Optimization of the Fermentation Process for Pine-needle Sweet-potato Glutinous Rice Wine and Analysis of Its Antioxidant Activity
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摘要: 目的:改善传统红薯糯米酒的风味和功效,优化松针红薯糯米酒的发酵工艺,并对其理化指标和抗氧化活性进行评价。方法:在传统红薯米酒发酵基础上,采用单因素实验和响应面试验对发酵条件进行优化。考察了松针添加量、初始糖度、发酵时间、酵母添加量、料液比和发酵温度等因素对发酵过程的影响,对最优发酵工艺下所得松针红薯糯米酒的理化指标进行评价,并通过1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)和2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)阳离子自由基清除实验评估其抗氧化活性。结果:优化后的发酵条件为松针添加量3.3%,初始糖度22.5°Bx,发酵时间7 d,酵母添加量0.20%,料液比1:3(g/mL),发酵温度30 ℃。在此条件下,松针红薯糯米酒的总糖含量为12.5 g/L,酒精含量为17.6%,氨基酸态氮含量为0.58 g/L。产品呈淡黄透明色泽,具有特有的松针草本香气,且满足理化及微生物安全标准。抗氧化能力方面,松针红薯糯米酒对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率分别高达87.2%和90.3%,显著优于传统红薯糯米酒(P<0.05)。结论:本研究确定的优化发酵工艺,不仅提升了松针红薯糯米酒的风味,还显著增强了其抗氧化性能。该工艺对促进传统红薯糯米酒的创新和升级具有实际应用价值,为植物性辅料在酒类产品中的应用提供了新的思路。Abstract: Objective: In order to improve the flavor and efficacy of traditional sweet-potato glutinous rice wine, optimize the fermentation process of pine-needle sweet-potato glutinous rice wine and evaluate its physicochemical indexes and antioxidant activity. Methods: Based on the traditional fermentation of sweet-potato rice wine, the fermentation conditions were optimized using a single-factor experiment and the response surface method. The effects of pine-needle addition, initial sugar content, fermentation time, yeast addition, solid-liquid ratio, and fermentation temperature on the fermentation process were investigated. The physicochemical indexes of the pine-needle sweet-potato glutinous rice wine obtained under the optimal fermentation conditions were evaluated. In addition, its antioxidant activity was analyzed by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) cation free radical scavenging experiments. Results: The optimized fermentation conditions were as follows: pine needle mass addition of 3.3%, initial sugar content of 22.5°Bx, fermentation time of 7 d, yeast mass addition of 0.20%, solid (raw material mass):liquid (distilled water volume) ratio of 1:3 (g/mL), and fermentation temperature of 30 ℃. Under these conditions, the resulting pine-needle sweet-potato glutinous rice wine had a total sugar content of 12.5 g/L, alcohol content of 17.6%, and amino acid nitrogen content of 0.58 g/L. The resulting product exhibited a light-yellow transparent appearance with a unique pine-needle herb aroma. Moreover, it satisfied physical, chemical, and microbial safety standards. In terms of antioxidant capacity, the scavenging rates of the DPPH and ABTS+ free radicals of the pine-needle sweet-potato glutinous rice wine were as high as 87.2% and 90.3%, respectively, which were significantly higher than those of traditional sweet-potato glutinous rice wine (P<0.05). Conclusion: The optimized fermentation process developed in this study improved the flavor of pine-needle sweet-potato glutinous rice wine and significantly enhanced its antioxidant properties. Therefore, this process has practical application value for promoting the innovation and upgrading of traditional sweet-potato glutinous rice wine and providing new ideas for the application of plant excipients in wine products.
