Effect of Casein on Digestion and Absorption Characteristics of 5-Methyltetrahydrofolate
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摘要: 本研究以5-甲基四氢叶酸和酪蛋白为研究对象，在体外消化模型中以粒径、Zeta电位、生物可及性和微观结构为测定指标，探究不同条件下酪蛋白对5-甲基四氢叶酸消化特性的影响；同时利用大鼠药代动力学方法研究不同剂量酪蛋白对5-甲基四氢叶酸吸收动力学的影响。结果表明，在体外消化过程中，酪蛋白浓度为3%、酪蛋白经均质处理、肠道pH为6、消化时间为5 h时，酪蛋白对5-甲基四氢叶酸的粒径、Zeta电位及生物可及性影响最显著（P<0.05）。与5-甲基四氢叶酸对照组相比，粒径减小至436.00~1465.33 nm，电位绝对值增大至18.58~30.64 mV，生物可及性提升至55.96%~87.06%。微观结构表明，酪蛋白可以与5-甲基四氢叶酸结合，减少5-甲基四氢叶酸在胃肠道降解，保证其更有效地运输至肠道。在体内吸收过程中，低、中、高剂量组酪蛋白均显著提高5-甲基四氢叶酸的生物利用度（P<0.05），为43.18%，50.21%，60.24%。综上，酪蛋白对5-甲基四氢叶酸的消化和吸收有促进作用。该研究可为5-甲基四氢叶酸在乳制品的应用奠定理论基础。Abstract: In this study, 5-methyltetrahydrofolate and casein were selected as the research objects. In an in vitro digestion model, particle size, Zeta potential, bioaccessibility, and microstructure were measured to explore the influence of casein under different conditions on the digestion characteristics of 5-methyltetrahydrofolate. Meanwhile, using a rat pharmacokinetic method, the impact of different doses of casein on the absorption kinetics of 5-methyltetrahydrofolate was investigated. The results showed that during in vitro digestion, when the concentration of casein was 3%, casein was homogenized, intestinal pH was 6, and digestion time was 5 hours, the most significant effects of casein on the particle size, Zeta potential, and bioaccessibility of 5-methyltetrahydrofolate were observed (P<0.05). Compared with the 5-methyltetrahydrofolate control group, the particle size decreased to 436.00~1465.33 nm, the absolute value of zeta potential increased to 18.58~30.64 mV, and the bioaccessibility increased to 55.96%~87.06%. The microstructure suggested that casein could bind with 5-methyltetrahydrofolate, reduce its degradation in the gastrointestinal tract, and ensure its more efficient transportation to the intestine. During in vivo absorption, the low, medium, and high dose groups of casein significantly increased the bioavailability of 5-methyltetrahydrofolate (P<0.05), with 43.18%, 50.21%, 60.24%. In conclusion, casein promotes the digestion and absorption of 5-methyltetrahydrofolate. This study provides a theoretical basis for the application of 5-methyltetrahydrofolate in dairy products.
