Research Progress of Crustacean Allergens and Allergens Specific Immunological Products
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摘要: 甲壳类水产品是我国常见的致敏食物之一，除了规避致敏食物的摄入，目前仍无有效的根治方法。因此，致敏原的性质分析及防控技术方法的研究至关重要。本文针对甲壳类水产品致敏原，介绍了致敏原的免疫学特性与分子结构，归纳了致敏原的抗原表位，探讨了应用于致敏原特异性治疗的免疫制品，比较了不同免疫制品的作用机理及优缺点，可为研发水产品过敏的防控技术方法提供参考。Abstract: Crustaceans are a prevalent source of food allergies in China. Despite efforts to avoid consuming allergenic foods, there is currently no known remedy that effectively treats these allergies. Hence, conducting a therapeutic investigation of crustacean allergens and examining their characteristics holds great significance. This paper provides an introduction to the immunological characteristics and molecular structure of allergens. It also summarizes the antigen epitope of allergens and discusses the immunological products used in allergen-specific immunotherapy. Furthermore, it compares the advantages and disadvantages of different immunological products and their respective mechanisms of action. This information can serve as a reference for the development of reliable treatment methods for aquatic products.
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Keywords:
- crustacean /
- allergen /
- molecular structure /
- antigen epitope /
- specific immunological product
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过敏性疾病是一种严重影响人体健康的全球性问题，引起机体过敏的原因众多，其中食物过敏不容忽视[1]。据不完全统计，食物过敏影响了全球约5.2亿人，已经成为全球关注的食品安全和公共卫生问题[2]。水产品属于八大类过敏食物之一，包括甲壳类、贝类和鱼类，其中甲壳类水产品的致敏率高于鱼类与贝类[3]。甲壳类水产品是指无脊椎动物中的节肢类水生生物，如虾、蟹等。2022年，我国甲壳类水产品总产量为842.6万吨，同比增长5.26%[4]。随着年产量及消费量的增加，食用甲壳类水产品引起的过敏问题日益严重。
迄今为止，甲壳类水产品中已有多种致敏原被鉴定发现。结构及抗原表位是致敏原发挥作用的分子基础，且结构的变化会掩盖或摧毁抗原表位，进而影响致敏原的致敏性[5]。根据免疫应答过程中T细胞和B细胞的识别特点，通常将表位分为T细胞表位和B细胞表位[6]。致敏原进入机体后，通常被小肠外周组织中的树突状细胞（Dendritic Cell，DC）所摄取，然后被DC内的溶酶体所酶解，经过酶解得到抗原肽段在高尔基体内与主要组织相容性复合体II融合形成复合物，然后被转运、表达于DC表面，上述抗原肽即为T细胞表位，均为线性表位[7]；B细胞表位指致敏原中能被IgE特异性识别的特殊化学基团，故也称为IgE表位，可分为氨基酸序列连续的线性表位和氨基酸位置不连续但在折叠之后空间相邻的构象表位[8]。因此，明确致敏原结构及表位，对致敏原致敏性的研究具有重要意义，但甲壳类水产品致敏原的分子结构与表位信息仍缺乏系统归纳。我国甲壳类水产品过敏的发生率高，而完全规避进食致敏食物会对生活质量和营养产生负面影响[9]，故而亟需研发甲壳类水产品过敏的防控技术。致敏原特异性免疫疗法（Allergen-specific immunotherapy，AIT）是有效治疗过敏性疾病的新兴策略，往往依托于致敏原特异性免疫制品发挥作用。甲壳类水产品过敏的AIT研究具有挑战性，且目前应用于甲壳类水产品AIT的免疫制品分子尚未进行深入探讨。综上，本文针对甲壳类水产品致敏原，阐述其免疫学特性、分子结构与抗原表位，对比了用于致敏原特异性治疗的免疫制品分子，并在此基础上展望未来可用于甲壳类水产品AIT研究的安全有效的免疫制品，以期为甲壳类水产品过敏性疾病的防控技术研发提供参考。
1. 甲壳类水产品致敏原结构及抗原表位
甲壳类水产品致敏原大多存在于肉中或作为肌肉蛋白质系统的一部分，具有耐热、耐酸碱和耐消化的特性[10]。随着蛋白质检测技术的快速发展，目前已有多种甲壳类水产品致敏原被鉴定（表1），包括原肌球蛋白（tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（arginine kinase，AK）、肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）、肌质钙结合蛋白（sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）、磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase，TIM）和细丝蛋白C（filamins c，FLN c）等[11]。甲壳类水产品过敏反应的发生分为致敏与效应两个阶段，即机体摄入致敏原后产生特异性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E抗体，并与效应细胞表面的FcεRI高亲和力受体交联使机体致敏；当同一致敏原再次进入机体后，会与FcεRI受体上交联的IgE抗体结合，激活效应细胞使其脱颗粒并释放介质，进而引发过敏症状[12]。
