Preparation, Structural Characterization and Antioxidant Activity of Extracellular Nanovesicles from Hericium erinaceus
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摘要: 目的：优化猴头菇纳米囊泡的制备方法，考察其抗氧化活性以及对Caco-2细胞氧化损伤的保护作用。方法：采用差速离心与蔗糖密度梯度离心联用法制备猴头菇纳米囊泡（Hericium erinaceus-derived extracellular nanovesicles，HEDENVs），采用单因素实验和响应面试验对纳米囊泡的制备条件进行优化，并用激光纳米粒度仪与透射电镜对其粒径、Zeta电位和形貌进行表征；利用液相色谱质谱联用仪（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）对纳米囊泡进行脂质组学和蛋白质组学分析；通过DPPH、ABTS+和O2−自由基清除率评价纳米囊泡的抗氧化活性；H2O2构建Caco-2细胞氧化应激损伤模型，采用激光共聚焦显微镜测定细胞中ROS含量变化。结果：纳米囊泡最佳制备条件：蔗糖浓度25%，离心时间2 h，离心转速86000 r/min，此时纳米囊泡的浓度为402.24 μg/mL；纳米囊泡为具有膜结构的小泡，粒径110.7±16.9 nm，PDI 0.551，Zeta电位−14.2 mV；基于脂质组学和蛋白质组学分析，鉴定出纳米囊泡中大约含有346种脂质与52种蛋白质。体外抗氧化结果表明，400 μg/mL纳米囊泡的DPPH自由基清除率为94.79%、ABTS+自由基清除率为96.67%、O2−自由基清除率为96.83%；在H2O2构建的Caco-2细胞氧化损伤模型中，纳米囊泡能显著减少损伤细胞中ROS的产生。结论：体外多种抗氧化评价方法表明纳米囊泡具有一定的抗氧化活性。Abstract: Objective: To optimize the preparation method of Hericium erinaceus-derived extracellular nanovesicles and investigate their antioxidant activity and protective effect against oxidative damage in Caco-2 cells. Methods: Hericium erinaceus-derived extracellular nanovesicles (HEDENVs) were isolated from fresh Hericium erinaceus by ultracentrifugation and sucrose gradient ultracentrifugation. The optimal extraction process of HEDENVs was optimized by one-way test and response surface test, while the particle size, Zeta potential, and morphology of HEDENVs were characterized by a laser particle size instrument and transmission electron microscope. Lipidomics and proteomics analysis of HEDENVs was performed by liquid chromatography-mass spectrometry. The in vitro antioxidant activity of HEDENVs was evaluated by determining the DPPH, ABTS+, and O2− radical scavenging capacity. A Caco-2 cell oxidative stress damage model was created using H2O2, and changes in ROS content in cells were measured using laser confocal microscopy. Results: The optimal extraction process of HEDENVs was the 25% interface of the sucrose concentration, centrifugation time was 2 h, and centrifugal speed was 86000 r/min, at which the concentration of HEDENVs was 402.24 μg/mL. HEDENVs were nanovesicles with a lipid bilayer membrane, the particle size was 110.7±16.9 nm, PDI=0.551, and the Zeta potential was −14.2 mV. Based on the analysis of lipidomics and proteomics, 346 lipids species and 52 proteins were identified in HEDENVs. The results of in vitro antioxidant test showed that the scavenging rate of 400 μg/mL HEDENVs for DPPH free radical was 94.79%, the scavenging rate for ABTS+ free radical was 96.67%, and the scavenging rate for O2− free radical was 96.83%. An oxidative damage model in Caco-2 cells was established by H2O2, HEDENVs could significantly reduce the production of ROS in damaged cells. Conclusion: It showed that HEDENVs had certain antioxidant activity in various antioxidant experiment.
