Research on the Interaction between Eight Polyphenols and Arachin
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摘要: 为探究花生球蛋白与8种常见多酚的相互作用，包括阿魏酸、白藜芦醇、橙皮素、儿茶素、槲皮素、姜黄素、没食子酸和杨梅素。采用紫外-可见光谱、荧光光谱分析8种多酚与花生球蛋白的相互作用规律，并探讨多酚对蛋白质结构、表面疏水性及溶解度的影响。紫外-可见光谱分析显示，8种多酚改变了花生球蛋白的氨基酸残基所处的微环境，使其分子构象发生改变；荧光光谱表明，多酚对花生球蛋白的猝灭机制均为静态猝灭；其中白藜芦醇和儿茶素与花生球蛋白结合率最高。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，儿茶素、杨梅素、没食子酸与花生球蛋白通过共价交联形成了大分子量的聚合物；傅里叶红外光谱表明，多酚使花生球蛋白的构象发生不同程度改变，其中大部分多酚使花生球蛋白的α-螺旋占比增大，最高增加到36.33%。多酚使花生球蛋白表面疏水性和溶解度均下降，最低分别降至19.92 µg和51.7%。综上，8种多酚与花生球蛋白相互作用，不同程度地改变了花生球蛋白的构象和理化性质。该研究可为多酚与花生球蛋白的进一步加工利用提供科学依据及理论指导。Abstract: This study investigated the interaction between arachin and eight common polyphenols—ferulic acid, resveratrol, hesperidin, catechin, quercetin, curcumin, gallic acid, and myricetin. The interaction patterns of these polyphenols with arachin were analyzed using UV-visible and fluorescence spectroscopy, with a focus on their effects on protein structure, surface hydrophobicity and solubility. UV-visible spectroscopy revealed that the polyphenols altered the microenvironment surrounding the amino acid residues of arachin, leading to changes in its molecular conformation. Fluorescence spectroscopy identified static quenching as the quenching mechanism of polyphenols on arachin, with resveratrol and catechin demonstrating the highest binding affinity. Additionally, catechin, myricetin, and gallic acid were observed to form high-molecular-weight polymers with arachin through covalent cross-linking, verified by SDS-PAGE. Fourier infrared spectroscopy showed that polyphenols induced various conformational changes in arachin, notably increasing the proportion of α-helix, with the maximum rise reaching 36.33%. The polyphenols decreased the surface hydrophobicity and solubility of arachin, with the lowest levels dropping to 19.92 µg and 51.7%, respectively. In conclusion, the interaction between the eight polyphenols and arachin induced diverse alterations to the conformation and physicochemical properties of arachin. This study offers a scientific basis and theoretical guidance for the further processing and utilization of polyphenols and arachin.
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Keywords:
- arachin /
- polyphenol /
- interaction /
- spectrum /
- structure
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花生是我国第一大油料作物，2023年我国花生种植面积41.5万公顷，总产量高达1640万吨，居世界第一[1]。花生仁中蛋白质占45%~55%，具有较高的消化性，营养价值与动物蛋白接近且不含胆固醇，是优质的天然蛋白质资源[2]。花生球蛋白（Arachin）是从花生仁中提取的一种储存蛋白，约占花生种子蛋白质总量的50%~65%[3]，由3个酸性亚基和1个碱性亚基组成，分子量分别为40.5、37.5、35.5和19.5 kDa，等电点约为5，营养价值较高，并具有较高的热稳定性和良好的乳化、起泡性能，是花生中最主要的蛋白质之一，对花生的营养和工业应用价值具有决定性作用[4]。
