Synthesis and Antioxidant Activity of Selenized Apigenin
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摘要: 本研究以亚硒酸钠为硒化剂，黄酮类化合物芹菜素（Apigenin，AP）为底物制备硒化芹菜素（Selenated Apigenin，Se-AP）。通过多种分析技术对Se-AP进行结构表征并推测其可能出现的配位结构。由结构表征分析结果可知，硒化修饰后AP在不改变黄酮母环主体结构的基础上形成新的Se-O、C-O-Se化学键，Se元素在Se-AP中均匀分布，并得出Se-AP可能存在的1种配位结构，由原子荧光光谱法测得Se-AP中硒含量约为1.91%±0.11%。设计ABTS+、DPPH、OH自由基清除实验研究硒化前后AP的抗氧化活性。由抗氧化活性实验结果可知，Se-AP在400 mg/L时对ABTS+自由基的清除率为93.82%±0.63%，在800 mg/L时对DPPH、OH自由基的清除率分别为39.53%±0.67%、96.54%±0.77%。硒化修饰后AP对DPPH自由基的清除能力略有增强，对ABTS+、OH自由基的清除能力明显提高（IC50分别为53.52±1.85 mg/L、11.33±0.64 mg/L），在800 mg/L时与同浓度下VC清除能力相当。因此说明硒化修饰后AP抗氧化活性提高，生物活性增强，可为硒化黄酮相关食品、药物的研发利用提供新途径。Abstract: Selenized apigenin (Se-AP) synthesized using sodium selenite employed as a highly reactive selenide reagent and the flavonoid apigenin (AP) as a substrate was investigated in this paper. Followed by a series of analytical techniques were used to characterize structure of Se-AP and extrapolate the possible coordination structures in Se-AP. Se content of Se-AP was measured from the fluorescent spectrophotometry to be about 1.91%±0.11%. Based on the results of structural characterization analysis, there could be concluded that new Se-O and C-O-Se bonds were formed without altering the main structure of the flavonoid backbone in selenized apigenin. The Se elements were evenly distributed in Se-AP, and one possible coordination structure of Se-AP was inferred. In addition, the antioxidant activity of AP and Se-AP was investigated by designing ABTS+, DPPH, and OH radical scavenging experiments. The in vitro antioxidant results suggested that Se-AP exhibited a clearance rate of 93.82%±0.63% for ABTS+ radicals at a concentration of 400 mg/L, 39.53%±0.67% for DPPH radicals and 96.54%±0.77% for OH radicals at a concentration of 800 mg/L and the ability of scavenging DPPH free radicals was slightly enhanced, while the scavenging ability of ABTS+ and OH radicals was significantly increased (IC50 was 53.52±1.85 mg/L and 11.33±0.64 mg/L), and the scavenging ability was comparable to that of VC at 800 mg/L at the same concentration for Se-AP. Therefore, the present data indicated that selenylation modification of AP could increase the antioxidant activity and enhance the biological activity, which could offer the possibility of the development and utilization of selenized flavonoid-related foods and drugs.