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Keywords:
- 5-methyltetrahydrofolate /
- casein /
- in vitro digestion /
- in vivo absorption
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叶酸是一种水溶性B族维生素，在核苷酸合成、氨基酸相互转化以及单碳转移中发挥重要作用[1]。研究发现饮食中叶酸摄入量低于标准值，需要补充叶酸强化食品。国标中允许添加叶酸营养强化剂的形式大部分是合成叶酸[2]，但合成叶酸必须通过肠粘膜和肝脏中的还原酶转化为其活性形式，才能被人体吸收利用[3]。而天然叶酸——5-甲基四氢叶酸（5-methyltetrahydrofolate，5-MTHF）作为叶酸的活性形式，不受叶酸代谢酶转化的影响，可以直接被各类人群吸收，因此5-MTHF是机体良好的叶酸补充来源。5-MTHF在消化吸收过程中生物可及性和生物利用度不仅易受氧气、温度、胃肠pH等因素的影响[4−5]，同时也会受到食物基质（蛋白质[6]、淀粉[7]、维生素[8]）的影响。目前，有关蛋白质对5-MTHF消化吸收的影响主要集中在牛乳中叶酸结合蛋白的研究[9−10]。但其他重要乳蛋白对5-MTHF的消化吸收特性的影响尚未见报道。
酪蛋白（Casein，CN）是乳蛋白中的主要组成部分，占乳蛋白的80%左右，具有生物相容性和生物可降解性。基于其多孔结构和易消化的特点，酪蛋白对小分子物质（黄酮类化合物、维生素、多酚等）的生物可及性、生物利用度会产生积极或消极的影响[11−14]。而酪蛋白对叶酸消化和吸收影响的研究只集中在合成叶酸方面，Penalva等[15]研究酪蛋白纳米颗粒对合成叶酸的消化吸收特性影响时，发现酪蛋白纳米颗粒可充当胃耐受装置，减少合成叶酸在胃消化阶段的降解，提高其体外释放能力，进一步提高其生物利用度17%。但目前有关酪蛋白如何影响5-MTHF的消化和吸收特性并不明确。
近年来，5-MTHF被国家批准作为营养强化剂应用的范围较小，只在调制乳、果蔬（肉）汁饮料、即食谷物及特殊医学用途配方类食品中添加[16]，这预示着5-MTHF未来可能被允许应用于更多乳制品或其他食品中。因此，明确乳制品中的酪蛋白对5-MTHF消化和吸收的影响对于5-MTHF广泛应用于乳制品及其他食品是必要且有意义的。基于此，本文利用体外消化模型，研究酪蛋白在不同条件下（酪蛋白浓度、酪蛋白加工方式、胃肠pH、胃肠消化时间）对5-MTHF消化特性的影响；同时利用大鼠药代动力学方法，从吸收动力学层面探究酪蛋白对5-MTHF吸收特性的影响，为5-MTHF在配方乳粉及其他乳制品中的应用奠定理论基础和提供指导。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
SPF级SD大鼠 雄性60只，6周龄，体重220~240 g，均由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物使用许可证号：[SCXK（川）2020-0030]，于湿度40%~50%，温度20~24 ℃的环境下饲养；酪蛋白酸钠（蛋白质量分数为90.1%）、5-甲基四氢叶酸（纯度≥97%） 上海雅培贸易有限公司；5-甲基四氢叶酸标准品（纯度≥99.8%） 上海安谱璀世标准技术服务有限公司；乙腈（色谱纯） 上海阿拉丁科技有限公司；其余试剂 均为国产分析纯。
Malvern型纳米粒度及Zeta电位分析仪 马尔文帕纳科技有限公司；1260Ⅱ Prime型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；FV3000型激光共聚焦显微镜 日本奥林巴斯公司；三重四级杆液质联用仪 美国Waters公司。
1.2 实验方法
1.2.1 CN与5-MTHF复合溶液的制备
1.2.1.1 不同浓度CN的复合溶液制备
称取不同质量的CN溶于磷酸盐缓冲溶液PBS（pH7.0，0.01 mol/L），磁力搅拌2 h，配制成浓度为0.5%、1%、2%、3%、4%的CN溶液，置于4 ℃冰箱过夜。取0.0027 g的5-MTHF加入CN溶液，配制5-MTHF和CN复合溶液（5-MTHF+CN），其中，5-MTHF浓度为0.27 μg/mL，将复合溶液磁力搅拌30 min后，用于后续体外消化试验。5-MTHF的添加浓度根据国标GB 29922-2013中使用范围确定[17]。
1.2.1.2 不同加工处理CN的复合溶液制备
称取一定质量的CN溶于磷酸盐缓冲溶液PBS，磁力搅拌2 h，分别进行超声处理（150 W，10 min，温度控制在4 ℃）[18]、均质处理（100 MPa，1个循环）[19]、加热处理（60 ℃，30 min）[20]，4 ℃下过夜，得到不同加工方式处理的CN溶液。将5-MTHF与处理后的CN混合，使5-MTHF浓度为0.27 μg/mL，CN浓度为3%。磁力搅拌30 min后，用于后续体外消化试验。