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猴头菇（Hericium erinaceus）在我国广泛种植，属于齿菌科猴头属大型菌，因其质感鲜嫩，拥有“山珍猴头，海味燕窝”之称，喜好生长在湿度较高的森林等地。猴头菇不仅营养丰富，还具有多种生物活性，是自然界中具有极高食用与药用价值的药食同源真菌，我国已有2000多年采食猴头菇的历史[1]。研究表明猴头菇中含有多肽类、多糖类、萜类、甾醇类、酚类等活性成分[2]，具有抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、降胆固醇、保肝[5]等多种功能活性。
细胞外囊泡（Extracellular vesicles），又称外泌体，是具有膜结构的纳米小泡，其含有活细胞释放的脂质、蛋白质和核酸等物质[6]，参与细胞生理过程，在免疫和组织动态平衡等方面均发挥重要作用[7]。1983年，Harding等[8]从哺乳动物血浆中首次发现细胞外囊泡，相较而言，从植物中提取细胞外囊泡的研究相对滞后，然而随着不同来源的细胞外囊泡不断深入的研究，有关药食同源植物提取的细胞外囊泡，已在功能食品领域开展了广泛的研究[9]。越来越多的研究阐明了植物来源细胞外囊泡是一种以脂质双分子层为基本骨架，内包裹各种蛋白质、脂质和核酸等活性物质的膜性小泡[10]。因其具有安全性及细胞靶向性等独特的优点，从而在食品领域得到广泛关注[11]。
早在2009年，Regente等[12]首次通过真空渗透离心方法从向日葵种子中分离出细胞外囊泡，从而为植物细胞外囊泡的研究奠定基础。随着研究的深入与植物的多样性，发现从植物中分离出的细胞外囊泡大小范围在50~200 nm，内容物包含脂质、蛋白质和mRNA等物质[13]。植物细胞外囊泡具有小尺寸、无毒、免疫原性低、靶向性与生物利用度高等优点，有助于解决许多活性成分生物利用度差的问题[14]。目前已有研究从大蒜[15]、生姜[16]、西兰花[17]、人参[18]等植物中提取细胞外囊泡，并对其形态结构、组成成分与功能活性进行研究。从可食用果蔬汁中提取得到的细胞外囊泡与其来源植物有相似的活性，包括抗氧化、抗炎[19]和抗癌活性[20]等。Perut等[21]从草莓中提取得到草莓细胞外囊泡，研究表明草莓细胞外囊泡以剂量依赖性的方式抑制人间充质干细胞（MSC）氧化应激。这可能是由于草莓细胞外囊泡中有高含量的花青素、叶酸、黄酮醇、维生素C等活性物质，使其具有抗氧化能力。
植物结构非常复杂，从植物组织中提取细胞外囊泡不仅产率低且质量差。因此探索一个适用于植物细胞外囊泡的提取方法对今后的发展是至关重要的。已有的研究表明植物细胞外囊泡的提取方法包括超速离心法[22]、密度梯度离心法[23]、免疫亲和捕获法[24]、基于尺寸的分离方法、聚合物沉淀法[25]、电泳与透析联用[26]等。其中超速离心法是提取植物细胞外囊泡最常用的方法，但对于黏性较大、杂质较多的植物组织来说提取效率较低，同时破碎细胞、细胞外基质、细胞壁等共沉降从而影响提取率。对于蔗糖密度梯度离心法来说，植物组织各成分各自以一定的速度沉降，具有良好的分辨率，分离效果好[27]。因此通过超速离心法结合蔗糖密度梯度离心法能得到数量多且高纯度的植物细胞外囊泡[28]。Bokka等[29]使用超速离心法从番茄中提取番茄细胞外囊泡粗产物，随后进一步使用蔗糖密度梯度离心法对其纯化，得到番茄细胞外囊泡的颗粒数为2.6×1015个/kg，蛋白质量为6.9 mg/kg，该方法提高了植物细胞外囊泡的产量。
本研究采用差速离心与蔗糖密度梯度离心联用法从新鲜猴头菇中制备猴头菇纳米囊泡（Hericium erinaceus-derived extracellular nanovesicles，HEDENVs），以下简称纳米囊泡。为了克服纳米囊泡提取效率低等问题，利用响应面模型得到纳米囊泡最佳制备条件，并对其粒径、Zeta电位与形貌进行表征，为了进一步了解纳米囊泡组成成分，采用液相色谱质谱联用仪（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）质谱仪对纳米囊泡与猴头菇进行脂质与蛋白质组成分析。通过体外抗氧化实验研究纳米囊泡的抗氧化活性功能，旨在探索药食同源植物细胞纳米囊泡的制备方法和功能活性，为促进药食同源植物的功能开发提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
猴头菇 中国黑龙江省林海市悦来颐和食用菌种植专业合作社；甲醇（色谱纯）、氯仿（分析纯） 南京化学试剂有限公司；磷酸缓冲盐粉剂、邻苯三酚、2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、超氧阴离子自由基检测试剂盒 上海源叶生物科技有限公司；结肠癌细胞系Caco-2 武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS） 南京迈博生物科技公司；脂膜荧光探针DiD、增强型CCK-8试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、活性氧检测试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司。
Allegra X-15R低速离心机、Optima XPN-100超速离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；ReadMax 1900酶标仪 中国上海闪谱生物科技有限公司；BT-90动态光散射纳米粒度分析仪 中国丹东百特仪器有限公司；H-7650透射电子显微镜 日本日立公司；TCS-SP8X激光共聚焦显微镜 德国徕卡公司；QTRAP 5500质谱仪 美国SCIEX公司；Nexera X2 LC-30AD超高压液相色谱仪 日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 纳米囊泡的制备
1.2.1.1 差速离心法制备粗提囊泡
200 g猴头菇浸泡在冷PBS（pH7.2）中并在搅拌器中粉碎，将固液混合物过滤后在4 ℃下以3000 r/min离心30 min、6000 r/min离心30 min和12000 r/min离心1 h，每一步提取上清液。最终的上清液在4 ℃下以100000 r/min超速离心2 h，取沉淀，用冷PBS洗涤并重新悬浮在PBS中得到粗提囊泡。
