Screening of N-Acyl Homoserine Lactone-degrading Bacteria and Evaluation of Their Quorum Quenching Activities
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摘要: 为了研究土壤中具有群体感应淬灭作用的细菌类型以及其群体感应淬灭活性，本研究对土壤中可降解蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）所产N-酰基高丝氨酸内酯的菌株进行了筛选、分离和鉴定，对群体感应淬灭菌的特性以及其对蜂房哈夫尼菌生物被膜的抑制和清除能力进行了分析，并通过特异性引物扩增判断菌株可能产群体感应淬灭酶类型。共从土壤中分离到4株对蜂房哈夫尼菌所分泌的群体感应信号分子具有较高降解活性的细菌，经鉴定分别为霍氏肠杆菌（Enterobacteri hormaechei）GS31、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）GS44、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）GS48和沙雷氏菌（Serratia sp.）GS53；其中霍氏肠杆菌 GS31的淬灭活性最强，其次为沙雷氏菌GS53、蜡样芽孢杆菌GS44和苏云金芽孢杆菌GS48。霍氏肠杆菌GS31和沙雷氏菌GS53的潜在群体感应淬灭活性物质存在无细胞上清液中（Cell-free supernatant，CFS），而蜡样芽孢杆菌 GS44和苏云金芽孢杆菌GS48存在于细胞破碎提取物（Crude cell extract，CCE）中；结合结晶紫染色和光学显微镜分析结果发现，所分离的菌株具有不同程度的抑制和清除蜂房哈夫尼菌生物被膜能力，其中霍氏肠杆菌GS31的抑制率和清除率最高，分别为42.9%和53.0%。同源基因扩增结果表明，霍氏肠杆菌GS31、蜡样芽孢杆菌GS44、沙雷氏菌GS53中可能存在AiiA内酯酶和PvdQ酰化酶基因，苏云金芽孢杆菌GS48中可能存在AiiA内酯酶基因。通过对土壤中可降解N-酰基高丝氨酸内酯菌株的筛选及其群体感应淬灭活性研究，为进一步丰富群体感应淬灭菌资源，以及基于群体感应淬灭菌的水产保鲜剂的开发奠定了基础。
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关键词:
- N-酰基高丝氨酸内酯 /
- 群体感应 /
- 群体感应淬灭 /
- 生物被膜 /
- 蜂房哈夫尼菌
Abstract: To study the types of quorum quenching bacteria in soil and their quorum quenching characteristics, the study screened, isolated, and identified quorum quenching strains from soil and assessed their quorum quenching properties, the inhibitory and dispersion abilities on the biofilm of Hafnia alvei (H. alvei), and the potential types of quorum quenching enzymes by specific primer amplification. Four bacteria that showed significant degrading activity against the quorum sensing signals produced by H. alvei were isolated and identified as Enterobacter hormaechei (GS31), Bacillus cereus (GS44), Bacillus thuringiensis (GS48), and Serratia sp. (GS53). E. hormaechei GS31 exhibited the highest level of quenching activity, followed by Serratia sp. GS53, B. cereus GS44, and B. thuringiensis GS48. The cell-free supernatant of E. hormaechei GS31 and Serratia sp. GS53 contained