表 1 WHO/IUIS命名的甲壳类水产品致敏原Table 1. WHO/IUIS registered crustacean allergens物种 致敏原 蛋白名称 Genbank蛋白
登录号物种 致敏原 蛋白名称 Genbank蛋白
登录号大鳌虾 Panulirus stimpsoni Pan s 1 TM AAC38996 宽沟对虾 Melicertus latisulcatus Mel l 1 TM AGF86397 克氏原螯虾 P. clarkii Pro c 1 TM ACN87223 刀额新对虾 M. ensis Met e 1 TM AAA60330 Pro c 2 AK ACN87223 北极虾 P. borealis Pan b 1 TM CBY17558 Pro c 5 MLC ACN87223 褐对虾 P. aztecus Pen a 1 TM AAZ76743 淡水龙虾 Archaeopotamobius sibiriensis Arc s 8 TIM CAD29196 细爪小龙虾 Pontastacus leptodactylus Pon l 4 SCP P05946 斑节对虾 P. monodon Pen m 1 TM AAX37288 美洲螯龙虾 Homarus americanus Hom a 1 TM AAC48287 Pen m 2 AK AAO15713 Hom a 3 MLC KAG7167762 Pen m 3 MLC ADV17342 Hom a 6 TnC P29291 Pen m 4 SCP ADV17343 褐虾 C. crangon Cra c 1 TM ACR43473 Pen m 6 TnC ADV17344 Cra c 2 AK ACR43474 Pen m 7 Hc AEB77775 Cra c 4 SCP ACR43475 Pen m 8 TIM ADG86240 Cra c 5 MLC ACR43477 Pen m 13 FABP AEP84100 Cra c 6 TnC ACR43478 拟穴青蟹 S. paramamosain Scy p 1 TM ABS12233.1 凡纳滨对虾 L. vannamei Lit v 1 TM ACB38288 Scy p 2 AK AFA45340 Lit v 2 AK ABI98020 Scy p 3 MLC QDH76468.1 Lit v 3 MLC ACC76803 Scy p 4 SCP AFJ80778 Lit v 4 SCP ACM89179 Scy p 8 TIM APP94292 Lit v 13 FABP ADK66280 Scy p 9 FLN c QFI57017 印度对虾 Penaeus indicus Pen i 1 TM - 梭子蟹 Portunus pelagicus Por p 1 TM AGE44125 锈斑蟳 Charybdis feriatus Cha f 1 TM AAF35431 褐蟹 C. bellicosus Cal b 2 AK UVH30529.1 1.1 原肌球蛋白
TM存在于除植物外的所有真核细胞中，在脊椎动物和无脊椎动物中都高度保守，但只在无脊椎动物中被认为是致敏原。它以肌钙蛋白复合物的形式存在，通过与肌动蛋白、肌球蛋白相互作用参与肌肉的收缩功能，对肌细胞和非肌细胞都有重要意义[8]。1981年，TM首次在虾中被鉴定为一种热稳定的具有IgE结合活性的致敏原[13]。目前，食物来源的TM在WHO/IUIS数据库系统（http://www.allergen.org/）登记数已达27个，其中，甲壳类水产品TM有16个（表1）。TM是甲壳类水产品中的主要致敏原，耐热、耐酸碱，等电点约为4.5，致敏率在23%~83%之间[14]。其开放阅读框由281个氨基酸组成，单体分子量为34~38 kDa，易形成同型二聚体，产生更大的蛋白质复合物[11]。此外，TM高度保守的氨基酸序列使其成为甲壳类水产品、贝类水产品、昆虫、蛛形纲动物之间发生交叉反应的泛致敏原[15]。不同甲壳类水产品间TM的序列同源性高达90%以上，甲壳类与贝类水产品间TM的序列同源性为65%、与吸入性致敏原TM的序列同源性达到78%~83%[8]。
TM的空间结构由两条α-螺旋相互缠绕而成（图1A），包含七个交替的肌动蛋白结合位点，增加了蛋白结构稳定性，使其经高温高压处理后仍能保持致敏性，甚至可能通过暴露结构内部的抗原表位而增强致敏性[16]。迄今为止，已有多数研究报导了甲壳类水产品TM的抗原表位：Kamath等[17]利用内溶酶体降解斑节对虾（Penaeus monodon）TM，产生的降解肽段经质谱分析后进行合成，进一步结合T细胞增殖实验确定了2条T细胞表位V199-K213、R244-D258；Wai等[18]通过分离刀额新对虾（Metapenaeus ensis）TM致敏的Balb/c小鼠脾细胞，获得6条能刺激T细胞增殖的T细胞表位E26-N45、D56-D75、A86-R105、N146-V165、Y221-E240、K251-I270；Amedee等[19]采用四聚体技术鉴定了斑节对虾TM的3条T细胞表位Q9-Q28、E97-A116、K161-E180；综上发现3种不同试验鉴定的甲壳类水产品TM的T细胞表位存在差异。