1.2.2 体外消化模型的建立
参考Minekus等[21]的体外模拟方法，建立唾液（SSF）、胃液（SGF）、肠液（SIF）模拟体系。模拟唾液、模拟胃液、模拟肠液由相应的电解质原液、酶、CaCl2和水组成，其中电解质原液具体配制见表1。
表 1 SSF、SGF和SIF电解液的配制Table 1. Preparation of SSF, SGF and SIF electrolyte组成 浓度
（mol/L）体积（mL） SSF电解液pH=7 SGF电解液pH=1.5 SIF电解液pH=7 KCl 0.5 15.1 6.9 6.8 KH2PO4 0.5 3.7 0.9 0.8 NaHCO3 1 6.8 12.5 42.5 NaCl 2 − 11.8 9.6 MgCl2·6H2O 0.15 0.5 0.4 1.1 （NH4）2CO3 0.5 0.06 0.5 − HCl 6 0.09 1.3 0.7 蒸馏水 − 定容至500 mL 定容至500 mL 定容至500 mL 取5-MTHF+CN复合溶液10 mL与7 mL SSF、1 mL的α-淀粉酶（1500 U/mL）、50 μL的CaCl2（0.3 mol/L）、1.95 mL的水混合，并于37 ℃、85 r/min温育5 min，置于冰水浴10 min。按照体积比1:1的比例向模拟口腔消化后的样品中加入SGF，调节pH为1.5。之后加入胃蛋白酶，使其最终浓度为2000 U/mL；在37 ℃、85 r/min温育2 h，置于冰水浴10 min。最后将胃消化产物与SIF以体积比为1:1的比例相混合，设置不同肠道pH，分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；加入胰酶和胆盐，使得胰酶和胆盐的最终浓度分别为100 U/mL和0.16 mol/L；并在37 ℃、85 r/min温育不同消化时间，分别为1、2、3、4、5 h，置于冰水浴10 min后，转移至4 ℃。消化过程结束时，样品于12000 r/min离心15 min，取上清液，用于后续体外消化指标测定。
1.2.3 粒径和Zeta电位的测定
采用粒度及Zeta电位分析仪测定上述消化前后的粒径和Zeta电位。各组消化液用PBS稀释10倍，每个样品3次平行，每次测量前，样品平衡120 s，循环扫描12次。
1.2.4 5-MTHF生物可及性的测定
根据Herbig等[22]的高效液相色谱方法，稍作改动。色谱柱：Aglient UPLC Poroshell C18柱（4.6×150 mm，5 μm）；进样量：25 μL；流速：0.8 mL/min；流动相：乙腈:0.1%（V/V）的甲酸水溶液=10:90；进样温度：30 ℃；激发波长：295 nm，发射波长：356 nm。
准确称取5-MTHF标准品0.5 mg，用pH7.0，0.01 mol/L的PBS溶解，配制成10 μg/mL的母液。取适量母液稀释定容，分别得到0.1、0.5、1、2、5 μg/mL的5-MTHF标准溶液，按照上述高效液相色谱方法进行测定，以5-MTHF浓度作为横坐标X，对应的峰面积作为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算线性方程：Y=592.83916X-6.23744，决定系数R2=0.9992。
按高效液相色谱色谱方法分别检测各组体外消化样品中的5-MTHF含量，并计算5-MTHF生物可及性。5-MTHF生物可及性的计算方法如下：
(1) 1.2.5 微观结构测定
采用激光共聚焦激光显微镜表征消化前后的微观结构。样品用几滴0.3% w/v罗丹明B进行非共价标记。使用Ar+激光（457 nm）和He-Ne激光（543 nm）的20× 物镜扫描并获得荧光图像。
1.2.6 药代动力学模型的建立
SD大鼠适应性预饲一周后，取6~8周龄200 g雄性大鼠60只，随机平均分为6组，即空白对照组（PBS）、静脉注射组（5-MTHF-I）、5-MTHF对照组（5-MTHF对照）、5-MTHF+低剂量酪蛋白组（5-MTHF+CN-L）、5-MTHF+中剂量酪蛋白组（5-MTHF+CN-M）、5-MTHF+高剂量酪蛋白组（5-MTHF+CN-H）。按以下方式给药：空白对照组灌胃1 mg/kg的PBS；静脉注射组注射1 mg/kg的5-MTHF；5-MTHF对照组灌胃1 mg/kg的5-MTHF；5-MTHF+低、中、高剂量酪蛋白组灌胃1 mg/kg的5-MTHF，同时分别灌胃120、480、960 mg/kg的酪蛋白[23]。
给药前大鼠被禁食18 h，可自由饮水。各组大鼠分别于灌胃前及灌胃后0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h眼眶静脉丛取血。血样立即以10000 r/min离心10 min，得到上清液血清，置于−80 ℃冰箱，用于后续吸收动力学试验。本研究经东北农业大学实验动物委员会审批核准（审批编号：NEAUEC20）。