compounds with potential quorum quenching activity, whereas the crude cell extract of B. cereus GS44 and B. thuringiensis GS48 contained such chemicals. The crystal violet staining and optical microscopy assay indicated that the isolated strains exhibited different inhibitory and dispersion capabilities against the biofilm of H. alvei. Among them, E. hormaechei GS31 exhibited the most significant effect, with inhibition and dispersion rates of 42.9% and 53.0%, respectively. The homologous gene amplification results suggested E. hormaechei GS31, B. cereus GS44, and Serratia sp. GS53 likely involved AiiA lactonase and PvdQ acylase gene. Additionally, B. thuringiensis GS48 was likely to possess AiiA lactonase gene. The screening and study of quorum quenching activity of strains degrading N-acyl homoserine lactone in soil enriching quorum quenching bacterial resources and provide a theoretical reference for developing aquaculture preservatives based on quorum quenching bacteria.-
Keywords:
- N-acyl homoserine lactone /
- quorum sensing /
- quorum quenching /
- biofilm /
- Hafnia alvei
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微生物代谢活动是造成水产品腐败变质的主要原因之一[1]。研究表明多种腐败微生物毒力因子的产生受群体感应系统（Quorum sensing，QS）调控，QS系统依赖于信号分子浓度的变化，当信号分子浓度达到一个临界浓度时，会启动细菌相关基因表达，调控其生物行为包括生物胺、生物被膜等的形成，容易导致细菌引起腐败发生[2]。QS信号分子主要有3种：自诱导肽（5~10氨基酸环内酯）、N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactonase，AHLs）、自动诱导剂2（Auto inducer-2, AI-2，呋喃硼酸二酯）[3−5]。水产品腐败的优势腐败菌主要为革兰氏阴性菌，其QS信号分子类型主要是AHLs[6−7]。已报道其为AHLs介导的LuxI/R群体感应系统，分泌N-丁酰-L-高丝氨酸内酯（N-butyryl-L-homoserine lactone，C4-HSL）、N-己酰-L高丝氨酸内酯（N-hexanoyl-L-homoserine lactone，C6-HSL）及N-（3-氧代辛酰基）-L-高丝氨酸内酯（N-3-oxo-octanoyl-L-homoserine lactone，3-oxo-C8-HSL）短链信号分子[8]。
已有研究表明可以通过抑制QS系统即通过群体感应淬灭（Quorum quenching，QQ）作用控制细菌导致的水产品腐败。Wang等[9]从荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）PF08中得到一种QS抑制剂，可以抑制红鲷鱼腐败变质中优势腐败菌维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）的QS系统，抑制维氏气单胞菌毒力因子的产生，有效延长了红鲷鱼的货架期。还有研究人员发现胞苷-5'-单磷酸（5'-CMP）和5'-腺苷酸（5'-AMP）也可以作为QS抑制剂用于抑制水产品中特定腐败微生物荧光假单胞菌及希瓦氏菌（Shewanella spp.）的QS系统，降低QS信号分子水平，有效延长鲑鱼片的保质期[10]。QS抑制剂种类很多，QQ酶就是其中的一种[11]。迄今为止，已经报道了多种QQ酶，微生物是QQ酶的一个主要来源，包括细菌、真菌等在内的多种微生物都可分泌QQ酶[12−13]。
