60±0.82^b
辛酸	22.15±0.64^a	12.32±0.35^c	7.61±0.58^f	13.50±0.66^b	9.04±0.42^d	8.03±0.48^e
棕榈酸	193.04±1.12^a	78.23±0.88^b	72.34±0.92^c	63.98±0.89^d	21.95±0.53^e	n.d.
醇类
乙醇	136.87±1.94^a	128.95±0.88^b	115.77±0.75^d	118.74±0.85^c	109.06±0.77^e	106.95±0.69^f
己醇	8.70±0.35^b	10.77±0.62^a	4.46±0.37^f	6.46±0.58^d	7.75±0.78^c	5.80±0.45^de
2-乙基己醇	12.66±0.69^a	5.07±0.52^c	6.30±0.49^b	5.87±0.48^bc	3.44±0.42^e	4.91±0.46^cd
1-辛烯-3-醇	n.d.	10.29±0.42^d	16.04±0.68^c	16.69±0.63^c	18.18±0.66^b	19.39±0.74^a
2,3-丁二醇	n.d.	3.62±0.35^a	2.89±0.41^b	2.93±0.38^b	3.29±0.29^ab	3.57±0.45^a
芳樟醇	19.78±0.35^a	18.84±0.47^b	15.76±0.62^c	16.44±0.49^c	13.77±0.52^d	15.61±0.48^c
（-）-4-萜品醇	n.d.	32.61±0.68^a	31.06±0.59^b	30.52±0.79^b	23.24±0.91^d	29.44±0.84^c
丙二醇	n.d.	10.14±0.35^b	10.36±0.28^b	10.57±0.41^b	13.01±0.39^a	12.93±0.42^a
烯烃
月桂烯	4.75±0.23^e	55.07±0.69^a	52.56±0.54^b	52.83±0.68^b	46.49±0.72^d	49.96±0.59^c
γ-松油烯	18.19±0.46^e	55.79±0.75^c	57.04±0.63^b	59.33±0.68^a	54.33±0.59^d	55.31±0.55^c
D-柠檬烯	12.79±0.22^d	50.75±0.48^c	53.97±0.57^a	54.45±0.62^a	53.13±0.59^ab	50.93±0.54^c
苯乙烯	10.28±0.19^f	141.97±0.73^e	149.88±0.78^d	184.90±1.08^c	238.77±1.89^b	245.76±1.93^a
β-石竹烯	95.73±0.69^a	41.30±0.46^c	41.84±0.52^c	43.63±0.56^b	38.75±0.47^d	33.45±0.38^e
α-律草烯	10.28±0.37^a	4.35±0.26^bc	3.67±0.27^c	4.70±0.32^b	4.74±0.35^b	4.01±0.29^bc
β-蒎烯	n.d.	6.52±0.18^a	6.79±0.21^a	6.93±0.26^a	6.41±0.17^a	6.34±0.16^a
烷烃
正己烷	7.12±0.19^c	7.98±0.16^ab	8.05±0.18^ab	8.26±0.13^a	8.61±0.25^a	7.85±0.10^ab
正十六烷	27.69±0.32^a	10.27±0.18^c	9.93±0.10^c	11.74±0.25^b	10.94±0.17^c	10.01±0.12^c
正十八烷	n.d.	11.59±0.28^a	9.94±0.19^c	10.32±0.21^b	9.47±0.19^c	8.50±0.14^d
正二十一烷	4.65±0.08^e	15.50±0.24^a	11.55±0.18^d	12.89±0.19^c	12.49±0.25^c	14.91±0.12^b
其他
茴香脑	224.68±0.92^a	113.02±0.32^d	106.57±0.52^e	108.96±0.67^e	129.57±0.43^c	161.91±0.63^b
D-樟脑	n.d.	100.86±0.63^a	96.17±0.62^c	97.44±0.59^b	94.37±0.52^d	93.67±0.35^de
异丙基苯	45.89±0.43^e	77.53±0.25^a	77.01±0.38^a	54.59±0.42^d	66.29±0.38^b	59.32±0.27^c
左旋龙脑	26.11±0.25^a	17.25±0.16^b	14.72±0.20^d	17.63±0.34^b	15.60±0.16^c	17.14±0.24^b
黄樟素	23.73±0.24^a	15.80±0.19^b	13.67±0.21^d	14.70±0.23^c	13.44±0.22^d	13.57±0.15^d
丁香酚	92.56±0.48^f	121.00±0.35^e	129.80±1.04^b	127.92±0.82^d	130.60±1.30^a	128.94±0.28^c
注：不同小写字母代表同一行的不同组的挥发性风味物质的含量存在显著性差异（P<0.05）；n.d.：未检测到。