1.2.1.2 蔗糖密度梯度离心法纯化纳米囊泡
配制五种质量浓度的蔗糖溶液（10%、20%、30%、40%和50%），在超速离心管中依次分别滴加3mL的50%、40%、30%、20%、10%的蔗糖溶液，最后滴加粗提囊泡。采用蔗糖梯度离心法在4 ℃下以100000 r/min超速离心2 h。离心结束后吸取20%/30%蔗糖层，使用PBS清洗去除蔗糖溶液，纯化获得的纳米囊泡放于−80 ℃冰箱中避光存储。
1.2.2 BCA蛋白定量法测纳米囊泡浓度
采用赵婉均[30]使用的BCA蛋白定量方法对纳米囊泡原液进行蛋白定量，将纳米囊泡分别稀释成不同浓度梯度后，加入200 µL蛋白酶裂解液，轻轻混匀，冰上裂解30 min。收集囊泡裂解液于4 ℃，12000 r/min离心5 min，吸取10 μL上清加至96孔板，不同浓度梯度样品中分别加入200 μL BCA工作液，37 ℃恒温孵育30 min。在370 nm处测定各孔OD值并绘制标准曲线，根据标准曲线计算出不同浓度梯度对应的蛋白浓度。
1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 蔗糖浓度对纳米囊泡提取浓度的影响
在超速离心管中分别滴加两层不同浓度的蔗糖溶液，浓度分别为0%/10%、10%/20%、20%/30%、30%/40%、40%/50%（单因素变量以两蔗糖层浓度的均值表示），最上层滴加粗提囊泡，并在4 ℃下以100000 r/min超速离心2 h，测定不同蔗糖层中纳米囊泡的浓度，确定蔗糖浓度对纳米囊泡提取浓度的影响。
1.2.3.2 离心时间对纳米囊泡提取浓度的影响
在超速离心管中分别滴加两层20%/30%的蔗糖溶液，最上层滴加粗提囊泡，4 ℃下以100000 r/min分别超速离心1、1.5、2、2.5、3 h，测定不同离心时间下纳米囊泡的浓度，确定离心时间对纳米囊泡浓度的影响。
1.2.3.3 离心转速对纳米囊泡提取浓度的影响
在超速离心管中分别滴加两层20%/30%的蔗糖溶液，最上层滴加粗提囊泡，4 ℃下分别以60000、80000、100000、120000、140000 r/min超速离心2 h，测定不同离心转速下纳米囊泡的浓度，确定离心转速对纳米囊泡浓度的影响。
1.2.4 响应面试验设计
单因素实验结果结合响应面试验法，以纳米囊泡浓度（μg/mL）为响应指标，设置蔗糖浓度（A，%）、离心时间（B，h）、离心转速（C，r/min）为三个单因素，设计三因素三水平的Box-Behnken响应试验，试验因素水平见表1。
表 1 响应面试验因素与水平Table 1. Factors and levels coding of response surface experiment水平 因素 A蔗糖浓度（%） B离心时间（h） C离心转速（r/min） −1 15 1.5 60000 0 25 2 80000 1 35 2.5 100000 1.2.5 纳米囊泡表征
1.2.5.1 粒径与电位
取适量纳米囊泡，用PBS（pH7.2）稀释至合适浓度，利用动态光散射纳米粒度分析仪在25 ℃下测定纳米囊泡的粒径、多分散系数（polydispersity index，PDI）及Zeta电位。
1.2.5.2 透射电镜
取5 µL纳米囊泡滴加于铜网，再用5 µL乙酸铀酰染色1 min，静置10 min后滴加PBS（pH7.2）溶液1滴，放置3 min使其晾干，随后通过透射电子显微镜观察纳米囊泡的形态。
1.2.5.3 激光共聚焦显微镜
取500 µL纳米囊泡与1 mmol/L亲脂性荧光染料DiD在室温下孵育20 min。通过12000 r/min离心30 min，重悬沉淀得到DiD标记的纳米囊泡，通过激光共聚焦显微镜观察纳米囊泡的形态。
1.2.5.4 脂质组学分析
从纳米囊泡中提取总脂质，取100 μL纳米囊泡原液，加入480 μL提取液（MTBE:MeOH=5:1），涡旋混匀30 s，冰水浴超声10 min后，将样品在−20 ℃条件下静置1 h。将样品4 ℃，12000 r/min，离心15 min，取上清液后立即真空干燥；加入100 μL DCM:MeOH=1:1溶液进行复溶并涡旋30 s，冰水浴超声10 min，将样品16000 r/min，4 ℃，离心15 min；取100 μL上清液于进样瓶中，使用LC-MS测定其脂质组成。
1.2.5.5 蛋白质组学分析
a.蛋白质提取与LC-MS质谱分析：取300 µL纳米囊泡原液，加入100 µL的蛋白裂解液，超声破碎10 min，冰上放置30 min，丙酮过夜沉淀，12000 r/min，离心20 min，5 mol/L尿素复溶。以蛋白酶与蛋白质量比1:50的比例加入胰蛋白酶，酶解过夜。25 ℃，12000 r/min离心10 min回收肽段，再用超纯水回收肽段，酸化后进行除盐，肽段分离后用LC-MS质谱仪进行质谱分析。
b.生物信息学分析：使用Perseus、Microsoft Excel和R统计计算软件对生物信息学数据进行分析。欧氏距离作为距离度量，用pheatmap软件包进行了系统聚类分析。基于UniProtKB/Swiss-Prot数据库（http://www.uniprot.org/）进行Swiss-Prot函数注释分析，基于GO数据库（http://geneontology.org/page/）进行GO函数注释分析，以及基于KEGG数据库（http://www.kegg.jp/kegg/ko.html）的KEGG通路注释分析。然后使用Fisher精确检验进行GO和KEGG富集分析，并对多次检验进行FDR校正。GO术语分为三类：生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC），丰富的GO和KEGG途径名义上在P<0.05水平上具有统计学意义。
1.2.6 纳米囊泡体外抗氧化能力测定
1.2.6.1 DPPH自由基清除能力
将纳米囊泡稀释为100、200、300、400 μg/mL，用0.2 mg/mL VC溶液作为阳性对照；分别取100 μL待测样品，加入100 μL 0.1 mmol/L DPPH工作液，25 ℃避光孵育30 min，517 nm处测定OD值并计算DPPH自由基清除率。
1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力
将纳米囊泡稀释为100、200、300、400 μg/mL，用0.2 mg/mL VC溶液作为阳性对照；分别取100 μL待测样品，加入100 μL 734 nm处吸光度为0.7的ABTS工作液，25 ℃避光反应30 min，734 nm处测定OD值并计算ABTS+自由基清除率。