生物被膜是微生物通过自身生产的胞外聚合物基质建立的一种复杂的微生物群落，其生命周期可以分为四个阶段，即细胞的可逆黏附、不可逆黏附及细胞外基质产生、生物被膜的成熟以及分解[14−16]。生物被膜的存在提高了细菌对抗生素耐受性[17]，也使得其清除变得困难。目前研究表明QQ作用可以起到抑制和清除生物被膜的作用。结合乳杆菌（Lactobacillus crustorum）ZHG2-1粗提物通过降解C4-HSL和N-（3-氧代十二烷酰基）-L-高丝氨酸内酯（N-（3-Oxododecanoyl）-L-homoserine lactone，3-oxo-C12-HSL），进而显著抑制了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物被膜，抑制率能达到47.3%[18]。皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）HITSZ001能够降解C6-HSL，24 h降解率能达到57.46%，同时使铜绿假单胞菌PAO1与PA14的生物被膜形成分别减少了32.97%和22.63%[19]。副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）ZP1能够产生YntP内酯酶，且对长链与短链信号分子都有降解能力，但对长链信号分子的降解能力更为显著，因而与铜绿假单胞菌PAO1、BR5H共孵育时，显著抑制其生物被膜的形成，抑制率分别能达到25.0%与85.0%[20]。
土壤是微生物多样性和丰富度最高的自然环境之一。土壤中存在着大量未知微生物种类，其中可能包含具有QQ能力的菌株。通过在土壤样品中寻找具有降解AHLs能力的菌株，可以进一步扩展我们对QQ菌的了解，并探索其在其他环境中的潜在应用价值。此外，由于土壤是许多微生物的天然栖息地，从土壤中筛选出的菌株更有可能适应复杂的环境条件，并表现出较高的AHLs降解能力。因此，本研究拟从土壤中筛选具有能够降解蜂房哈夫尼菌AHLs的菌株，为进一步丰富QQ菌资源，以及基于QQ菌的水产品保鲜剂开发奠定了基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
Taq PCR Mix预混液、4S GelBlue核酸染料、Real Band DNA分子量标准Marker BBI试剂公司；不同碳链长度AHLs标准品、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷（X-gal） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；紫色杆菌（C. violaceum）CV026、根癌农杆菌（A. tumefaciens）A136 本实验室保存；蜂房哈夫尼菌 本实验室从腐败三文鱼中分离。
HZQ-X300C型恒温振荡器 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台 德国Airtech公司；Quantity One型全自动凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。
1.2 实验方法
本研究利用腐败三文鱼源蜂房哈夫尼菌所产生的AHLs信号分子作为测定对象，以紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV026及根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）A136为指示菌，从土壤中筛选具有能够降解蜂房哈夫尼菌AHLs的菌株，对QQ菌降解特定信号分子的能力进行测定，并分析QQ酶位置及热稳性，同时测定了QQ菌对H. alvei生物被膜的抑制与清除能力。此外本研究还利用特异性引物扩增QQ酶同源基因，判断其可能产生的QQ酶类型，主要实验设计如图1所示。
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图 1 土壤中可降解AHLs的QQ菌株筛选及特性分析流程示意图Figure 1. Schematic diagram of screening and characterization evaluation process of QQ strains with degrading AHLs abilities from the soil1.2.1 菌株初筛