1.2.7 血清中5-MTHF的测定
利用高效液相色谱-串联质谱方法测定血清中5-MTHF含量[24]。检测条件：色谱柱：Waters Acquity BEH C18柱（2.1×50 mm，1.7 μm）；流动相：A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.4 mL/min；柱温：30 ℃；进样量5 μL。梯度洗脱程序：0~1 min，99.9%A；1~3 min，99.9%~82%A；3~4 min，82%~10%A；4~5 min，10%A；5~6 min，10%~99.9%A。MS/MS操作参数在正离子（ESI+460→313）下采用3000 V的毛细管电压和150 ℃的源温度。去溶剂化温度为400 ℃。碰撞气体流量设置为0.13 mL/min。锥孔气体和脱溶剂气流量分别为30 L/h和900 L/h。
1.2.8 药代动力学参数的测定
用DAS 2.0非房室模型进行药代动力学参数的估算分析。选取5-MTHF的最大血清浓度（Cmax）、达到血清浓度峰值的时间（Tmax）、血清浓度-时间曲线下面积（AUC）、消除半衰期（t1/2）、清除率（CL）、表观分布容积（Vd）、平均停留时间（MRT）等参数，评估各组5-MTHF的生物利用度（Fr）。
5-MTHF的生物利用度的计算方法如下：
(2) 1.3 数据处理
设置3次平行试验，试验数据用平均值±标准差（SD）表示。数据处理使用SPSS 26.0统计软件进行组间和组内方差分析，P<0.05表示数据有显著性差异。使用Origin 2021软件作图。
2. 结果与分析
2.1 CN对5-MTHF消化特性的影响
2.1.1 不同浓度CN对5-MTHF消化特性的影响
图1为不同浓度CN对5-MTHF+CN消化前后粒径（a）和Zeta电位（b）的影响。从图1（a）可以看出，消化前所有5-MTHF+CN组的粒径均低于CN组。这与Penalva等[15]的研究结果一致，可能是因为酪蛋白比较无定形和多分散，通过疏水作用与叶酸结合，形成的复合物是球状，结合更紧密。随着CN浓度增加，5-MTHF+CN组粒径不断增大。消化后，当CN浓度处于0.5%~2%区间内，5-MTHF+CN组粒径在600 nm左右，有较小波动，无显著差异（P>0.05）。随着CN浓度继续增加，5-MTHF+CN组粒径减小，并且在CN浓度为3%时达到最小值，此时5-MTHF+CN组粒径最低，粒径为436.17 nm。当CN浓度继续增加至4%时，5-MTHF+CN组粒径变化不显著（P>0.05）。
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图1（b）可观察到相似的结果，消化前后CN组、5-MTHF+CN组溶液都呈现负电荷，CN组和5-MTHF+CN组复合物的Zeta电位的绝对值呈现先增大后减小的趋势。这是由于消化前后的溶液pH都为7，而酪蛋白的等电点为4.6，此时CN和5-MTHF溶液带负电荷，且经过小肠消化后，所有消化液的负电荷均有显著增加（P<0.05）。电位的变化可能是由于消化产物（胆汁、胰酶）和颗粒去除表面活性剂产生的阴离子盐；也可能是消化过程中，酶解产物成分之间相互作用对消化液的Zeta电位产生影响[25]。
图2为不同浓度CN对5-MTHF生物可及性的影响。由图可知，5-MTHF+CN组的5-MTHF生物可及性显著高于5-MTHF对照组（CN浓度为0）（P<0.05）。且随着CN浓度增加，5-MTHF+CN组的生物可及性呈现先增加后降低的趋势。同时，在CN浓度为3%时，5-MTHF+CN组的生物可及性最高，为64.59%。这与Naderi等[26]研究趋势一致，说明CN对5-MTHF有很好的保护作用，也能促进5-MTHF释放肠道中被吸收。这可能是因为进入肠消化阶段后，CN被胰蛋白酶水解，释放的5-MTHF逐渐增多，其生物可及性不断增加。当CN浓度增加至4%时，CN没有完全被胰蛋白酶消化，使得5-MTHF可能没有全部被释放，其生物可及性降低。
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图 2 不同浓度CN对5-MTHF生物可及性的影响Figure 2. Effect of different concentrations of CN on the bioaccessility of 5-MTHF2.1.2 不同加工处理CN对5-MTHF消化特性的影响
