Optimization of Preparation Process of Antioxidant Peptides from Golden Pompano (Trachinotus ovatus) Skin by Response Surface Method and Its Composition Analysis
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摘要: 为促进金鲳鱼皮资源的综合利用，本研究以金鲳鱼皮为原料，探究其抗氧化肽的最佳制备工艺。以水解度和DPPH自由基清除率为考察指标，在单因素实验的基础上，结合响应面试验对金鲳鱼皮的酶解条件包括蛋白酶种类、酶解时间、加酶量、酶解温度以及酶解pH进行优化，得到金鲳鱼皮抗氧化肽的最佳酶解条件，并测定最佳条件下得到的酶解产物的分子量分布及氨基酸组成。结果表明，制备金鲳鱼皮抗氧化肽酶解效果最优的酶为碱性蛋白酶，其最佳酶解工艺为：酶解温度52.3 ℃、酶解pH10.0、酶解时间8.4 h、加酶量15409 U/g。通过最佳酶解条件制备得到的酶解产物的DPPH自由基清除率为81.59%±2.96%，其分子量主要分布在3000 Da以下，占比高达79.20%，其含有17种氨基酸，甘氨酸为主要氨基酸，疏水性氨基酸占比35.28%。本研究结果为金鲳鱼皮的高值化利用与抗氧化肽的筛选提供了一定的理论依据。Abstract: In order to promote the comprehensive utilization of the resource of golden pompano skin, this study investigated the optimal preparation process of its antioxidant peptides using golden pompano skin as raw material. Taking hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate as inspection indexes, the enzymatic hydrolysis conditions of golden pompano skin, including enzyme type, time, enzyme amount, temperature and pH were optimized on the basis of single factor experiment combined with response surface methodology. Therefore, the optimal enzymatic hydrolysis conditions of antioxidant peptides from golden pompano skin were obtained, and the molecular weight distribution and amino acid composition of enzymolysis product were further determined. The results showed that the optimal enzyme for the preparation of antioxidant peptides from the golden pompano skin was alkaline protease, and the optimal enzymatic hydrolysis conditions were: Enzymolysis temperature 52.3 ℃, pH10.0, time 8.4 h and enzyme amount 15409 U/g. The DPPH free radical scavenging rate of the enzymolysis product obtained under the optimal enzymatic hydrolysis conditions was 81.59%±2.96%. The molecular weight of the enzymolysis product was mainly distributed below 3000 Da, accounting for 79.20%. Besides, 17 kinds of amino acids were detected in the enzymolysis product, of which glycine was the main amino acid and hydrophobic amino acids accounted for 35.28%. The results of this study provide a theoretical basis for the high-value utilization of golden pompano skin and the screening of antioxidant peptides.
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氧化应激与许多慢性疾病的发病机制密切相关，而控制氧化损伤有利于减缓这些疾病发展或预防其并发症。食物来源制备的抗氧化肽是成本低廉、活性高、分子量低和易于吸收的健康抗氧化剂，具有结构简单、稳定、无害等优点，可以激活人体的抗氧化防御系统并减少氧化应激损伤[1]，在食品、医药、化妆品等领域具有潜在的应用前景[2]。鱼皮是水产品加工的主要副产物，含有丰富的蛋白质，其水解后的多肽具有较高的抗氧化活性，已成为近年来制备抗氧化肽的重要原料。近年来国内外针对不同来源的鱼皮抗氧化肽开展了大量研究，已从罗非鱼[3]、金枪鱼[4]、黑鲨[5]、鲣鱼[6]等多种鱼皮中提取得到了多种具有抗氧化活性的多肽，证实了鱼皮在抗氧化肽开发中的巨大潜力。