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Keywords:
- flavonoids /
- apigenin /
- selenated apigenin /
- coordination structure /
- antioxidant activity
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随着人口老龄化程度不断加深，延缓衰老已经成为当今社会极为关注的健康问题[1]。由自由基引起的氧化应激是导致衰老的主要因素，虽然人体自身具有一套由超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、维生素以及部分微量元素（如锌和硒等元素）构成的抗氧化防御系统可以清除自由基和脂质过氧化物[2−3]。但是人体在生长发育成熟后，各组织器官开始逐步退化，抗氧化防御能力下降，导致体内自由基的产生与抗氧化系统失衡，造成机体细胞和组织的氧化损伤[4−6]。因此开发健康、安全和副作用小的抗氧化剂十分必要。
研究表明，黄酮类化合物作为天然产物的活性成分，具有良好的抗氧化作用[7]。目前以黄酮类化合物为主要成分的抗衰老产品也日益增多，如花青素口服液和绿茶儿茶素含片等[8−9]，但纯天然黄酮类化合物的抗氧化活性仍存有巨大的潜在提升空间。硒（Selenium，Se）作为人体和动物所必需微量元素，参与机体抗氧化防御系统的构成，具有抗氧化、维护机体免疫功能、抗癌、抗菌、抗炎等多种功效[10−13]，研究报道称黄酮类化合物被硒化修饰以后具有更低的硒毒性和更强的抗氧化活性[14]。余香[15]制备的槲皮素硒配合物在DPPH自由基清除及含有槲皮素硒配合物的护肤霜中表现出良好的抗氧化性；黄九林等[16]合成大黄素-硒（Ⅳ）配合物，并证实其抗氧化活性相对于大黄素有显著提高，大黄素与硒之间存在协同抗氧化作用；张莉萍等[17]制备了橙皮素硒配合物，并采用超氧阴离子自由基（O2−·）清除法测定橙皮素及其配合物对O2−·的清除能力，结果显示橙皮素硒配合物对O2−·的清除能力大于橙皮素，表现出良好的抗氧化活性。由此推断，硒化黄酮的优异生物活性既来自黄酮与硒本身，也来自二者形成配合物后的独特结构。因此，对黄酮类化合物进行硒化修饰成为新的研究热点。
芹菜素是一种在食品和制药行业备受关注的黄酮类化合物，广泛分布于水果、蔬菜和某些草本植物中，如葡萄柚、橙子、欧芹、芹菜、洋葱、甘菊和小麦芽等[18−19]。研究表明，芹菜素具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和抗病毒等多种生物活性，是一种天然低毒的活性物质[20−22]。为进一步开发出优异的抗氧化、抗衰老产品，本研究以芹菜素为底物，亚硒酸钠为硒化剂对其进行硒化修饰，制得硒化芹菜素。由多种分析技术进行结构表征并推测其可能出现的结构，通过ABTS+、DPPH、OH自由基清除实验研究硒化后芹菜素的抗氧化能力，最终得到抗氧化能力更强的天然抗氧化物的衍生物，为相关食品、保健药物等研发提供新的途径和科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
芹菜素 纯度98%，购于肽爱生物科技（西安）有限公司；亚硒酸钠、无水乙醇、抗坏血酸（Vitamin C，VC）、二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO） 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸、硼氢化钠、硝酸、铁氰化钾、溴化钾 分析纯，国药集团化学有限公司；水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢（质量分数为30%）、2,2-联苯基-1-1苦基肼（1 Dint 1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH，96%）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）t，ABTS）、过硫酸钾 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。