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松树是一种常见的针叶松科松属植物树种,松树的针叶称为松针,其富含多种水溶性黄酮、儿茶素、花青素等成分,具有降低血压、血脂、保护血管等功效[1−3]。红薯富含淀粉、膳食纤维、胡萝卜素和维生素C等营养物质,具有降低血糖、血脂、抗氧化等作用[4]。糯米含有丰富的营养物质,包括蛋白质、脂肪、淀粉、糖类、维生素B等[5−6]。薯米酒是一种传统甜酒,以红薯和糯米为主要原料,通过发酵工艺制成[7]。在中国,薯米酒有着悠久的历史和广泛的市场,其发酵酿造工艺已被列入福建省省级非物质文化遗产代表性名录[8]。
松节醇在松树的生长过程中起着重要的生理作用,不仅有助于抵御外部环境的压力,还具有抗氧化和抗菌等功效[9−10]。松针作为松树的一部分,含有一定量的松节醇,也可以为人体提供健康保健益处。目前国内外对松针保健功能的研究还比较少,大多数停留在木材的利用阶段[11]。已有研究表明,添加天然植物原料能够显著提升发酵酒类产品的抗氧化活性并对风味产生积极影响。例如,添加水果、草本植物和香料等已被证实可以增强酒的抗氧化能力,同时丰富其感官特性[12−13]。在传统薯米酒的酿制过程中,类似的方法也被探索,以期通过天然添加剂改善其营养价值和口感[14]。松针的可持续性和环境友好性,以及其在酿酒工艺中的创新应用,为传统酿酒业提供了一种新的发展方向。与现有研究相比,本研究探讨了将松针作为天然添加剂在传统薯米酒酿制过程中的应用,在关注最终产品抗氧化活性强度的同时,研究不同发酵条件对酒品质和风味特性的影响,探索其在提升酒品质量和独特性方面的潜在价值。
本研究利用响应面分析法优化主要发酵条件,确定松针红薯糯米酒的最佳参数,通过分析发酵过程中理化指标的变化和抗氧化活性,旨在科学改善产品风味和功效。研究成果将为业界和研究人员研发新型薯米酒产品提供指导,同时为进一步优化松针红薯糯米酒发酵流程提供科学基础,增强产品品质和感官体验,更好满足消费者对营养和健康的追求。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
松针 采自福州鼓山的健康松树,经鉴定为松科松属乔木植物马尾松(Pinus massoniana Lamb.)的新鲜针叶;红薯、糯米、白砂糖 永辉超市股份有限公司;乙醇 分析纯,沧州德信生物技术有限公司;柠檬酸 分析纯,西安大丰收生物科技有限公司;糖化酶(酶活力为50000 U/g) 成都万象宏润生物科技有限公司;酵母菌 安琪酵母有限公司,菌株编号为安琪高活性干酵母;抗坏血酸(VC) 分析纯,无锡市亚泰联合化工有限公司;DPPH 纯度≥98%,四川省维克奇生物科技有限公司;ABTS 纯度≥98%,湖北鸿鑫瑞宇精细化工有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
FW177中草药粉粹机 天津市泰斯特仪器有限公司;RE-2000E旋转蒸发仪 西安禾普生物科技有限公司;SD20 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱 上海三申医疗器械有限公司;KQ-800DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;HPX-9162MBE数显电热恒温培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;LDZX-50L立式高压蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;TG18-WS台式高速离心机 常州金坛良友仪器有限公司;UV-1800紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;5 L装砂罐、0.5 L装陶瓷瓶 福建德化县朴达陶瓷有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 松针红薯糯米酒发酵工艺流程
松针红薯糯米酒发酵工艺流程包括3个阶段(图1):原料预处理、发酵主过程、成品后处理。
原料预处理→蒸煮→拌匀→调节→发酵→过滤→灭菌→装罐→陈酿→成品。
1.2.2 操作要点
1.2.2.1 原料预处理