金鲳鱼（Trachinotus ovatus），属鲈形目，广泛分布于热带和亚热带海洋，是华南沿海一种重要的海水养殖经济鱼类。金鲳鱼生长迅速，肉质优良，含有蛋白质、微量元素、不饱和脂肪酸等多种营养成分，具有较高的营养价值[7]。自1990年人工育苗成功以及商业配方饲料的广泛应用，金鲳鱼的产量迅速增加[8−9]，2021年全国金鲳鱼海水养殖量产量达到24.39万吨[10]。金鲳鱼加工过程中会产生鱼头、鱼骨、鱼皮等废弃物，约占金鲳鱼总重量的50%，而这些废弃物的深加工利用有利于降低环境污染和促进金鲳鱼加工产业的发展。金鲳鱼鱼皮中蛋白质含量较高，约占湿基的23.48%，且富含胶原蛋白，其含量占鱼皮粗蛋白含量的83.33%，是提取胶原蛋白、制备生物活性肽的优质原料[11]。然而，目前国内外关于金鲳鱼皮蛋白或多肽的研究较少，主要集中在胶原蛋白的提取方面。Wang等[12]从金鲳鱼皮中提取酸溶性胶原蛋白（ASC）和酶溶性胶原蛋白（PSC），并对其性质进行了表征，发现ASC在25 ℃时可形成纤维凝胶，热稳定性较好，而PSC无此效果。廖伟等[11]对胃蛋白酶法提取金鲳鱼鱼皮酶溶性胶原蛋白（PSC）的提取工艺进行了优化，并与酸溶性胶原蛋白（ASC）的基本理化特性进行了对比研究，发现PSC有较高热变性温度（30.44 ℃），且与ASC有相似的电泳性质和红外峰型。目前，关于金鲳鱼皮多肽尤其是抗氧化肽的制备研究尚鲜见报道。
本研究以金鲳鱼皮为原料，以DPPH自由基清除率、铁离子还原能力、水解度为筛选指标，通过蛋白酶的筛选确定最佳酶解用酶。然后以水解度和DPPH自由基清除率为考察指标，探究不同酶解温度、酶解pH、酶解时间、加酶量、料液比下酶解产物的酶解效果。基于单因素实验的结果，结合响应面分析法进一步优化得到金鲳鱼皮抗氧化肽的最佳制备工艺，并测定酶解产物的分子量和氨基酸组成。本探究旨在为深度开发金鲳鱼产品、实现加工废弃物的高值化利用提供一定参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
金鲳鱼皮 湛江农贸市场；木瓜蛋白酶（800000 U/g）、酸性蛋白酶（50000 U/g）、菠萝蛋白酶（300000 U/g）、二硫代苏糖醇（DTT） 上海源叶生物科技有限公司；中性蛋白酶（50000 U/g）、碱性蛋白酶（200000 U/g）、胃蛋白酶（250 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、DL-丝氨酸 北京Solarbio（索莱宝）科技有限公司；三氯乙酸、2,2-联苯基-1-苦基肼基 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；铁氰化钾 福晨（天津）化学试剂有限公司；氯化铁、磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、邻苯二甲醛、十水合四硼酸钠、十二烷基硫酸钠等试剂均为国产分析纯 西陇科学股份有限公司。
M8双光束紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；DF-101S磁力搅拌水浴锅 上海力辰邦西仪器科技有限公司；Sigma 3-30K低温高速离心机 德国Sigma公司；ALPHA 1-4 LSC plus冷冻干燥机 德国CHRIST公司；LC-20高效液相色谱仪 日本Shimadzu（岛津）公司；A300全自动氨基酸分析仪 德国MembraPure公司。
1.2 实验方法
1.2.1 金鲳鱼皮抗氧化肽的制备工艺
金鲳鱼皮→剪碎→脱脂→除杂蛋白→研磨→冷冻干燥→酶解→灭酶→冷却→离心→抽滤→冷冻干燥→多肽。
操作要点：a.鱼皮预处理：将金鲳鱼皮解冻，刮除鱼皮上的鳞片和残留的鱼肉，剪成小块，用去离子水反复冲洗干净后用厨房纸吸干鱼皮表面的水分。
b.脱脂：使用脂肪酶法[13−14]对金鲳鱼皮进行脱脂处理，即称取定量鱼皮，按照1:4（w/v）的比例在烧杯中加入配好的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液（pH9.0），随后加入0.5%脂肪酶，并将其置于39 ℃恒温水浴锅内持续搅拌60 min。
c.除杂：将脱脂后的鱼皮按1:10（w/v）的比例加入0.1 mol/L NaOH溶液，在4 ℃下浸泡36 h，每12 h更换一次NaOH溶液，除去杂蛋白，然后使用蒸馏水反复冲洗鱼皮至中性。
d.冷冻干燥：将鱼皮液氮研磨后冷冻干燥，−20 ℃冷冻保存备用。
e.酶解：称取金鲳鱼皮，按1:20（w/v）的比例加入蒸馏水混匀，用0.1 mol/L氢氧化钠或盐酸溶液调整到适宜的pH，加入蛋白酶，在一定温度的恒温水浴锅内搅拌进行酶解，达到酶解设定时间后，沸水浴灭酶10 min，待冷却后，在4 ℃条件下以12000 r/min离心20 min，真空抽滤后，取上清液于4 ℃冷藏备用。
1.2.2 蛋白酶的筛选
选用中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶以及菠萝蛋白酶这7种蛋白酶，对经脱脂、除杂、冷冻干燥后的鱼皮进行初步水解，其中酶解设定条件为料液比1:20（w/v），加酶量6000 U/g，在7种蛋白酶的最适酶解条件（见表1）下酶解6 h，沸水浴灭酶10 min。以各蛋白酶的酶解液的水解度、DPPH自由基清除率以及铁离子还原能力为考察指标，通过综合比较，筛选出水解度以及抗氧化能力较高的蛋白酶进行后续实验。