多酚是具有一定数量羟基的芳香环化合物统称，广泛存在于植物性食品中，具有优异的抗氧化、抗菌、抗肿瘤等功能特性。食物中多酚和蛋白质通常是共存的，已有研究报道二者可通过疏水作用、范德华力和氢键等非共价及共价结合相互作用[5]，从而改变蛋白质结构和性质。如Rawel等[6]研究发现阿魏酸、绿原酸等酚类化合物通过疏水作用驱动，改变了溶菌酶、牛血清蛋白的二级、三级结构，并使其溶解度降低；Kopjar等[7]发现槲皮素可与糙米蛋白、杏仁蛋白复合，使蛋白质的二级结构和表面疏水性发生明显的变化；Kanakis等[8]研究了儿茶素、表儿茶素等茶多酚与牛乳清蛋白的相互作用，结果显示这几种茶多酚与乳清蛋白之间通过氢键、疏水相互作用结合，改变了乳清蛋白的构象，使氨基酸残基微环境变得更加疏水。但目前多酚与蛋白质的相互作用研究主要以大豆蛋白及动物蛋白为主，研究的多酚种类也较为局限，而作为膳食重要组成的植物蛋白（花生蛋白、核桃蛋白等）与常见多酚的相互作用规律仍有待于探讨。
因此，本文以花生球蛋白为对象，研究其与8种常见多酚（阿魏酸、白藜芦醇、橙皮素、儿茶素、槲皮素、姜黄素、没食子酸、杨梅素）的相互作用规律。采用紫外可见光谱和荧光光谱研究蛋白质-多酚作用机制与结合位点，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及傅里叶红外光谱对多酚-蛋白质复合物进行结构表征，同时探究多酚对花生球蛋白表面疏水性和溶解性的影响，旨在为多酚-蛋白质的相互作用研究及花生蛋白食品的开发与加工提供一些依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
云南红皮小花生 购于云南昆明市场；阿魏酸、白藜芦醇、橙皮素、儿茶素、槲皮素、姜黄素、没食子酸、杨梅素、溴酚蓝、福林酚、牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA） 纯度98%，上海源叶生物科技有限公司；蛋白分子量标准Marker、十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、4×非变性上样缓冲液、4×变性蛋白上样缓冲液（含二硫苏糖醇Dithiothreitol， DTT）、三羟基甲基氨基甲烷（Trihydroxymethy aminomethane，Tris）、NaHSO3 分析纯，北京索莱宝生物科技有限公司。
5427R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；UV-2600紫外可见分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；ModulyoD-230真空冷冻干燥机、Lumina荧光光度计、Is50傅里叶红外光谱仪 美国Thermo公司；MD SpectraMax Plus 384 酶标仪 美国 Biotek 公司；Powerpac Universal电泳仪 美国BIO-RAD公司等。
1.2 实验方法
1.2.1 花生球蛋白的制备
采用盐提法制备花生球蛋白[9]。花生经干燥、粉碎、脱脂、过60目筛后，得到脱脂花生粉，接着按料液比1:10（g:mL）加入含0.8% NaCl（v:v）的0.05 mol/L Tris-HCl溶液（pH 7.9），室温搅拌提取1 h后于4 ℃、8000 r/min离心10 min。取上清液按1:15（w:v）加入0.05 mol/L NaHSO3溶液，调节pH至6.4，静置过夜后在同等条件下离心，水洗沉淀2~3次后冻干，得到花生球蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其纯度为89%。
1.2.2 多酚-花生球蛋白复合物的制备
参照Ali等[10]的方法并稍加改动。10 µmol/mL的阿魏酸与10 mg/mL的花生球蛋白溶液（0.01 mol/L pH7.4 PBS配制）按体积比1:10混合，37 ℃摇床振荡培养24 h、4 ℃透析48 h后冻干，为阿魏酸-花生球蛋白复合物。按上述方法分别制备白藜芦醇、橙皮素、儿茶素、槲皮素、姜黄素、没食子酸、杨梅素和花生球蛋白的复合物（以下简称复合物）。
1.2.3 紫外-可见分光光谱
花生球蛋白及其多酚复合物分别以0.01 mol/L pH7.4 PBS配制为0.1 mg/mL溶液，于4 ℃ 10 000 r/min离心30 min后，取上清液于240~420 nm紫外扫描。
1.2.4 荧光光谱
以0.01 mol/L pH7.4 PBS配制3 mg/mL的花生球蛋白溶液于4 ℃ 10000 r/min离心30 min后，取上清液2.5 mL，以PBS溶液为对照，并调整仪器参数为温度25 ℃，狭缝宽度4 nm，激发波长280 nm，发射扫描波长290~420 nm[11]，进行荧光光谱扫描。在上述花生球蛋白液中继续加入2.5 μL多酚溶液（10 µmol/mL）后，测量其荧光光谱，重复上面步骤，依次测量，得到多酚浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 mmol/L梯度下对花生球蛋白的荧光光谱，利用Stern-Volmer方程（1）对所得荧光数据进行计算，以求得猝灭速率常数Kq和Stern-Volmer猝灭常数Ksv。采用式（2）来计算静态猝灭的结合常数（Ka）和结合位点（n）。
F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q] (1) lgF0−FF=lgKa+nlg[Q] (2) 式中，F0为猝灭剂加入前荧光体的荧光强度峰值；F为猝灭剂加入后荧光体的荧光强度峰值；[Q]为猝灭剂浓度，mol/L；τ0为未加猝灭剂时荧光体的平均寿命，10−8 s；Ksv为Stern-Volmer猝灭常数；Kq为生物分子猝灭速率常数；Ka为表观结合常数；n为结合位点。
1.2.5 多酚与花生球蛋白结合率的测定
分别将8种多酚标准品与95%乙醇按1:1 （mg:mL）溶解，取50 µL与125 µL福林酚试剂（1 mg/mL）混合2 min后，加入100 µL Na2CO3溶液 （7.5 mg/mL），摇匀后25 ℃暗处静置反应30 min，在765 nm处测定吸光度，以95%乙醇为空白，以吸光度值减去空白后的OD值为纵坐标，多酚的质量浓度为横坐标，绘制8种多酚的标准曲线。另外取8种复合物用0.01 mol/L pH7.4 PBS溶解，4500 r/min离心10 min，取上清液按相同步骤测定。按照式（3）计算复合物中多酚结合率[12]。
多酚结合率(%)=GW×100 (3) 式中，G为通过标准曲线计算的多酚量，mg；W为复合物中多酚的添加量，mg。
1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳
将复合物分别与非还原、还原上样液按3:1（v:v）混匀，沸水浴5 min后立即冰浴，4 ℃ 10000 r/min离心5 min，取上清液10 µL进行电泳分析。采用12%的分离胶和5%的浓缩胶，起始电压80 V，进入分离胶电压升至120 V。电泳完成后，考马斯亮蓝R-250染色40 min后，脱色、凝胶成像系统拍照，Image Lab软件对条带进行分析[13]。