10 g土壤样品与90 g无菌水混合均匀，取100 µL涂布到LB固体培养基平板，培养24~48 h，挑取培养基上不同形态的菌株单菌落接种于LB肉汤中，培养24~48 h后保存菌株。
1.2.2 蜂房哈夫尼菌发酵液中AHLs提取
参考Shen等[21]的方法并稍做修改。将蜂房哈夫尼菌在LB肉汤中活化，以10000 r/min离心10 min得到上清液，后与等体积乙酸乙酯（0.1%（v/v）冰乙酸）混合，于分液漏斗中萃取3 h，重复萃取2~3次，用旋转蒸发器（35 ℃，150 r/min）蒸发至干燥得到AHLs。
1.2.3 降解蜂房哈夫尼菌AHLs菌株筛选
参考Reina等[22]的方法，具体操作如下。将从蜂房哈夫尼菌提取的8 µL AHLs甲醇溶液加入到800 µL分离筛选得到的QQ菌液中，共孵育24 h（28 ℃），后离心取上清，并将上清液通过0.22 µm滤膜得到无细胞上清液（Cell-free supernatant，CFS）。取活化后的紫色杆菌 CV026菌液，按1%~2%接种量于 LB半固体培养基，混匀后倒入放置牛津杯平板中，凝固后去除牛津杯，加100 µL CFS于孔洞中，28 ℃培养24~48 h。根据孔洞周围紫色圈的产生和大小，判断AHLs的降解情况。
1.2.4 QQ菌鉴定
将QQ菌株接种于LB肉汤中活化培养，后4 ℃离心5 min，收集菌体，通过DNA提取试剂盒提取具有QQ活性的菌株的DNA后进行PCR扩增，扩增引物为通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’）。反应体系为上下游引物各2 μL、DNA模板1 μL、2×TaqPCR Master Mix25 μL、ddH2O 20 μL； 95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环。对PCR产物测序（生工生物上海股份有限公司）。利用NCBI的BLASTN程序对测序结果进行序列比对，采用MEGA7.0软件（Neighbor-joining）构建系统发育树。
1.2.5 QQ菌对特定信号分子的降解能力分析
采用96孔板测定QQ菌对不同信号分子的降解能力。将终浓度为10 μmol/L的不同信号分子与800 µL QQ菌菌液共孵育24 h（28 ℃）。将共孵育物离心（11000×g，10 min，4 ℃），取上清，并将上清液通过0.22 µm的滤膜得到CFS。QQ菌对短链信号分子C4-HSL、C6-oxo-HSL、C6-HSL和C8-HSL的降解能力以紫色杆菌 CV026为指示菌，观察孔板中紫色程度变化；QQ菌对长链信号分子C10-HSL和C12-HSL的降解能力以根癌农杆菌 A136为指示菌，观察孔板中蓝色程度变化。
1.2.6 QQ活性物质确定及热稳定性分析
参考Reina等[23]的实验方法，确定具有QQ活性菌株QQ活性成分的位置，具体操作如下。分别取800 µL QQ菌的CFS与细胞破碎提取物（Crude cell extract，CCE），与8 μL AHLs混合，在28 ℃下共孵育 24 h，将共孵育物加入到含有紫色杆菌CV026的半固体培养基的孔洞中，观察是否有紫色圈生成，及生成紫色圈的大小，从而确定有效成分是在细胞内还是在细胞外。同时为了验证QQ活性物质的热稳定性，将其在100 ℃水浴30 min之后与AHLs共孵育24 h，用琼脂扩散法检测AHLs的降解情况。
1.2.7 对蜂房哈夫尼菌生物被膜抑制和清除能力
参考Raissa等[24]的方法测定QQ菌对蜂房哈夫尼菌生物被膜的抑制与清除能力。抑制能力：在含有100 μL LB肉汤96孔板中加入100 μL CFS或CCE，后添加2%蜂房哈夫尼菌到孔板中，过夜培养，后弃去菌液，用PBS冲洗风干后，利用0.1%的结晶紫染液进行染色20 min，利用无水乙醇脱色20 min，根据OD595 nm的数值判断活性物质对蜂房哈夫尼菌生物被膜形成的抑制情况。清除能力：预先在孔板中过夜培养蜂房哈夫尼菌使其形成生物被膜，后弃去菌液，加入QQ菌CFS或CCE共孵育12 h使其形成成熟生物被膜，后弃去菌液，用PBS冲洗风干后，利用0.1%的结晶紫染液进行染色20 min，利用无水乙醇脱色20 min，根据OD595 nm判断活性物质对蜂房哈夫尼菌生物被膜的清除情况，计算公式如下：
式中：A1为不经QQ菌CFS或CCE处理测得的OD595 nm吸光度值；A2为经QQ菌CFS或CCE处理测得的OD595 nm吸光度值。
