Research on the Mechanism of Mannose Oligosaccharide Enhancing the Inhibitory Effect of Bifidobacterium breve on the Growth of Fusobacterium nucleatum
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摘要: 为探究双歧杆菌与低聚糖协同抑制具核梭杆菌作用及机理，采用6种常见双歧杆菌（动物双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌）代谢6种不同结构且应用广泛的低聚糖（低聚甘露糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚乳果糖、阿拉伯半乳聚糖），通过硫化氢的生成与生物膜的抑制，确定最佳抑制具核梭杆菌组合，通过扫描电镜、透射电镜与流式细胞仪分析具核梭杆菌菌体细胞完整性，研究抑菌机理，并探讨其酸性代谢产物对具核梭杆菌的抑制作用影响，测定其短链脂肪酸产量，此外还挖掘了双歧杆菌潜在细菌素基因簇。结果显示，低聚甘露糖促进短双歧杆菌抑制具核梭杆菌效果最佳，其组合可显著减少硫化氢的产生与生物膜的形成，与空白对照相比，在添加量达到20%时，对具核梭杆菌的抑制率可达到63.16%±4.48%，其表观结构明显损伤，蛋白和核酸流出，细胞膜的完整性和通透性被破坏。这种抑菌效果会随着上清液pH向中性环境的靠近而下降，表明上清液中酸性代谢产物在发挥抑菌效果中起重要作用，上清液中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸分别含量为26.112、10.829、5.106、5.232 mmol/L。此外基因预测到短双歧杆菌包含2个潜在的细菌素合成基因簇。综上，低聚甘露糖配合短双歧杆菌的合生元组合或可作为一种安全、有效的具核梭杆菌生物防控抑制剂，为预防及辅助治疗结直肠癌等肿瘤疾病提供更为安全有效的新方法。Abstract: To explore the synergistic inhibitory effect and mechanism of Bifidobacterium and oligosaccharides on Fusobacterium nucleatum, six common Bifidobacterium species (Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium youth) were used to metabolize six widely used oligosaccharides (mannose oligosaccharides, galactose oligosaccharides, isomaltose oligosaccharides, fructooligosaccharides, lactulose oligosaccharides, and arabinogalacia) with different structures. Through the generation of hydrogen sulfide and the inhibition of biofilm, the optimal combination of inhibition of Fusobacterium nucleatum was determined. The cell integrity of Fusobacterium nucleatum was analyzed by scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and flow cytometry to study the inhibition mechanism of Fusobacterium nucleatum. The inhibitory effect of acidic metabolites on Fusobacterium nucleatum and the yield of short-chain fatty acids were investigated. In addition, the potential bacteriocin gene clusters of Bifidobacterium were also excavated. The results showed that mannose oligosaccharide had the best effect in promoting Bifidobacterium breve to inhibit Fusobacterium nucleatum, and the combination could significantly reduce the production of H2S and the formation of biofilm. Compared with the blank control, when the addition amount of cell-free supernatant reached 20%, the inhibition rate of Fusobacterium nucleatum could reach 63.16%±4.48%. The apparent structure was obviously damaged, protein and nucleic acid flowed out, and the integrity and permeability of the cell membrane were destroyed. This inhibitory effect diminished as the supernatant's pH became closer to neutral, suggesting that the supernatant's acidic metabolites were crucial to the antibacterial action. The supernatant had the following amounts of acid: 26.112 mmol/L for acetic acid, 10.829 mmol/L for propionic acid, 5.106 mmol/L for butyric acid, and 5.232 mmol/L for valeric acid. In addition, Bifidobacterium breve was predicted to contain two potential bacteriocin synthesis gene clusters. In conclusion, the combination of mannose oligosaccharides and Bifidobacterium breve may be used as a safe and effective biological control inhibitor of Fusobacterium nucleatum, which may provide a safer and more effective method for the prevention and adjuvant treatment of colorectal cancer and other tumor diseases.