1.2.7 傅里叶变换红外光谱
采用溴化钾压片法测定复合物傅里叶变换红外光谱。将样品与溴化钾按1:100 （w:w）混匀、研磨、压片后，于400~4000 cm−1光谱扫描。利用Peak Fit Version 4.12，在1600~1700 cm−1进行基线校正，在二阶导数谱的基础上采用Gauss分峰拟合，根据各区域内子峰面积占总峰面积之比计算二级结构[14]。
1.2.8 表面疏水性的测定
以PBS配制质量浓度为5 mg/mL的复合物溶液，取1 mL与200 µL 1 mg/mL的溴酚蓝溶液漩涡振荡3 min，于4 ℃ 10000 r/min离心5 min后，取上清液200 µL于595 nm处测吸光度，并以溴酚蓝溶液为对照，以溴酚蓝结合量来表示表面疏水性[15]。按公式（4）计算。
溴酚蓝结合量(µg)=200×(Ac−As)Ac (4) 式中，Ac为溴酚蓝溶液在595 nm处的吸光度值；As为复合物溶液在595 nm处的吸光度值。
1.2.9 溶解度的测定
采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的溶解度。用0.01 mol/L pH7.4 PBS溶液配制质量浓度为3 mg/mL的复合物溶液，漩涡振荡混匀，于4 ℃、10000 r/min离心5 min取上清液，分别测定其蛋白浓度。以BSA绘制标准曲线，按公式（5）计算溶解度。
溶解度(%)=上清液蛋白浓度复合物实际蛋白浓度×100 (5) 1.3 数据处理
所有实验均重复测定3次，取平均值。实验数据采用Excel 2016计算，Origin 2018作图，SPSS 20进行单因素ANOVA显著性分析（P<0.05）。
2. 结果与分析
2.1 紫外-可见光谱分析
紫外-可见光谱法是分析蛋白质的结构变化常采取的方法。8种多酚与花生球蛋白相互作用的紫外可见吸收谱图如图1所示，由于色氨酸和酪氨酸残基对光的吸收作用[16]，花生球蛋白在284.4 nm处出现吸收峰。与8种多酚相互作用后，花生球蛋白的吸收峰强度均升高，此变化可能是色氨酸残基上的吲哚环的π→π*跃迁产生的吸收带导致[17]；其中槲皮素及杨梅素伴随有约为31.6 nm和41.2 nm的红移，表明发色基团所处环境由极性向非极性变化，说明多酚改变了花生球蛋白的结构[18]。阿魏酸、白藜芦醇、橙皮素、槲皮素及杨梅素与花生球蛋白相互作用后均出现新吸收峰，说明形成了新的复合物，且复合物的结构与多酚的种类有关[19]。此外，由于动态猝灭只改变猝灭分子的激发态，而不能改变物质的吸收光谱[20]，因此推测8种多酚与花生球蛋白的猝灭类型为静态猝灭。
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图 1 花生球蛋白与8种多酚相互作用的紫外-可见吸收谱图Figure 1. Ultraviolet-visible absorption of arachin interactions with eight polyphenols2.2 荧光光谱分析
蛋白质分子中的芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）由于含有苯环或共轭双键结构，可以在一定的激发波长下产生荧光，因此蛋白质具有内源荧光特性。不同浓度的8种多酚与花生球蛋白相互作用的荧光光谱如图2所示，除白藜芦醇及橙皮素外，其余6种多酚与花生球蛋白相互作用后峰形均基本保持不变，但随着多酚浓度的增加，花生球蛋白的荧光强度降低，说明发生了荧光猝灭[21]。白藜芦醇和橙皮素则使花生球蛋白的最大吸收峰红移（图2b和图2c），说明它们的相互作用使内部疏水性色氨酸暴露于亲水性环境中，花生球蛋白结构发生改变[22]。同时白藜芦醇、橙皮素及没食子酸与花生球蛋白互作后出现新的吸收峰（图2b、图2c和图2g），推测这三种多酚可能通过疏水相互作用和氢键与蛋白质中的氨基酸残基结合形成新的产物。此外，随着槲皮素及杨梅素浓度的增大（图2e和图2h），其荧光猝灭反应逐渐增强，花生球蛋白的荧光几乎完全被猝灭，说明这两种多酚与花生球蛋白作用力较强。Meng等[23]研究也表明，乳清蛋白与酚类化合物结合后最大发射波长发生了红移且荧光强度明显降低，与本文结果相似。
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图 2 花生球蛋白与不同浓度的8种多酚相互作用的荧光光谱图注：a~h分别为阿魏酸、白藜芦醇、橙皮素、儿茶素、槲皮素、姜黄素、没食子酸和杨梅素与花生球蛋白互作的光谱。Figure 2. Fluorescence spectra of arachin interactions with different species and concentrations of eight polyphenols2.3 结合常数和结合位点分析
通过式（1）和式（2）中Stern Volmer方程计算8种多酚与花生球蛋白的猝灭常数（Ksv），猝灭速率常数（Kq），结合常数（Ka）及结合位点（n），结果如表1所示，8种复合物的猝灭速率常数Kq均大于各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数值（约为2.0×1010 L/（mol·s）），说明这8种多酚对花生球蛋白的荧光猝灭作用均是静态猝灭，与紫外光谱结果一致[24]。同时，不同种类的多酚与花生球蛋白的猝灭速率常数Kq和猝灭常数Ksv存在一定的差异；其中槲皮素的猝灭常数值与结合常数Ka最大，说明其与花生球蛋白的相互作用能力强，能量传递效率高。其它多酚与花生球蛋白的结合位点都接近于1或2，表明蛋白质与多酚是按照约1:1和1:2的物质的量比结合，在高瑾等[17]的研究中发现，三种多酚（单宁酸、表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子酸）与玉米醇溶蛋白的结合位点接近1，与本文研究类似。