称取20 g新鲜松针,漂洗干净,室内常温阴干,剪至0.3~0.4 cm后置于粉碎机粉碎,置于带有密封盖的锥形瓶中[15]。向锥形瓶中加入200 mL的95%乙醇,确保松针完全浸没。将锥形瓶密封,放置在室温下避光处,进行浸泡提取,并不时搅拌以提高提取效率。浸泡24 h后,用滤纸将浸泡液过滤,分离松针残渣和乙醇提取液。在35 ℃旋蒸以去除乙醇,至提取液体积达到100 mL,得到相对浓缩的松针浸提汁液[16];红薯洗净切小块,糯米洗净后在蒸饭锅中浸泡14 h;将处理后的红薯和糯米分别隔水蒸煮至红薯无硬心、糯米变色柔软,结束蒸煮,冷却至30 ℃以下,进行后续操作。
1.2.2.2 发酵主过程
称取处理后的400 g红薯和600 g糯米混合装入灭菌的发酵罐,按照原料与蒸馏水的比例1:3(g/mL)混匀,加入松针汁、0.5%的糖化酶,用白砂糖调节初始糖度为20°Bx,用柠檬酸调节pH为4,加入0.2%的酵母菌,置于恒温培养箱中发酵7 d,控制发酵温度为30 ℃。
1.2.2.3 成品后处理
使用200目的过滤袋细密过滤酒液,随后4000 r/min离心,取上清液,75 ℃加热25 min,110 ℃超高温处理15 s以完成灭菌,然后立即冷却。冷却后的酒液被转移至灭菌的陶瓷瓶中,得到试验酒样。最后,于4 ℃和30 ℃交替陈酿30 d,每隔5 d交替一次,制得松针红薯糯米酒。
1.2.3 发酵工艺优化
1.2.3.1 单因素实验
松针添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、初始糖度(16°Bx、18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx)、酵母添加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)、料液比(1:5、1:4、1:3、1:2、1:1(g/mL))、发酵温度(24、26、28、30、32 ℃)和发酵时间(4、5、6、7、8 d)作为单因素实验中主要的影响因素。品质评估系统以总糖含量、酒精含量和氨基酸态氮含量为主要指标,同时结合感官评分指标,全面分析这些因素对松针红薯糯米酒品质的影响。
1.2.3.2 响应面试验
结合单因素实验结果,使用Design-Expert 13软件,根据Box-Behnken中心组合试验原理,设计响应面试验设计3因素和3水平的响应面试验(表1)。为将不同量纲的四个评估指标转化为可以比较的相对数值,结合各自的权重综合评价,运用权重均衡化与偏差标准化方法,对四个评估指标加权综合。因总糖含量为逆向指标,其余三个评估指标为正向指标,按式(1)计算得综合响应值(Y),以此确定松针红薯糯米酒的最优发酵工艺条件。
表 1 Box-Behnken设计试验因素水平Table 1. Factors and levels of Box-Behnken design test水平 因素 A松针添加量(%) B初始糖度(°Bx) C发酵时间(d) −1 2 20 6 0 3 22 7 1 4 24 8 Y=(1−X1−min(X1)max(X1)−min(X1))⋅ω1+∑4i=2(Xi−min(Xi)max(Xi)−min(Xi)⋅ωi) (1) 式中:Y表示综合响应值,Xi依次表示总糖含量、酒精含量、氨基酸态氮含量、感官评分四个评价指标值,min(Xi)表示对应评价指标值集最小值,max(Xi)表示对应评价指标值集最大值,ωi表示对应评价指标所占权重。
1.2.4 基本理化指标测定方法
总糖含量的测定:采用GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法、指示剂法[17];酒精含量的测定:采用GB 5009.225-2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》[18];pH的测定:采用pH计法即通过校准pH计后将电极浸入酒样读取稳定数值测定;氨基酸态氮的测定:参照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》[19];可溶性固形物:采用手持糖度仪法即利用校准归零后酒液覆盖棱镜于光源处读取刻度盘数值测定。
1.2.5 抗氧化活性分析方法
以0.2%VC溶液和未添加松针薯米酒为对照组,测定松针红薯糯米酒的DPPH和ABTS+自由基清除能力。