Multiskan FC型酶标仪 Thermo Fisher Scientific公司；Nicolet Avatar 370型傅里叶红外光谱分析仪 Thermo Fisher Scientific 公司；TU－1901型紫外－可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Quanta FEG 250型扫描电子显微镜 Thermo Fisher Scientific 公司；Element型能谱分析仪 EDAX公司；XRD-7000型X射线衍射仪 日本岛津公司；TG/DTA 6300型热重差热综合分析仪 SII 纳米有限公司；AFS-230型原子荧光光度计 北京海光仪器有限公司；H2050R型高速冷冻离心机 上海坤诚科学仪器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 硒化芹菜素的制备
参照赵鸣飞[23]的研究方法，并稍加修改制备硒化芹菜素（Selenated Apigenin，Se-AP）。取芹菜素（Apigenin，AP）1.5 g置于100 mL圆底烧瓶中，加入30 mL DMSO将其溶解，再加入0.5 g Na2SeO3，搅拌至完全溶解，保护于N2气氛下，水浴60 ℃反应8 h。反应完成后用蒸馏水将样品析出，10000 r/min离心5 min得淡黄色固体，蒸馏水和无水乙醇各洗涤3次，65 ℃真空干燥12 h，备用。
1.2.2 硒含量的测定
1.2.2.1 硒标准溶液的配制
根据文献[24]中所述方法配制1000 μg/L硒标准溶液，将其稀释成0、4、8、12、16、20、30 μg/L系列浓度的硒标准溶液，检测其荧光强度。
1.2.2.2 Se-AP硒含量的测定
根据文献[24]中所述方法稍加修改。精确称取干燥的Se-AP样品0.5 g于专用的微波消解罐，依次加入4 mL硝酸、2 mL过氧化氢，然后用4 mL纯水冲洗罐壁，充分摇晃使罐内样品混合均匀，置于微波消解仪中消化。消解反应结束后，将消解液转移至烧杯中，加热至近干。冷却后加入10 mL盐酸，继续加热使其沸腾5 min，完成Se6+到Se4+的转变。再次冷却之后，加1 mL铁氰化钾溶液，用水稀释至25 mL，用硼氢化钠做还原剂，检测其荧光强度。
1.2.3 硒化芹菜素的结构表征
1.2.3.1 紫外光谱分析（UV-Vis）
配制0.2 mg/mL的AP、Se-AP溶液，于紫外可见分光光度计200~500 nm进行全波长扫描。
1.2.3.2 红外光谱分析（FTIR）
按照质量比1:100称取适量AP、AP-Se和溴化钾于玛瑙研钵中充分研磨，经压片处理后通过傅里叶红外光谱仪进行红外光谱分析。
1.2.3.3 扫描电子显微镜（SEM）
取适量干燥Se-AP在真空条件下进行喷金处理，通过SEM观察其微观形貌并配合能谱仪（EDS）对其进行元素分析。
1.2.3.4 核磁共振分析（NMR）
取适量AP、Se-AP溶于DMSO-d6中，通过核磁共振取得样品1H-NMR、13C-NMR谱图对其进行结构分析。
1.2.3.5 X射线衍射仪（XRD）
取适量AP、Se-AP、Na2SeO3、AP和Na2SeO3混合物于X射线衍射仪样品盘中，扫描速度8°/min条件下采集2°~80°（2θ）的数据用于实验分析。
1.2.3.6 热重分析（TG）
取适量AP、Se-AP样品于陶瓷坩埚中，在氮气气氛中进行检测。检测条件为氮气流速100 mL/min；温度扫描范围35~600 ℃；升温及降温速率10 ℃/min。
1.2.4 体外抗氧化活性实验
1.2.4.1 Se-AP对ABTS+·的清除能力
参照温启华等[25]的研究方法并稍加修改，配制ABTS工作液，将7.4 mmol/L的ABTS溶液与2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液按照体积比1:1混合，室温下避光静置12 h。取2 mL混合溶液加纯水稀释约20倍，在734 nm波长处吸光度稳定在0.68~0.72范围内，即为ABTS工作液。配制质量浓度为25、50、100、200、400 mg/L的AP、Se-AP、溶液，取不同浓度的AP、Se-AP、VC溶液各50 μL加入96孔板中，每孔再加入100 µL ABTS工作液，混合均匀并于室温下静置8 min，用酶标仪在734 nm的紫外吸收波长下对待测溶液进行测定。按照公式（1）计算AP、Se-AP和VC对ABTS+·的清除能力。
ABTS+⋅清除率(\%)=(1−A11−A21A01)×100 (1) 式中：A11为AP、Se-AP和VC与ABTS工作液混合的吸光度值；A21为AP、Se-AP和VC与无水乙醇混合的吸光度值；A01为纯水与ABTS工作液混合的吸光度值。
1.2.4.2 Se-AP对DPPH·的清除能力