1.2.6.3 超氧阴离子清除能力
将纳米囊泡稀释为100、200、300、400 μg/mL，用0.2 mg/mL VC溶液作为阳性对照；分别取待测样品100 μL加入100 μL 0.2 mmol/L邻苯三酚工作液，室温避光反应30 min，在325 nm处测定OD值并计算超氧阴离子清除率。
1.2.7 纳米囊泡对Caco-2细胞氧化损伤的影响
1.2.7.1 Caco-2细胞氧化损伤模型的建立
取对数生长期的细胞，以1×104/孔接种到96孔板中培养24 h，用100 µL不同浓度的H2O2（0、300、600、900、1200、1500 µmol/L）诱导细胞氧化损伤，通过CCK-8法测定细胞存活率，通过细胞存活率确定合适的H2O2浓度，建立氧化损伤模型。
1.2.7.2 纳米囊泡对正常及损伤后Caco-2细胞存活率的影响
将对数生长期的Caco-2细胞以1×104个/孔接种于96孔板中培养24 h，分别加入100 µL不同浓度的纳米囊泡（100、200、300、400 μg/mL）孵育24 h后，通过CCK-8法测定纳米囊泡对正常Caco-2细胞存活率影响；在100 µL H2O2（900 µmol/L）诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型中，加入100 µL不同浓度的纳米囊泡（100、200、300、400 μg/mL）孵育24 h后，通过CCK-8法测定纳米囊泡对损伤后Caco-2细胞存活率影响。
1.2.7.3 纳米囊泡对损伤后Caco-2细胞内ROS水平测定
首先在24孔板中放置细胞爬片，随后取对数生长期的Caco-2细胞以5×104个/孔接种在24孔板中并培养24 h，再用500 µL H2O2（900 µmol/L）诱导细胞氧化损伤后，加入500 µL不同浓度的纳米囊泡（100、200、300、400 μg/mL）孵育24 h，弃原培养基，PBS（pH7.4）洗涤2次，清洗后使用4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，用PBS（pH7.4）洗涤2次，每孔加1 mL荧光探针工作液DCFH-DA（10 µmol/L），继续放至细胞培养箱孵育培养30 min，然后取出细胞爬片，滴加抗荧光猝灭剂进行封片处理，用激光共聚焦显微镜观察并分析。
1.3 数据处理
所有实验平行重复3次，实验结果采用平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据统计分析，并用单因素方差分析检验法进行显著性分析，P<0.05被认为具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
由3个单因素实验得到不同制备条件对纳米囊泡产率的影响。纳米囊泡的浓度随着蔗糖浓度的增加而显著增加，但当蔗糖浓度到达25%时，再增加蔗糖浓度，纳米囊泡提取浓度反而下降（图1A）。可能是由于增加蔗糖浓度后，粗提物中除纳米囊泡外的大颗粒杂质在高浓度蔗糖中沉降，使得纳米囊泡浓度下降，所以确定蔗糖浓度为25%。随着离心时间的增加，纳米囊泡浓度也持续增加，在2 h时浓度达到最大，再增加离心时间对纳米囊泡浓度影响不大（图1B）。这可能是因为2 h时，粗提物中的纳米囊泡基本沉降完全，延长离心时间意义不大，所以确定离心时间为2 h。从图1C可以看出，转速从60000 r/min增加到80000 r/min，纳米囊泡的浓度明显增加，当转速为80000 r/min时纳米囊泡浓度达到最大，再增加转速纳米囊泡的浓度持续降低。推测可能是随着转速的增加，沉降的杂质增多，故纳米囊泡的浓度下降，所以确定离心转速为80000 r/min。
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图 1 不同因素对提取纳米囊泡浓度的影响注：A：蔗糖浓度；B：离心时间；C：离心转速。Figure 1. Effect of different factors on HEDENVs concentrations2.2 响应面试验结果及分析
2.2.1 响应面试验结果
根据单因素实验结果，对纳米囊泡的制备设计试验优化方案，以纳米囊泡浓度为响应值，蔗糖浓度（A）、离心时间（B）与离心转速（C）为影响因素。Box-Benhnken（BBD）响应曲面设计的试验条件和试验结果见表2。
表 2 响应面分析试验设计及结果Table 2. Design and results of response surface experiment试验号 蔗糖浓度
（A）离心时间
（B）离心转速
（C）纳米囊泡浓度
（Y，μg/mL）1 −1 1 0 184.35 2 0 1 −1 378.29 3 0 0 0 426.37 4 1 1 0 277.64 5 1 0 −1 237.86 6 0 0 0 406.24 7 0 1 1 387.68 8 0 −1 1 364.78 9 1 0 1 287.45 10 −1 −1 0 162.48 11 0 0 0 418.93 12 0 0 0 438.17 13 −1 0 −1 147.43 14 0 −1 −1 308.86 15 1 −1 0 257.44 16 −1 0 1 163.29 17 0 0 0 408.31 2.2.2 回归模型方程的建立及方差分析
用Design-Expert 8.0.6 Trial软件对纳米囊泡制备的17组试验结果进行数据分析，得到多元二次回归模型方程式：
Y=417.65+53.68A+20.12B+16.34C−2.07AB+8.43AC−11.63BC−174.86A2−23.96B2−33.78C2
回归方差分析见表3，从表中可看出，模型项F=1543.52>0.05，模型项P<0.0001，表明该二次回归方程模型极显著。失拟项F=5.76>0.05，失拟项P=0.0619>0.05，表明该模型失拟不显著。模型确定系数R2Adj=0.9988，说明方程模拟值与实际值相符。综上所述，该二次回归方程模型与实验值具有良好的拟合相关性。此外，蔗糖浓度（A）、离心时间（B）、离心转速（C）对响应值均有高度显著影响（P<0.0001）；两因素交互项BC>AC>AB，其中AB的P=0.2778>0.05，说明蔗糖浓度（A）与离心时间（B）交互作用对响应值影响不显著；各二次项的影响都高度显著（P<0.0001）。由此可说明，纳米囊泡浓度和各制备因素之间不是单纯的线性关系。比较F值可知，各制备因素对于纳米囊泡浓度影响顺序为：A（蔗糖浓度）>B（离心时间）>C（离心转速）。
