Optimization of Silkworm Pupae Fermentation by Response Surface Methodology and Products Taste Characteristics Study
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摘要: 为优化建立蚕蛹发酵工艺，探索其发酵产物呈味特性，本文研究了不同菌种、接种量、发酵温度、发酵时间对蚕蛹发酵产氨基酸态氮含量的影响，在单因素实验的基础上，采用响应面法对蚕蛹发酵工艺进行优化，并对比分析发酵前后呈味物质与滋味的变化。结果表明：清酒乳杆菌接种量1.0%、发酵温度32 ℃、发酵时间10 d是最佳发酵工艺，此时氨基酸态氮含量达0.95±0.02 g/100 g，与预测值相近。与未发酵蚕蛹相比，发酵蚕蛹的游离氨基酸、核苷酸和有机酸含量均显著升高（P<0.05），分别为52.19±0.11、1.01±0.03、65.54±1.61 mg/g。呈鲜味的天冬氨酸、谷氨酸、鸟苷酸、腺苷酸和琥珀酸的TAV值均大于1，特别是谷氨酸和琥珀酸，TAV值高达20.06、138.47，是发酵蚕蛹中鲜味的重要贡献者；蚕蛹发酵后的味精当量达74.44 g MSG/100 g，是发酵前的6.74倍。本研究表明，蚕蛹发酵可产鲜味物质，且风味良好，为蚕蛹的开发利用和鲜味物质的制备提供了新的思路。Abstract: To establish an optimized silkworm pupae fermentation process and explore the taste characteristics of the fermented products, the effects of different bacterial species, inoculum amounts, fermentation temperatures, and fermentation times on the amino acid nitrogen content generated by fermented silkworm pupae were investigated. Based on single factor experiments, response surface methodology was employed to optimize the silkworm pupae fermentation process. Differences in taste-contributory substances and taste before and after fermentation were elucidated. The optimal fermentation parameters were found to be 1.0% Lactobacillus sakei inoculum, fermentation temperature of 32 ℃, and fermentation time of 10 days. Under these conditions, the amino acid nitrogen content reached 0.95±0.02 g/100 g, closely aligning with the anticipated value. Compared with those in unfermented silkworm pupae, the free amino acid, nucleotide, and organic acid contents in fermented silkworm pupae were significantly increased (P<0.05), reaching 52.19±0.11, 1.01±0.03, and 65.54±1.61 mg/g, respectively. The taste activity value (TAV) of aspartic, glutamic, guanylic, adenylic, and succinic acids, which contribute to umami taste, were all above 1. Notably, glutamic and succinic acids, which were considered to be the best contributors to umami taste in fermented silkworm pupae, exhibited TAV as high as 20.06 and 138.47, respectively. The monosodium glutamate (MSG) equivalent after silkworm pupae fermentation reached 74.44 g MSG/100 g, a 6.74-fold increase compared to the pre-fermentation level. This study demonstrates that silkworm pupae fermentation can produce umami substances that yield a desired flavor, providing new insights for the development and utilization of silkworm pupae and for the production of umami substances.