DPPH自由基清除率测定:参考魏鑫等[20]的方法进行略微修改,吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL样液和VC溶液定容至2 mL,加入0.2 mmol/L DPPH溶液,避光反应45 min,在波长517 nm处测定吸光度值A1,同时测定2 mL待测液与2 mL溶剂无水乙醇混合后的吸光度值A2,以及2 mL无水乙醇与2 mL DPPH溶液混合后的吸光度值A0。按式(2)计算DPPH自由基清除率(k1)。
k1(%)=(1−A1−A2A0)×100 (2) ABTS+自由基清除率测定:参考张开平等[21]的方法进行略微修改,吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL样液和维生素C溶液定容至2 mL,加入2.0 mL ABTS+自由基稀释液,室温下避光反应45 min,以无水乙醇为参比,在波长734 nm处测定吸光度值A1。以2 mL无水乙醇代替待测液作空白对照,测定吸光度值A0。按式(3)计算ABTS+自由基清除率(k2)。
k2(%)=A0−A1A0×100 (3) 1.2.6 感官评定方法
感官评分小组由10名食品专业领域的专家组成,包括5位男性和5位女性。松针红薯糯米酒的感官评定参考GB/T 13662-2018《黄酒》和Q/FKZY 0002 S-2019《花果糯米酒》的感官评分要求[22],对松针红薯糯米酒分别在外观、香气、口感和风格上进行评分,满分为100分。具体的感官评定标准详见表2。
表 2 松针红薯糯米酒感官评定标准Table 2. Sensory evaluation standard of pine-needle sweet-potato glutinous rice wine指标 分值 标准 减分项目 减分值 外观 30 整体应呈淡黄、透亮的颜色 颜色浑浊、暗淡 1~10 清澈度好,无浑浊、透明 清澈度差、浑浊不透明 1~10 振摇有细腻、持久的气泡 气泡粗糙、短暂 1~10 香气 30 有清新浓郁的松针香味 松针香不明显、弱 1~10 有甜润芳香的红薯香味 红薯香缺失、单调 1~10 有米香醇厚的糯米香味 糯米香不足、平淡 1~10 口感 30 酒体柔和顺滑 酒体粗糙、刺激 1~10 酸甜度平衡适中 过酸、过甜 1~10 余味悠长回甘 余味短暂无回甘 1~10 风格 10 个性鲜明、与众不同的独特性 酒体缺乏个性、平庸 1~3 层次丰富、变化多样的复杂度 复杂度单一、平淡 1~4 成分协调、和谐统一的平衡感 成分冲突、不协调 1~3 1.3 数据处理
所有实验均重复3次取平均值,采用IBM SPSS Statistics 27软件进行多重比较分析(P<0.05) ,通过Origin2022软件绘制图表。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 生物活性物质对发酵工艺的影响
松针和酵母的添加量均涉及到生物活性物质对发酵过程的影响。松针添加量影响发酵中的酶活性和代谢途径,进而影响产物的生成[23]。酵母添加量直接影响发酵的速率和程度,决定了酒精的生成量和发酵时间[24]。
从图2A中可以看出,随着松针添加量的逐渐增加,松针中的松脂醇、松节油和黄酮类化合物与酵母菌发酵过程中的酶发生相互作用,抑制了还原糖的生成并加速了其消耗,总糖含量呈现下降趋势。同时,酒精含量和氨基酸态氮含量表现出先增加后减小的趋势。当松针添加量为2%时,感官评分最高为89.1分,显著高于其他组(P<0.05);当松针添加量为3%时,酒精含量、氨基酸态氮含量均显著提升(P<0.05),酒精含量达到最高13.7%,总糖含量和感官评分显著下降(P<0.05)。当松针添加量过多,对酵母菌的发酵过程产生抑制作用,导致发酵不完全,酒精含量和感官评分显著下降(P<0.05)。图2B显示,随着酵母添加量的增加,酒精含量和氨基酸态氮含量逐渐增长;当酵母添加量过多时,还原糖消耗过快,甚至可能导致发酵失控,同时酒精生成过快,产生其他副产物,影响酒的质量和口感[25]。酵母添加量为0.20%时,感官评分最高(89.5分),酒精含量(15.1%)略低于最高值(15.4%),酵母添加量在0.10%~0.25%范围,各评价指标总体与其他组分差异不显著(P>0.05)。