参照黄瑜等[26]的研究方法并稍加修改配制DPPH乙醇溶液。称取适量DPPH粉末溶于无水乙醇，配制成0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液。配制质量浓度为50、100、200、400、800 mg/L的AP、Se-AP、VC溶液。取不同浓度的AP、Se-AP、VC溶液各100 μL加入96孔板中，每孔再加入100 µL DPPH乙醇溶液，混合均匀并于室温下静置30 min，用酶标仪在517 nm的紫外吸收波长下对待测溶液进行测定。按照公式（2）计算AP、Se-AP和VC对DPPH·的清除能力。
DPPH⋅清除率(\%)=(1−A12−A22A02)×100 (2) 式中：A12为AP、Se-AP和VC与DPPH乙醇溶液混合的吸光度值；A22为AP、Se-AP和VC与纯水混合的吸光度值；A02为纯水与DPPH乙醇溶液混合的吸光度值。
1.2.4.3 Se-AP对·OH的清除能力
参照秦毅臻等[27]的研究方法并稍加修改，依次配制硫酸亚铁溶液（6 mmol/L）、过氧化氢溶液（6 mmol/L）和水杨酸乙醇溶液（6 mmol/L）。配制质量浓度为50、100、200、400、800 mg/L的AP、Se-AP、VC溶液。在96孔板中加入不同浓度AP、Se-AP和VC溶液各50 µL，再依次加入50 µL 硫酸亚铁溶液、过氧化氢溶液混合均匀并在室温下静置10 min，最后再每孔加入50 µL水杨酸乙醇溶液，用酶标仪37 ℃孵育30 min，在510 nm的紫外吸收波长下对待测溶液进行测定。按照公式（3）计算AP、Se-AP和VC对·OH的清除能力。
⋅OH清除率(\%)=(1−A13−A23A03)×100 (3) 式中：A13为AP、Se-AP和VC与水杨酸乙醇溶液、硫酸亚铁溶液和过氧化氢溶液混合的吸光度值；A23为AP、Se-AP和VC与纯水、硫酸亚铁溶液和过氧化氢溶液混合的吸光度值；A03为纯水与水杨酸乙醇溶液、硫酸亚铁溶液和过氧化氢溶液混合的吸光度值。
1.3 数据处理
实验数据使用WPS Office Excel记录，表示为3次独立重复实验结果的平均值±标准差。数据使用Origin 2021软件绘图，核磁共振数据和绘图使用MestReNova软件处理。
2. 结果与分析
2.1 硒含量测定结果
按照1.2.2.1中所述方法检测各质量浓度硒标准溶液的荧光强度，以质量浓度为横坐标X，荧光强度为纵坐标Y，绘制硒的标准曲线，得到硒含量标准曲线方程为Y=237.236X−38.814，R2=0.9994；将1.2.2.2中检测结果代入上述方程计算得Se-AP的硒含量为1.91%±0.11%。
2.2 UV-Vis分析
图1（a）为AP和Se-AP的紫外吸收光谱图。AP在269 nm和335 nm处的两个吸收峰分别属于黄酮类化合物在紫外吸收光谱中的两个特征吸收带，即黄酮母环中A环对应的Band Ⅱ（240~280 nm）和B环对应的Band Ⅰ（300~400 nm）[28]。Se-AP在Band Ⅱ的吸收峰与AP无明显差异，但在Band Ⅰ的吸收峰由335 nm移至345 nm，说明Se-AP仍保留黄酮类化合物的母环结构且可能B环上羟基参与配位并引起Band Ⅰ产生红移[29]。
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图 1 AP、Se-AP的紫外可见吸收光谱图（a）和红外光谱图（b）Figure 1. UV spectrogram (a) and FTIR spectrogram (b) of AP and Se-AP2.3 FTIR分析
为探究硒化修饰前后AP分子间的相互作用，对AP和Se-AP进行红外光谱分析，结果如图1（b）所示。图中AP在3425.12 cm−1、1650.72 cm−1、1558.27 cm−1和1180.28 cm−1处的特征吸收峰分别由O-H、C=O、C=C和C-O-C的伸缩振动引起的，与LIU等[30]报道结果一致。Se-AP中O-H、C=O、C=C和C-O-C的特征吸收峰位置与AP一一对应，整体相比AP在硒化修饰前后特征吸收峰位移差距微小，说明在硒化修饰后AP的苯环依旧存在，黄酮母环骨架未变。Se-AP在806.14 cm−1、694.28 cm−1出现新的特征吸收峰，其中806.14 cm−1处的吸收峰为Se-O的特征吸收峰，694.28 cm−1处的吸收峰为C-O-Se的特征吸收峰[31]。上述结果说明AP硒化修饰成功，硒以亚硒酸酯的形式与AP黄酮母环上的羟基结合。
2.4 SEM-EDS分析