表 1 多酚与花生球蛋白相互作用的猝灭、结合常数Table 1. Quenching constants and binding constants of the interaction between polyphenols and arachin种类 Ksv （×103 L/mol） Kq（×1011 L·mol−1·s−1） Ra Ka（×104 L/mol） n Rb FA-A 3.23 3.23 0.99842 0.094 1.7345 0.98316 R-A 46 46 0.99971 0.053 1.1891 0.98686 H-A 210 210 0.91862 0.096 1.9981 0.96823 E-A 1.85 1.85 0.99934 0.0627 2.2547 0.96823 Q-A 7430 7430 0.9359 1.063 1.0016 0.96839 C-A 10.62 10.62 0.99656 0.401 2.3439 0.99067 GA-A 7.04 7.04 0.99945 0.091 0.6643 0.99172 M-A 1.40 1.4 0.91226 0.016 1.9578 0.99053 注： FA-A为阿魏酸-花生球蛋白；R-A为白藜芦醇-花生球蛋白；H-A为橙皮素-花生球蛋白；E-A为儿茶素-花生球蛋白；Q-A为槲皮素-花生球蛋白；C-A为姜黄素-花生球蛋白；GA-A为没食子酸-花生球蛋白；M-A为杨梅素-花生球蛋白；Ra为方程（1）拟合Ksv相关系数，Rb为方程（2）拟合Ka相关系数；Ksv为荧光猝灭常数；Kq为猝灭速率常数；Ka为结合常数；n为结合位点。 2.4 多酚结合率分析
多酚结合率可以反映其与蛋白质非共价/共价相互作用的亲和程度，从而影响蛋白质的结构、功能及生物利用度[25]。8种多酚与花生球蛋白的结合率如图3所示，其中白藜芦醇与花生球蛋白结合率最高，其次是槲皮素及姜黄素；可能是有氧条件下，白藜芦醇的间苯二酚被氧化为醌，与花生球蛋白的氨基酸侧链发生反应，形成更稳定的共价键[26]，因此白藜芦醇-花生球蛋白复合物相较于其他复合物更稳定；同时2.2和2.3中荧光光谱的结果也证实了白藜芦醇、槲皮素与花生球蛋白有更强的结合力（图2、表1）。没食子酸的分子量比其他多酚更小，所含的酚羟基和结合位点也最少，可能是与花生球蛋白的结合率最低的原因。
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2.5 SDS-PAGE分析
SDS-PAGE是一种依据蛋白质分子量进行分离的分子筛技术，蛋白亚基分子量是影响其迁移效率的重要因素。根据其在样品处理过程中是否添加还原剂（如β-巯基乙醇或DTT），可分为还原型SDS-PAGE和非还原型SDS-PAGE。如图4所示，儿茶素、槲皮素和没食子酸3种多酚在非还原和还原条件下均使花生球蛋白原有条带变浅，同时在245 kDa附近出现新的条带（泳道4、5、7），可能是这3种多酚与花生球蛋白发生共价交联，形成大分子聚合物[27]。其中，非还原条件下，其二硫键未被断裂，导致其与多酚结合形成聚合物的条带更深，而在还原条件下，多酚可与花生球蛋白中的巯基发生非二硫键共价交联，形成巯基-醌加成物[28]。此结果与2.1紫外光谱实验中，槲皮素与花生球蛋白相互作用出现新吸收峰的结果一致。
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图 4 多酚-花生球蛋白复合物的非还原型（a）和还原型（b）SDS-PAGE注：M为Marker蛋白；A为花生球蛋白；泳道1~8分别为阿魏酸、白藜芦醇、橙皮素、儿茶素、槲皮素、姜黄素、没食子酸和杨梅素与花生球蛋白的复合物。Figure 4. Polyphenol-arachin complex non-reduced (a) and reduced (b) SDS-PAGE2.6 二级结构分析
通过红外光谱拟合得到的8种多酚对花生球蛋白二级结构的影响如图5所示。花生球蛋白与8种多酚复合后，二级结构比例发生了不同程度的变化。花生球蛋白的α-螺旋、β-折叠、无规卷曲和β-转角相对含量分别为18.52%、34.04%、14.78%和32.65%。阿魏酸、橙皮素、儿茶素和没食子酸使花生球蛋白的α-螺旋和无规卷曲占比增加，β-转角含量明显减少，可能是这4种多酚通过氢键和疏水作用使蛋白质羰基中氢键网络结构发生重排[29]；白藜芦醇、姜黄素使花生球蛋白α-螺旋占比增加和β-转角占比减少，说明白藜芦醇和姜黄素在一定程度上使花生球蛋白的结构从无序转向有序[30]。根据Tang等[15]的研究，蛋白质结构的稳定性归因于结构中β-折叠（链状结构）与β-转角（环状结构）的含量，较低的环链比说明蛋白质稳定性更高[15]。除橙皮素、白藜芦醇外，6种多酚-花生球蛋白复合物均拥有较低的环链比，说明这6种多酚可使花生球蛋白的结构更稳定。Xu等[31]的研究也表明，单宁酸、没食子酸、槲皮素等多酚可使肌原纤维蛋白的二级结构发生改变，主要表现为α-螺旋含量增加，与本文结果相似。
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图 5 8种多酚对花生球蛋白二级结构的影响Figure 5. Effects of eight polyphenols on the secondary structure of arachin2.7 表面疏水性分析
表面疏水性是影响分子间相互作用的主要因素之一，常用以反映蛋白质疏水基暴露的程度。8种多酚对花生球蛋白表面疏水性的影响如图6所示。除儿茶素外，7种多酚的加入均使复合物的表面疏水性降低，一方面可能是多酚本身含有亲水基团，另一方面可能是多酚掩盖了花生球蛋白的部分表面疏水区域[32]。其中加入没食子酸后，表面疏水性最低，可能是没食子酸的羟基和羰基可与蛋白质形成更稳定的复合物[33]，使更多的疏水区域被掩盖，从而降低了其表面疏水性；儿茶素则使花生球蛋白的表面疏水性显著升高（P<0.05），原因可能是二者相互作用后，暴露出更多的疏水基团[34]，提高了表面疏水性。
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图 6 8种多酚对花生球蛋白表面疏水性的影响Figure 6. Effects of eight polyphenols on the surface hydrophobicity of arachin2.8 溶解度分析
8种多酚与花生球蛋白复合后溶解度的变化如图7所示。其中，阿魏酸对花生球蛋白溶解度无明显影响，可能是一方面阿魏酸与花生球蛋白的氨基酸残基结合后，使蛋白疏水性基团减少；另一方面阿魏酸与花生球蛋白之间还存在静电斥力[35]，两者综合作用导致阿魏酸对花生球蛋白的溶解度无显著影响。相比而言，其余7种多酚均使花生球蛋白的溶解性显著降低（P<0.05），其中没食子酸和白藜芦醇对花生球蛋白的溶解度的降幅最大，可能是由于多酚氧化形成的醌类物质与氨基酸残基共价交联，导致其溶解度的降低；此外2.2中荧光光谱结果也证明没食子酸和白藜芦醇与花生球蛋白相互作用形成了新的复合物，使蛋白溶解度降低。Hu等[36]研究表明，肌原纤维蛋白与茶多酚的相互作用可使蛋白质的溶解度降低，与本文结果相似。