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双歧杆菌是目前应用最为广泛的益生菌[1]，具有调节肠道炎症及免疫[2]、抑制致病菌[3]以及参与癌症治疗等诸多功效[4]。具核梭杆菌是口腔特征致病菌，在结直肠癌患者的粪便和肿瘤组织中显著富集[5]，该菌不仅能促进结直肠癌细胞的增殖和代谢、创造促炎肿瘤环境，还可同时抑制抗癌免疫反应、促进结直肠癌的耐药和转移[6]。目前，通过抑制具核梭杆菌达到抗肿瘤治疗的方法已被证实为一种新的结直肠癌治疗策略[7]。Jessie等[8]临床研究发现，受试者服用青春双歧杆菌、长双歧杆菌和两歧双歧杆菌后，粪便中具核梭菌的丰度可有效减少，肠道微生物环境得以改善，结直肠发生的风险显著降低。本团队前期研究发现[9]，某些益生菌代谢产物具有破坏具核梭杆菌细胞膜、抑制其生长增殖的作用，并可有效控制由具核梭杆菌诱导的结直肠癌细胞的增殖和转移。现有的临床与动物实验研究发现[10]，服用含有多糖和低聚糖的成分可促使肠道内双歧杆菌的丰度上调，提高短链脂肪酸的产量，增强抑菌能力，加强对肿瘤细胞的调控作用，改善宿主健康。也有报道证明了低聚半乳糖与短双歧杆菌协同作用具有改善肠综合征患者的肠道吸收的功能[11]。但目前研究均集中于临床及动物实验中低聚糖类可有效促进肠道双歧杆菌增殖等效果研究，而不同种类（单糖组成）及结构（空间构象）的低聚糖对双歧杆菌的促进作用与其所能利用的单糖是否类似，这种靶向供养关系与益生菌的功能性发挥及作用机制尚无报道。
本文旨在探究不同结构低聚糖被不同种双歧杆菌代谢后抑制具核梭杆菌作用及机理，揭示低聚糖介导肠道益生菌发挥调控肠道稳态及免疫的机制，为预防及辅助治疗结直肠癌等肿瘤疾病提供更为安全有效的新方法。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）ATCC25586 北纳创联生物技术究院；动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）、两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis） 本实验室保藏菌种；细菌培养基 青岛海博生物技术有限公司；低聚甘露糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚乳果糖、阿拉伯半乳聚糖 上海源叶生物科技有限公司；短链脂肪酸标品 美国Sigma公司；蛋白定量试剂盒 南京建成；0.1%结晶紫 北京索莱宝科技有限公司。
GI54DWS高压灭菌器 美国致微仪器有限公司；INFINITE M200 PRO多功能酶标仪 帝肯贸易有限公司；LE-80k超速离心机 美国Beckman公司；7890B气相色谱仪 美国Agilent公司；*FACSCelesta分析性流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；SU8010扫描电子显微镜、H-7650透射电子显微镜 日本日立公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细菌菌株和培养条件
将动物双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌在37 ℃ MRS肉汤培养基中活化[12]，以108 CFU/mL的接种量接种在用益生元（低聚甘露糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚乳果糖、阿拉伯半乳聚糖）替代碳源的无糖MRS中发酵48 h，益生元替代添加量同青岛海博公司MRS肉汤培养基中葡萄糖含量20 g/L。将培养后的上清液于8000×g、4 ℃、离心10 min后，过0.22 μm微孔膜去除细菌，制成无细胞发酵上清液（Cell-free supernatant，CFS），用于后续实验。具核梭杆菌需在37 ℃硫乙醇酸盐液体培养基中厌氧培养。
1.2.2 抑制具核梭杆菌的益生组合筛选