参考Li等[25]的方法，观察生物被膜形态。抑制条件下生物被膜形态：在提前放置无菌细胞爬片12孔板加入CFS或CCE，加入LB肉汤，并按照2%的接种量添加活化好的蜂房哈夫尼菌，28 ℃ 培养48 h，后取出爬片，用甲醇固定15~20 min，0.1%的结晶紫染液进行染色20 min，洗去多余染色液后在光学显微镜下观察。清除后生物被膜形态：在提前放置无菌细胞爬片孔板中过夜培养蜂房哈夫尼菌，使其形成生物被膜，后弃去菌液，加入QQ菌CFS或CCE共孵育12 h，取出细胞爬片，后续操作和观察步骤同上。
1.2.8 PCR扩增QQ酶同源基因
根据对QQ菌鉴定结果通过特定引物扩增判断所分离的QQ菌是否有AHLs内酯酶基因（aiiA）和酰化酶基因（pvdQ和quiP）的存在[26]，参考Khalid等[4]的方法并稍做修改，针对所选基因保守序列设计两类主要QQ酶（内酯酶和酰化酶）的引物（表1）。PCR扩增条件为94 ℃初始变性5 min，94 ℃（45 s），44 ℃（45 s），72 ℃（1 min）5次循环；94 ℃（45 s），53 ℃（45 s），72 ℃（1 min），30个循环，然后引物在72 ℃延伸8 min[27]。后采用1%琼脂糖凝胶电泳验证目的条带是否存在，同时判断PCR扩增产物大小。
表 1 两大类群体感应淬灭基因（内酯酶和酰化酶）引物Table 1. Primers for two main categories of quorum quenching genes (lactonase and acylase)引物名称 引物序列（5’-3’） 目的基因 扩增片段
大小（bp）aiiA F GATGGCCTGGAGAATGAC
R GCGTGTAGGGTATGAGCC内酯酶基因 257 pvdQ F GTTCTGCACGAAGTCCCTG
R GCTGTTGGGTTCGATGATG酰化酶基因 1411 quiP F GTCGGCCAGGTAATAGAGC
R GCTACCGTCCGGAATACTG酰化酶基因 572 1.3 数据处理
相关研究均进行三次独立重复实验，使用SPSS 25.0进行统计分析（P<0.05），Origin 2022作图。
2. 结果与分析
2.1 QQ菌的筛选和鉴定
以紫色杆菌CV026作为指示菌株，对从土壤分离得到的菌株降解蜂房哈夫尼菌短链信号分子的能力进行检测，通过琼脂扩散法根据其所产生紫色圈的大小进行评价。结果表明，所分离的菌株中有四株具有降解蜂房哈夫尼菌产生的信号分子的能力，显示出QQ活性（图2A）。根据革兰氏染色结果确定GS31与GS53为革兰氏阴性杆菌、GS44与GS48为革兰氏阳性杆菌。对四株菌株进行形态学观察及16S rDNA测序，并通过BLASTN对测序结果进行序列比对以及MEGA7.0软件构建系统发育树。结果表明，GS31在平板上呈圆形、表面光滑、不透明，其核苷酸序列与霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）香方根亚种菌株BPB23有99.99%同源性判断其为霍氏肠杆菌；GS53在平板上凸起、边缘不规则，核苷酸序列与粘质沙雷氏菌（Serratia sp.）同源性为99.00%，判断其为沙雷氏菌；GS44在平板上呈近圆形、稍有光泽，核苷酸序列与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）B1有99.76%同源性，判断其为蜡样芽孢杆菌；GS48在平板上呈现椭圆形、淡黄色、不透明微隆起形态，核苷酸序列与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）L33同源性为99.99%（图2B、图2C）。
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图 2 具有降解蜂房哈夫尼菌信号分子的菌株的筛选和鉴定注：A：菌株对蜂房哈夫尼菌信号分子的降解活性；B：菌株形态；C：系统发育树分析。Figure 2. Screening and identification of strains with quorum quenching abilities against signals of H. alvei2.2 QQ菌对特定信号分子的降解能力