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图 7 8种多酚对花生球蛋白溶解度的影响Figure 7. Effects of eight polyphenols on the solubility of arachin3. 结 论
论文研究了8种常见多酚（阿魏酸、白藜芦醇、橙皮素、儿茶素、槲皮素、姜黄素、没食子酸和杨梅素）与花生球蛋白的相互作用规律。紫外光谱和荧光光谱表明，8种多酚与花生球蛋白相互作用形成了复合物，二者通过静态机制猝灭花生球蛋白固有荧光，并使其荧光峰红移，结合位点数为1~2个，其中白藜芦醇与花生球蛋白的结合率最高，为32.89%。阿魏酸、橙皮素、儿茶素和没食子酸4种多酚对花生球蛋白二级结构的影响较为明显，表现为α-螺旋和无规卷曲含量上升。儿茶素、杨梅素和没食子酸加入使花生球蛋白聚集形成大分子量的聚合物。此外，花生球蛋白与8种多酚作用后，表现出更低的表面疏水性和溶解度。综上，论文初步阐明了8种多酚与花生球蛋白的相互作用规律，此研究结果可为花生球蛋白及多酚在食品体系中的开发和利用提供新的参考。
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图 1 花生球蛋白与8种多酚相互作用的紫外-可见吸收谱图
Figure 1. Ultraviolet-visible absorption of arachin interactions with eight polyphenols
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图 2 花生球蛋白与不同浓度的8种多酚相互作用的荧光光谱图
注：a~h分别为阿魏酸、白藜芦醇、橙皮素、儿茶素、槲皮素、姜黄素、没食子酸和杨梅素与花生球蛋白互作的光谱。
Figure 2. Fluorescence spectra of arachin interactions with different species and concentrations of eight polyphenols
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图 4 多酚-花生球蛋白复合物的非还原型（a）和还原型（b）SDS-PAGE
注：M为Marker蛋白；A为花生球蛋白；泳道1~8分别为阿魏酸、白藜芦醇、橙皮素、儿茶素、槲皮素、姜黄素、没食子酸和杨梅素与花生球蛋白的复合物。
Figure 4. Polyphenol-arachin complex non-reduced (a) and reduced (b) SDS-PAGE
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图 5 8种多酚对花生球蛋白二级结构的影响
Figure 5. Effects of eight polyphenols on the secondary structure of arachin
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图 6 8种多酚对花生球蛋白表面疏水性的影响
Figure 6. Effects of eight polyphenols on the surface hydrophobicity of arachin
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图 7 8种多酚对花生球蛋白溶解度的影响
Figure 7. Effects of eight polyphenols on the solubility of arachin
表 1 多酚与花生球蛋白相互作用的猝灭、结合常数
Table 1 Quenching constants and binding constants of the interaction between polyphenols and arachin
种类 Ksv （×103 L/mol） Kq（×1011 L·mol−1·s−1） Ra Ka（×104 L/mol） n Rb FA-A 3.23 3.23 0.99842 0.094 1.7345 0.98316 R-A 46 46 0.99971 0.053 1.1891 0.98686 H-A 210 210 0.91862 0.096 1.9981 0.96823 E-A 1.85 1.85 0.99934 0.0627 2.2547 0.96823 Q-A 7430 7430 0.9359 1.063 1.0016 0.96839 C-A 10.62 10.62 0.99656 0.401 2.3439 0.99067 GA-A 7.04 7.04 0.99945 0.091 0.6643 0.99172 M-A 1.40 1.4 0.91226 0.016 1.9578 0.99053 注： FA-A为阿魏酸-花生球蛋白；R-A为白藜芦醇-花生球蛋白；H-A为橙皮素-花生球蛋白；E-A为儿茶素-花生球蛋白；Q-A为槲皮素-花生球蛋白；C-A为姜黄素-花生球蛋白；GA-A为没食子酸-花生球蛋白；M-A为杨梅素-花生球蛋白；Ra为方程（1）拟合Ksv相关系数，Rb为方程（2）拟合Ka相关系数；Ksv为荧光猝灭常数；Kq为猝灭速率常数；Ka为结合常数；n为结合位点。 
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[1] 刘娜, 谢畅, 黄海云, 等. 施钾量对花生根系和根瘤特性、养分吸收及产量的影响[J]. 中国农业科学,2023,56(4):635−648. [LIU N,XIE C, HUANG H Y, et al. Effects of potassium application on root and nodule characteristics, nutrient uptake and yield of peanut[J]. Scientia Agricultura Sinica,2023,56(4):635−648.] LIU N, XIE C, HUANG H Y, et al. Effects of potassium application on root and nodule characteristics, nutrient uptake and yield of peanut[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56（4）: 635−648.