1.2.2.1 硫化氢法
通过H2S与FeSO4反应产生黑色的FeS沉淀，来初步判断CFS抑制具核梭杆菌产生H2S的能力[13]。向含有10% CFS或MRS的培养基中加入0.02%（体积分数）的硫酸亚铁和0.03%（体积分数）的硫代硫酸钠，现配现用，随后将对数期的菌悬液，以5%的接种量接入到培养基中，37 ℃厌氧培养48 h，根据沉淀情况判断。
1.2.2.2 生物膜抑制法
通过结晶紫法测定CFS对具核梭杆菌生成生物膜的影响[14]。向96孔板中加入180 μL细菌悬液（107 CFU/mL）和20 μL CFS，十字摇匀厌氧培养48 h，阴性对照以添加益生元（20 g/L）的空白MRS培养基替代CFS。待培养结束后，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）重复清洗生物膜两次，取100 μL甲醇加入每孔中固定15 min，从孔中吸出甲醇并让其自然风干，再向每孔中加入100 μL 0.1%结晶紫溶液，染色30 min，吸去结晶紫染液后，PBS重复清洗两次，加入100 μL 95%乙醇，摇床室温振荡30 min，使用酶标仪在590 nm处测定孔中溶液的吸光度值。每种菌株做6个复孔，取平均值。
抑制率(%)=(阴性对照生物膜量−上清液干预生物膜量阴性对照生物膜量)×100 式中：生物膜量数值均为酶标仪590 nm处测定孔中的吸光度。
1.2.3 CFS对具核梭杆菌抑制机理探究
1.2.3.1 CFS对具核梭杆菌抑制效果的影响
实验方法参照文献[15]并稍加调整，以探究筛选出的双歧杆菌代谢低聚糖生成的CFS（后文特指短双歧杆菌代谢低聚甘露糖上清液）对具核梭杆菌的抑菌效果。将具核梭杆菌以107 CFU/mL接种到含CFS 10%、20%、30%的硫乙醇酸盐培养基，不含CFS硫乙醇酸盐培养基为空白对照，厌氧培养48 h，过程中用酶标仪测定菌液OD600，绘制生长曲线，吸光值OD600可以反映菌液中细菌数目的多少，从而反映CFS对具核梭杆菌抑菌效果[16]，并根据48 h的吸光值计算其相对抑菌率。
相对抑菌率(%)=100−(A×100/B) 式中：A为具核梭杆菌在不同浓度CFS中培养48 h的OD600；B为空白培养基中培养48 h的OD600。
1.2.3.2 CFS对具核梭杆菌细胞膜破坏作用
通过碘化丙啶（Propidium indide，PI）与细菌DNA嵌入情况检测细菌细胞膜的通透性[17]。将过夜培养至对数期的具核梭杆菌接种到含有CFS（0%、20%、30%，v:v）的硫乙醇酸盐培养基中，孵育3 h，8000 r/min离心10 min，弃去上清，将菌体沉淀PBS洗涤两次，将洗涤好的细菌重悬至OD600值为0.1。将菌液与PI染液混合，至PI终浓度为10 μg/mL，避光孵育15 min，过300目尼龙筛，用流式细胞仪进行检测。
1.2.3.3 CFS对具核梭杆菌细胞膜通透性影响
实验方法参照文献[18]并稍加调整，具核梭杆菌培养方式同1.2.3.2，分别孵育0、4、8、16、24 h后，取上清液以4 ℃、8000 r/min离心10 min，过0.22 μm微孔膜去除细菌，测OD260 nm处核酸含量；考马斯亮蓝法测蛋白含量。
1.2.3.4 CFS对具核梭杆菌菌体破坏作用的表观观察
利用扫描电镜与透射电镜观察具核梭杆菌在CFS处理前后细胞形态的变化，以探究其对菌体的破坏作用[19]。通过扫描电镜来观测细胞表面结构变化，具核梭杆菌培养方式同1.2.3.2，孵育3 h，对样品进行离心，弃去上清，将菌体沉淀PBS洗涤两次，用2.5% pH7.2的戊二醛4 ℃固定过夜，再用PBS冲洗细菌三次，之后使用50%、70%、90%和100%的乙醇对细菌进行脱水。脱水后分别用乙醇和叔丁醇对细菌进行置换，然后对样品进行冷冻干燥、粘样和镀膜，最后观察拍照。
利用透射电镜观察具核梭杆菌在CFS处理前后细胞内结构的变化。处理方式同扫描电镜，固定过夜洗涤后的菌体加入1%的锇酸固定液进行后固定，后用PBS漂洗细菌三次，收集菌泥。然后使用50%、70%、90%和100%的乙醇和丙酮对细菌进行脱水，脱水结束，使用丙酮和包埋液对样品进行浸透，接着对样品进行包埋、切片和正染色，观察拍照。