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图 1 甲壳类水产品常见致敏原的三维结构模型注：蓝色表示α-螺旋结构，紫色为β-折叠结构，绿色为无规则卷曲。图A：SWISS-MODEL模拟的甲壳类水产品中原肌球蛋白TM的三级结构，以野猪TM的晶体结构（PDB：1c1g.2.B）作为模板；图B：拟穴青蟹精氨酸激酶AK晶体结构（PDB：5ZHQ），红色短棍为二硫键位点Cys；图C：SWISS-MODEL模拟的甲壳类水产品中肌球蛋白轻链MLC的三级结构，以黑腹果蝇MLC的晶体结构（PDB：5w1a.1.B）作为模板，红色短棍为二硫键位点Cys；图D：拟穴青蟹肌质钙结合蛋白SCP晶体结构（PDB：7WBO），红色短棍为二硫键位点Cys，黄色小球为钙离子；图E：拟穴青蟹磷酸丙糖异构酶TIM晶体结构（PDB：6JOX）；图F：拟穴青蟹FLN c优势致敏区域晶体结构（PDB：7VZO）。Figure 1. Three-dimensional structure model of common allergens in crustaceans此外，TM的IgE表位研究更全面，Ayuso等[20]利用重叠肽技术结合血清学实验鉴定了褐对虾（Penaeus aztecus）TM的5条IgE线性表位V43-L57、V85-R105、R133-L148、E187-N202、Q247-Y284与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）TM的9条IgE线性表位M1-A36、E37-S63、Q61-A81、E82-R105、E115-E150、D142-Y162、Q157-A183、I190-S210、V246-Y284[21]；Xu等[22]通过合成肽技术结合血清学实验确定了凡纳滨对虾TM的3条IgE线性表位Q47-Q61、E97-T108、R244-E257；Furka[23]通过OBOC技术淘选结合血清学实验获得刀额新对虾TM的6条IgE线性表位V43-A57、Q83-T101、R123-A145、E186-E201、K221-L239、N252-G283；Zhang等[24]选择5种生物信息学软件预测结合血清学实验验证了秀丽白虾（Exopalaemon modestus）TM的5条IgE线性表位V43-S59、V85-R105、E131-E164、E187-G201、E243-I280；Myrset等[25]将北极虾（Pandalus borealis）TM分段表达后，结合血清学及细胞实验确定了5条IgE线性表位M1-L78、H70-E131、D121-E181、E173-E236、K226-Y284；Fu等[26]选择5种生物信息学软件预测结合血清学实验鉴定了中国明对虾（Penaeus chinensis）TM的10条IgE线性表位K12-L25、Q47-V60、A87-R105、K112-K128、E131-Q147、A155-R167、E187-N203、Y221-A239、E243-E259、E263-E280；Liu等[27]采用酶解消化结合质谱分析获得拟穴青蟹（Scylla paramamosain）TM的7条耐热耐消化IgE表位M19-N29、T39-K48、L99-A109、T110-S123、F153-Y162、A170-S188、E211-Y221；Li等[28]综合生物信息学技术、噬菌体展示技术、一珠一化合物技术，确定拟穴青蟹TM的10条IgE线性表位A59-L70、A76-R90、E100-T110、L113-R125、M126-E139、R140-Y162、E163-D175、L176-S188、K189-V210、G211-Y231与3个IgE构象表位I4M8A10M11K12L13E14D16M19、L148R152L154A158R160E164A166V165L169M171V172L176、L249E252V253L256L260N262V261K264Y267I270L274，并证明TM线性表位与血清IgE结合时占主导作用；经过比对分析可以确定多种虾与青蟹TM重叠的IgE表位为：A76-R90、R100-T110、M126-E139、R140-Y162、L176-S188、K189-V210，提示这6条保守的线性表位应该是甲壳类水产品TM发生交叉反应的原因之一。
除了上述鉴定的T细胞表位与IgE表位，Liu等[29]以兔抗拟穴青蟹TM多克隆抗体为靶蛋白，通过噬菌体展示技术淘选获得青蟹TM的8条IgG线性表位R44-A55、R90-E100、R105-A116、R133-D142、A143-L154、E196-S206、K222-K233、V253-K264，与青蟹TM的IgE线性表位E100-T110、M126-E139、R140-Y162、K189-V210、G211-Y231部分重叠或完全重叠，表明上述5条表位既是TM的IgG线性表位又是IgE线性表位。
1.2 精氨酸激酶
AK主要参与细胞ATP水平的调节，催化甲壳类动物L-精氨酸残基的磷酸化，是影响细胞能量稳态机制的重要反应[30]。在WHO/IUIS数据库中，被系统命名的食物来源的AK个数共13个，其中，甲壳类水产品AK有6个（表1）。甲壳类水产品中AK含量丰富，通常以单体形式存在，分子量约为40~42 kDa，根据对虾类过敏患者的致敏原组分检测，发现10%~51%的过敏反应是由AK引起的[31]。与TM相比，AK更不稳定、不耐热且易挥发，因此被认为是吸入蒸汽引起呼吸道过敏症状的致敏原之一[32]。同时，AK也已在贝类及其它无脊椎动物（螨虫、蟑螂、蟋蟀、蚕和印度粉蛾等）中鉴定，与TM一样，是无脊椎动物中的泛致敏原。
甲壳类水产品凡纳滨对虾（PDB：4AM1）[33]与拟穴青蟹（PDB：5ZHQ）[34]中AK的晶体结构已被解析，其空间结构包含一个N端的α螺旋结构域和C端的α-β结构域（图1B）。此外，AK的抗原表位也陆续被报道：Amedee等[19]采用四聚体技术鉴定了斑节对虾AK的3条T细胞表位L81-P100、R193-H212、L265-H284，其它物种AK的T细胞表位仍有待探究。