通过观察指示菌株产生色素的变化评价QQ菌对不同碳链长度的AHLs的降解能力（图3，表2）。结果表明，四株菌对不同的信号分子都有一定的降解能力但是降解效果不同，对于短链AHLs降解能力最强的为沙雷氏菌GS53，其次为霍氏肠杆菌GS31、蜡样芽孢杆菌GS44与苏云金芽孢杆菌GS48；对长链信号分子降解能力最强的为蜡样芽孢杆菌GS44，其次为沙雷氏菌GS53、霍氏肠杆菌GS31与苏云金芽孢杆菌GS48。其中，霍氏肠杆菌GS31能够显著降解短链AHLs，对长链AHLs降解能力较弱。Torabi等[28]从虹鳟鱼中分离出多株具有QQ活性的菌株，其中的霍氏肠杆菌可以降解C6-HSL，与本实验结果一致。沙雷氏菌GS53能够显著降解短链AHLs C4-HSL、3-oxo-C6-HSL、C6-HSL及C8-HSL，其在孔板中生成的紫色色素明显少于对照组，对长链C10-HSL与C12-HSL也有一定的降解能力，但是降解效果相较于短链AHLs较差。已有研究表明，沙雷氏菌可能具有QQ活性，其生长可利用C8-HSL作为唯一碳源，可以水解C8-HSL内酯键[29]。苏云金芽孢杆菌GS48在一定程度上能够降解短链和长链AHLs，且降解能力相当。Anandan等[30]研究了苏云金芽孢杆菌KMCL07对铜绿假单胞菌PAO1的QQ活性，发现该菌株能够产生AiiA内酯酶，且对长链和短链AHLs都有一定的降解能力，其中对于短链AHLs的降解能力较强，与本实验结果略有差异，可能是菌株来源不同导致菌株的特异性。蜡样芽孢杆菌GS44对于短链AHLs的降解能力相对于长链AHLs明显较弱，但是相对于对照组生成紫色色素明显减少。Raafat等[31]发现蜡样芽孢杆菌能够产生AHLs内酯酶，具有广泛的AHLs降解能力，对多种短链和长链信号分子的降解能力能够达到100%。综上所述，初步判断沙雷氏菌GS53 QQ活性最强，其次为霍氏肠杆菌GS31、蜡样芽孢杆菌GS44与苏云金芽孢杆菌GS48。
表 2 四株菌对六种不同AHLs的QQ活性Table 2. QQ activity of the four strains to six different AHLsAHLs 指示菌株 GS31 GS44 GS48 GS53 C4-HSL CV026 +++ ++ ++ +++ C6-HSL CV026 +++ ++ ++ +++ C6-oxo-HSL CV026 +++ ++ ++ +++ C8-HSL CV026 ++ ++ ++ ++ C10-HSL A136 ++ ++++ ++ ++ C12-HSL A136 ++ +++ ++ ++ 注：超强降解活性：++++；强降解活性：+++；中等降解活性：++；无降解活性：−。 2.3 QQ活性物质位置和热稳定性分析
通过测定QQ菌CFS及CCE的QQ活性，确定QQ菌所产生QQ酶的位置。结果表明，霍氏肠杆菌GS31与沙雷氏菌GS53所产生的QQ活性物质存在于CFS中而CCE中未检测到QQ活性；蜡样芽孢杆菌GS44与苏云金芽孢杆菌GS48 QQ活性物质存在于CCE中（图4A）。同时对四株QQ菌所产生QQ活性物质的在100 ℃下热稳定性进行了判断，结果表明，四株QQ菌所产QQ活性物质基本都失去QQ活性（图4B）。
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图 4 QQ菌活性物质位置及热稳定性分析注：A：QQ菌活性物质位置；B：活性物质热稳定性。Figure 4. Location of the active substance of QQ bacteria and its thermal stability2.4 对蜂房哈夫尼菌生物被膜的抑制和清除能力
四株QQ菌都能在一定程度上显著抑制蜂房哈夫尼菌生物被膜的形成，也能够在一定程度上清除成熟的生物被膜。其中霍氏肠杆菌GS31对蜂房哈夫尼菌生物被膜的抑制能力最优，抑制率达到42.9%，其次是蜡样芽孢杆菌GS44、沙雷氏菌GS53与蜡样芽孢杆菌GS44与苏云金芽孢杆菌GS48抑制率分别达到39.6%、38.3%、与30.7%（图5A）；在对蜂房哈夫尼菌生物被膜清除能力测定中，霍氏肠杆菌GS31对其清除能力最强，清除率能达到53%，其次是沙雷氏菌GS53、苏云金芽孢杆菌GS48与蜡样芽孢杆菌GS44，清除率分别为50.0%、45.4%与42.5%（图5B）。同时在光学显微镜观察下，与对照组相比，经过QQ菌处理后未有致密生物被膜形成，苏云金芽孢杆菌GS48抑制效果较差，但是与对照组相比，生物被膜致密程度较弱（图5C-抑制）；经过QQ菌处理后蜂房哈夫尼菌成熟的生物被膜发生明显脱落（图5C-清除）。
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图 5 QQ菌对蜂房哈夫尼菌生物被膜的影响注：不同字母表示各组间差异显著（P<0.05）；A：QQ菌对蜂房哈夫尼菌生物被膜抑制能力；B：QQ菌对蜂房哈夫尼菌生物被膜的清除能力；C：光学显微镜观察QQ菌对蜂房哈夫尼菌生物被膜的抑制与清除能力。Figure 5. Effects of QQ bacteria on the biofilm of H. alvei2.5 QQ酶同源基因的PCR扩增结果