松针的添加能够给薯米酒提供独特的风味和抗氧化物质,对其感官品质和功能性有重要影响。松针中的生物活性成分对总糖含量和氨基酸态氮含量有积极影响。酵母添加量对发酵过程至关重要,但在实验中发现其对最终产品品质的影响在一定范围内变化不大。综合考虑,选择松针添加量为2%、3%、4%进行响应面优化试验,选择最佳的酵母添加量为0.20%。
2.1.2 底物特性因素对发酵工艺的影响
初始糖度和料液比与发酵底物的特性有关。初始糖度决定了发酵过程中可发酵糖的含量,直接影响发酵速率和酒精生成[26]。料液比反映了固体物料与液体发酵液的比例,对发酵液的黏稠度和传质效果有重要影响,从而影响发酵效率和产物质量[27]。
从图3A可以得出,随着初始糖度的逐渐增加,总糖含量和酒精含量呈现出明显的上升趋势,当初始糖度为22%,酒精含量、感官评分均达最大值(15.0%、92.0分),与其他初始糖度差异显著(P<0.05),然而,当初始糖度进一步增加时,酒精含量的增加速率逐渐减缓,甚至出现酒精含量下降的情况。这是因为较高初始糖度对酵母发酵作用起到抑制作用,同时发酵过程也促使过多副产物产生,导致感官评分和酒精含量显著下降(P<0.05),总糖含量显著增加(P<0.05)。图3B显示,当料液比较小于1:3(g/mL)时,即固体物料与液体发酵液的比例较低,总糖含量相对较高,酒精含量相对较低。随着料液比的逐渐增加,总糖含量继续下降,但下降速率逐渐减缓而后上升,相应的酒精含量的增加速率逐渐减缓后下降。当料液比为1:3(g/mL)时,总糖含量达最低值(11.9 g/L)、酒精含量达最大值(15.1%),与其他料液比差异显著(P<0.05)。在料液比增加到一定程度后,过高的黏稠度和传质限制可能使酵母菌无法充分利用所有的还原糖。此时,一部分还原糖可能无法被酵母菌转化和利用,导致总糖含量的相对增加,从而影响了酒精的生成。
初始糖度作为酵母发酵的主要底物因素直接影响酒精含量,不同的初始糖度导致酒精含量的显著差异(P<0.05),这对于确定最佳发酵条件非常重要。总糖含量的变化也与初始糖度有关,因为较高的初始糖度意味着发酵结束后残留的总糖量也较高。是影响发酵效率和最终酒精含量的关键因素[28];料液比主要影响的是发酵体系的稀释程度,在实验中显示出对产品品质的影响相对较小(P>0.05)。综合考虑酒的品质和发酵效率,选择初始糖度为20°Bx、22°Bx、24°Bx进行响应面优化试验,选择最佳料液比为1:3(g/mL)。
2.1.3 发酵环境对发酵工艺的影响
发酵温度和时间这两个因素属于发酵过程中的环境条件。发酵温度影响酵母菌的生长和代谢速率,对发酵的进度和产物的生成具有重要影响[29]。发酵时间决定了发酵过程的持续时间,过长或过短的发酵时间都可能影响产物的质量和成分的形成[30]。
由图4A可知,随着发酵温度的升高,酵母菌的代谢活性增强,对还原糖的利用速率加快,总糖含量逐渐下降,酒精含量逐渐上升。当发酵温度为28 ℃时,酵母菌能够高效地将还原糖转化为酒精和其他代谢产物,总糖含量达到最低12.2 g/L,酒精含量达到最高14.6%,当发酵温度为30 ℃时,感官评分达最高值91.1分,在26~32 ℃范围,总糖、酒精、氨基酸态氮含量差异不显著(P>0.05)。当发酵温度过高,酵母菌的生长和代谢加快,菌体提前老化,发酵动力不足,导致还原糖利用速率减慢,总糖含量有所上升,酒精含量下降,同时产生不良的发酵味和酸味[31],导致酒的感官评分显著下降(P<0.05)。图4B显示,随着发酵时间的增加,酵母菌对还原糖的利用量逐渐增加,各发酵时间总糖、氨基酸态氮含量差异显著(P<0.05)。当发酵时间为7 d时,总糖含量为10.5 g/L,氨基酸态氮含量0.54 g/L,酒精含量、感官评分达到最大值(14.4%、87.3分)。发酵时间过长会导致部分酒精被酵母菌和其他微生物进一步代谢从而酒精含量显著下降(P<0.05)。
发酵温度对发酵速率和微生物活性有显著影响(P<0.05),但在实验中发现在一个较宽的温度范围内,其对产品品质的影响不显著(P>0.05)。发酵时间决定了酵母与糖分接触的时间长度,进而影响发酵的完成度,对酒精含量和总糖含量有显著影响,不同的发酵时间导致酒精含量和总糖含量的显著变化(P<0.05),这对于达到理想的酒的风味和口感至关重要,且容易控制和调整。综合考虑,选择最佳的发酵温度为30 ℃,选择发酵时间为6、7、8 d进行响应面优化试验。
2.2 响应面优化松针红薯黑米酒发酵工艺试验结果及分析