1.2.4 酸性代谢产物对具核梭杆菌抑制作用研究
1.2.4.1 CFS中酸强度对抑菌效果影响
将上述筛选出的短双歧杆菌代谢低聚甘露糖的上清液，用6 mol/L氢氧化钠溶液将pH调至4.0、5.0、6.0、7.0，以20%的添加量添加到硫乙醇酸盐液体培养基，用此培养基培养具核梭杆菌24 h，测定此时OD600值，以短双歧杆菌代谢葡萄糖为对比参照，确定短双歧杆菌代谢低聚甘露糖后对具核梭杆菌的抑菌效果，每个实验重复三次，取平均值。
1.2.4.2 CFS中短链脂肪酸含量
参照张翊文[20]的方法，采用外标法对短链脂肪酸含量（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸）进行测定。从短双歧杆菌代谢低聚甘露糖的上清液中取2 mL发酵液，4 ℃、10000×g离心5 min后，取1 mL上清液置于2 mL离心管中，加入0.5 mol/L硫酸溶液5 μL振荡混匀，取1 mL乙酸乙酯与其振荡混匀，4 ℃、10000×g离心10 min，取上层有机相经0.22 μm滤膜过滤后置于样品瓶中，通过气相色谱仪检测短链脂肪酸含量。标准品与发酵液处理方式相同，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归分析，绘制标准曲线，计算样品中短链脂肪酸的含量，将短双歧杆菌代谢葡萄糖作为阳性对照。
1.2.5 细菌素基因簇的发掘
利用在线软件BAGEL4（http://bagel5.molgenrug.nl/），挖掘短双歧杆菌基因组中潜在细菌素基因。以antiSMASH数据库（Anti-biotics and Secondary Metabolite Analysis Shell）为参考数据库，获取次级代谢物合成基因簇的分析结果。
1.3 数据处理
本实验设置三组平行，使用SPSS中单因素方差对数据进行显著性分析，用Origin作图。
2. 结果与分析
2.1 基于抑制具核梭杆菌产H2S能力的益生组合筛选
具核梭杆菌产生挥发性硫化物（如H2S）不仅造成口臭，还分泌更多的促炎细胞因子，诱发炎症反应，导致牙周炎发病[21]。双歧杆菌代谢物可显著降低具核梭杆菌生成的H2S，沉淀量可以初步判断抑菌效果，沉淀量越少或无沉淀，证明具核梭杆菌产生的H2S越少，抑菌效果越强。结果如表1所示，两歧双歧杆菌组都产生大量或较多沉淀，无抑菌效果或抑菌效果较差，动物双歧杆菌在只有代谢低聚甘露糖时有抑菌能力，而长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌与短双歧杆菌组沉淀量普遍较少，证明其上清液可减少具核梭杆菌生成的H2S，有较好的抑菌效果。这也与Huang等[22]发现的乳双歧杆菌对产生挥发性硫化物的具核梭杆菌表现出优异的抑菌效果一致。
表 1 CFS抑制具核梭杆菌产H2S的能力Table 1. Ability of CFS to inhibit the production of H2S by Fusobacterium nucleatum菌株 阿拉伯半
乳聚糖低聚
果糖低聚甘
露糖低聚乳
果糖低聚异
麦芽糖低聚半
乳糖动物双歧杆菌 +++ + − ++ + ++ 长双歧杆菌 − + +++ − − + 婴儿双歧杆菌 ++ − − − − − 短双歧杆菌 + − − − − + 两歧双歧杆菌 +++ ++ +++ +++ ++ +++ 青春双歧杆菌 − ++ − − − + 注：“−”表示无沉淀，“+”有一点沉淀，“++”有较多沉淀，“+++”有大量沉淀。 2.2 基于抑制具核梭杆菌生物膜形成的益生组合筛选