[2] 杨琴. 花生球蛋白-罗勒籽胶复合凝胶的形成机理、结构性质及应用研究[D]. 合肥:合肥工业大学, 2021. [YANG Q. Formation mechanism, structure, properties and application of arachin-basil seed gum composite gels[D]. Hefei:Hefei University of Technology, 2021.] YANG Q. Formation mechanism, structure, properties and application of arachin-basil seed gum composite gels[D]. Hefei: Hefei University of Technology, 2021.
[3] 高云中. 花生粕蛋白的提取及性质研究[D]. 无锡:江南大学, 2009. [GAO Y Z. Study on extraction and properties of peanut meal protein[D]. Wuxi:Jiangnan University, 2009.] GAO Y Z. Study on extraction and properties of peanut meal protein[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2009.
[4] 徐飞. 花生球蛋白亚基缺失对热特性的影响[D]. 北京:中国农业科学院, 2016. [XU F. Effect of subunit-lacking on thermal properties of arachin[D]. Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2016.] XU F. Effect of subunit-lacking on thermal properties of arachin[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2016.
[5] YAN X H, ZENG Z L, MCCLEMENTS D J, et al. A review of the structure, function, and application of plant-based protein–phenolic conjugates and complexes[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2023,22(2):1312−1336. doi: 10.1111/1541-4337.13112
[6] RAWEL H M, CZAJKA D, ROHN S, et al. Interactions of different phenolic acids and flavonoids with soy proteins[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2002,30(3):137−150.
[7] KOPJAR M, BULJETA I, ĆORKOVIĆ I, et al. Adsorption of quercetin on brown rice and almond protein matrices:Effect of quercetin concentration[J]. Foods,2022,11(6):793. doi: 10.3390/foods11060793
[8] KANAKIS C D, HASNI I, BOURASSA P, et al. Milk β-lactoglobulin complexes with tea polyphenols[J]. Food Chemistry,2011,127(3):1046−1055. doi: 10.1016/j.foodchem.2011.01.079
[9] 尹可宏, 杨茜, 赵秀飞, 等. 羟自由基氧化对花生球蛋白结构和功能性质的影响[J]. 食品与发酵工业,2022,48(4):24−31. [YIN K H, YANG X, ZHAO X F, et al. Effects of hydroxyl radical oxidation on the structure and functional property of arachin[J]. Food and Fermentation Industries,2022,48(4):24−31.] YIN K H, YANG X, ZHAO X F, et al. Effects of hydroxyl radical oxidation on the structure and functional property of arachin[J]. Food and Fermentation Industries, 2022, 48（4）: 24−31.
[10] ALI M. Chemical, structural and functional properties of whey proteins covalently modified with phytochemical compounds[J]. Journal of Food Measurement and Characterization,2019,13(4):2970−2979. doi: 10.1007/s11694-019-00217-1
[11] 刘雪梅, 王华敏, 赵利, 等. 橙皮苷、柚皮苷与酪蛋白相互作用机制比较分析[J]. 食品科学,2023,44(4):162−170. [LIU X M, WANG H M, ZHAO L, et al. Comparative study on interaction mechanism between hesperidin, naringin and casein[J]. Food Science,2023,44(4):162−170.] LIU X M, WANG H M, ZHAO L, et al. Comparative study on interaction mechanism between hesperidin, naringin and casein[J]. Food Science, 2023, 44（4）: 162−170.
[12] 游见明, 曹新志. 福林酚法测定茶树中茶多酚的分布水平[J]. 湖北农业科学,2013,52(10):2417−2419. [YOU J M, CAO X Z. Analysis on the distribution of tea polyphenol in tea tree by folin-ciocalteaut method[J]. Hubei Agricultural Sciences,2013,52(10):2417−2419.] YOU J M, CAO X Z. Analysis on the distribution of tea polyphenol in tea tree by folin-ciocalteaut method[J]. Hubei Agricultural Sciences, 2013, 52（10）: 2417−2419.
[13] 赵谋明, 辛佩贤, 陈楠楠, 等. 花生球蛋白和伴花生球蛋白在酸性条件下亚基结构的变化规律[J]. 现代食品科技,2016,32(3):30−35. [ZHAO M M, XIN P X, CHEN N N, et al. Structural variations in the subunits of arachin and conarachin under acidic conditions[J]. Modern Food Science and Technology,2016,32(3):30−35.] ZHAO M M, XIN P X, CHEN N N, et al. Structural variations in the subunits of arachin and conarachin under acidic conditions[J]. Modern Food Science and Technology, 2016, 32（3）: 30−35.