在IgE表位的研究中，Ayuso等[21]利用合成肽技术结合血清学实验获得凡纳滨对虾AK的9条IgE线性表位M1-E18、S25-K42、G64-T96、I121-T141、E142-L159、E160-D192、S232-K255、E319-M342；Fu等[26]选择5种生物信息学软件预测结合血清学实验验证了中国明对虾AK的7条IgE线性表位A19-K33、Q55-A72、T123-P135、L140-S154、C250-G266、K286-E299、G320-L333；Chen等[35]利用DNA Star Protean软件分析了克氏原螯虾（Procambarus clarkii）AK的6条IgE线性表位L39-K43、Y89-D103、K146-V152、D252-R256、T311-E317、I325-R330；Liu等[27]采用酶解消化结合质谱分析获得拟穴青蟹AK的11条耐热耐消化IgE表位Y30-K34、L61-Y68、K91-D97、N101-G117、L159-T166、Q179-L195、I230-Y243、L246-R256、R294-Y304、G310-Y323、K340-L349；Yang等[36]以蟹类过敏患者血清中特异性IgE为靶蛋白，通过噬菌体展示技术获得拟穴青蟹AK的5条IgE线性表位Y30-V53、P100-Q109、C127-A143、V257-H284、Q307-E314与8个IgE构象表位A19A20T21D22C23K24K28D62、G105D106V107N108Q109F110V247F336、L46G47N137C139L140T141Q144N199、S153S154T155S157N158L159L163T166R256、S157G165T166Y167Y168P169V177L181I182、K146P169L170T171G172P205T206G207、T171Q196N199R202Y203W204P205T206、I121K189T311R312T316E319G320V322；Mao等[37]通过重叠肽技术在拟穴青蟹AK序列上发现了3条IgE线性表位C127-T141、T141-T155、Y211-E225；Brassea-Estardante等[38]利用BediPred和Discotope进行褐蟹（Callinectes bellicosus）AK的表位预测分析，得到8条IgE线性表位K40-S45、V58-A74、K91-F104、N112-G117、S130-F136、Y145-K151、Y203-N213和7个IgE构象表位G92K94Q95T96D97K98D263、P100N101D103T334、D106N108、P115D116G117、G172T174K175D176V177Q178Q179K180D183、N293E295、E317E319G320。因此，甲壳类水产品AK的保守IgE线性表位主要为I121-T141、E142-L159、E319-M342，同时相似氨基酸组成的构象表位也能够引发甲壳类物种间的交叉反应。
1.3 肌球蛋白轻链
MLC是肌球蛋白大分子复合物中的一部分，属于钙离子结合蛋白家族，存在EF-hand结构域[11]。2008年，凡纳滨对虾MLC被鉴定为一种耐热的致敏原，经WHO/IUIS过敏原命名小组命名为Lit v 3[39]，此后MLC也相继在其它无脊椎动物中被发现[21,40−41]。目前，WHO/IUIS数据库系统收录的甲壳类水产品MLC共7个（表1），其开放阅读框包含152个氨基酸，分子量为18~20 kDa，致敏率为19%~55%，且有研究发现MLC、TM同时与虾类过敏患者血清中IgE结合的能力约为36%[31,41]。此外，MLC二级结构发生改变后，仍能保持与血清IgE结合的能力[42]，使MLC引起的过敏问题不容忽视。与TM和AK一样，虾MLC与德国小蠊（Blattella germanica）Bla g 8等节肢动物的氨基酸序列具有高同源性[39]。
MLC是由8个α-螺旋组成的紧凑结构，在Cys36和Cys130之间有一个二硫键（图1C）。目前，MLC的抗原表位也有相关的报道。Ayuso等[21]利用合成肽技术结合血清学实验鉴定凡纳滨对虾MLC的6条IgE线性表位R13-R30、N22-G48、V49-A66、T58-D90、P79-S99、N118-D141；Liu等[27]采用酶解消化结合质谱分析获得拟穴青蟹MLC的5条耐热耐消化IgE表位A39-V48、D66-A73、K77-F87、H109-V126、E136-F145；Li等[28]通过3种表位定位方法验证了拟穴青蟹MLC的7条IgE线性表位A7-G24、D35-E50、K51-K61、M62-F87、K96-E106、L107-P125、D135-K147与7个IgE构象表位I19Y20F31C36L40L42N43L46I49、L42P44L46V48E50K51V52K55K61L63P70V75K76、L42P44I49V65D66P70I71A73V75、N41P44T45A47Q74K76K77K79A81S83F87、F87M88K92L93N99L103I110L111L114F139、V90L93Y94L103Y104A105E106I110D137G138F139、M88T97G100T101Y104G138P141P144，同时确定MLC线性表位在与血清IgE结合时占主导作用。陈亨莉[43]利用DNA Star软件预测获得克氏原螯虾MLC的4条IgE线性表位G53-R58、K76-S83、D95-N99、R117-E122与1个IgE构象表位N25K57R58K59E60K96S97E98N99E136；Yang等[44]以兔抗克氏原螯虾MLC多克隆抗体为靶蛋白，通过噬菌体展示技术淘选到MLC的5个IgG构象表位N41N43P44T45L46A47I48I49V75G82、S83Y84E85F87M88L146K147K148、G82S83Y84E85D86F87V90L91L146、A81G82E85F87M88V90L91L146、K96S97E98N99G100T101Y104F139。经比对，虾蟹MLC重叠的IgE线性表位为K51-K61、M62-F87、L107-P125，且青蟹MLC的构象表位与克氏原螯虾MLC的IgG构象表位具有相似的氨基酸组成，这些表位对解析不同甲壳类水产品的交叉反应性具有重要的指导意义。
1.4 肌质钙结合蛋白
与MLC同属于钙离子结合蛋白家族的SCP在肌肉松弛方面发挥作用，仅发现于无脊椎动物中，是与小清蛋白具有相似结构与功能的新型过敏原[45]。SCP最早在黑虎虾（Penaeus monodon）和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）中被鉴定为致敏原，经WHO/IUIS过敏原命名小组分别命名为Pen m 4与Lit v 4[46−47]。目前，WHO/IUIS数据库系统收录的甲壳类水产品SCP共有5个（表1），其分子量在20 kDa左右，开放阅读框包含192个氨基酸，具有良好的耐热性。与其他致敏原类似，不同甲壳类水产品SCP的氨基酸序列高度保守，同源性达80%~98%，而甲壳类和贝类水产品SCP的同源性仅为15%~21%[48]。