表 1 不同种类蛋白酶的酶解条件Table 1. Enzymolysis conditions of different types of proteases酶的种类 pH 温度（℃） 料液比（g/mL） 加酶量（U/g） 时间（h） 中性蛋白酶 7 50 1:20 6000 6 酸性蛋白酶 3 40 1:20 6000 6 碱性蛋白酶 10 55 1:20 6000 6 胃蛋白酶 2 37 1:20 6000 6 胰蛋白酶 8 37 1:20 6000 6 木瓜蛋白酶 7 55 1:20 6000 6 菠萝蛋白酶 7 55 1:20 6000 6 1.2.3 酶解单因素实验
用筛选出的最佳用酶进行酶解，固定料液比1:20（w/v）、酶解温度55 ℃、酶解pH10.0、加酶量6000 U/g、酶解时间6 h；分别对酶解温度（35、45、55、65、75 ℃）、酶解pH（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）、酶解时间（2、4、6、8、10 h）、加酶量（2000、6000、10000、14000、18000 U/g）、料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL）进行单因素实验，并以水解度和DPPH自由基清除率为优化指标，探究各因素对金鲳鱼皮酶解产物的影响。
1.2.4 响应面试验设计
基于单因素实验结果，选取酶解时间、加酶量、酶解温度、酶解pH四个因素为自变量，以DPPH自由基清除率为因变量，设计四因素三水平的响应面优化试验。试验因素及水平见表2。
表 2 响应面试验因素及水平Table 2. Factors and levels of response surface test因素 水平 −1 0 1 A：酶解时间（h） 6 8 10 B：加酶量（U/g） 10000 14000 18000 C：酶解温度（℃） 45 55 65 D：酶解pH 9.0 10.0 11.0 1.2.5 抗氧化活性测定
1.2.5.1 DPPH自由基清除率测定
参考赵雅静[15]的方法测定DPPH自由基清除率。使用无水乙醇配制0.1 mmol/L DPPH溶液。分别吸取2 mL稀释后的酶解液和2 mL DPPH溶液，经过涡旋振荡混合均匀后，在避光状态下室温孵育30 min，随后在517 nm波长处测定混合溶液的吸光值，标记为A1。使用2 mL无水乙醇替代DPPH自由基溶液作为背景组，并测定其吸光值，记为A2。对于空白组则用2 mL蒸馏水替代酶解液，测定吸光值，记为A0。
DPPH自由基清除率由以下公式计算：
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (1) 1.2.5.2 铁离子还原能力测定
参考Liu等[16]的方法测定铁离子还原能力并略微改进。分别吸取0.2 mol/L磷酸钠缓冲液（pH6.6）、1%铁氰化钾溶液和稀释后的酶解液各1 mL于5 mL离心管中，经过涡旋振荡混合均匀后，将混合液置于50 ℃恒温水浴内反应20 min，取出，快速冷却至室温后，往混合液中加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，充分混合均匀后于离心机中在8000 r/min条件下离心10 min。吸取2 mL上清液与2 mL蒸馏水以及0.4 mL 0.1%三氯化铁溶液于新的离心管中，振荡混合均匀后在室温条件下静置10 min，测定混合溶液在700 nm处的吸光度。吸光度越大，意味着酶解产物的还原能力越强。
1.2.6 水解度（DH）测定
用邻苯二甲醛法（OPA）[17−19]测定水解度。取400 μL稀释到一定浓度的酶解液，加入3 mL OPA试剂，涡旋振荡5 s后，于室温下反应2 min，于340 nm波长下测定吸光度。分别取0、100、200、300、400 μL的100 μg/mL丝氨酸标准溶液于5 mL离心管中，加入蒸馏水补足体积至400 μL，然后加入3 mL OPA试剂，涡旋振荡5 s后，于室温下反应2 min，测定吸光度（以蒸馏水做参比溶液），并以丝氨酸标准品的浓度为横坐标x（mmol/L），以吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线。标准曲线方程为y=0.6385x+0.1546（R2=0.9999）。水解度由以下公式计算：
DH(%)=(Cserine×V×Nm×ω−β)htotα×100 (2) 式中：DH表示水解度，%；htot表示总肽键数，11.1 mmol/g；Cserine为样品中丝氨酸的当量浓度，mmol/L；V为酶解液定容体积，L；N为酶解液稀释倍数；m为鱼皮质量，g；ω为鱼皮中蛋白质含量，%；β为常数，0.457；α为常数，0.796。
1.2.7 分子量测定
参考Hu等[20]方法，稍作改进。采用TSKgel GMPWXL水相凝胶色谱柱通过HPLC系统测定金鲳鱼皮抗氧化肽的分子量分布。流动相为含有0.1 mol/L NaNO3和0.06% NaN3的水溶液；泵流速为1 mL/min；柱温为35 ℃；进样体积为20 μL；检测器为RID-20示差折光检测器。分别使用流动相配制浓度1 mg/mL的聚乙二醇系列标准品溶液（分子量分别为1212、2108、128040、467521、2085072 Da），过膜后上机分析，得到标准品的色谱图，以保留时间为x轴，分子量的对数为y轴作图得到标准曲线。标准曲线方程为：y=−0.7106x+15.239（R2=0.9990）。将金鲳鱼皮抗氧化肽配制为终浓度为10 mg/mL的溶液，过膜后上机进样，根据标准曲线方程计算得到多肽组分的分子量分布。
1.2.8 氨基酸组成测定
参考Lu等[21]的方法，通过全自动氨基酸分析仪对金鲳鱼皮抗氧化肽的氨基酸组成进行分析。称取50 mg样品于真空水解管中，小心往管内加入6 mol/L盐酸，使用氮吹仪充气15 min后封管，置于110 ℃烘箱水解24 h。待水解溶液冷却至室温后过滤转移至25 mL容量瓶中，并加入蒸馏水定容至刻度线。取1 mL定容后的水解液，利用氮吹仪脱酸至干燥，再加入1 mL样品缓冲溶液，混匀后使用0.22 μm滤膜过滤后利用全自动氨基酸分析仪对氨基酸含量进行分析。