2.2.1 试验设计与结果
根据单因素实验结果,采用了Box-Behnken设计原理,设计了3因素3水平共17个试验点的响应面试验优化松针红薯糯米酒发酵工艺条件,响应面试验设计及结果见表3。
表 3 响应面试验设计与结果Table 3. Design and results of response surface test试验号 因素 Y综合响应值(分) A松针添加量(%) B初始糖度(°Bx) C发酵时间(d) 1 3 24 6 71.09 2 2 20 7 69.42 3 2 24 7 66.88 4 2 22 8 71.69 5 3 22 7 83.90 6 4 24 7 78.57 7 3 22 7 84.40 8 4 22 6 73.19 9 4 20 7 68.27 10 3 24 8 77.77 11 3 20 6 65.00 12 3 22 7 83.18 13 3 22 7 83.11 14 4 22 8 78.24 15 3 20 8 68.27 16 3 22 7 85.00 17 2 22 6 70.37 2.2.2 回归模型建立与方差分析
使用Design-Expert 13软件对表3的试验结果进行多元回归拟合后,获得二次多项回归模型:
Y=−1056.02−8.46975A+81.5121B+65.451C+1.605AB+0.9325AC+0.42625BC−5.1465A2−1.99662B2−5.399C2。
由表4可知,此回归模型极显著(P<0.01),模型失拟项不显著(P=0.0809>0.05)。表明松针红薯糯米酒发酵过程数据模型拟合度较好,模型的选择是合理的,试验误差不显著(P=0.0809>0.05);模型的决定系数R2为0.9843,校正系数R2Adj为0.9642,表明模型的预测值和试验值相关性好,可用于松松针红薯糯米酒发酵过程参数的可靠分析与预测。F值大小表明各因素对松针红薯糯米酒发酵过程综合加权分的影响大小依次为:初始糖度>松针添加量>发酵时间,模型自变量一次项A、B、C和交互相AB以及二次项A2、B2、C2的影响达到极显著水平(P<0.01),AC和BC均不显著(P>0.05)。
表 4 响应面试验方差分析Table 4. Variance analysis of response surface test方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 回归模型 757.09 9 84.12 48.92 <0.0001 ** A 49.55 1 49.55 28.81 0.0010 ** B 68.15 1 68.15 39.63 0.0004 ** C 33.29 1 33.29 19.36 0.0032 ** AB 41.22 1 41.22 23.97 0.0018 ** AC 3.48 1 3.48 2.02 0.1980 BC 2.91 1 2.91 1.69 0.2347 A2 111.52 1 111.52 64.85 <0.0001 ** B2 268.56 1 268.56 156.17 <0.0001 ** C2 122.73 1 122.73 71.37 <0.0001 ** 残差 12.04 7 1.72 失拟项 9.44 3 3.15 4.84 0.0809 纯误差 2.60 4 0.650 2 总误差 769.12 16 注:**表示差异极显著(P<0.01)。 通过利用Design-Expert 13软件结合Origin 2022作图,绘制了松针红薯糯米酒在发酵过程中的响应曲面图,有效地揭示了不同变量因素及其交互影响。响应面图形的扩展程度更大表明两变量因素间的影响作用就更为显著[32]。图5展示了松针添加量、初始糖度和发酵时间之间交互作用对于综合加权分的影响,观察到响应面呈下凹开口并存在峰值。其中,图5a所示交互作用项等高线呈现椭圆状,这表述它们对于实验结果具有强烈的影响力,这也与方差分析的结果保持一致。
2.3 最佳工艺参数确定与验证
经由Design-Expert 13软件分析,确定出松针红薯糯米酒的最优发酵工艺条件:松针添加量为3.346%,初始糖度为22.53%,发酵时间为7.24 d,此条件下模型预测的综合加权分最大的理论值为84.98。基于操作实践的便利性,最终将松针红薯糯米酒最优发酵工艺条件调整为:3.3%的松针添加量、22.5°Bx的初始糖度、7 d的发酵时间、0.20%的酵母添加量、1:3(g/mL)的料液比以及30 ℃的发酵温度。通过3次重复实验取数据平均值,获得的综合加权分达到85.12±0.40。这一结果显示响应面模型与实际操作情况相近(P>0.05),为发酵流程的优化提供了有效的指导。