图3为不同加工处理CN对5-MTHF+CN消化前后粒径（a）、Zeta电位（b）的影响。可以看出，消化前，5-MTHF+CN组的粒径均比CN粒径小；超声、均质、加热三个处理组5-MTHF+CN的粒径相较于无处理组的粒径显著降低（P<0.05）。且三个处理组5-MTHF+CN的Zeta电位绝对值相较于无处理组的显著增大（P<0.05）。消化后，三个处理组的粒径和电位变化均趋势一致，其中粒径的排序：无处理>加热>超声>均质；电位绝对值的排序：均质>超声>加热>无处理组。这可能是由于处理组破坏了CN的氢键、疏水作用和静电相互作用，破坏CN结构，CN疏水基团暴露，导致疏水相互作用增强，5-MTHF与CN之间相互作用增强，5-MTHF+CN处理组粒径减小[27−28]且处理组增加了基团的电离程度，并在表面暴露出更多带负电的部分，导致有效电荷增加，从而导致分子之间的静电排斥增加，Zeta电位绝对值增大[29]。而不同处理组会不同程度的破坏CN结构，使得不同处理组之间的粒径和电位有差异。
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图 3 不同加工处理CN对5-MTHF+CN消化前后粒径、Zeta电位的影响Figure 3. Effect of different processing methods of CN on particle size and Zeta potential of 5-MTHF+CN before and after digestion图4为不同加工处理CN对5-MTHF生物可及性的影响。5-MTHF+CN组的生物可及性均显著高于5-MTHF对照组，同时三个加工处理组的生物可及性也显著高于无处理组（P<0.05）。这是由于处理过程中会产生剪切力和旋转，导致酪蛋白原有结构被改变，5-MTHF+CN复合物结合更紧密[30]，从而5-MTHF受到CN保护，防止了5-MTHF在酸性胃环境的降解，可以更有效运输5-MTHF至肠道，提高5-MTHF的生物可及性。此外，不同加工处理组间的5-MTHF生物可及性也有显著差异（P<0.05），其中均质处理组的5-MTHF生物可及性最高，为71.79%；加热处理组的5-MTHF生物可及性最低，为61.22%，说明均质处理后的CN更利于提高5-MTHF的生物可及性。
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图 4 不同加工处理CN对5-MTHF生物可及性的影响Figure 4. Effect of different processing methods of CN on the bioaccessility of 5-MTHF2.1.3 不同肠道pH下CN对5-MTHF消化特性的影响
图5为不同的肠道pH下CN对5-MTHF+CN消化前后粒径（a）、Zeta电位（b）的影响。可以看出，5-MTHF+CN组的粒径显著低于CN组（P<0.05，pH为8.0时除外）。经过体外消化后，随pH增加，消化液粒径增大；Zeta电位绝对值大于消化前，且消化后的Zeta电位绝对值与pH呈正相关。这可能是因为pH在6~8之间，胰酶活性增加，胰蛋白酶将碱性氨基酸旁边的肽键裂解成小分子，这导致酪蛋白上的疏水域松动，CN与5-MTHF分开，氨基酸彼此通过氢键、疏水作用和静电相互排斥力而松散堆积，增强了小分子的排斥力，导致粒径增大，Zeta电位绝对值增大[31]。
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图 5 不同肠道pH下CN对5-MTHF+CN消化前后粒径、Zeta电位的影响Figure 5. Effect of CN on particle size and Zeta potential of 5-MTHF+CN before and after digestion at different intestinal pH levels图6为不同肠道pH下CN对5-MTHF生物可及性的影响。由图可知，5-MTHF+CN组的生物可及性显著高于5-MTHF对照组，且随pH不断增大，5-MTHF+CN组的生物可及性显著降低（P<0.05）。其中pH为6时，5-MTHF+CN组的5-MTHF生物可及性最高，为87.06%。这可能是因为在该pH下，CN与5-MTHF去结合程度最大化，5-MTHF生物可及性最高[32]。该生物可及性变化趋势与上述粒径电位结果趋势相符合，pH为6时5-MTHF+CN组的粒径、Zeta电位影响最大，说明此时CN对5-MTHF的消化吸收影响程度最大，可以更好地促进5-MTHF被肠道吸收。
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图 6 不同肠道pH下CN对5-MTHF生物可及性的影响Figure 6. Effect of CN on the bioaccessility of 5-MTHF at different intestinal pH levels2.1.4 不同消化时间下CN对5-MTHF消化特性的影响