拟穴青蟹SCP的晶体结构已解析（PDB：7WBO），是由9个α-螺旋及loop环围绕而成（图1D）。其中，两个相邻的α-螺旋和连接的loop环构成了EF-hand基序“螺旋-环-螺旋”，共包含3个EF手域，且均保留了结合Ca2+或混合Ca2+/Mg2+的能力[48]。随着SCP研究的不断深入，抗原表位也被相继验证报道。Ayuso等[21]利用合成肽技术结合血清学实验鉴定凡纳滨对虾SCP的3条IgE线性表位K10-R36、D49-N72、C130-N147；Liu等[27]采用酶解消化结合质谱分析获得拟穴青蟹SCP的4条耐热耐消化IgE表位L39-Y51、V77-F82、K111-L120、V139-L149；Chen等[49]选择生物信息学软件预测结合血清学实验鉴定拟穴青蟹SCP的3条IgE线性表位Q76-C91、K111-E125、S137-Y146；Yang等[36]采用噬菌体展示技术获得拟穴青蟹SCP的6个IgE构象表位A34L35T38L39I40G42R43Y51、N37T38L39I40E41R43Y51N54T112、G42R43G44E45F46N47S48Y51、N37A50A52N53N54Q55K56I57、Y3W5L89C90C91G92G97S174、E64E67L68G97F98P99P100K103。对比已报导虾蟹SCP的IgE表位，重叠区域主要为S137-Y146，而构象表位的研究还较少。
1.5 磷酸丙糖异构酶
褐虾（Crangon crangon）中的TIM于2011年被鉴定为致敏原，致敏率在15%~23%之间[41]，随后，其他几种食物和非食物来源的TIM也陆续被鉴定为致敏原，包括章鱼、小麦粉和蟑螂、尘螨等[50−51]。在WHO/IUIS数据库系统中，收录的甲壳类水产品TIM共有5个（表1），其是一种分子量为26~29 kDa的酶促蛋白，主要以二聚体的形式存在，不耐热，主要功能是参与葡萄糖的能量代谢[11]。
目前，甲壳类水产品中凡纳滨对虾TIM（PDB：5EYW）与拟穴青蟹TIM（PDB：6JOX）的晶体结构被解析，呈现为（β/α）8组成的筒状结构，每个单体含有12个α-螺旋和8个反向平行的β-折叠，螺旋和折叠间以loop相接，α-螺旋环绕中央β折叠构成筒状（图1E）。Liu等[27]采用酶解消化结合质谱分析获得拟穴青蟹TIM的4条耐热耐消化IgE表位M15-F28、V101-K112、A149-W157、L230-F240；Yang等[36]通过噬菌体展示技术获得拟穴青蟹TIM的4条IgE线性表位Q45-P56、S79-S110、D183-L188、P198-S235与4个IgE构象表位L131E132E135T139P166W168A169I170T172T175T177、L131W168I170G171T172G173T175T177、W168T175A176T177P178E179Q180S183、I24S210S213G233L236K237P238D239，也确定了克氏原螯虾TIM的6条IgG线性表位D18-S27、Y67-A70、I78-V91、V151-S158、I170-T177、Y208-G215[52]。上述虾蟹TIM的表位分析显示D18-S27、S79-V91、V151-W157既是IgE表位又是IgG表位，说明IgG抗体有望阻断IgE与致敏原的结合。此外，与SCP类似，甲壳类水产品TIM的构象表位研究也较为缺乏。
1.6 细丝蛋白c
与TIM存在免疫交叉反应的致敏原FLN c最早在克氏原螯虾中被鉴定，是一种分子量为90 kDa左右的细胞骨架蛋白，耐热性差[52]。在WHO/IUIS过敏原命名系统中仅收录了拟穴青蟹FLN c，命名为Scy p 9。He等[53]对青蟹FLN c进行分段表达分析，发现结构域5-6（氨基酸336-531区）可能是潜在的优势致敏区域。
现阶段尚无完整的甲壳类水产品FLN c的结构，仅有拟穴青蟹FLN c优势致敏区域的晶体被解析（PDB：7VZO），该单体是由16个β-折叠和2个α-螺旋组成的桶状结构（图1F）。He等[54]通过合成肽技术结合血清学实验确定了拟穴青蟹FLN c的6条IgE线性表位G336-L353、T363-T377、E418-L433、P446-W462、D490-Y505、N512-S528，并预测了3个构象表位N338R339Q340T341E342R343E449R450G451E452Q453G454M455P456E476G477P478S479K480A481E482V498V499A500E501P502G503E504R506K522Y524I525T526P527S528、K345Q347E349A350V351P352L353T354E355V356G357S358Q359T379S380P381G382G383V384T385E386A387A388E389V403P404K405E406L407G408V430G431P432L433K434G467A468G469S470A512R513K514、L366P367G368I369S370P371F372D373L374G375V390N391F392V393P394K395E396L397K415Y416Q417E418M419H420；Yang等[36]鉴定了拟穴青蟹FLN c的6条IgE线性表位F259-E271、D411-P437、T495-N503、G608-A621、A748-L758、G816-P832和6个IgE构象表位K228I229V236V252T253K255I295A296、P425E448A449C450E451N453W455I561、C571F572I573Q574S575I576D577S578D579H596、P716T740M741P742K743F744K745D747、A625A748K750V751K759Y782G784Y786、H728R802Y805Q806V807G808Y809L810，还发现拟穴青蟹TIM和FLN c存在共同表位，相似表位基序为PLRG、MQP、P（T/K）VH（I/T）L和L-TT-GA。
1.7 其他致敏原