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Keywords:
- silkworm pupae /
- fermentation /
- process optimization /
- taste compounds /
- umami
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鲜味是食品中重要的滋味特征之一，是由多种呈鲜物质和增鲜物质共同作用产生，主要包括鲜味肽、游离氨基酸及其钠盐、呈味核苷酸及其钠盐、有机酸等[1]。鲜味物质广泛存在于各种天然食品中，包括肉类[2]、海鲜[3]、菌菇[4]等，可从中提取有良好呈味的鲜味物质。此外，有些食材经过发酵后可提高鲜味，如酱油[5]、腐乳[6]、鱼露[7]、发酵肉制品[8]等。微生物发酵是一种有效的产鲜方法，常见的菌种有酵母菌、乳酸菌、葡萄球菌等[9]。朱文慧等[10]采用耐盐酵母对鳕鱼骨酶解液进行发酵，发现发酵后酶解液中鲜味氨基酸的含量明显增加，风味品质得到显著改善。徐玮东等[11]发现清酒乳杆菌有助于风干肠中蛋白质降解，显著提高游离氨基酸含量。黄乐丹等[12]利用副干酪乳杆菌发酵鱿鱼，发现其可以促进蛋白质降解生成呈味氨基酸和小分子肽，提高了发酵鱿鱼的鲜味。高继庆等[13]利用木糖葡萄球菌发酵海鲈鱼，发现小分子肽和氨基酸含量明显上升。
蚕蛹被认为是优质动物蛋白的来源，蚕蛹蛋白的必需氨基酸与非必需氨基酸之比高于WHO/FAO推荐的氨基酸组合模式[14]。蚕蛹蛋白中呈味氨基酸含量较高，以鲜味氨基酸和甜味氨基酸为主，谷氨酸和天冬氨酸占比最高，分别为13.35%、10.03%，赋予蚕蛹浓郁的鲜味[15]。鲁珍[15]研究发现蚕蛹蛋白酶解制备的酶解液具有良好的鲜味，陈政等[16]利用酶解和美拉德反应得到蚕蛹呈味基料，具有增香提鲜作用。由此可知，蚕蛹酶解可制备鲜味物质，利用微生物发酵有可能增加其鲜味，但目前开展蚕蛹发酵的研究少有文献报道。
本文筛选适宜发酵蚕蛹的菌种，设计单因素实验并进行响应面优化，得到最优发酵参数。对发酵蚕蛹中的游离氨基酸、核苷酸和有机酸等组分含量进行测定，采用滋味活性值（taste activity value，TAV）和味精当量（equivalent umami concentration，EUC）方法客观准确地评价发酵蚕蛹中呈味物质的滋味贡献程度，以期为开发蚕蛹发酵产品提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
蚕蛹 黄沙海鲜市场，−20 ℃冷冻贮存；戊糖片球菌（Lactobacillus plantarum）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） 北京北纳创联生物技术研究院；碱性蛋白酶37071（20.30×104 U/g）、风味蛋白酶（2.00×104 U/g） 诺维信（中国）生物技术有限公司；磷酸二氢钾 色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇、乙腈 色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；17种氨基酸混合标品 美国Sigma公司；鸟苷酸（guanosine monophosphate，GMP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosincacid, inosine monphosphate，IMP）、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）、草酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸 标准品，上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯 天津富宇精细化工有限公司。
SW-CJ-2FD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；台式恒温振荡器 太仓市华美生化仪器厂；IMJ-78A高压灭菌锅 施都凯仪器设备（上海）有限公司；SQP分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；MGC-450HP-2人工气候箱 上海一恒科学仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；Milli-Q Intgral 5超纯水系统 Merk Millipore/德国；L-8900全自动氨基酸分析仪 HITACHI/日本； LC1200高效液相色谱 美国Agilent公司； SB25-12DTD超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；CR22GIII离心机 天美（中国）科学仪器有限公司广州分公司；SA402B型电子舌 日本Insent公司。