1.3 数据处理
每组数据平行测定三次，数据采用平均值±标准差的形式表示，采用Design-Expert 10.0.3进行响应面设计，Excel 2021进行数据处理，SPSS 25进行统计与方差分析，Origin 2021进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 蛋白酶的筛选
七种蛋白酶分别在其最适条件下酶解得到的金鲳鱼皮酶解物的水解度、DPPH自由基清除率及铁离子还原能力的测定结果如图1所示。由图1A可知，7种蛋白酶中碱性蛋白酶的酶解产物的水解度最高，达到23.21%±0.21%，其次是木瓜蛋白酶（15.00%±0.22%）和酸性蛋白酶（14.11%±0.15%），胃蛋白酶的水解度最小，仅为2.15%±0.05%。这可能是因为碱性蛋白酶是一种内源性蛋白酶，具有广泛的底物特异性，可水解蛋白质内的大部分肽键和酰胺键[22]。由图1B可知，7种蛋白酶中碱性蛋白酶的酶解产物的DPPH自由基清除率和铁离子还原能力均最高，分别为68.23%±0.24%和0.43±0.01，胃蛋白酶与酸性蛋白酶的效果次之，而抗氧化效果最差的是胰蛋白酶的酶解产物。这可能是因为不同种类的蛋白酶的酶切位点各不相同，酶解所得到的多肽的氨基酸序列与分子量大小也有所区别，故多肽的抗氧化活性也会存在一定的差异性[23]。碱性蛋白酶的作用位点主要集中于蛋白质羧基侧链上的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸，其倾向于剪切Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和Gln的肽键，因而产生的多肽具有较强的抗氧化活性[24]。因此选择碱性蛋白酶作为最佳用酶进一步优化，该实验结果在蛋白酶种类的筛选上与文献所报道的研究结果一致[25−26]。
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2.2 单因素实验
2.2.1 不同酶解温度下酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率的变化
如图2所示，随着酶解温度的逐步增加，酶解产物的水解度和DPPH自由基清除率均呈现先上升后下降趋势。当酶解温度为55 ℃时，酶解产物的水解度达到最高值18.59%±0.23%，DPPH自由基清除率也达到最大值63.49%±0.29%。这是因为在适当的温度范围内，温度的提高有利于蛋白酶作用于底物，从而使酶促反应增强，但温度过高会引起酶的结构发生一定程度的变化，从而降低酶解效率，影响酶解效果[27]。这与刘聪等[28]研究的辣椒籽抗氧化肽酶解温度结果相似。因此确定55 ℃为最佳酶解温度。
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图 2 不同酶解温度下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率Figure 2. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different enzymatic hydrolysis temperatures2.2.2 不同酶解pH下酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率的变化
如图3所示，伴随酶解pH的逐渐增大，水解度和DPPH自由基清除率均呈先增加后减少趋势。当酶解pH为10时，水解度达到最高值20.20%±0.23%，DPPH自由基清除率也达到最大值70.53%±0.52%。蛋白酶只有在适宜的pH范围才能发挥其酶解效果，不适宜的pH条件会破坏蛋白酶内部的空间结构，从而使得蛋白酶的活性降低甚至失活，影响酶解效果[29]。这与王振强等[30]研究的皖鱼皮胶原蛋白活性肽酶解pH结果相似。因此确定pH10为最佳酶解pH。
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图 3 不同酶解pH下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率Figure 3. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different enzymatic hydrolysis pH2.2.3 不同酶解时间下酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率的变化
如图4所示，随着酶解时间的延长，水解度整体呈上升趋势，当酶解时间达到10 h时，水解度达到最大值，为22.57%±0.14%，但与8 h时的水解度（22.19%±0.41%）相比，差异不显著（P>0.05）。DPPH自由基清除率则呈先上升后平缓趋势，当酶解时间达到8 h时，DPPH自由基清除率达到最高值65.18%±1.74%。这是由于在酶解反应初期，酶活力较强，底物浓度也相对较高，蛋白酶的结合位点较多，水解度与DPPH自由基清除率增长迅速，随时间的推移和酶解产物浓度的积累，对酶解反应产生了抑制作用，进而使得酶促反应达到动态平衡，水解度和DPPH自由基清除率基本达到峰值[31]。因此确定8 h为最佳酶解时间。
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图 4 不同酶解时间下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率Figure 4. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different enzymatic hydrolysis time2.2.4 不同加酶量下酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率的变化