2.4 理化及微生物指标检测结果
总糖含量、酒精含量、氨基酸态氮是影响糯米酒品质的重要因素[33−34]。现下结合化学分析和感官评分对糯米酒的研究较少,根据优级传统型糯米酒的业内标准,从保持天然酿酒的观点出发,兼顾口感,对松针红薯糯米酒的质量进行了质量指标分析。
从表5可以看出,松针红薯糯米酒的总糖含量、酒精含量,pH、氨基酸氮含量等质量指标均符合行业标准。
表 5 松针红薯糯米酒品质分析Table 5. Quality analysis results of pine-needle sweet-potato glutinous rice wine项目 标准 检测结果 总糖含量(g·L−1) ≤15.0 12.5 酒精含量(%) ≥8.0 17.6 氨基酸态氮含量(g·L−1) ≥0.16 0.58 pH 3.5~4.6 4.0 非糖固形物含量(g·L−1) ≥8.0 8.6 2.5 抗氧化活性测定结果
VC溶液、松针红薯糯米酒、无松针传统薯米酒对DPPH和ABTS+自由基的清除能力见图6。
研究发现,松针中含松节醇、花青素、类黄酮等多酚类化合物,具备较强的抗氧化能力[35]。由图6可知,这种抗氧化能力在松针红薯糯米酒中同样得到很好的体现:三种样品对DPPH和ABTS+自由基的消除能力都随着样品用量的增加而增强,但增幅随后趋于稳定,这与魏鑫等[20]研究的枳椇茶酒以及张开平等[21]对大果山楂红枣果酒抗氧化性的研究结果相吻合。IC50即半抑制率,是衡量药物、抗体或其他生物活性物质在抑制特定生物过程(如抗氧化性、酶活性、细胞增殖等)方面的效力的重要指标,本试验以维生素C作为阳性对照,样品的用量与IC50值呈正相关,样品用量越高,IC50值越高,抗氧化性越弱[36]。
根据图6A,当样品用量达到0.6 mL后,各样品对DPPH自由基清除率差异不显著(P>0.05),样品用量为0.6 mL时,松针红薯糯米酒对DPPH自由基的清除率为85.0%,比无松针传统薯米酒(72.1%)高出12.9%,但略低于维生素C溶液的86.3%。另一方面,图6B显示,在样品用量小于0.3 mL的情况下,三种样品对ABTS+自由基的清除率存在显著差异(P<0.05)。当样品用量介于0.5~0.7 mL之间时,松针红薯糯米酒与维生素C溶液对ABTS+自由基的清除率相近(P>0.05)。样品用量增至0.7 mL时,松针红薯糯米酒的ABTS+自由基清除率达到90.3%的峰值,略低于维生素C溶液的91.8%,但高于无松针传统薯米酒的84.5%。说明松针红薯糯米酒有效地保留了松针中的抗氧化成分,表现出显著的清除DPPH和ABTS+自由基的能力。从图6可知,在两种自由基清除率方面,三种样品的IC50值均表现为:维生素C溶液<松针红薯糯米酒<无松针传统薯米酒,松针红薯糯米酒的抗氧化性略低于维生素C溶液,明显优于无松针传统薯米酒。
3. 讨论与结论
通过引入辅料松针对传统红薯糯米酒的发酵工艺进行了创新优化,应用单因素实验及响应面法确定最优发酵参数:松针添加量3.3%,初始糖度22.5°Bx,发酵时间7 d,酵母添加量0.20%,料液比1:3(g/mL),发酵温度30 ℃。所得酒品在总糖含量、酒精含量和氨基酸态氮含量上达到预定标准,且具备引人的淡黄透明色泽和独特的草本香气。在DPPH和ABTS+自由基清除率上表现出明显提升的抗氧化能力,标志着产品质量和功能性的同步增强。
本研究证实了松针对提高酒品风味和抗氧化性的积极效果,为传统红薯糯米酒的品质改进和功能性增强开辟了新途径,也为食品工业中天然植物添加剂的应用提供了新视角。因实验设计的限制,包括样本规模、实验重复次数、以及实验条件与工业生产环境存在差异,将与相关企业合作开展中试和工业化生产试验,对研究成果进行实际验证和不断完善,切实推动松针在食品工业中的广泛应用。实验中使用的松针因产地和季节的不同可能会存在差异,未来将考虑以松针活性物质的标准化提取作为研究方向,深入探究如何针对不同产地和季节的松针建立一套科学合理的提取工艺标准,通过实验数据的积累和分析,确定最佳的提取参数组合,以确保提取的活性物质具有稳定的品质和功效。