生物膜是一种由细菌自身分泌的包括多糖、DNA、磷脂和蛋白质等物质的聚合物基质，对致病菌起到一定程度的保护作用，免受抗生物膜和抗菌物质的侵害[23]，生长在生物膜中的细菌比未附着的细菌对抗生素更具耐药性，更难从体内根除[24]。本研究利用结晶紫染色法测定CFS对具核梭杆菌生物膜的抑制作用，如图1所示，双歧杆菌上清液对生物膜的抑制率大多维持在20%到60%之间，且大多数生物膜抑制率不低于40%，而短双歧杆菌代谢低聚甘露糖上清液抑制率高达63.59%，抑菌效果最好。同时结合抑制H2S生成实验进行分析，发现短双歧杆菌代谢低聚甘露糖所得上清液在抑制硫化氢生成与生物膜抑制率所达到的效果最好，故而选择此上清液用于后续实验。相似地，Kyung等[25]研究发现在添加30%（v/v）罗伊式乳杆菌无细胞上清液时，显著抑制了口腔致病菌生物膜的形成，并下调与生物膜形成与附着有关的相关基因，从而抑制细菌的生长代谢，这与本实验结果基本一致，为接下来讨论短双歧杆菌代谢低聚甘露糖上清液抑制具核梭杆菌提供基础。
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图 1 CFS对具核梭杆菌生物膜形成抑制效果注：不同小写字母表示同一种低聚糖被不同种双歧杆菌代谢产生的代谢产物对具核梭杆菌生物膜的抑制效果差异显著（P<0.05）。Figure 1. Inhibition effect of CFS on biofilm formation in Fusobacterium nucleatum2.3 CFS对具核梭杆菌的抑菌效果比较
在硫乙醇酸盐培养基中加入不同浓度短双歧杆菌代谢低聚甘露糖上清液CFS，如图2所示，正常具核梭杆菌生长曲线呈典型的S型，18 h菌液吸光度最高，随后进入稳定期。而经CFS处理后，曲线变化明显，10%处理组，细菌虽也呈现扩增生长，但所达到最高点的菌液吸光度明显降低，而随着CFS浓度升高，具核梭杆菌的生长受抑制效果更显著，在添加量为20%时，相对抑菌率为63.16%±4.48%，可以看出CFS对具核梭杆菌有明显的抑制效果，当添加量达到30%时，相对抑菌率达到92.22%±0.17%，具核梭杆菌的生长几乎完全被抑制。后文采用了20%与30%两个浓度分析上清液对具核梭杆菌的抑菌机理，而对于表观结构的分析仅采用了20%浓度，因在30%的条件下，具核梭杆菌无法生长增殖，菌体量过少且菌体结构被破坏严重，无法观察推测。
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图 2 CFS对具核梭杆菌的抑菌效果注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 2. Antibacterial effect of CFS against Fusobacterium nucleatum2.4 CFS对细胞膜完整性影响
细菌的细胞膜是一个具有调节物质进出作用的功能单位，完整的细胞膜保证细菌正常生长。细胞膜被破坏后，膜的渗透性增加，内容物流出，致使细菌死亡。通常使用碘化丙啶染色，将其进入细胞后与细胞中的DNA非特异性结合发射的荧光作为检测标志。图3的x轴为PI荧光强度，表明渗透水平，当细胞膜受损，碘化丙啶与DNA结合得越多，其荧光强度峰就会越向右移动到P2区域。空白对照中P2区域不显示荧光，表明具核梭杆菌的细胞膜完整。而当CFS浓度为20%与30%时，P2区域荧光信号达到75.8%与95.9%，表明CFS破坏了具核梭杆菌细胞膜的选择透过性及完整性，细胞膜通透性明显提高。
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图 3 CFS对具核梭杆菌细胞膜完整性影响Figure 3. Effect of CFS on cell membrane integrity of Fusobacterium nucleatum2.5 CFS对具核梭杆菌细胞膜通透性影响