[14] LI W LI S G, HU Y, et al. Impact of hot alkali modification conditions on secondary structure of peanut protein and embeding rate of curcumin[J]. Food Science and Human Wellness,2019,8(3):283−291. doi: 10.1016/j.fshw.2019.05.004
[15] TANG Y, YANG Y X, WANG Q M, et al. Combined effect of carboxymethylcellulose and salt on structural properties of wheat gluten proteins[J]. Food Hydrocolloids,2019,97:105189. doi: 10.1016/j.foodhyd.2019.105189
[16] 张雪春, 茹月蓉, 程群, 等. 八种多酚与核桃蛋白相互作用的研究[J]. 食品与发酵工业,2022,48(12):97−104. [ZHANG X C, RU Y R, CHENG Q, et al. Studies of interaction between eight polyphenols and walnut protein[J]. Food and Fermentation Industries,2022,48(12):97−104.] ZHANG X C, RU Y R, CHENG Q, et al. Studies of interaction between eight polyphenols and walnut protein[J]. Food and Fermentation Industries, 2022, 48（12）: 97−104.
[17] 高瑾, 梁宏闪, 赵靖昀, 等. 玉米醇溶蛋白-多酚相互作用及复合物制备与表征[J]. 食品科学,2022,43(2):8−17. [GAO J, LIANG H S, ZHAO J Y, et al. Interactions between zein and polyphenols and characterization of their complexes[J]. Food Science,2022,43(2):8−17.] GAO J, LIANG H S, ZHAO J Y, et al. Interactions between zein and polyphenols and characterization of their complexes[J]. Food Science, 2022, 43（2）: 8−17.
[18] CHEN X W, WANG J, YANG X, et al. Subcritical water induced complexation of soy protein and rutin:Improved interfacial properties and emulsion stability[J]. Journal of Food Science,2016,81(9):C2149−C2157.
[19] 曹云刚. 植物多酚对肉蛋白氧化稳定性和功能特性的影响机理及应用[D]. 无锡:江南大学, 2016. [CAO Y G. Effect of plant-derived polyphenols on oxidative stability and functional properties of meat proteins:Mechanism and application[D]. Wuxi:Jiangnan University, 2016.] CAO Y G. Effect of plant-derived polyphenols on oxidative stability and functional properties of meat proteins: Mechanism and application[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2016.
[20] DONG A C, HUANG PING, CAUGHEY W S. Protein secondary structures in water from second-derivative amide I infrared spectra[J]. Biochemistry,1990,29(13):3303−3308. doi: 10.1021/bi00465a022
[21] ZHAO Q, YU X, ZHOU C, et al. Effects of collagen and casein with phenolic compounds interactions on protein in vitro digestion and antioxidation[J]. LWT,2020,124:109192. doi: 10.1016/j.lwt.2020.109192
[22] 王晨, 谢岩黎, 范亭亭. 花青素与小麦蛋白相互作用及对蛋白质结构的影响[J]. 食品科学,2019,40(20):60−66. [WANG C, XIE Y L, FAN T T. Interactions of cyanidin-3-o-glucoside with gliadin and glutenin and their effects on protein structure[J]. Food Science,2019,40(20):60−66.] WANG C, XIE Y L, FAN T T. Interactions of cyanidin-3-o-glucoside with gliadin and glutenin and their effects on protein structure[J]. Food Science, 2019, 40（20）: 60−66.
[23] MENG Y Y MENG C L. Conformational changes and functional properties of whey protein isolate-polyphenol complexes formed by non-covalent interaction[J]. Food Chemistry,2021,364:126922.
[24] 赵思明, 江连洲, 王冬梅, 等. EGCG对大豆蛋白结构的调控机理[J]. 食品科学,2021,42(12):67−75. [ZHAO S M, JIANG L Z, WANG D M, et al. Regulation mechanism of epigallocatechin gallate on the structure of soybean protein[J]. Food Science,2021,42(12):67−75.] ZHAO S M, JIANG L Z, WANG D M, et al. Regulation mechanism of epigallocatechin gallate on the structure of soybean protein[J]. Food Science, 2021, 42（12）: 67−75.
[25] 郄雪娇, 程亚, 曾茂茂, 等. 食品多酚与蛋白相互作用及其对多酚生物可利用性影响的研究进展[J]. 食品与发酵工业,2019,45(8):232−237. [XI X J, CHENG Y, ZENG M M, et al. Advances in food polyphenol-protein interactions and their impact on polyphenol bioavailability[J]. Food and Fermentation Industries,2019,45(8):232−237.] XI X J, CHENG Y, ZENG M M, et al. Advances in food polyphenol-protein interactions and their impact on polyphenol bioavailability[J]. Food and Fermentation Industries, 2019, 45（8）: 232−237.
[26] TRAN HONG QUAN S B T S. Protein–polyphenol conjugates:Antioxidant property, functionalities and their applications[J]. Trends in Food Science & Technology,2019(91):501−507.
[27] 曹佳兴. 超声辅助EGCG共价修饰在小麦醇溶蛋白改性中的应用研究[D]. 郑州:河南工业大学,2023. [CAO J X. Ultrasound-assisted covalent modification of EGCG in the modification of gliadin[D]. Zhenzhou:Henan University of Technology,2023.] CAO J X. Ultrasound-assisted covalent modification of EGCG in the modification of gliadin[D]. Zhenzhou: Henan University of Technology, 2023.