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表 1 Box-Behnken设计试验因素水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design test
水平 因素 A松针添加量(%) B初始糖度(°Bx) C发酵时间(d) −1 2 20 6 0 3 22 7 1 4 24 8 表 2 松针红薯糯米酒感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standard of pine-needle sweet-potato glutinous rice wine
指标 分值 标准 减分项目 减分值 外观 30 整体应呈淡黄、透亮的颜色 颜色浑浊、暗淡 1~10 清澈度好,无浑浊、透明 清澈度差、浑浊不透明 1~10 振摇有细腻、持久的气泡 气泡粗糙、短暂 1~10 香气 30 有清新浓郁的松针香味 松针香不明显、弱 1~10 有甜润芳香的红薯香味 红薯香缺失、单调 1~10 有米香醇厚的糯米香味 糯米香不足、平淡 1~10 口感 30 酒体柔和顺滑 酒体粗糙、刺激 1~10 酸甜度平衡适中 过酸、过甜 1~10 余味悠长回甘 余味短暂无回甘 1~10 风格 10 个性鲜明、与众不同的独特性 酒体缺乏个性、平庸 1~3 层次丰富、变化多样的复杂度 复杂度单一、平淡 1~4 成分协调、和谐统一的平衡感 成分冲突、不协调 1~3 表 3 响应面试验设计与结果
Table 3 Design and results of response surface test
试验号 因素 Y综合响应值(分) A松针添加量(%) B初始糖度(°Bx) C发酵时间(d) 1 3 24 6 71.09 2 2 20 7 69.42 3 2 24 7 66.88 4 2 22 8 71.69 5 3 22 7 83.90 6 4 24 7 78.57 7 3 22 7 84.40 8 4 22 6 73.19 9 4 20 7 68.27 10 3 24 8 77.77 11 3 20 6 65.00 12 3 22 7 83.18 13 3 22 7 83.11 14 4 22 8 78.24 15 3 20 8 68.27 16 3 22 7 85.00 17 2 22 6 70.37 表 4 响应面试验方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface test
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 回归模型 757.09 9 84.12 48.92 <0.0001 ** A 49.55 1 49.55 28.81 0.0010 ** B 68.15 1 68.15 39.63 0.0004 ** C 33.29 1 33.29 19.36 0.0032 ** AB 41.22 1 41.22 23.97 0.0018 ** AC 3.48 1 3.48 2.02 0.1980 BC 2.91 1 2.91 1.69 0.2347 A2 111.52 1 111.52 64.85 <0.0001 ** B2 268.56 1 268.56 156.17 <0.0001 ** C2 122.73 1 122.73 71.37 <0.0001 ** 残差 12.04 7 1.72 失拟项 9.44 3 3.15 4.84 0.0809 纯误差 2.60 4 0.650 2 总误差 769.12 16 注:**表示差异极显著(P<0.01)。 表 5 松针红薯糯米酒品质分析
Table 5 Quality analysis results of pine-needle sweet-potato glutinous rice wine
项目 标准 检测结果 总糖含量(g·L−1) ≤15.0 12.5 酒精含量(%) ≥8.0 17.6 氨基酸态氮含量(g·L−1) ≥0.16 0.58 pH 3.5~4.6 4.0 非糖固形物含量(g·L−1) ≥8.0 8.6 -
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