表 3 回归方程方差分析结果Table 3. Regression equation variance analysis变异源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 171200 9 19018.06 1543.52 <0.0001 *** A 23051.27 1 23051.27 1870.85 <0.0001 *** B 3239.72 1 3239.72 262.94 <0.0001 *** C 2137.27 1 2137.27 173.46 <0.0001 *** AB 17.06 1 17.06 1.38 0.2778 AC 284.43 1 284.43 23.08 0.002 ** BC 541.26 1 541.26 43.93 0.0003 ** A2 128700 1 128700 10448.29 <0.0001 *** B2 2417.49 1 2417.49 196.2 <0.0001 *** C2 4805.72 1 4805.72 390.04 <0.0001 *** 残差 86.25 7 12.32 失拟项 70.04 3 23.35 5.76 0.0619 不显著 误差 16.2 4 4.05 总和 171200 16 决定系数R2=0.9995；调整系数R2Adj=0.9988；变异系数CV=1.14% 注：***表示P<0.0001，差异高度显著；**表示P<0.01，差异极显著；*表示P<0.05，差异显著；图6同。 如图2所示，根据回归方程模型作3D响应面立体图，图中曲面陡峭，说明这两个因素之间交互作用显著。结合表3可知，AC、BC两个交互项对响应值作用极显著（P<0.01），AB的交互作用对响应值影响最弱。图2中可以看出单独项A或B都对响应值有很大影响，且A的影响比B强。由于B的影响比较小，所以形成曲面的原因是受A的影响最大。因此各因素对响应值的影响由大到小排序为A>B>C，结果与表3中方差分析结果一致。响应面模型得出纳米囊泡最优制备工艺为：蔗糖浓度为24.88%，离心时间为2.10 h，离心转速为85932.90 r/min，预测在此条件下纳米囊泡提取浓度为421.20 μg/mL。按照上述最佳制备工艺调整试验实际方案为：蔗糖浓度为25%，离心时间2 h，离心转速86000 r/min。平行试验3次，结果显示，纳米囊泡提取浓度为402.24 μg/mL，实际值与预测值仅相差18.96 μg/mL，说明该模型真实可靠。
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图 2 各因素交互作用对纳米囊泡浓度影响的响应面图Figure 2. Response surface of the effect of interaction of various factors on the HEDENVs concentrations2.3 纳米囊泡表征
2.3.1 粒径、电位与形态表征
动态光散射测定纳米囊泡的粒径成正态分布，平均直径为110.7±16.9 nm，PDI为0.551（图3A）；Zeta电位为−14.2 mV（图3B），说明纳米囊泡的粒径分布相对均匀，稳定性好。透射电子显微镜显示纳米囊泡为大小均一，被膜结构包围且形状完整的球型结构（图4）。选DiD亲脂荧光染料标记纳米囊泡这类脂质纳米结构，在激光共聚焦显微镜下观察发现纳米囊泡呈具有膜结构的空心小泡（图5）。实验结果表明，从猴头菇中提取的纳米囊泡基于形态和大小初步鉴定符合植物源纳米囊泡的形态特征，与Liu等[31]研究的韭菜纳米囊泡透射电镜结果相似。
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图 3 纳米囊泡粒径分布与PDI（A）、纳米囊泡Zeta电位（B）Figure 3. Particle size distribution and PDI of HEDENVs (A), Zeta potential of HEDENVs (B)![]()
图 4 纳米囊泡透射电镜图注：A：30000×的纳米囊泡；B：60000×的纳米囊泡。Figure 4. Transmission electron microscopy of HEDENVs![]()
图 5 纳米囊泡激光共聚焦图注：A：20000×的纳米囊泡；B：40000×的纳米囊泡。Figure 5. Laser scanning confocal microscopy of HEDENVs2.3.2 纳米囊泡脂质组学分析
细胞纳米囊泡中的主要脂质成分包括胆固醇、鞘磷脂、糖鞘脂和磷脂酰丝氨酸，是构成囊泡磷脂双分子层的重要成分，在维持自身结构稳定和细胞间信号传递中起着重要作用[32]。因此对猴头菇与纳米囊泡分别进行脂质组学分析比较，鉴定出猴头菇中大约含有589种脂质（图6A），纳米囊泡中大约含有346种脂质（图6B）。猴头菇与纳米囊泡脂质数据相比较（图6C），发现纳米囊泡中磷酸甘油酯（Phosphatidylglycerol，PG）、磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyl serines，PS）等甘油磷脂显著上调（P<0.05），它们是构成纳米囊泡磷脂双分子层的重要成分。值得注意的是，纳米囊泡中鞘脂类神经酰胺（Ceramide，Cer）也高度显著上调（P<0.0001），Cer作为第二信使能参与细胞信号传导、脂质和蛋白质的分选以及细胞膜的转运，对于细胞的生长、增殖、凋亡具有重要的调节作用[33]。对猴头菇与纳米囊泡差异脂质进行显著性分析（图6D），其中上调31个，下调558个，纳米囊泡中PG、PA、PS相对含量明显上调，分增加了89.33%、41.98%、34.54%，这可能是提取囊泡过程中富集了构成膜双分子层的磷脂的缘故。在猴头菇与纳米囊泡中筛选了差异脂质，其中PA（16:0/18:2）、PS（18:2/18:2）、PE（18:1/18:2）、PI（16:0/16:0）、PC（18:2/18:2）、HexCer（18:1/18:1）、Cer（18:1/18:0）等磷脂亚类的VIP值为前20%（图6E）。Rome等[34]报道植物细胞外囊泡中PG是膜重要组成结构，起到维护细胞外囊泡膜完整性和稳定性的作用，还可以作为生物活性分子，参与细胞信号传导和调节细胞功能；PA能参与多种生物学过程，包括细胞增殖、细胞转化和分化等；PS通过与细胞膜表面磷脂酰丝氨酸受体结合，可被巨噬细胞靶向特异性识别。