为探究Se-AP的固态形貌，因此采用SEM和EDS对其进行分析，结果如图2所示。从图2（a）、图2（b）中可以看出Se-AP呈现出不规则片状，且积压成块状结构。AP的主体结构主要由C元素和O元素构成，硒化修饰后则有Se元素引入，图2（c）所示为Se-AP中C、O、Se三种元素总体分布图，其中图2（d）为C元素的分布情况，含量为78.58%；图2（e）为O元素的分布情况，含量为19.35%；图2（f）为Se元素的分布情况，含量为2.07%，与2.1中硒含量测定结果接近，且从图中可以看出Se元素在Se-AP中均匀分布，进而初步推断AP完成硒化，形成Se-AP。
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图 2 Se-AP中的元素分布和扫描电镜图注：（a）、（b）放大倍数分别为50000倍、10000倍；（c）为C（红色）、O（黄色）、Se（绿色）三种元素在Se-AP中的整体分布；（d）、（e）、（f）分别为C、O、Se三种元素分布在Se-AP中的独立视角。Figure 2. Elemental distribution and SEM maps of Se-AP2.5 NMR分析
从图3（a）AP的1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）可知δ10.79和δ10.42为5-OH和7-OH的信号峰；δ6.20和δ6.49分别为8-H和6-H的相互耦合信号峰，δ6.94和δ7.94为2’-H和3’-H的相互耦合信号峰；未观察到4’-H位的信号峰，从图3（b）Se-AP的1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）可知，δ6.09和δ6.37分别为8-H和6-H的相互耦合信号峰，δ6.92和δ7.89为2’-H和3’-H的相互耦合信号峰，未观察到黄酮母核中其他位置的羟基信号峰，根据以上信息可以推断，硒化并未破坏黄酮的基本母核，与FTIR分析结果一致。对比硒化前后AP的1H NMR谱图可以初步推断，硒化后的AP不存在原有的5-OH和7-OH，即硒活性基团可能取代修饰AP中的羟基生成硒化AP。
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图 3 AP、Se-AP的1H NMR谱图（a）、（b）和13C NMR谱图（c）、（d）Figure 3. 1H NMR spectra (a), (b) and 13C NMR spectra (c), (d) of AP, Se-AP从图3（c）AP的13CNMR（600 MHz，DMSO-d6）可知，δ181.80为4-C信号峰，δ164.19、163.78、161.50、161.22分别为2-C、7-C、4’-C、9-C信号峰，δ157.36为5-C信号峰，δ128.52为6’-C、2’-C信号峰，δ121.22为1’-C信号峰，δ116.00为5’-C、3’-C信号峰，δ103.74为8-C信号峰，δ102.88为3-C信号峰，δ98.88为10-C信号峰，δ94.01为6-C信号峰，与MA等[32]报道基本一致。从图3（d）Se-AP的13C NMR（600 MHz，DMSO-d6）可知，δ181.80为4-C信号峰，δ167.93、163.82、162.28、161.89分别为2-C、7-C、4’-C、9-C信号峰，δ158.07为5-C信号峰，δ128.82为6’-C、2’-C信号峰，δ121.37为1’-C信号峰，δ116.63为5’-C、3’-C信号峰，δ103.02 为8-C信号峰，δ102.92为3-C 信号峰，δ100.10为10-C信号峰，δ94.91为6-C信号峰。
结合上述表征分析，推测Se-AP结构如图4所示。Se4+与AP的O2−可形成d-p配键，根据配位场和晶体场理论分析，Se4+与AP可能形成八面体的六配位络合物（图4）[33]。
2.6 XRD分析
对AP、Se-AP、Na2SeO3以及AP和Na2SeO3的混合物进行X射线衍射分析，所得结果如图5（a）所示。图中Na2SeO3各个峰位的晶体衍射峰均与其标准卡片（JCPDS No. 32-1153）一致。AP在2θ=7.12°、10.06°、11.44°、15.53°、25.18°、26.16°、26.70°、27.13°、28.52°处具有强烈的晶体衍射峰，与POUREINI等[18]报道一致，说明AP具有高结晶性。Se-AP在2θ=7.00°、9.82°、11.10°、14.12°、15.80°、17.92°、23.84°、24.93°、26.21°、27.12°、28.48°、41.32°具有强烈的晶体衍射峰，因此硒化后AP同样具有高结晶性。AP和Na2SeO3的混合物的晶体衍射峰中包含AP、Na2SeO3的特征晶体衍射峰，且明显不属于Se-AP的晶体衍射峰，由此推断出Se-AP是由化学反应得到的产物而不是物理混合物。