如图5所示，随着加酶量从2000 U/g增加至18000 U/g时，水解度呈先上升后下降趋势，而DPPH自由基清除率则呈逐渐上升趋势。当加酶量达到14000 U/g时，水解度达到最大值22.19%±0.17%，此时DPPH清除率达到65.42%±0.82%。这可能由于在一定条件下，随着加酶量的不断增大，酶解效率会不断提高，但加酶量达到一定数值时，酶与底物充分接触，使得水解完全，过多的酶可能导致竞争性抑制或酶自身相互水解，从而导致水解度下降[32]。综上，确定14000 U/g为最佳加酶量。
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图 5 不同加酶量下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率Figure 5. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different enzyme dosage2.2.5 不同料液比下酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率的变化
如图6所示，随着提取液用量的逐步增加，水解度和DPPH自由基清除率均逐渐降低，当料液比为1:10 g/mL时，水解度达到最高值23.22%±0.09%，DPPH自由基清除率也为最大值78.35±0.83%。由于提取液用量的增加，降低了反应体系中的底物浓度，使得底物与酶的接触概率变少，进而降低酶解产物的水解度和DPPH自由基清除率[33]。因此确定1:10 g/mL为最佳料液比。
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图 6 不同料液比下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率Figure 6. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different solid-liquid ratios2.3 响应面试验
2.3.1 响应面试验设计及结果
酶解工艺优化试验设计方案与结果如表3所示。
表 3 响应面试验方案及结果Table 3. Response surface test scheme and results试验号 因素 DPPH自由基清
除率（%）A酶解时间 B加酶量 C酶解温度 D酶解pH 1 −1 0 0 −1 75.64±0.36 2 1 −1 0 0 73.63±0.52 3 0 0 0 0 82.17±0.65 4 0 0 0 0 81.77±0.34 5 0 −1 1 0 68.77±0.60 6 0 0 1 1 65.14±0.45 7 −1 1 0 0 77.91±0.52 8 −1 0 −1 0 70.03±0.95 9 1 0 0 1 72.95±0.60 10 0 0 0 0 82.53±0.28 11 0 −1 0 −1 73.15±0.77 12 0 −1 −1 0 71.32±1.03 13 1 0 0 −1 74.35±0.84 14 0 0 −1 1 68.49±1.03 15 0 1 1 0 67.57±0.97 16 0 0 0 0 80.23±0.83 17 1 1 0 0 76.39±0.80 18 1 0 1 0 68.40±0.44 19 0 1 0 1 74.68±0.72 20 −1 0 1 0 68.10±0.81 21 0 1 0 −1 71.66±0.72 22 1 0 −1 0 77.08±0.57 23 0 1 −1 0 79.34±0.62 24 −1 0 0 1 67.58±0.26 25 0 0 −1 −1 70.94±1.43 26 0 0 0 0 80.93±0.21 27 0 0 1 −1 67.01±0.26 28 −1 −1 0 0 73.08±0.40 29 0 −1 0 1 65.91±0.71 2.3.2 模型的建立与方差分析
利用Design-Expert 10.0.3软件进行多元回归拟合，得到回归模型方程：Y=81.53+0.87A+1.81B−2.68C−1.5D−0.52AB−1.69AC+1.67AD−2.31BC+2.57BD+0.14CD−3A2−3.22B2−7.12C2−6.46D2。
方差分析的结果见表4。该模型的显著性水平P<0.0001，表明该回归模型拟合极显著；决定系数 R2=0.9644，调整决定系数 R2adj=0.9288，失拟项 P=0.1716>0.05 不显著，表明该方程可靠性较高，模型拟合程度较好，可以运用该模型进行预测和分析金鲳鱼皮的酶解工艺优化结果。通过F值的大小的比较可评估各个因素对响应值的影响程度，F值越大表示该因素对响应值的影响越显著。通过比较F值，可得知考察指标受各个因素的影响程度的排列顺序为：酶解温度（C）>加酶量（B）>酶解pH（D）>酶解时间（A）。