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图 6 猴头菇与纳米囊泡脂质组学分析注：A：猴头菇脂质亚类分布；B：纳米囊泡脂质亚类分布；C：猴头菇与纳米囊泡磷脂相对含量；D：猴头菇与纳米囊泡脂质差异火山图；E：猴头菇与纳米囊泡脂质OPLS-DA评分图。Figure 6. Lipidomics analysis of Hericium erinaceus and HEDENVs2.3.3 纳米囊泡蛋白质组学分析
细胞纳米囊泡中含有丰富的内容物，其中蛋白质是不可缺少的组分之一，植物细胞纳米囊泡蛋白质的组成取决于它的来源植物和分泌途径[35]。通过蛋白质组学技术，检测到猴头菇中大约含102种蛋白质，纳米囊泡中大约含有52种蛋白质。如图7A所示，猴头菇与纳米囊泡中共有差异表达蛋白31种，包括21种表达上调蛋白和10种表达下调蛋白。发现上调的21种蛋白中有5种蛋白与膜蛋白有关。本研究发现从纳米囊泡中鉴定的蛋白大部分来源于猴头菇中，其中表现出跨膜特征的蛋白有ABC-type transporter eriD、Diterpene cyclase eriG、Cytochrome P450 monooxyhenase eriI、Cytochrome P450 monooxyhenase eriA；表现出信号转运特征的蛋白有HEL1、Glycoside hydrolase family 5 endoglucanase、UDP-glycosyltransferase eriJ，以上标志性蛋白使得纳米囊泡在跨膜转运，参与细胞信号传导中发挥重要作用。
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图 7 猴头菇与纳米囊泡蛋白质组学分析注：A：差异表达蛋白分布图；B：差异蛋白BP功能富集图；C：差异蛋白CC功能富集图；D：差异蛋白MF功能富集图；E：差异蛋白KEGG通路分析图。Figure 7. Proteomic analysis of Hericium erinaceus and HEDENVs为了更好的了解猴头菇与纳米囊泡中差异蛋白的生物学作用，对差异蛋白进行Gene Ontology（GO）二级注释分析，包括生物进程（Biological Process，BP），细胞组成（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF），分别对三大分支的富集结果单独进行统计展示了差异蛋白富集显著性top 20的GO注释分析。结果表明，约30种蛋白质与生物过程相关（图7B）；CC亚细胞定位结果发现差异蛋白中有5个上调蛋白与细胞膜相关（图7C），说明纳米囊泡具有典型的细胞膜结构特征；约17种蛋白质与分子功能相关（图7D）。Zhang等[36]研究发现植物细胞纳米囊泡中含有低浓度的蛋白质，其中大部分是植物组织中的胞质蛋白，包括肌动蛋白、蛋白酶以及在膜本身内充当通道和转运的膜蛋白。由于GO注释只能帮助我们了解蛋白质所代表的生物学意义，并不能严格地注释蛋白质的生物学功能。因此，我们进一步对差异蛋白进行了KEGG注释通路分析，分析得到差异蛋白中富集显著性top 30的KEGG通路。2条通路与细胞过程有关，7条通路与细胞代谢有关（图7E）。其中，有关细胞代谢通路的蛋白质与代谢途径相关，然而分析发现与代谢途径有关的蛋白质与氧化还原过程、新陈代谢及氧化应激反应有关[37]。
2.4 纳米囊泡体外抗氧化活性
猴头菇中含有许多活性组分，如脂质、蛋白质、多酚和多糖等，具有较强的抗氧化活性[38]。纳米囊泡蛋白质组学分析鉴定出细胞色素P450、过氧化物酶、还原酶eriB等活性蛋白质，这可能与纳米囊泡抗氧化功能活性相关。与Chen等[39]研究一致，发现茶树花纳米囊泡中16种蛋白质具有抗氧化相关功能。此外，纳米囊泡脂质组学分析鉴定了PE、PG、PI、PS及PC等磷脂，由于磷脂含有不饱和双键，具有一定的抗氧化能力[40]。因此，本文通过体外抗氧化法分别考察纳米囊泡的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率与超氧阴离子清除率作为评价纳米囊泡抗氧化能力的指标。VC阳性对照组DPPH自由基清除率为78.87%，不同浓度纳米囊泡清除DPPH自由基的能力也不同，随着纳米囊泡浓度的增加，DPPH自由基清除率逐渐增加（图8A），当纳米囊泡浓度为400 µg/mL时，DPPH自由基清除率最强，高达94.79%，显著高于VC对照组（P<0.05）。VC阳性对照组ABTS+自由基清除率为85.90%，当纳米囊泡浓度为400 µg/mL时，ABTS+自由基清除率高达96.67%。纳米囊泡浓度稀释后，ABTS+自由基清除能力均出现不同程度下降，其中400 µg/mL纳米囊泡的清除率是100 µg/mL的2倍（图8B）。纳米囊泡超氧阴离子清除率如图8C所示，VC阳性对照组清除率为84.35%，400 µg/mL纳米囊泡的清除率为96.83%，随着纳米囊泡浓度梯度稀释后，超氧阴离子清除率出现不同程度下降，呈浓度依赖性。张娇等[41]研究表明生姜、柠檬和洋葱来源纳米囊泡在DPPH自由基清除体系、ABTS+自由基体系和FRAP体系中均表现出较强的抗氧化能力。
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图 8 纳米囊泡的抗氧化活性注：A：DPPH自由基清除率；B：ABTS+自由基清除率；C：超氧阴离子清除率；不同小写字母代表有显著性差异，P<0.05；图9同。Figure 8. Antioxidant activity of HEDENVs2.5 纳米囊泡对Caco-2细胞氧化损伤的影响
采用H2O2建立Caco-2细胞氧化损伤模型，评价纳米囊泡的抗氧化活性。首先用不同浓度H2O2处理细胞使其造成氧化损伤。由图9A可知，细胞存活率随H2O2浓度增加而显著减小（P<0.05），当H2O2浓度为900 µmol/L时, 细胞存活率为44.56%，因此用900 µmol/L的H2O2构建细胞的氧化损伤模型[42]。利用CCK-8法检测纳米囊泡对Caco-2细胞存活率的影响，结果显示，与对照组相比，不同浓度纳米囊泡（100~400 µg/mL）对Caco-2细胞的存活率均在90%以上，不产生细胞毒性（图9B）。谢登超[43]使用MTT测定法测定细胞活力发现不同浓度铁皮石斛纳米囊泡对RAW 264.7细胞表现出良好的细胞相容性，无明显体外细胞毒性。当900 µmol/L H2O2损伤细胞与纳米囊泡孵育24 h后，纳米囊泡可呈剂量依赖地提高氧化损伤模型中Caco-2细胞的存活率，减轻了H2O2对Caco-2细胞的毒性作用。400 µg/mL纳米囊泡处理后，可使900 µmol/L H2O2损伤的Caco-2细胞存活率从44.55%提高到84.62%（图9C）。