图7为不同消化时间下CN对5-MTHF+CN消化前后粒径（a）、Zeta电位（b）的影响。可以看出，消化前，5-MTHF+CN组的粒径显著低于CN组粒径（P<0.05）。随消化时间延长，粒径呈现先减小再增大后趋于平缓的趋势。这可能归因于肠道消化物存在胰蛋白酶，它们作用于消化液中CN，从而导致5-MTHF+CN复合物的破坏和颗粒尺寸的减小。而随着消化时间的延长，肠液pH可能会增强液滴之间的静电排斥，同时肠液中胆盐很容易吸附在液滴表面，增加液滴聚集[33]。Zeta电位趋势与粒径趋势相互印证，CN组和5-MTHF+CN组的Zeta电位绝对值均随消化时间增加而增大，分别从21.41 mV和22.2 mV（1 h）上升到28.58 mV和30.64 mV（5 h）。
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图 7 不同消化时间下CN对5-MTHF+CN消化前后粒径、Zeta电位的影响Figure 7. Effect of CN on particle size and Zeta potential of 5-MTHF+CN before and after digestion at different digestion times图8不同消化时间下CN对5-MTHF生物可及性的影响。由图可知，5-MTHF+CN组的生物可及性显著高于5-MTHF对照组（P<0.05）。随着消化时间的延长，5-MTHF+CN组和5-MTHF对照组的生物可及性呈现不断升高的趋势。这是因为在胃肠道消化酶和胆汁盐的作用下，导致酪蛋白结构被破坏，消化液中一些与蛋白结合不易释放的5-MTHF被释放出来。同时，在消化5 h时，5-MTHF+CN组的5-MTHF生物可及性最大，为58.91%。这与Penalva等[15]研究酪蛋白对合成叶酸消化结果相似，即CN一定程度上影响5-MTHF的释放，有利于人体对5-MTHF的吸收利用，也很大程度上提高了5-MTHF的稳定性。
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图 8 不同消化时间下CN对5-MTHF生物可及性的影响Figure 8. Effect of CN on the bioaccessility of 5-MTHF under different digestion times2.1.5 5-MTHF、CN、5-MTHF+CN的微观结构
将CN（3%）、5-MTHF（0.27 μg/mL）、CN（3%）+5-MTHF（0.27 μg/mL）体外消化后，进行激光共聚焦显微镜观察，结果见图9。图像中的亮绿色代表富含5-MTHF的区域，红色代表富含CN的区域。
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图 9 5-MTHF、CN、5-MTHF+CN消化前和消化后的激光共聚焦显微镜图像Figure 9. Laser confocal microscopy images of 5-MTHF, CN and 5-MTHF+CN before and after digestion消化前，5-MTHF的微观结构呈现小分子聚集状态，而酪蛋白呈现离散小颗粒状态。
胃消化阶段，5-MTHF组大部分5-MTHF裸露在外，而5-MTHF+CN组能明显看出红色荧光将绿色荧光包裹在其中，形成较大的聚集体，保护5-MTHF被酸性胃环境氧化降解。产生这种现象的原因可能是胃的模拟体系pH1.5低于酪蛋白的等电点4.6，导致蛋白质氨基的质子化，降低了5-MTHF+CN复合物表面的电荷密度，粒子间的静电斥力很弱，从而絮凝[34]。
肠消化阶段，5-MTHF+CN组明显看出红色荧光消失，绿色荧光裸露在外，说明包裹在5-MTHF外的酪蛋白几乎完全消化，使5-MTHF暴露在肠道中。这是由于肠液中存在胆盐、阳离子（如钙离子）且肠道pH上升，导致分子间静电斥力增加，胰蛋白酶对肽键的作用增强[35]，使CN被最大程度地消化，5-MTHF释放增多。另外，与5-MTHF组相比，肠消化后的5-MTHF+CN组绿色荧光亮度更强、更密集，可以看出CN对5-MTHF的消化吸收会起到积极的作用。
2.2 CN对5-MTHF吸收动力学的影响
图10为大鼠血清中5-MTHF的平均浓度-时间曲线。可以看出，灌胃后1 h内，5-MTHF对照组、5-MTHF+CN-L组、5-MTHF+CN-M组、5-MTHF+CN-H四组大鼠血清中5-MTHF水平均快速升高，达到Cmax，分别为77.78、155.57、209.35、257.32 ng/mL；灌胃后1~6 h，5-MTHF含量快速下降；灌胃后6~24 h，5-MTHF含量逐渐降至基线值。另外，三组5-MTHF+CN的5-MTHF血清水平明显高于5-MTHF对照组。研究结果与倪四阳等[36]报道的结果相似，表明CN对5-MTHF吸收有明显的影响，提高了5-MTHF的吸收水平。