[28] JONGBERG S, LUND M N, SKIBSTED L H, et al. Competitive reduction of perferrylmyoglobin radicals by protein thiols and plant phenols[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(46):11279−11288. doi: 10.1021/jf5041433
[29] 郑启航, 苗振弛, 宋斌, 等. 高静水压处理对玉米淀粉/阿魏酸复合体系理化及结构特性的影响[J]. 食品科学,2023,44(19):51−57. [ZHENG Q H, MIAO Z C, SONG B, et al. Effects of high hydrostatic pressure treatment on physicochemical and structural characteristics of maize starch/ferulic acid composite system[J]. Food Science,2023,44(19):51−57.] doi: 10.7506/spkx1002-6630-20220921-206 ZHENG Q H, MIAO Z C, SONG B, et al. Effects of high hydrostatic pressure treatment on physicochemical and structural characteristics of maize starch/ferulic acid composite system[J]. Food Science, 2023, 44（19）: 51−57. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20220921-206
[30] 李琦, 葛思彤, 张士禹, 等. 玉米后熟期间醇溶蛋白结构和理化特性[J]. 食品科学,2022,43(18):16−23. [[LI Q, GE S T, ZHANG S Y, et al. Structure and physicochemical properties of zein during postharvest ripening of corn[J]. Food Science,2022,43(18):16−23.] doi: 10.7506/spkx1002-6630-20211108-088 [LI Q, GE S T, ZHANG S Y, et al. Structure and physicochemical properties of zein during postharvest ripening of corn[J]. Food Science, 2022, 43（18）: 16−23. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20211108-088
[31] XU Q D, YU L Z, ZENG W. Structural and functional modifications of myofibrillar protein by natural phenolic compounds and their application in pork meatball[J]. Food Research International,2021,148:110593.
[32] 程周周. 基于多酚-蛋白分子互作的低牛乳蛋白体系构建及机制研究[D]. 杭州:浙江工商大学, 2022. [CHENG Z Z. Construction and mechanism of hypoallergenic milk protein system based on polyphenol-protein molecular interaction[D]. Hangzhou:Zhejiang Gongshang University,2022.] CHENG Z Z. Construction and mechanism of hypoallergenic milk protein system based on polyphenol-protein molecular interaction[D]. Hangzhou: Zhejiang Gongshang University, 2022.
[33] 孟令莉, 张晗, 侯惠静, 等. 卵清白蛋白-没食子酸-葡聚糖共聚物对白藜芦醇稳定性和抗氧化性的影响[J]. 食品科学,2022,43(16):135−144. [MENG L L, ZHANG H, HOU H J, et al. Effects of OVA-GA-DEX conjugates on stability and antioxidant activity of resveratrol[J]. Food Science,2022,43(16):135−144.] doi: 10.7506/spkx1002-6630-20220320-235 MENG L L, ZHANG H, HOU H J, et al. Effects of OVA-GA-DEX conjugates on stability and antioxidant activity of resveratrol[J]. Food Science, 2022, 43（16）: 135−144. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20220320-235
[34] 赵钜阳, 袁惠萍, 姚恒喆, 等. pH值对儿茶素-大豆分离蛋白复合物结构与乳化性的影响[J]. 食品科学技术学报,2023,41(3):127−138. [ZHAO J Y, YUAN H P, YAO H Z, et al. Effect of pH on the structure and emulsibility of catechin-soy protein isolate complex[J]. Journal of Food Science and Technology,2023,41(3):127−138.] ZHAO J Y, YUAN H P, YAO H Z, et al. Effect of pH on the structure and emulsibility of catechin-soy protein isolate complex[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023, 41（3）: 127−138.
[35] 瞿丞, 贺稚非, 王兆明, 等. 不同食盐添加量腌制对鸡肉脂质氧化、蛋白质氧化及食用品质的影响[J]. 食品科学,2020,41(16):77−85. [QU C, HE Z F, WANG Z M, et al. Effects of different salt concentrations on lipid oxidation, protein oxidation and eating quality of cured chicken meat[J]. Food Science,2020,41(16):77−85.] QU C, HE Z F, WANG Z M, et al. Effects of different salt concentrations on lipid oxidation, protein oxidation and eating quality of cured chicken meat[J]. Food Science, 2020, 41（16）: 77−85.
[36] HU Y P, GAO Y F, SOLANGI I, et al. Effects of tea polyphenols on the conformational, functional, and morphological characteristics of beef myofibrillar proteins[J]. LWT,2022,154:112596. doi: 10.1016/j.lwt.2021.112596
-
期刊类型引用(6)
1. 冯博，邵毅，黄柳娟，禹建虎，龚新武，白冰. 不同处理方式对‘大泡’青皮核桃采后保鲜效果的影响. 上海农业学报. 2024(01): 103-108 . 
百度学术
2. 王盼盼，管维良，孙志栋，蔡路昀. 芥末精油复合1-甲基环丙烯保鲜处理对绿花菜贮藏期间品质的影响. 食品工业科技. 2024(11): 270-279 . 本站查看
3. 李金金，李春媛，罗铮，张鹏，张爱琳，吴迪，李江阔. 高值果蔬采后保鲜技术研究进展. 保鲜与加工. 2024(06): 109-119 . 百度学术
4. 张玉萍，莫丽媛，丁惠敏，史君彦，王文亮，王延圣，乔丽萍. 双乙酰处理对鲜切西兰花贮藏品质及抗氧化能力的影响. 食品与发酵工业. 2024(24): 114-122 . 百度学术
5. 钱井，郑鄢燕，李蔚，满杰，郑丽静，韦强，赵立群. 1-甲基环丙烯结合寡雄腐霉菌对番茄贮藏品质的影响. 食品科技. 2023(09): 23-29 . 百度学术
6. 刘培秀，赵美萱，杨梅，雷晓英，刘文强，杨敏，李玉鹏. 西兰花粉营养成分及理化性质研究. 食品工业科技. 2022(11): 326-333 . 本站查看
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