1.2 实验方法
1.2.1 蚕蛹发酵工艺流程
冷冻蚕蛹→解冻→打浆→调节蛋白浓度→调pH→添加蛋白酶→酶解→灭菌→接种→发酵。
参考吴婕[17]的方法进行酶解。蚕蛹解冻后打浆，用蒸馏水将底物蛋白浓度稀释至10%（m/v），将pH调为8.0，按蛋白含量的5%添加碱性蛋白酶37071和风味蛋白酶（质量比为0.85:1），50 ℃酶解8 h后于105 ℃高压灭菌锅中灭酶灭菌20 min，冷却至室温，在超净工作台中将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释至1×107 CFU/mL，接种到蚕蛹酶解液中，充分混合，置于培养箱中发酵。酶解结束时pH为6.7，在发酵菌种的适宜生长pH范围内，菌种生长情况良好，考虑工业生产的操作性和方便性，采用酶解后自然pH进行发酵。
1.2.2 发酵菌种的培养和筛选
戊糖片球菌、清酒乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌在MRS液体培养基中以37 ℃培养18 h，18 h后进行第二次传代，传代结束后用无菌生理盐水稀释成1×107 CFU/mL的菌悬液，用于接种。固定菌种接种量1.0%（V/V），发酵温度30 ℃，发酵时间15 d，考察戊糖片球菌、清酒乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌对发酵蚕蛹的氨基酸态氮含量的影响。
1.2.3 发酵条件优化
1.2.3.1 单因素实验
固定清酒乳杆菌接种量1.0%、发酵温度30 ℃和发酵时间15 d，以氨基酸态氮含量为评价指标，选择清酒乳杆菌接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、发酵温度（25、30、35、40 ℃）、发酵时间（0、5、10、15 d）3个因素进行单因素实验，考察各因素对产氨基酸态氮能力的影响。
1.2.3.2 响应面试验
在单因素实验的基础上，以清酒乳杆菌接种量、发酵时间和发酵温度3个因素为自变量，以氨基酸态氮含量为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理进行三因素三水平试验设计，并进行数据拟合优化发酵工艺，试验因素水平见表1。
表 1 响应面试验因素与水平Table 1. Response surface test factors and levels因素 水平 −1 0 1 清酒乳杆菌接种量（%） 0.5 1 1.5 发酵温度（℃） 25 30 35 发酵时间（d） 5 10 15 1.2.4 发酵液氨基酸态氮含量的测定
参考GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》。
1.2.5 发酵液游离氨基酸的测定
参考Guo等[18]的方法，稍作改进。样品加入0.01 mol/L盐酸浸泡30 min，过滤，取3 mL滤液于10 mL离心管中，加入3 mL 8 g/100 g磺基水杨酸溶液振荡均匀，放置1 h，将离心管于10000 r/min离心10 min。取上清液过0.22 μm滤膜，用氨基酸自动分析仪检测。
1.2.6 发酵液核苷酸的测定
样品处理方法参考黄煜燃等[19]的方法略作修改。准确称取5 g样品，加入已预冷的15 mL高氯酸（5%，V/V），均质2 min，随后在4 ℃、8000 r/min离心15 min，取出上清，沉淀再用15 mL相同浓度的高氯酸重复以上步骤，合并2次上清液。用5 mol/L氢氧化钾溶液调节pH至6.5±0.01，在4 ℃下静置30 min，取上清液加纯水定容至50 mL。摇匀，过0.22 μm膜后测定。色谱柱采用ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；其余条件参考刘登勇等[20]的方法。
1.2.7 发酵液有机酸的测定
参考GB 5009.157-2016《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》。高效液相色谱仪条件略作修改，采用ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸溶液，流动相A和B的比例为5:95，等梯度洗脱，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温40 ℃，检测波长210 nm。
1.2.8 TAV和EUC值的计算
TAV是样品中滋味活性物质含量与其呈味阈值的比值，可判定某单一化合物对整体滋味的贡献[21]。当TAV大于1时，认为该化合物对样品滋味有贡献，且数值越大，贡献越大[22]。计算公式如下：
TAV=CT 式中：C为滋味物质的浓度（mg/g）；T为滋味物质的滋味阈值（mg/g）。
EUC值是指食品体系中鲜味氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）和鲜味核苷酸（AMP、GMP和IMP）所呈现的鲜味强度相当于等价的谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）的浓度[23]。计算公式如下：