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图 9 不同处理组对Caco-2细胞存活率的影响注：A：不同浓度H2O2对Caco-2细胞存活率的影响；B：不同浓度纳米囊泡对Caco-2细胞存活率的影响；C：不同浓度纳米囊泡对H2O2诱导的Caco-2细胞存活率的影响；ns表示无显著差异。Figure 9. Effects of different treatment groups on the survival rate of Caco-2 cells2.6 纳米囊泡对氧化损伤后Caco-2细胞内ROS水平的影响
活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是细胞的代谢产物，当细胞受到外界刺激时，胞内ROS水平会急剧增加并对细胞结构造成严重损害，因此ROS水平是细胞生理功能和环境因素导致细胞损伤的重要信号之一。实验通过DCFH-DA荧光探针染色法在激光共聚焦显微镜下成像，检测纳米囊泡作用于损伤细胞后，胞内ROS的水平变化。激光共聚焦显微镜荧光结果如图10所示，随着纳米囊泡浓度增加，损伤细胞中ROS产生的荧光强度明显减弱。荧光定量结果如图11所示，与空白组相比，H2O2损伤组荧光强度显著增强（P<0.05），胞内ROS荧光强度是空白组的4.43倍，ROS含量显著升高（P<0.05），表明细胞严重损伤。与H2O2损伤组相比，不同浓度纳米囊泡（100~400 µg/mL）处理后，荧光强度逐渐降低，说明胞内ROS含量减少且呈浓度依赖性。随着纳米囊泡浓度增加，细胞内荧光强度逐渐减弱，当纳米囊泡浓度为400 μg/mL时，荧光强度接近空白组。H2O2损伤组的荧光强度分别是100 μg/mL和400 μg/mL纳米囊泡处理组的1.19倍和3.65倍，结果表明纳米囊泡能够以浓度依赖性的方式降低细胞内ROS含量，在一定程度上减少细胞的氧化应激损伤。Zhao等[44]研究表明蓝莓外泌体可降低鱼藤酮处理的HepG2细胞中ROS水平，提高线粒体膜电位从而防止细胞氧化损伤。
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图 10 不同浓度纳米囊泡处理H2O2损伤的Caco-2细胞后胞内ROS含量变化共聚焦成像图Figure 10. Confocal microscopy images of intracellular ROS in Caco-2 damaged by H2O2 with different concentrations of HEDENVs![]()
图 11 不同浓度纳米囊泡处理H2O2损伤的Caco-2细胞后胞内ROS荧光定量统计图注：A：空白对照组；B：900 μmol/L H2O2损伤组；C：100 μg/mL纳米囊泡处理组；D：200 μg/mL纳米囊泡处理组；E：300 μg/mL纳米囊泡处理组；F：400 μg/mL纳米囊泡处理组。Figure 11. Quantitative statistical chart of fluorescence intensity of intracellular ROS in Caco-2 damaged by H2O2 with different concentrations of HEDENVs3. 结论
本文通过单因素实验结合响应面试验优化的方法，确定猴头菇纳米囊泡最佳制备条件：蔗糖浓度25%，离心时间2 h，离心转速86000 r/min。观察纳米囊泡为具有膜结构的中空小泡，其粒径为110.7±16.9 nm。通过多组学解析纳米囊泡的组成成分，纳米囊泡中大约含有346种脂质与52种蛋白质，是构成纳米囊泡膜结构的重要成分。此外，纳米囊泡对DPPH自由基、ABTS+自由基与O2−自由基具有一定的清除率，表现出良好的体外抗氧化活性。利用H2O2构建Caco-2细胞氧化损伤模型，结果表明纳米囊泡能明显降低H2O2损伤后Caco-2细胞内ROS的含量。综上所述，本实验优化了纳米囊泡的制备方法，证明了纳米囊泡具有一定的抗氧化能力。此外，将进一步研究纳米囊泡中是否含有多酚、多糖以及其他活性物质，为后续纳米囊泡抗氧化功能应用奠定良好的基础。
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图 1 不同因素对提取纳米囊泡浓度的影响
注：A：蔗糖浓度；B：离心时间；C：离心转速。
Figure 1. Effect of different factors on HEDENVs concentrations
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图 2 各因素交互作用对纳米囊泡浓度影响的响应面图
Figure 2. Response surface of the effect of interaction of various factors on the HEDENVs concentrations
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图 3 纳米囊泡粒径分布与PDI（A）、纳米囊泡Zeta电位（B）
Figure 3. Particle size distribution and PDI of HEDENVs (A), Zeta potential of HEDENVs (B)
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图 4 纳米囊泡透射电镜图
注：A：30000×的纳米囊泡；B：60000×的纳米囊泡。
Figure 4. Transmission electron microscopy of HEDENVs
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图 5 纳米囊泡激光共聚焦图
注：A：20000×的纳米囊泡；B：40000×的纳米囊泡。
Figure 5. Laser scanning confocal microscopy of HEDENVs
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图 6 猴头菇与纳米囊泡脂质组学分析