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图 5 AP、Se-AP的XRD图和TG-DTG图注：（a）：Na2SeO3、Se-AP、AP与Na2SeO3混合物和AP的XRD图；（b）：AP、Se-AP的TG曲线；（c）：AP、Se-AP的DTG曲线。Figure 5. XRD spectra and TG-DTG spectra of AP, Se-AP2.7 TG分析
通过热重分析法对AP和Se-AP的热稳定性进行探究，结果反映为TG曲线和失重速率（DTG）曲线，如图5（b）、图5（c）所示。从图中可以看出AP和Se-AP的TG曲线和DTG曲线具有明显差异，在图5（b）中显示，AP在35~600 ℃有两个主要失重阶段。在35~205 ℃为第一阶段，失重率为3.76%，此阶段失去的主要是AP中的结晶水；在205~358 ℃为第二阶段，失重率为13.63%，此阶段为AP的燃烧迅速分解阶段[34]。
Se-AP在35~600 ℃有三个主要失重阶段，在65 ℃内，失重率为9.89%，此阶段失去的主要是分子外的吸附水；在65~300 ℃为第二阶段，失重率为7.81%，此阶段失去的主要是分子内的结晶水；在300~428 ℃为第三阶段，Se-AP在此阶段迅速燃烧分解，失重率为23.34%。结合图5（c）可知，在35~600 ℃温度范围内AP和Se-AP的分解失重温度分别为351 ℃、335 ℃，Se-AP相较于AP热稳定性略微降低，推测是由于AP硒化反应后其黄酮母环以及与Se结合位置同时热分解所致[35]。
2.8 抗氧化活性
2.8.1 ABTS+·的清除能力
ABTS+通过与氧化物过硫酸钾反应生成ABTS+·使反应体系呈绿色，当抗氧化剂加入后与ABTS+·反应使体系逐渐褪至无色，吸光度随之降低，进而反应抗氧化剂对ABTS+·的清除能力[36]。Se-AP、AP和VC对ABTS+·的清除能力如图6（a）所示。图中在25~400 mg/L浓度范围内AP（IC50=329.11±25.57 mg/L）和Se-AP（IC50=53.52±1.85 mg/L）对ABTS+·均具有良好的清除能力且随浓度的增加而增加，呈现出一定的量效关系。在该浓度范围内Se-AP的清除能力始终优于AP，Se-AP在400 mg/L浓度时清除能力最强，清除率达93.82%±0.63%，与VC清除能力接近。相同浓度下，AP的清除率仅为54.32%±0.58%。ABTS+·的清除能力是评价黄酮类化合物抗氧化能力的重要指标，在一定浓度范围内Se-AP与AP相比ABTS+·清除率明显提高，说明硒基的加入可以提高AP的抗氧化能力。
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图 6 Se-AP、AP和VC对ABTS+·（a）、DPPH·（b）以及·OH的清除能力（c）Figure 6. Scavenging ability of Se-AP, AP and VC to ABTS+ radical (a), DPPH radical (b), OH radical (c)2.8.2 DPPH·的清除能力
DPPH·是一种具有单电子结构的稳定自由基，当抗氧化剂加入与其单电子完成配对，DPPH·的自由基性质将不成立，即被清除，表示为抗氧化剂对DPPH·的清除能力[37]。Se-AP、AP和VC对DPPH·的清除能力图6（b）所示。图中在50~800 mg/L浓度范围内Se-AP和AP对DPPH·的清除能力随浓度增大而增强且Se-AP的清除能力大于AP，表明硒化反应后有利于DPPH·上孤电子配对，使DPPH·被清除。但两者在此浓度范围内清除率增长幅度均较小，均未达50%，无法计算IC50值，且与VC相比清除能力较弱。
2.8.3 ·OH的清除能力
硫酸亚铁溶液中Fe2+与H2O2反应生成·OH，水杨酸与其反应产生在510 nm波长处有强吸收的紫色物质，当抗氧化剂加入时，·OH被清除，紫色物质减少且溶液吸光度降低[38]。Se-AP、AP和VC对·OH的清除能力如图6（c）所示。图中Se-AP和AP对·OH的清除能力在50~800 mg/L随浓度增加清除能力均呈上升趋势，且Se-AP（IC50=11.33±0.64 mg/L）的清除能力在此浓度范围内较强于AP（IC50=63.87±4.29 mg/L），二者在浓度800 mg/L时清除能力达到最强，清除率分别为96.54%±0.77%、78.57%±0.80%，Se-AP浓度在800 mg/L时清除能力与VC相当。综上表明硒化后AP因共轭效应降低·OH的电荷密度，稳定性增加，对·OH的清除能力增强，抗氧化能力提高。