表 4 回归方程方差分析及显著性检验Table 4. Analysis of variance and significance test of regression equation方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 748.43 14 53.46 27.08 <0.0001 ** A 9.12 1 9.12 4.62 0.0496 * B 39.2 1 39.2 19.86 0.0005 ** C 86.46 1 86.46 43.8 <0.0001 ** D 27 1 27 13.68 0.0024 ** AB 1.07 1 1.07 0.54 0.4735 AC 11.39 1 11.39 5.77 0.0307 * AD 11.09 1 11.09 5.62 0.0327 * BC 21.25 1 21.25 10.77 0.0055 ** BD 26.32 1 26.32 13.33 0.0026 ** CD 0.084 1 0.084 0.043 0.8394 A2 58.4 1 58.4 29.59 <0.0001 ** B2 67.12 1 67.12 34.01 <0.0001 ** C2 328.76 1 328.76 166.56 <0.0001 ** D2 270.31 1 270.31 136.95 <0.0001 ** 残差 27.63 14 1.97 失拟项 24.12 10 2.41 2.74 0.1716 不显著 纯误差 3.52 4 0.88 总和 776.06 28 R2=0.9644 R2adj=0.9288 注：*表示显著，P<0.05；**表示极显著，P<0.01。 2.3.3 响应面优化试验结果
通过Design-Expert 10.0.3软件深入分析了各个因素之间的交互作用，并由此生成响应面图与等高线图如图7所示，DPPH自由基清除率随着各个因素值的增大而呈现先上升后下降的趋势。响应面的曲面陡峭程度与各因素对DPPH自由基清除率影响程度呈正相关关系；若响应曲面陡峭，表明该因素对响应值产生较大的影响，响应曲面平缓，则情况相反[34]。由图7（a）~（b）响应面曲面的坡度可知，DPPH自由基清除率受酶解温度和酶解pH的影响程度均超过酶解时间，而与酶解pH与酶解时间之间的交互作用相比，酶解温度与酶解时间之间的交互作用更强。图7（c）响应面曲面的坡度表明酶解温度对DPPH自由基清除率的影响程度高于加酶量，而图7（d）响应面曲面的坡度表明加酶量对DPPH自由基清除率的影响程度大于酶解pH。当等高线为圆形时，意味着两个因素之间的交互作用不显著，而椭圆形则意味着交互作用是显著的[35]。通过观察图7中四组等高线图，发现四组等高线图的形状均为椭圆形，说明酶解时间与酶解温度、酶解时间与酶解pH、酶解温度与加酶量、酶解pH与加酶量这四组因素之间具有显著的交互作用。
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图 7 四种因素交互作用的曲面图及等高线图Figure 7. Surface diagram and contour diagram of the interaction of four factors2.3.4 响应面试验验证
通过响应面回归方程模型优化，得到酶解的最佳工艺条件：酶解时间8.37 h、酶解pH9.98、加酶量15408.80 U/g、酶解温度52.32 ℃，在此工艺条件下得到的DPPH自由基清除率最高，其预测值为82.30%。按照此酶解工艺条件进行验证实验，并结合实际操作，选取酶解时间8.4 h、酶解pH10.0、加酶量15409 U/g、酶解温度52.3 ℃，验证实验重复3次，得到的DPPH自由基清除率为81.59%±2.96%，预测值与实际结果的相对误差为0.87%，表明了该响应模型优化出的条件具有较高的可靠性[36]。
2.4 金鲳鱼皮抗氧化肽的分子量分布
金鲳鱼皮抗氧化肽的分子量分布如表5所示。由表5可知，金鲳鱼皮抗氧化肽的分子量主要分布在3000 Da以下，占比高达79.20%，其中分子量小于1000 Da的肽占比最高，达到30.77%，说明在最佳酶解工艺下酶解得到的金鲳鱼皮抗氧化肽大部分为小分子多肽。多肽的抗氧化活性与其分子量分布有关，低分子量的多肽能更有效地清除与氧化相关的自由基[37]。Wu等[38]的研究也表明分子量小于3000 Da的鲑鱼皮胶原蛋白水解液具有更高的DPPH自由基清除率。
表 5 金鲳鱼皮抗氧化肽分子量分布Table 5. Molecular weight distribution of antioxidant peptides from golden pompano skin分子量范围（Da） 峰面积相对比例（%） <1000 30.77 1000~2000 29.63 2000~3000 18.80 3000~5000 15.01 5000~10000 5.15 >10000 0.64 2.5 氨基酸组成测定结果
氨基酸组成对多肽抗氧化活性起着至关重要的作用[39]。金鲳鱼皮抗氧化肽的氨基酸组成及含量的测定结果见表6。由表6可得，金鲳鱼皮抗氧化肽具有丰富的氨基酸组成，包含了17种氨基酸，其总量为97.61 g/100 g，其中必需氨基酸的含量占氨基酸总量的18.17%。金鲳鱼皮抗氧化肽中含量最高的氨基酸是甘氨酸（26.62 g/100 g），占氨基酸总量的27.27%，其次是丙氨酸（14.39 g/100 g）、脯氨酸（9.64 g/100 g）和精氨酸（9.24 g/100 g），含量最低为胱氨酸（0.07 g/100 g）。甘氨酸因其侧链上的单个氢原子可作为质子供体来中和活性自由基，有助于提高多肽的抗氧化活性[40]。脯氨酸可通过单电子转移来清除自由基，其具有一个特殊的吡咯烷酮环，电离势较低，可淬灭单线态氧，增强多肽的抗氧化活性[41]。金鲳鱼抗氧化肽中疏水性氨基酸（Trp、Phe、Val、Leu、lle、Ala、Met和Pro）的含量占氨基酸总量的35.28%。疏水性氨基酸可以作为芳香残基侧链上自由基过氧化的供氢体来提高多肽的抗氧化活性，其残基可促进多肽与脂质中自由基的相互作用，有利于清除脂相产生的自由基[42]。疏水性氨基酸C末端的肽键在水解过程中发生断裂，裂解后疏水性氨基酸位于新肽链的端基，从而发挥其抗氧化能力[43]。本研究制备得到的金鲳鱼皮抗氧化肽中疏水性氨基酸含量较高，这可能是其具有较强的抗氧化活性的原因之一。