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表 4 不同添加量蛋白酶对哈尔滨风干肠感官评价的影响

Table 4 Effect of different additions of proteases on the sensory evaluation of Harbin dry sausages

指标	S 0	S 0.5	S 1.0	S 1.5	S 2.0
色泽	5.75±0.16^a	5.69±0.14^ab	5.64±0.13^ab	5.47±0.12^b	4.97±0.22^c
嫩度	5.77±0.18^a	5.63±0.08^ab	5.25±0.17^c	5.05±0.16^cd	4.91±0.10^d
气味	4.81±0.13^c	5.13±0.11^b	5.50±0.14^a	5.25±0.12^b	5.39±0.09^ab
鲜味	4.60±0.15^d	4.90±0.09^c	5.59±0.11^a	5.44±0.15^a	5.32±0.12^ab
总体可接受度	4.64±0.07^e	5.13±0.06^d	6.10±0.15^a	5.50±0.17^b	5.37±0.16^c
注：不同小写字母代表不同处理组之间存在显著性差异（P<0.05）。

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参考文献(42)

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施引文献(9)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 哈尔滨风干肠的制作
1.2.2 pH、水分含量和水分活度的测定
1.2.3 色差的测定
1.2.4 剪切力测定
1.2.5 脂质氧化测定
1.2.6 SDS-PAGE的测定
1.2.7 TCA-可溶性肽含量的测定
1.2.8 游离氨基酸含量的测定
1.2.9 挥发性化合物的测定
1.2.10 感官评定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 不同添加量蛋白酶对风干肠pH、水分含量和水分活度值的影响
2.2 不同添加量蛋白酶对风干肠色泽的影响
2.3 不同添加量蛋白酶对风干肠剪切力的影响
2.4 不同添加量蛋白酶对风干肠脂质氧化的影响
2.5 不同添加量蛋白酶对风干肠蛋白降解的影响
2.5.1 SDS-PAGE
2.5.2 不同添加量蛋白酶对风干肠中TCA-可溶性肽含量的影响
2.5.3 不同添加量蛋白酶对风干肠中游离氨基酸的影响
2.6 不同添加量蛋白酶对风干肠中挥发性风味物质的影响
2.7 感官评定
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 哈尔滨风干肠的制作
1.2.2 pH、水分含量和水分活度的测定
1.2.3 色差的测定
1.2.4 剪切力测定
1.2.5 脂质氧化测定
1.2.6 SDS-PAGE的测定
1.2.7 TCA-可溶性肽含量的测定
1.2.8 游离氨基酸含量的测定
1.2.9 挥发性化合物的测定
1.2.10 感官评定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 不同添加量蛋白酶对风干肠pH、水分含量和水分活度值的影响
2.2 不同添加量蛋白酶对风干肠色泽的影响
2.3 不同添加量蛋白酶对风干肠剪切力的影响
2.4 不同添加量蛋白酶对风干肠脂质氧化的影响
2.5 不同添加量蛋白酶对风干肠蛋白降解的影响
2.5.1 SDS-PAGE
2.5.2 不同添加量蛋白酶对风干肠中TCA-可溶性肽含量的影响
2.5.3 不同添加量蛋白酶对风干肠中游离氨基酸的影响
2.6 不同添加量蛋白酶对风干肠中挥发性风味物质的影响
2.7 感官评定
3. 结论

参考文献(42)

施引文献

资源附件(1)

酿酒酵母L3蛋白酶对哈尔滨风干肠品质特性和风味的影响

作者简介: 刘新平（1999−），女，硕士研究生，研究方向：畜产品加工，E-mail：liuxinping330@163.com

通讯作者: 孙方达（1987−），男，博士，副教授，研究方向：畜产品加工，E-mail：sunfangda@neau.edu.cn。 孔保华（1963−），女，博士，教授，研究方向：畜产品加工，E-mail：kongbh@163.com。

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