细胞内大分子物质（核酸和蛋白质）的泄露是评价细胞膜完整性的重要指标。由图4可知，具核梭杆菌与CFS共孵育一段时间后，空白对照组无细胞上清液中OD260 nm（核酸）虽然上升，但始终保持在0.2以下，而处理组在4 h处OD260 nm显著上升（P<0.05），且随CFS浓度增加，数值变化更为明显，8 h后趋于稳定。在8 h时，20% CFS与30% CFS的OD260 nm分别上升至0.27和0.32，表明CFS处理增加了其细胞膜通透性，使菌内核酸泄露。由图5可知，空白对照组胞外蛋白质量浓度虽有变化，但整体低于10 μg/mL，而处理组随时间推移，胞外蛋白溶出量均呈上升趋势，在24 h处分别升至28 μg/mL和36 μg/mL，表明具核梭杆菌细胞膜发生严重破损，通透性增加，导致大量蛋白质溶出，这也与核酸外泄结果基本一致。
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图 4 CFS对具核梭杆菌细胞膜通透性影响注：不同小写字母表示同一时间点组间差异显著（P<0.05）；图5同。Figure 4. Effect of CFS on cell membrane permeability of Fusobacterium nucleatum![]()
图 5 具核梭杆菌胞外蛋白含量变化Figure 5. Variation of extracellular protein content in Fusobacterium nucleatum2.6 CFS对具核梭杆菌表观结构的影响
通过扫描电镜观察CFS对具核梭杆菌的细胞损伤，未处理组（图6A1、6A2）菌体形态完整，形状规则，无损伤，边缘光滑，呈现圆润饱满的杆状，菌体周围有一层很厚的细菌分泌物，细菌被包裹在自产的细胞外聚合物基质中；20% CFS处理组（图6B1、6B2）菌体出现变形和破裂，菌膜出现塌陷皱缩，周围结构松散，几乎没有分泌物包裹，推测为CFS抑制具核梭杆菌生物膜的形成，并破坏其细胞膜。
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图 6 扫描电镜与透射电镜观察CFS对具核梭杆菌结构影响注：A1~A3为未处理组具核梭杆菌；B1~B3为20% CFS处理具核梭杆菌；第1、2、3列分别为5000倍数扫描电镜、30000倍数扫描电镜、40000倍数透射电镜。Figure 6. SEM and TEM observation of the effect of CFS on the cellular structure of Fusobacterium nucleatum透射电镜结果进一步验证了扫描电镜的观察结果。未经CFS处理的具核梭杆菌（图6A3）细胞膜边缘清晰、形状规整、连续，细胞质均匀致密；而经20% CFS处理的具核梭杆菌（图6B3）细胞壁变薄，部分位置破损消失，与细胞膜界限出现断裂且边缘模糊，细胞结构完整性遭到破坏，沿细胞膜聚集成簇，呈空心区，表明也有细胞质渗漏的可能。结果表明，20%浓度CFS对具核梭杆菌的细胞膜和胞内结构均造成损伤，导致其无法正常生长。
2.7 酸性代谢产物对具核梭杆菌抑制作用的研究
2.7.1 代谢产物酸强度对抑菌效果影响
双歧杆菌在其生长繁殖过程中可生成多种代谢产物（如有机酸、过氧化氢、细菌素等）抑制病原菌的黏附，从而限制病原体的生长并与病原菌竞争营养物质，达到抑菌的效果[26]。为明确该作用是否为有机酸的效果，将筛选出的代谢产物调节至不同pH，进行抑菌能力检测。由图7可知，随着上清液pH的升高，抑菌能力呈现下降趋势，证明上清液中的有机酸是抑菌的关键。在同一pH条件下，低聚甘露糖代谢产物均比仅葡萄糖代谢产物抑菌效果更佳，这与低聚甘露糖能更好地促进短双歧杆菌生长繁殖有关。Geng等[27]的研究也证实，低聚甘露糖相较低聚果糖、低聚半乳糖更能提高副干酪乳杆菌的活力，增强其抗菌性能。此外，也有报道称[28]，低聚甘露糖本身也可能对病原菌有较高的抗黏附能力，从而减少其生物膜的形成，达到一定抑菌效果。
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图 7 pH对CFS抑菌效果的影响注：不同大写字母代表同一pH不同上清液存在显著性差异，不同小写字母代表同一上清液不同pH存在显著性差异（P<0.05）。Figure 7. Effect of pH on the antibacterial efficacy of CFS2.7.2 CFS中短链脂肪酸含量测定