表 6 金鲳鱼皮抗氧化肽氨基酸组成和含量Table 6. Amino acid composition and content of antioxidant peptides from golden pompano skin氨基酸种类 氨基酸名称 含量（g/100 g） 必需氨基酸 苏氨酸（Thr） 2.43 酪氨酸（Tyr） 0.57 胱氨酸（Cys-s） 0.07 缬氨酸（Val） 1.82 甲硫氨酸（Met） 2.05 苯丙氨酸（Phe） 2.52 异亮氨酸（Ile） 1.19 亮氨酸（Leu） 2.83 赖氨酸（Lys） 4.26 非必需氨基酸 谷氨酸（Glu） 8.75 丝氨酸（Ser） 2.00 天冬氨酸（Asp） 6.74 甘氨酸（Gly） 26.62 丙氨酸（Ala） 14.39 脯氨酸（Pro） 9.64 半必需氨基酸 组氨酸（His） 2.48 精氨酸（Arg） 9.24 总量 97.61 3. 结论
本文以金鲳鱼皮为原料，以抗氧化活性和水解度为指标，筛选得到水解金鲳鱼皮制备抗氧化肽的最佳用酶为碱性蛋白酶。通过单因素实验和响应面试验优化得到金鲳鱼皮抗氧化肽的最佳制备工艺条件为酶解时间8.4 h、酶解pH10.0，加酶量15409 U/g、酶解温度52.3 ℃，在上述条件下所制备的酶解产物的DPPH自由基清除率为81.59%±2.96%。分子量分布和氨基酸组成结果表明，金鲳鱼皮抗氧化肽中分子量小于3000 Da的多肽含量占79.20%，其大部分为小分子肽，其含有17种氨基酸，其中甘氨酸的含量最多，达到27.27%，与抗氧化活性相关的疏水性氨基酸的含量为35.28%。本研究优化得到了金鲳鱼皮抗氧化肽的最佳酶解制备工艺，并分析了其分子量分布和氨基酸组成，研究结果可为金鲳鱼皮抗氧化肽的有效制备及金鲳鱼皮资源的合理利用提供一定的参考依据，也为金鲳鱼的深加工产业的发展方向提供了新思路。但本研究仅对金鲳鱼皮酶解混合肽的结构组成进行了初步探究，要想进一步明确其构效关系，后续可通过超滤、柱层析等手段对其进行分离纯化，得到抗氧化活性更高的肽段并鉴定其氨基酸序列。
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图 2 不同酶解温度下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率
Figure 2. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different enzymatic hydrolysis temperatures
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图 3 不同酶解pH下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率
Figure 3. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different enzymatic hydrolysis pH
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图 4 不同酶解时间下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率
Figure 4. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different enzymatic hydrolysis time
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图 5 不同加酶量下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率
Figure 5. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different enzyme dosage
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图 6 不同料液比下金鲳鱼皮酶解产物的水解度及DPPH自由基清除率
Figure 6. Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate of enzymatic products of golden pompano skin at different solid-liquid ratios
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图 7 四种因素交互作用的曲面图及等高线图
Figure 7. Surface diagram and contour diagram of the interaction of four factors
表 1 不同种类蛋白酶的酶解条件
Table 1 Enzymolysis conditions of different types of proteases
酶的种类 pH 温度（℃） 料液比（g/mL） 加酶量（U/g） 时间（h） 中性蛋白酶 7 50 1:20 6000 6 酸性蛋白酶 3 40 1:20 6000 6 碱性蛋白酶 10 55 1:20 6000 6 胃蛋白酶 2 37 1:20 6000 6 胰蛋白酶 8 37 1:20 6000 6 木瓜蛋白酶 7 55 1:20 6000 6 菠萝蛋白酶 7 55 1:20 6000 6 
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表 2 响应面试验因素及水平