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图 10 大鼠血清中5-MTHF的平均浓度-时间曲线Figure 10. Mean concentration-time curve of 5-MTHF in rat serum表2为5-MTHF的主要药代动力学参数。三组5-MTHF+CN的Cmax、AUC、Fr、t1/2、Vd、MRT参数均显著高于5-MTHF对照组（P<0.05），排序如下：5-MTHF+CN-H > 5-MTHF+CN-M > 5-MTHF+CN-L > 5-MTHF。其中，5-MTHF+CN组的Cmax比5-MTHF对照组提高2.0~3.3倍，AUC比5-MTHF对照组提高180.32~667.13 ng·h/mL，生物利用度比5-MTHF对照组提高6.34%~23.40%。这与Penalva等[23]研究结果相似，该研究发现了玉米醇溶蛋白纳米颗粒负载合成叶酸后，其生物利用度较未负载玉米醇溶蛋白纳米颗粒的合成叶酸提高约1倍。以上结果说明，不同剂量的CN可以均对5-MTHF的吸收产生促进影响，且高剂量CN组对5-MTHF的促进作用最为显著，生物利用度提高1.6倍，更有利于5-MTHF的吸收利用。
表 2 5-MTHF的主要药代动力学参数Table 2. Main pharmacokinetic parameters of 5-MTHF样品 Cmax（ng/mL） Tmax（h） AUC0-∞（ng·h/mL） t1/2（h） CL（L/h） Vd（L） MRT（h） Fr（%） PBS − − − − − − − − 5-MTHF-I 529.44±14.93* 0 2851.34±118.57* 6.24±0.54* 0 0.003* 8.08±0.72* 100 5-MTHF对照 77.78±4.41 1 1050.38±57.80 6.91±1.72 0.001 0.006±0.002 8.85±1.18 36.84 5-MTHF+CN-L 155.57±11.12* 1 1231.20±115.12* 7.34±2.31* 0.001 0.007±0.002* 9.68±1.81* 43.18 5-MTHF+CN-M 209.35±11.42* 1 1431.67±88.44* 7.35±0.93* 0.001 0.009±0.001* 10.42±0.53* 50.21 5-MTHF+CN-H 257.32±12.87* 1 1717.51±16.89* 8.34±1.30* 0.001 0.012±0.001* 11.84±1.44* 60.24 注：Cmax：峰值血清浓度；Tmax：达到血清浓度峰值的时间；AUC：从时间0到∞的曲线下面积浓度时间；t1/2：终端的半衰期；CL：血清清除率；Vd：表观分布容积；MRT：平均停留时间；Fr：相对生物利用度；*与5-MTHF相比P<0.05；−代表数据无意义。 3. 结论
本研究通过体外消化模型和药代动力学模型探究酪蛋白对5-甲基四氢叶酸消化和吸收特性的影响。结果表明，CN可与5-MTHF结合并包裹5-MTHF，减少其在胃肠道降解，提高5-MTHF的生物可及性和生物利用度。体外消化过程中，CN浓度、CN加工方式、肠道pH、消化时间均会一定程度影响5-MTHF的消化特性，且在CN浓度为3%、CN加工方式为均质处理、肠道pH为6、消化时间为5 h的条件下，5-MTHF+CN组的粒径最小（436 nm）、Zeta电位绝对值最大（30.64 mV）、生物可及性最高（87.06%）；体内吸收过程中，5-MTHF+CN组中的5-MTHF血清水平明显高于5-MTHF对照组，且5-MTHF+CN-H组的生物利用度最高，比5-MTHF对照组提高23.40%。以上表明一定范围内的CN对5-MTHF的消化和吸收有积极的影响。基于本研究结果，关于酪蛋白对5-甲基四氢叶酸的吸收作用机制还需要更深入的研究。
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图 2 不同浓度CN对5-MTHF生物可及性的影响
Figure 2. Effect of different concentrations of CN on the bioaccessility of 5-MTHF
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图 3 不同加工处理CN对5-MTHF+CN消化前后粒径、Zeta电位的影响
Figure 3. Effect of different processing methods of CN on particle size and Zeta potential of 5-MTHF+CN before and after digestion
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图 4 不同加工处理CN对5-MTHF生物可及性的影响
Figure 4. Effect of different processing methods of CN on the bioaccessility of 5-MTHF
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图 5 不同肠道pH下CN对5-MTHF+CN消化前后粒径、Zeta电位的影响