注：A：猴头菇脂质亚类分布；B：纳米囊泡脂质亚类分布；C：猴头菇与纳米囊泡磷脂相对含量；D：猴头菇与纳米囊泡脂质差异火山图；E：猴头菇与纳米囊泡脂质OPLS-DA评分图。
Figure 6. Lipidomics analysis of Hericium erinaceus and HEDENVs
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图 7 猴头菇与纳米囊泡蛋白质组学分析
注：A：差异表达蛋白分布图；B：差异蛋白BP功能富集图；C：差异蛋白CC功能富集图；D：差异蛋白MF功能富集图；E：差异蛋白KEGG通路分析图。
Figure 7. Proteomic analysis of Hericium erinaceus and HEDENVs
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图 8 纳米囊泡的抗氧化活性
注：A：DPPH自由基清除率；B：ABTS+自由基清除率；C：超氧阴离子清除率；不同小写字母代表有显著性差异，P<0.05；图9同。
Figure 8. Antioxidant activity of HEDENVs
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图 9 不同处理组对Caco-2细胞存活率的影响
注：A：不同浓度H2O2对Caco-2细胞存活率的影响；B：不同浓度纳米囊泡对Caco-2细胞存活率的影响；C：不同浓度纳米囊泡对H2O2诱导的Caco-2细胞存活率的影响；ns表示无显著差异。
Figure 9. Effects of different treatment groups on the survival rate of Caco-2 cells
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图 10 不同浓度纳米囊泡处理H2O2损伤的Caco-2细胞后胞内ROS含量变化共聚焦成像图
Figure 10. Confocal microscopy images of intracellular ROS in Caco-2 damaged by H2O2 with different concentrations of HEDENVs
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图 11 不同浓度纳米囊泡处理H2O2损伤的Caco-2细胞后胞内ROS荧光定量统计图
注：A：空白对照组；B：900 μmol/L H2O2损伤组；C：100 μg/mL纳米囊泡处理组；D：200 μg/mL纳米囊泡处理组；E：300 μg/mL纳米囊泡处理组；F：400 μg/mL纳米囊泡处理组。
Figure 11. Quantitative statistical chart of fluorescence intensity of intracellular ROS in Caco-2 damaged by H2O2 with different concentrations of HEDENVs
表 1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels coding of response surface experiment
水平 因素 A蔗糖浓度（%） B离心时间（h） C离心转速（r/min） −1 15 1.5 60000 0 25 2 80000 1 35 2.5 100000 
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表 2 响应面分析试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiment
试验号 蔗糖浓度
（A）离心时间
（B）离心转速
（C）纳米囊泡浓度
（Y，μg/mL）1 −1 1 0 184.35 2 0 1 −1 378.29 3 0 0 0 426.37 4 1 1 0 277.64 5 1 0 −1 237.86 6 0 0 0 406.24 7 0 1 1 387.68 8 0 −1 1 364.78 9 1 0 1 287.45 10 −1 −1 0 162.48 11 0 0 0 418.93 12 0 0 0 438.17 13 −1 0 −1 147.43 14 0 −1 −1 308.86 15 1 −1 0 257.44 16 −1 0 1 163.29 17 0 0 0 408.31
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表 3 回归方程方差分析结果
Table 3 Regression equation variance analysis
变异源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 171200 9 19018.06 1543.52 <0.0001 *** A 23051.27 1 23051.27 1870.85 <0.0001 *** B 3239.72 1 3239.72 262.94 <0.0001 *** C 2137.27 1 2137.27 173.46 <0.0001 *** AB 17.06 1 17.06 1.38 0.2778 AC 284.43 1 284.43 23.08 0.002 ** BC 541.26 1 541.26 43.93 0.0003 ** A2 128700 1 128700 10448.29 <0.0001 *** B2 2417.49 1 2417.49 196.2 <0.0001 *** C2 4805.72 1 4805.72 390.04 <0.0001 *** 残差 86.25 7 12.32 失拟项 70.04 3 23.35 5.76 0.0619 不显著 误差 16.2 4 4.05 总和 171200 16 决定系数R2=0.9995；调整系数R2Adj=0.9988；变异系数CV=1.14% 注：***表示P<0.0001，差异高度显著；**表示P<0.01，差异极显著；*表示P<0.05，差异显著；图6同。
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