除了上述致敏原，其它一些致敏原也被鉴定报道，但结构及表位信息研究尚不深入：肌钙蛋白（Troponin C，TnC）是一种次要的甲壳类致敏原，分子量约20 kDa，IgE致敏率从12%到29%不等[31,41]。目前，TnC在WHO/IUIS系统中已命名3个（表1），与MLC、SCP同属于钙离子结合蛋白家族，共包含4个EF-hand基序，其中在甲壳类动物中具有2个功能性Ca2+结合环[55]。血蓝蛋白（Hemocyanin，Hc）已在斑节对虾中被鉴定，命名为Pen m 7，是一种高分子量的多亚基蛋白（77 kDa），主要存在于血淋巴或肝胰腺区域，IgE致敏率为29%~47%[14]。Hc由氧转运蛋白复合物组成，与铜离子相互作用，使其具有典型的蓝绿色[56]。脂肪酸结合蛋白（Fatty acid binding protein，FABP），是分子量为15~20 kDa的转运蛋白，WHO/IUIS系统中鉴定命名的仅有斑节对虾和凡纳滨对虾（表1），其IgE致敏率为10%~23%[14]。糖原磷酸化酶样蛋白（Glycogen phosphorylase-like protein，GP）在动物碳水化合物代谢中起至关重要作用，主要在大脑和肌肉中表达。迄今为止GP只在斑节对虾中被鉴定命名（Pen m 14），但作为致敏原的分子特性及其在人群中的致敏模式有待进一步研究[57]。
2. 甲壳类水产品致敏原特异性免疫制品
致敏原特异性免疫疗法又称为脱敏治疗，是一种可以影响变态反应性疾病自然进程的治疗方法。AIT主要通过依次激活机体多种免疫机制并诱导细胞和分子发生变化，从而诱使机体产生耐受性反应，达到脱敏的效果[58]。现阶段食物过敏AIT的临床研究主要集中在花生、鸡蛋和牛奶等食物，过敏患者通过口服免疫治疗后可达到脱敏效果[59]。但AIT新兴疗法尚未在水产品过敏患者中进行测试，在疗效和安全性方面仍具有挑战性。AIT大多基于致敏原特异性免疫制品进行研究，上述甲壳类水产品致敏原鉴定、表位及结构等特性的综述为制备不同免疫制品分子奠定了基础。迄今为止，甲壳类水产品AIT研究的免疫制品分子设计主要包括4大类（图2）。本文介绍了T细胞表位肽制品、基于IgE表位改造的低致敏性衍生物制品、DNA免疫制品及加工修饰的致敏原制品的应用效果，并对其作用机理及优缺点等信息进行归纳总结（表2）。
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图 2 甲壳类水产品AIT研究的免疫制品设计策略Figure 2. Design strategies of immunological products for crustacean AIT表 2 甲壳类水产品AIT研究设计的免疫制品Table 2. Immunological products for AIT research in crustacean制品类型 致敏原 设计策略 作用机理 优点 缺点 T细胞表位肽制品 Met e 1 T细胞表位混合肽灌胃致敏的BALB/c小鼠[18] 诱导小鼠体内Treg细胞以调节Th1/Th2反应的平衡，产生阻断IgG2a抗体 诱导T细胞从Th2型转变为Th1型和/或Treg主导的调节
潜能，是一种安全理想的
治疗调节剂T细胞激活序列的高度多样性使得在应用中确定免疫显性的T细胞表位存在困难 Pen a 2 T细胞表位肽包封于纳米
颗粒[61]小鼠肠组织中Th2反应减弱，
诱导Treg细胞反应基于IgE表位改造的低致敏性衍生物制品 Met e 1 删除IgE线性表位并突变表位关键氨基酸[63] IgE反应性和致敏性显著降低，
产生阻断IgG2a抗体定向改造致敏原的IgE表位，且由于致敏性低，患者对较高剂量的制品具有耐受性 尚处于构建早期阶段和临床前表征阶段，仍需进一步评价此类制品的免疫
治疗能力Scy p 1、
Scy p 3删除强IgE结合能力的
线性表位[64]降低致敏性，调节小鼠体内Th1/Th2反应趋于平衡，产生阻断IgG2a抗体 DNA免疫制品 Met e 1 低致敏原的基因序列克隆到哺乳动物表达载体
pCI-Neo中[66]下调小鼠体内Th2反应并诱导Treg细胞，且产生阻断IgG2a抗体 降低成本、更好地启动免疫系统，并提供长期免疫记忆 研究较少，具体机制
尚未明确加工修饰的致敏原制品 Scy p 1、
Scy p 2与L-阿拉伯糖发生
美拉德反应[67]在小鼠体内调节Th1/Th2反应的平衡 破坏致敏原空间结构或修饰表位上的关键氨基酸 无法精确控制致敏原抗原表位的修饰 Scy p 1 与辣根过氧化物酶/酪氨酸酶交联[68] 降低致敏性，诱导小鼠体内Th1
和/或Treg细胞的应答Pen a 1 与麦芽糖发生糖基化修饰[69] 下调小鼠Th2细胞因子、上调Treg和Th1细胞因子 Lit v 1 高压结合热处理[70] 降低致敏性，下调小鼠空肠组织中炎症因子的表达 Met e 1 与漆酶/咖啡酸发生交联[71] 在小鼠体内调节Thl/Th2免疫平衡以降低致敏性 Exo m 1 与不同分子质量糖发生糖基化修饰[72] 下调小鼠Th2细胞因子，减弱对小鼠的过敏反应 2.1 T细胞表位肽制品
T细胞表位是致敏原的短肽片段，通过抗原递呈细胞上表达的组织相容性复合物II类分子激活naïve T细胞[2]。这些片段缺乏二级或三级结构，无法交联IgE或激活效应细胞。然而，它们具有将T细胞从Th2型转变为Th1型和/或Treg主导反应的调节潜能，这些特性使其成为一种理想的治疗调节剂[60]。利用甲壳类水产品致敏原衍生的T细胞表位作为免疫制剂来改善小鼠炎症反应及致敏性的研究已有报道：Wai等[18]将T细胞表位混合物作为口服免疫制剂传递给Met e 1致敏的Balb/c小鼠，通过显著降低Th2型细胞因子及特异性IgE抗体水平以调节Th1/Th2反应的平衡，并能诱导调节性T细胞反应和产生阻断IgG2a抗体；Hong等[61]将Pen a 2的T细胞表位肽（氨基酸81~100位）包封于CpG-ODN纳米颗粒，连续6 d递送给BALB/c小鼠后，治疗组小鼠血清的IgE、IgG1水平及脾细胞因子IL-4和IL-13均显著降低，小肠组织中Foxp3和IL-10的表达增加，与Th2分化相关的STAT6和GATA3的表达降低。上述研究表明T细胞表位肽制品可以诱导小鼠体内Treg细胞以调节Th1/Th2反应的平衡，进而缓解小鼠过敏症状。但是目前，难以确定致敏原序列上的主要免疫显性T细胞表位，主要是由于消化道中白细胞抗原等位基因和抗原递呈细胞的多样性、过敏人群中致敏原消化程度的多样性而导致致敏原中T细胞激活序列的高度多样性[62]。因此，利用显性T细胞表位肽作为甲壳类水产品过敏AIT的免疫制品研究存在困难。