Figure 5. Effect of CN on particle size and Zeta potential of 5-MTHF+CN before and after digestion at different intestinal pH levels
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图 6 不同肠道pH下CN对5-MTHF生物可及性的影响
Figure 6. Effect of CN on the bioaccessility of 5-MTHF at different intestinal pH levels
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图 7 不同消化时间下CN对5-MTHF+CN消化前后粒径、Zeta电位的影响
Figure 7. Effect of CN on particle size and Zeta potential of 5-MTHF+CN before and after digestion at different digestion times
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图 8 不同消化时间下CN对5-MTHF生物可及性的影响
Figure 8. Effect of CN on the bioaccessility of 5-MTHF under different digestion times
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图 9 5-MTHF、CN、5-MTHF+CN消化前和消化后的激光共聚焦显微镜图像
Figure 9. Laser confocal microscopy images of 5-MTHF, CN and 5-MTHF+CN before and after digestion
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图 10 大鼠血清中5-MTHF的平均浓度-时间曲线
Figure 10. Mean concentration-time curve of 5-MTHF in rat serum
表 1 SSF、SGF和SIF电解液的配制
Table 1 Preparation of SSF, SGF and SIF electrolyte
组成 浓度
（mol/L）体积（mL） SSF电解液pH=7 SGF电解液pH=1.5 SIF电解液pH=7 KCl 0.5 15.1 6.9 6.8 KH2PO4 0.5 3.7 0.9 0.8 NaHCO3 1 6.8 12.5 42.5 NaCl 2 − 11.8 9.6 MgCl2·6H2O 0.15 0.5 0.4 1.1 （NH4）2CO3 0.5 0.06 0.5 − HCl 6 0.09 1.3 0.7 蒸馏水 − 定容至500 mL 定容至500 mL 定容至500 mL 
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表 2 5-MTHF的主要药代动力学参数
Table 2 Main pharmacokinetic parameters of 5-MTHF
样品 Cmax（ng/mL） Tmax（h） AUC0-∞（ng·h/mL） t1/2（h） CL（L/h） Vd（L） MRT（h） Fr（%） PBS − − − − − − − − 5-MTHF-I 529.44±14.93* 0 2851.34±118.57* 6.24±0.54* 0 0.003* 8.08±0.72* 100 5-MTHF对照 77.78±4.41 1 1050.38±57.80 6.91±1.72 0.001 0.006±0.002 8.85±1.18 36.84 5-MTHF+CN-L 155.57±11.12* 1 1231.20±115.12* 7.34±2.31* 0.001 0.007±0.002* 9.68±1.81* 43.18 5-MTHF+CN-M 209.35±11.42* 1 1431.67±88.44* 7.35±0.93* 0.001 0.009±0.001* 10.42±0.53* 50.21 5-MTHF+CN-H 257.32±12.87* 1 1717.51±16.89* 8.34±1.30* 0.001 0.012±0.001* 11.84±1.44* 60.24 注：Cmax：峰值血清浓度；Tmax：达到血清浓度峰值的时间；AUC：从时间0到∞的曲线下面积浓度时间；t1/2：终端的半衰期；CL：血清清除率；Vd：表观分布容积；MRT：平均停留时间；Fr：相对生物利用度；*与5-MTHF相比P<0.05；−代表数据无意义。
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