3. 讨论与结论
为探究硒化修饰对增强天然产物生物活性的影响，本研究以亚硒酸钠为硒化剂，对黄酮类化合物AP进行硒化修饰得到Se-AP。运用原子荧光光谱法测得Se-AP中的硒含量为1.91%±0.11%；UV-Vis、FTIR分析结果显示，硒化修饰后AP在不改变黄酮母环主体结构的基础上形成新的Se-O、C-O-Se化学键；EDS分析结果显示，硒元素含量为2.07%，在Se-AP中均匀分布；由NMR分析结果推测出Se-AP存在六配位八面体型两种配位结构。由抗氧化活性实验结果可知，AP和Se-AP对ABTS+、DPPH和OH自由基的清除能力存在量效关系，浓度越大清除能力越强。Se-AP在400 mg/L时对ABTS+自由基的清除率高达93.82%±0.63%，在800 mg/L时对DPPH自由基的清除率为39.53%±0.67%，对OH自由基的清除率高达96.54%±0.77%。硒化修饰后AP对三种自由基的清除能力均有所提高，其中对DPPH自由基的清除能力略有增强，而对ABTS+、OH自由基的清除能力则有明显提高，两者在800 mg/L时与同浓度下VC清除能力相当。
黄酮类化合物具有易与金属离子形成配合物的π键共轭体系和强配位氧原子[11]，李海霞等[39]合成了[Co L2]和[Zn L2]两种芹菜素席夫碱金属配合物，对其抗氧化活性进行探究，结果表明AP与两者清除·OH的IC50分别880.65±46.52 mg/L、517.12±16.36 mg/L、633.62±18.95 mg/L。多糖与黄酮类化合物同为天然产物中的主要活性成分，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等生物活性[40]。SHAO等[41]对蓝靛果多糖进行硒化修饰得到PSLP-1、PSLP-2两种硒化多糖，其抗氧化活性实验结果显示，两者在50~400 mg/L浓度范围内，对ABTS+·的最大清除率分别为28.85%±0.68%、39.37%±0.84%，未达到50%。本研究中AP、Se-AP对·OH清除的IC50为63.87±4.29 mg/L、11.33±0.64 mg/L；在50~400 mg/L浓度范围内对ABTS+·的清除率最高达93.82%±0.63%。上述结果说明硒化修饰后AP的抗氧化活性提高，生物活性增强；并且通过与黄酮类化合物金属配合物和硒化修饰多糖类天然产物活性成分相比，硒化修饰能够增强黄酮类化合物的生物活性。为探究硒化修饰对增强黄酮类化合物的生物活性提供科学依据，为硒资源的有效利用以及含有黄酮类化合物的相关食品和药物的研发提供新的思路和途径。
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图 1 AP、Se-AP的紫外可见吸收光谱图（a）和红外光谱图（b）
Figure 1. UV spectrogram (a) and FTIR spectrogram (b) of AP and Se-AP
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图 2 Se-AP中的元素分布和扫描电镜图
注：（a）、（b）放大倍数分别为50000倍、10000倍；（c）为C（红色）、O（黄色）、Se（绿色）三种元素在Se-AP中的整体分布；（d）、（e）、（f）分别为C、O、Se三种元素分布在Se-AP中的独立视角。
Figure 2. Elemental distribution and SEM maps of Se-AP
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图 3 AP、Se-AP的1H NMR谱图（a）、（b）和13C NMR谱图（c）、（d）
Figure 3. 1H NMR spectra (a), (b) and 13C NMR spectra (c), (d) of AP, Se-AP
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图 5 AP、Se-AP的XRD图和TG-DTG图
注：（a）：Na2SeO3、Se-AP、AP与Na2SeO3混合物和AP的XRD图；（b）：AP、Se-AP的TG曲线；（c）：AP、Se-AP的DTG曲线。
Figure 5. XRD spectra and TG-DTG spectra of AP, Se-AP
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