2.2 基于IgE表位改造的低致敏性衍生物制品
低致敏性衍生物制品主要是利用基因工程技术对诱发免疫反应的IgE表位进行表位改造，从而有效降低致敏原的IgE结合能力和致敏性。针对甲壳类水产品致敏原已报道的重要表位，经过表位改造而制备的低致敏性衍生物制品在小鼠体内展现出较好地改善过敏症状的潜力：Wai等[63]对Met e 1的IgE线性表位进行删除，并突变表位上的关键氨基酸获得2个低致敏性衍生物，该类衍生物在小鼠体内表现出良好的临床前特征，包括IgE反应性和致敏性显著降低，以及诱导阻断IgG抗体的能力；Li等[64]通过删除Scy p 1和Scy p 3序列上强IgE结合能力的线性表位获得2个低致敏性衍生物，该类衍生物显著降低小鼠的过敏症状，使小鼠体内Th1和Th2细胞趋于平衡状态，并能诱导阻断致敏原与血清IgE结合的特异性IgG抗体。低致敏性衍生物制品具有调节小鼠体内Th1/Th2平衡及产生阻断IgG抗体的能力，同时因其可定向修饰及安全性，是AIT研究的理想选择，但尚处于构建的早期阶段和临床前表征阶段，未来仍需进一步评价此类制品的免疫治疗能力。
2.3 DNA免疫制品
DNA制品的免疫疗法是一个新趋势，只需将目标基因（例如致敏原、低致敏原和/或多肽）克隆到质粒载体中即可完成免疫制品的制备，从而大大降低生产成本[65]。现阶段DNA免疫制品研究较少，Wai等[66]将Met e 1的低致敏原MEM49或MED171（删除IgE线性表位并突变表位上的关键氨基酸）的基因序列克隆到哺乳动物表达载体pCI-Neo中，构建的2种DNA免疫制品均能下调小鼠体内Th2反应并诱导Treg细胞，从而显著改善BALB/c致敏小鼠的过敏症状。与蛋白抗原相比，克隆基因的体内表达是由真核启动子进行驱动，更好地启动免疫系统，并提供长期免疫记忆，进一步揭示了DNA免疫制品潜在的临床价值。
2.4 加工修饰的致敏原制品
加工修饰技术（美拉德反应、酶法交联等）可以破坏致敏原空间结构或修饰表位上的关键氨基酸，期望降低致敏原IgE结合能力及致敏性。迄今为止，有多种经修饰后的甲壳类水产品致敏原制品在小鼠体内的致敏能力被研究：Han等[67]将Scy p 1、Scy p 2与L-阿拉伯糖进行反应，生成的美拉德反应产物结构变化且IgE表位上的关键氨基酸K与R发生修饰，同时，在小鼠体内均能显著降低Th2型细胞因子IL-4和IL-13的释放水平，而Th1型细胞因子IFN-γ的释放水平显著升高；Liu等[68]发现Scy p 1与辣根过氧化物酶/酪氨酸酶交联的产物在小鼠体内致敏性显著降低，可以诱导Th1和/或Treg细胞的免疫应答，从而提高了诱导小鼠口服耐受性的能力；在Pen a 1诱导的小鼠致敏模型中，通过提前口服Pen a 1的糖基化产物可通过下调Th2细胞因子、上调Treg和Th1细胞因子来达到脱敏效果[69]；经高压结合热处理后的凡纳滨对虾TM可降低小鼠血清中的组胺水平，同时下调小鼠空肠组织中炎症因子的表达，从而降低TM的致敏性[70]；Ahmed等[71]探究了刀额新对虾TM与漆酶等的交联产物在小鼠过敏模型中的致敏作用，结果显示小鼠血清中IgG1、IgE和组胺水显著降低，揭示了交联产物通过调节Thl/Th2免疫平衡达到降低TM致敏性的效果。Zhang等[72]利用不同分子质量糖与秀丽白虾TM进行糖基化，与未糖基化的TM相比，糖基化的TM能显著降低小鼠脾脏和肠系膜淋巴结淋巴细胞内Th2型细胞因子（IL-4和IL-13）的分泌，减弱对小鼠的过敏反应。综上，加工修饰的致敏原制品主要通过下调小鼠Th2细胞因子、诱导小鼠体内Th1和/或Treg细胞的应答以减轻小鼠的过敏反应，但由于加工方式无法精确控制致敏原的表位修饰及降低致敏性，因此加工产物用于AIT的研究较少。
3. 结论
迄今为止，已有多种甲壳类水产品致敏原被鉴定。本文系统分析甲壳类水产品致敏原的性质，明确了6种常见致敏原的分子结构，归纳了致敏原的T细胞表位、IgE表位及IgG表位；同时，整合了甲壳类水产品致敏原经表位改造及结构修饰等方式衍生的4种免疫制品分子，阐明了不同免疫制品均能通过诱导小鼠体内的Th1和/或Treg细胞应答以改善过敏症状的作用机理。综上，甲壳类水产品致敏原在分子结构、抗原表位及特异性治疗中所用免疫制品分子的相关研究取得了一定进展，但仍存在一些问题有待进一步开展：a.甲壳类水产品致敏原只有AK、SCP、TIM、FLN c的晶体结构被解析，而其它致敏原晶体结构的未被解析，对全面分析甲壳类水产品致敏原具有重要意义。b.AIT治疗的最终目标为诱导机体产生免疫耐受，而其作用机理尚不明确，还有待进一步分析，以使水产品过敏的AIT治疗研究更具安全性、有效性。此外，基于鲤鱼Cyp c 1改造制备的低致敏性衍生物制品已用于临床鱼类过敏患者的皮下AIT试验（临床II期，NCT编号：NCT02382718），表明低致敏性衍生物制品在4种制品中表现出良好的AIT候选疫苗分子的潜力。
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图 1 甲壳类水产品常见致敏原的三维结构模型
注：蓝色表示α-螺旋结构，紫色为β-折叠结构，绿色为无规则卷曲。图A：SWISS-MODEL模拟的甲壳类水产品中原肌球蛋白TM的三级结构，以野猪TM的晶体结构（PDB：1c1g.2.B）作为模板；图B：拟穴青蟹精氨酸激酶AK晶体结构（PDB：5ZHQ），红色短棍为二硫键位点Cys；图C：SWISS-MODEL模拟的甲壳类水产品中肌球蛋白轻链MLC的三级结构，以黑腹果蝇MLC的晶体结构（PDB：5w1a.1.B）作为模板，红色短棍为二硫键位点Cys；图D：拟穴青蟹肌质钙结合蛋白SCP晶体结构（PDB：7WBO），红色短棍为二硫键位点Cys，黄色小球为钙离子；图E：拟穴青蟹磷酸丙糖异构酶TIM晶体结构（PDB：6JOX）；图F：拟穴青蟹FLN c优势致敏区域晶体结构（PDB：7VZO）。
Figure 1. Three-dimensional structure model of common allergens in crustaceans