Table 2 Factors and levels of response surface test
因素 水平 −1 0 1 A：酶解时间（h） 6 8 10 B：加酶量（U/g） 10000 14000 18000 C：酶解温度（℃） 45 55 65 D：酶解pH 9.0 10.0 11.0
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表 3 响应面试验方案及结果
Table 3 Response surface test scheme and results
试验号 因素 DPPH自由基清
除率（%）A酶解时间 B加酶量 C酶解温度 D酶解pH 1 −1 0 0 −1 75.64±0.36 2 1 −1 0 0 73.63±0.52 3 0 0 0 0 82.17±0.65 4 0 0 0 0 81.77±0.34 5 0 −1 1 0 68.77±0.60 6 0 0 1 1 65.14±0.45 7 −1 1 0 0 77.91±0.52 8 −1 0 −1 0 70.03±0.95 9 1 0 0 1 72.95±0.60 10 0 0 0 0 82.53±0.28 11 0 −1 0 −1 73.15±0.77 12 0 −1 −1 0 71.32±1.03 13 1 0 0 −1 74.35±0.84 14 0 0 −1 1 68.49±1.03 15 0 1 1 0 67.57±0.97 16 0 0 0 0 80.23±0.83 17 1 1 0 0 76.39±0.80 18 1 0 1 0 68.40±0.44 19 0 1 0 1 74.68±0.72 20 −1 0 1 0 68.10±0.81 21 0 1 0 −1 71.66±0.72 22 1 0 −1 0 77.08±0.57 23 0 1 −1 0 79.34±0.62 24 −1 0 0 1 67.58±0.26 25 0 0 −1 −1 70.94±1.43 26 0 0 0 0 80.93±0.21 27 0 0 1 −1 67.01±0.26 28 −1 −1 0 0 73.08±0.40 29 0 −1 0 1 65.91±0.71
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表 4 回归方程方差分析及显著性检验
Table 4 Analysis of variance and significance test of regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 748.43 14 53.46 27.08 <0.0001 ** A 9.12 1 9.12 4.62 0.0496 * B 39.2 1 39.2 19.86 0.0005 ** C 86.46 1 86.46 43.8 <0.0001 ** D 27 1 27 13.68 0.0024 ** AB 1.07 1 1.07 0.54 0.4735 AC 11.39 1 11.39 5.77 0.0307 * AD 11.09 1 11.09 5.62 0.0327 * BC 21.25 1 21.25 10.77 0.0055 ** BD 26.32 1 26.32 13.33 0.0026 ** CD 0.084 1 0.084 0.043 0.8394 A2 58.4 1 58.4 29.59 <0.0001 ** B2 67.12 1 67.12 34.01 <0.0001 ** C2 328.76 1 328.76 166.56 <0.0001 ** D2 270.31 1 270.31 136.95 <0.0001 ** 残差 27.63 14 1.97 失拟项 24.12 10 2.41 2.74 0.1716 不显著 纯误差 3.52 4 0.88 总和 776.06 28 R2=0.9644 R2adj=0.9288 注：*表示显著，P<0.05；**表示极显著，P<0.01。
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表 5 金鲳鱼皮抗氧化肽分子量分布
Table 5 Molecular weight distribution of antioxidant peptides from golden pompano skin
分子量范围（Da） 峰面积相对比例（%） <1000 30.77 1000~2000 29.63 2000~3000 18.80 3000~5000 15.01 5000~10000 5.15 >10000 0.64
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表 6 金鲳鱼皮抗氧化肽氨基酸组成和含量
Table 6 Amino acid composition and content of antioxidant peptides from golden pompano skin
氨基酸种类 氨基酸名称 含量（g/100 g） 必需氨基酸 苏氨酸（Thr） 2.43 酪氨酸（Tyr） 0.57 胱氨酸（Cys-s） 0.07 缬氨酸（Val） 1.82 甲硫氨酸（Met） 2.05 苯丙氨酸（Phe） 2.52 异亮氨酸（Ile） 1.19 亮氨酸（Leu） 2.83 赖氨酸（Lys） 4.26 非必需氨基酸 谷氨酸（Glu） 8.75 丝氨酸（Ser） 2.00 天冬氨酸（Asp） 6.74 甘氨酸（Gly） 26.62 丙氨酸（Ala） 14.39 脯氨酸（Pro） 9.64 半必需氨基酸 组氨酸（His） 2.48 精氨酸（Arg） 9.24 总量 97.61
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