由于双歧杆菌生长过程中可产生一定数量的短链脂肪酸[29]，且目前已知这些脂肪酸对宿主肠免疫及肠稳态（包括抑制病原菌）起着至关重要的作用。因此，本研究测定了短双歧杆菌代谢低聚甘露糖和葡萄糖的短链脂肪酸含量（图8），短双歧杆菌代谢低聚甘露糖所生成的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量分别为26.112、10.829、5.106、5.232 mmol/L，而代谢葡萄糖所产生的短链脂肪酸含量分别为21.611、10.573、4.690、4.940 mmol/L。由此表明，短双歧杆菌代谢低聚甘露糖较葡萄糖可生成更多的短链脂肪酸。有临床研究显示，在结直肠癌患者肠道中丁酸盐生成菌丰度会显著减少，而具核梭杆菌丰度却增加[30]。向患者肠道靶向递送短链脂肪酸，可抑制具核梭杆菌的生长，减少其富集和黏附（下调相关外膜蛋白RadD、Foma和FadA的表达），并可缓解该菌引起的化疗耐药，该方法已作为预防或延缓结肠癌进展的新型生物疗法[31-32]。本研究证实低聚甘露糖可通过增强短双歧杆菌产酸数量，增强短双歧杆菌对具核梭杆菌的抑制能力。
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图 8 CFS中短链脂肪酸的含量注：不同大写字母代表同一短链脂肪酸不同上清液存在显著性差异，不同小写字母代表同一上清液不同短链脂肪酸存在显著性差异（P<0.05）。Figure 8. Content of short chain fatty acids in CFS2.8 细菌素基因簇挖掘
鉴于短双歧杆菌上清液对具核梭杆菌的特异性抗菌作用，使用自动化细菌素挖掘工具BAGEL4软件和antiSMASH探索短双歧杆菌基因组中抗菌肽或细菌素合成基因的潜在簇，预测结果如图9所示，共有2个潜在热点区域（Areas of intrest，AOI），以操纵子的结构排列，AOI-01是以Propionicin-SM1为核心肽的基因簇，由27个orf（Open reading frame）组成，其基因簇上游编码了LanKC转移酶，下游编码了1个ABC转运蛋白。AOI-02是以Propeptin-2为核心肽的基因簇，由19个orf组成，共编码了3个ABC转运蛋白，LasC调控天冬酰胺合成酶的合成，2个AOI均编码LanKC转移酶，LanKC即羊毛肽类糖基转移酶（III类羊毛肽合成酶）。羊毛硫细菌素具有防御和清除革兰氏阳性、阴性菌的生物被膜，抑制病原菌定植的功效[33]，可结合Lipid II抑制细胞壁合成或结合磷脂破坏细胞膜发挥抗菌活性，对多种口腔和上呼吸道细菌有抗菌作用[34]。
3. 结论
本研究旨在探究不同类型低聚糖与双歧杆菌的组合增强其抑制具核梭杆菌功能及其机制。实验结果证明了低聚糖与双歧杆菌具有一定的条件性协同益生作用，可显著抑制具核梭杆菌的生长及生物膜的生成，具体机制为其代谢产物对菌体细胞膜结构造成损伤，使蛋白与核酸等大分子物质外泄，破坏了细胞膜的完整性与通透性，从而起到抑菌作用。进一步对代谢产物中有机酸对抑菌效果进行分析发现，随着pH的调节，代谢产物由初始的酸性转变为中性后抑菌能力随之下降，表明有机酸在抑制具核梭杆菌生长中起关键作用，并测定了主要发挥抑菌作用的短链脂肪酸含量。此外，对短双歧杆菌进行基因预测发现其包含2个潜在的细菌素合成基因簇，证明短双歧杆菌自身也具有一定的抗菌能力。本研究为今后更好地利用低聚甘露糖与短双歧杆菌的合生元功能提供了有力的理论依据。
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图 1 CFS对具核梭杆菌生物膜形成抑制效果
注：不同小写字母表示同一种低聚糖被不同种双歧杆菌代谢产生的代谢产物对具核梭杆菌生物膜的抑制效果差异显著（P<0.05）。
Figure 1. Inhibition effect of CFS on biofilm formation in Fusobacterium nucleatum