内酯酶和酰化酶是研究最为广泛的两种QQ酶[32]，根据本研究所分离的菌株类型，参考内酯酶与酰化酶相关基因aiiA、pvdQ及quiP[4]，采用特异性引物进行扩增。结果表明，在霍氏肠杆菌GS31中扩增出大小分别为257 bp与1411 bp的目的条带，为aiiA与pvdQ同源基因（图6）。已有研究证实霍氏肠杆菌中含有编码AHLs内酯酶的aiiA基因[28]，但是对于编码酰化酶的pvdQ基因未见报道。蜡样芽孢杆菌GS44也扩增出aiiA与pvdQ目的条带（图6）。苏云金芽孢杆菌GS48存在aiiA同源基因，不存在pvdQ同源基因（图6）。在沙雷氏菌GS53也发现aiiA与pvdQ同源基因。
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图 6 相关QQ基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图像注：M代表Maker；U代表通用引物；A代表aiiA基因引物；P代表pvdQ基因引物；Q代表quiP基因引物。Figure 6. Agarose gel electrophoresis image showing the QQ gene amplified by PCRAHLs内酯酶通过水解内酯环的酯键，使短链和长链AHLs失活[33]。作为一种金属β-内酰胺酶，AHLs内酯酶含有保守的短序列104HXHXDH109，与几种金属水解酶Zn2+的结合基序相同；在该序列中，三个氨基酸残基，His-106、Asp-108和His-109，以及在金属水解酶中同样保守的His-169，已被证明对保持AHLs内酯酶活性至关重要[34−35]。Noor等[36]研究发现AHLs内酯酶活性位点包括两种Zn2+，Zn1包括H104、H106和H169配位，而Zn2+由H109、H235、D108和D191配位，这些特定氨基酸对AHLs内酯酶活性也极其重要。在已发现的内酯酶家族中AiiA内酯酶是被研究最多的一类[37]。迄今为止，已经在多种微生物中发现AHLs内酯酶，包括苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短双歧杆菌（Bifidobacterium sp.）等[34]。AHLs内酯酶AiiA首次被发现是在芽孢杆菌（Bacillus sp.）240B1中[38]；其他芽孢杆菌也陆续发现新型内酯酶，例如地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）T-1发现存在编码AHLs内酯酶的基因ytnp，其所编码的内酯酶证实可作为潜在的新型群体感应淬灭剂[39]。本研究筛选出的四株菌也均具有aiiA同源基因，可能产生AiiA内酯酶。
AHLs酰化酶通过水解连接内酯部分和酰基侧链的酰胺键，使AHLs失活[40]。交替假单胞菌（Pseudoalteromonas flavipulchra）JG1产生的PfmA酶即为AHLs酰化酶，它可以降解C4-HSL，使得信号分子的浓度降低不足以达到阈值浓度，从而抑制QS系统[41]。荧光假单胞菌PF08产生的酰化酶PF2571则可以降解长链信号分子N-癸酰基-L-高丝氨酸内酯（N-decanoyl-L-homoserine lactone，C10-HSL）与十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯（N-dodecanoyl-L-homoserine lactone，C12-HSL）[9]。本研究筛选出的霍氏肠杆菌GS31、蜡样芽孢杆菌GS44和沙雷氏菌GS53中均具有pvdQ酰化酶基因。
氧化还原酶能够在不降解AHLs的情况下，氧化或减少酰基侧链，从而改变AHLs结构并影响其活性[28]。例如，伯克霍尔德杆菌（Burkholderia sp.）GG4能分泌氧化还原性QQ酶，通过HPLC检测发现，该酶与N-3-氧代-己酰高丝氨酸内酯（N-（3-Oxohexanoyl）homoserine lactone，3-oxo-C6-HSL）共孵育，产生了3-oxo-C6-HSL异构体可以证实[42]。此外，贪铜菌（Cupriavidus sp.）HN-2也能产生一种氧化还原型QQ酶，该酶通过氧化或还原作用，改变了野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc）产生的信号分子[43]。然而，在本研究中，未验证筛选出的菌株是否具有编码氧化还原酶的基因。
3. 结论