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图 2 甲壳类水产品AIT研究的免疫制品设计策略
Figure 2. Design strategies of immunological products for crustacean AIT
表 1 WHO/IUIS命名的甲壳类水产品致敏原
Table 1 WHO/IUIS registered crustacean allergens
物种 致敏原 蛋白名称 Genbank蛋白
登录号物种 致敏原 蛋白名称 Genbank蛋白
登录号大鳌虾 Panulirus stimpsoni Pan s 1 TM AAC38996 宽沟对虾 Melicertus latisulcatus Mel l 1 TM AGF86397 克氏原螯虾 P. clarkii Pro c 1 TM ACN87223 刀额新对虾 M. ensis Met e 1 TM AAA60330 Pro c 2 AK ACN87223 北极虾 P. borealis Pan b 1 TM CBY17558 Pro c 5 MLC ACN87223 褐对虾 P. aztecus Pen a 1 TM AAZ76743 淡水龙虾 Archaeopotamobius sibiriensis Arc s 8 TIM CAD29196 细爪小龙虾 Pontastacus leptodactylus Pon l 4 SCP P05946 斑节对虾 P. monodon Pen m 1 TM AAX37288 美洲螯龙虾 Homarus americanus Hom a 1 TM AAC48287 Pen m 2 AK AAO15713 Hom a 3 MLC KAG7167762 Pen m 3 MLC ADV17342 Hom a 6 TnC P29291 Pen m 4 SCP ADV17343 褐虾 C. crangon Cra c 1 TM ACR43473 Pen m 6 TnC ADV17344 Cra c 2 AK ACR43474 Pen m 7 Hc AEB77775 Cra c 4 SCP ACR43475 Pen m 8 TIM ADG86240 Cra c 5 MLC ACR43477 Pen m 13 FABP AEP84100 Cra c 6 TnC ACR43478 拟穴青蟹 S. paramamosain Scy p 1 TM ABS12233.1 凡纳滨对虾 L. vannamei Lit v 1 TM ACB38288 Scy p 2 AK AFA45340 Lit v 2 AK ABI98020 Scy p 3 MLC QDH76468.1 Lit v 3 MLC ACC76803 Scy p 4 SCP AFJ80778 Lit v 4 SCP ACM89179 Scy p 8 TIM APP94292 Lit v 13 FABP ADK66280 Scy p 9 FLN c QFI57017 印度对虾 Penaeus indicus Pen i 1 TM - 梭子蟹 Portunus pelagicus Por p 1 TM AGE44125 锈斑蟳 Charybdis feriatus Cha f 1 TM AAF35431 褐蟹 C. bellicosus Cal b 2 AK UVH30529.1 
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表 2 甲壳类水产品AIT研究设计的免疫制品
Table 2 Immunological products for AIT research in crustacean
制品类型 致敏原 设计策略 作用机理 优点 缺点 T细胞表位肽制品 Met e 1 T细胞表位混合肽灌胃致敏的BALB/c小鼠[18] 诱导小鼠体内Treg细胞以调节Th1/Th2反应的平衡，产生阻断IgG2a抗体 诱导T细胞从Th2型转变为Th1型和/或Treg主导的调节
潜能，是一种安全理想的
治疗调节剂T细胞激活序列的高度多样性使得在应用中确定免疫显性的T细胞表位存在困难 Pen a 2 T细胞表位肽包封于纳米
颗粒[61]小鼠肠组织中Th2反应减弱，
诱导Treg细胞反应基于IgE表位改造的低致敏性衍生物制品 Met e 1 删除IgE线性表位并突变表位关键氨基酸[63] IgE反应性和致敏性显著降低，
产生阻断IgG2a抗体定向改造致敏原的IgE表位，且由于致敏性低，患者对较高剂量的制品具有耐受性 尚处于构建早期阶段和临床前表征阶段，仍需进一步评价此类制品的免疫
治疗能力Scy p 1、
Scy p 3删除强IgE结合能力的
线性表位[64]降低致敏性，调节小鼠体内Th1/Th2反应趋于平衡，产生阻断IgG2a抗体 DNA免疫制品 Met e 1 低致敏原的基因序列克隆到哺乳动物表达载体
pCI-Neo中[66]下调小鼠体内Th2反应并诱导Treg细胞，且产生阻断IgG2a抗体 降低成本、更好地启动免疫系统，并提供长期免疫记忆 研究较少，具体机制
尚未明确加工修饰的致敏原制品 Scy p 1、
Scy p 2与L-阿拉伯糖发生
美拉德反应[67]在小鼠体内调节Th1/Th2反应的平衡 破坏致敏原空间结构或修饰表位上的关键氨基酸 无法精确控制致敏原抗原表位的修饰 Scy p 1 与辣根过氧化物酶/酪氨酸酶交联[68] 降低致敏性，诱导小鼠体内Th1
和/或Treg细胞的应答Pen a 1 与麦芽糖发生糖基化修饰[69] 下调小鼠Th2细胞因子、上调Treg和Th1细胞因子 Lit v 1 高压结合热处理[70] 降低致敏性，下调小鼠空肠组织中炎症因子的表达 Met e 1 与漆酶/咖啡酸发生交联[71] 在小鼠体内调节Thl/Th2免疫平衡以降低致敏性 Exo m 1 与不同分子质量糖发生糖基化修饰[72] 下调小鼠Th2细胞因子，减弱对小鼠的过敏反应
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期刊类型引用(1)
1. 朱越，李治宽，高翔，杨静丽，何美军，彭诗琴. 黄精精深加工研究现状. 农业与技术. 2025(04): 35-40 . 
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