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图 2 CFS对具核梭杆菌的抑菌效果
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 2. Antibacterial effect of CFS against Fusobacterium nucleatum
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图 3 CFS对具核梭杆菌细胞膜完整性影响
Figure 3. Effect of CFS on cell membrane integrity of Fusobacterium nucleatum
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图 4 CFS对具核梭杆菌细胞膜通透性影响
注：不同小写字母表示同一时间点组间差异显著（P<0.05）；图5同。
Figure 4. Effect of CFS on cell membrane permeability of Fusobacterium nucleatum
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图 5 具核梭杆菌胞外蛋白含量变化
Figure 5. Variation of extracellular protein content in Fusobacterium nucleatum
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图 6 扫描电镜与透射电镜观察CFS对具核梭杆菌结构影响
注：A1~A3为未处理组具核梭杆菌；B1~B3为20% CFS处理具核梭杆菌；第1、2、3列分别为5000倍数扫描电镜、30000倍数扫描电镜、40000倍数透射电镜。
Figure 6. SEM and TEM observation of the effect of CFS on the cellular structure of Fusobacterium nucleatum
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图 7 pH对CFS抑菌效果的影响
注：不同大写字母代表同一pH不同上清液存在显著性差异，不同小写字母代表同一上清液不同pH存在显著性差异（P<0.05）。
Figure 7. Effect of pH on the antibacterial efficacy of CFS
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图 8 CFS中短链脂肪酸的含量
注：不同大写字母代表同一短链脂肪酸不同上清液存在显著性差异，不同小写字母代表同一上清液不同短链脂肪酸存在显著性差异（P<0.05）。
Figure 8. Content of short chain fatty acids in CFS
表 1 CFS抑制具核梭杆菌产H2S的能力
Table 1 Ability of CFS to inhibit the production of H2S by Fusobacterium nucleatum
菌株 阿拉伯半
乳聚糖低聚
果糖低聚甘
露糖低聚乳
果糖低聚异
麦芽糖低聚半
乳糖动物双歧杆菌 +++ + − ++ + ++ 长双歧杆菌 − + +++ − − + 婴儿双歧杆菌 ++ − − − − − 短双歧杆菌 + − − − − + 两歧双歧杆菌 +++ ++ +++ +++ ++ +++ 青春双歧杆菌 − ++ − − − + 注：“−”表示无沉淀，“+”有一点沉淀，“++”有较多沉淀，“+++”有大量沉淀。 
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