从土壤中分离出可完全降解蜂房哈夫尼菌所产信号分子的QQ菌，包括为霍氏肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌与沙雷氏菌。这些QQ菌在降解不同酰基长度的AHLs方面表现出不同的能力。它们的QQ活性物质存在于CCE或CFS中，对酸和热的敏感性各异，并能不同程度地抑制和清除蜂房哈夫尼菌的生物被膜。四株分离的QQ菌降解AHLs主要机制是其产生的AHLs内酯酶和AHLs酰化酶。本研究为挖掘QQ菌和新型QQ酶资源提供了一定理论依据和参考。
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图 1 土壤中可降解AHLs的QQ菌株筛选及特性分析流程示意图
Figure 1. Schematic diagram of screening and characterization evaluation process of QQ strains with degrading AHLs abilities from the soil
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图 2 具有降解蜂房哈夫尼菌信号分子的菌株的筛选和鉴定
注：A：菌株对蜂房哈夫尼菌信号分子的降解活性；B：菌株形态；C：系统发育树分析。
Figure 2. Screening and identification of strains with quorum quenching abilities against signals of H. alvei
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图 4 QQ菌活性物质位置及热稳定性分析
注：A：QQ菌活性物质位置；B：活性物质热稳定性。
Figure 4. Location of the active substance of QQ bacteria and its thermal stability
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图 5 QQ菌对蜂房哈夫尼菌生物被膜的影响
注：不同字母表示各组间差异显著（P<0.05）；A：QQ菌对蜂房哈夫尼菌生物被膜抑制能力；B：QQ菌对蜂房哈夫尼菌生物被膜的清除能力；C：光学显微镜观察QQ菌对蜂房哈夫尼菌生物被膜的抑制与清除能力。
Figure 5. Effects of QQ bacteria on the biofilm of H. alvei
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图 6 相关QQ基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图像
注：M代表Maker；U代表通用引物；A代表aiiA基因引物；P代表pvdQ基因引物；Q代表quiP基因引物。
Figure 6. Agarose gel electrophoresis image showing the QQ gene amplified by PCR
表 1 两大类群体感应淬灭基因（内酯酶和酰化酶）引物
Table 1 Primers for two main categories of quorum quenching genes (lactonase and acylase)
引物名称 引物序列（5’-3’） 目的基因 扩增片段
大小（bp）aiiA F GATGGCCTGGAGAATGAC
R GCGTGTAGGGTATGAGCC内酯酶基因 257 pvdQ F GTTCTGCACGAAGTCCCTG
R GCTGTTGGGTTCGATGATG酰化酶基因 1411 quiP F GTCGGCCAGGTAATAGAGC
R GCTACCGTCCGGAATACTG酰化酶基因 572 
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表 2 四株菌对六种不同AHLs的QQ活性
Table 2 QQ activity of the four strains to six different AHLs
AHLs 指示菌株 GS31 GS44 GS48 GS53 C4-HSL CV026 +++ ++ ++ +++ C6-HSL CV026 +++ ++ ++ +++ C6-oxo-HSL CV026 +++ ++ ++ +++ C8-HSL CV026 ++ ++ ++ ++ C10-HSL A136 ++ ++++ ++ ++ C12-HSL A136 ++ +++ ++ ++ 注：超强降解活性：++++；强降解活性：+++；中等降解活性：++；无降解活性：−。
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