EUC(gMSG/100g)=∑aibi+1218(∑aibi)×(∑ajbj) 式中：EUC按每100 g样品含谷氨酸钠质量计（gMSG/100g）；ai为鲜味氨基酸（Glu、Asp）的浓度（g/100 g）；bi为鲜味氨基酸相对于MSG的相对鲜度系数（Glu为1，Asp为0.077）；aj为呈味核苷酸（AMP、GMP、IMP）的浓度（g/100 g）；bj为呈味核苷酸相对于IMP的相对鲜度系数（AMP为0.18、GMP为2.3、IMP为1）；1218为协同作用常数。
1.2.9 电子舌分析
样品处理：称取发酵前后的样品各50 g，按照1:2稀释，8000 r/min离心10 min，过滤，取70 mL滤液上机检测。测试时间30 s，输出鲜味值；后参比液清洗3 s，传感器插入新的参比液中测试回味30 s，食品五味传感器C00（苦）、AE1（涩）、CA0（酸）、CT0（咸）、AAE（鲜）重复测试4次。
1.3 数据处理
每个实验重复三次，实验结果以“平均值±标准偏差”的形式表示，统计分析使用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statistics 27软件进行，采用Design-Expert 13软件进行Box-Behnken试验设计和数据分析，使用Origin 2022软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 发酵菌种的筛选
氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素，可反映蛋白质的水解程度，是发酵产品发酵程度的特性指标，与发酵产物的鲜味密切相关[24]。采用四种菌种对蚕蛹酶解液进行发酵，对氨基酸态氮含量的影响如图1所示。四种菌种发酵后均可显著提高蚕蛹酶解液的氨基酸态氮含量（P<0.05），其中清酒乳杆菌发酵蚕蛹中的氨基酸态氮含量最高，为0.85±0.01 g/100 g，其次为戊糖片球菌，肠膜明串珠菌发酵蚕蛹的氨基酸态氮含量最低。乳酸菌发酵提高蚕蛹中氨基酸态氮含量主要产生多种蛋白酶，使蚕蛹中的大分子蛋白质在发酵中不断水解成小分子蛋白、多肽及氨基酸等物质[25]。根据四种菌种对氨基酸态氮含量的影响，选择清酒乳杆菌作为发酵蚕蛹的最优菌种。
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2.2 发酵工艺的单因素实验
2.2.1 清酒乳杆菌接种量对发酵液的影响
清酒乳杆菌接种量对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响如图2所示。随着接种量的增加，氨基酸态氮含量呈先上升后下降趋势，当接种量为1.0%时，发酵蚕蛹中的氨基酸态氮含量达到最高值，为0.80±0.02 g/100 g，随接种量继续增大，氨基酸态氮含量降低，这可能是因为接种量较大时，一方面，碳源和氮源有限，限制了菌株生长繁殖；另一方面，发酵速度过快，酸积累过高，加速了菌种死亡[26]。因此，清酒乳杆菌最佳接种量为1.0%。
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图 2 清酒乳杆菌接种量对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响Figure 2. Effect of inoculation amount on amino nitrogen content in fermented silkworm pupae2.2.2 发酵温度对发酵液的影响
不同菌株生长的最适温度差异较大。温度过高会导致部分生物大分子变性失活，过低的温度会使酶活力钝化，降低分解蛋白的速率[27]。由图3可知，氨基酸态氮含量随发酵温度升高呈先升高后降低又有所回升的趋势，可能是因为在40 ℃时的酶活更高，与郭丽萍等[24]的实验结果相似。当发酵温度在30 ℃时，氨基酸态氮含量达到最大值，说明该温度是清酒乳杆菌在蚕蛹酶解液中生长的最适宜温度，有助于菌株生长繁殖和蛋白酶分泌，将蚕蛹中的大分子蛋白分解生成小分子游离态的氨基酸态氮。因此，选择30 ℃为清酒乳杆菌发酵蚕蛹的最佳温度。
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图 3 发酵温度对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响Figure 3. Effect of fermentation temperature on amino nitrogen content in fermented silkworm pupae2.2.3 发酵时间对发酵液的影响
适度的发酵可以让菌种充分分解和利用蛋白质、碳水化合物和脂肪等物质，产生丰富的风味化合物[28]，同时，发酵积累的有机酸等代谢产物会影响产品的风味，氨基酸也会被分解，因此，控制蛋白质水解程度，选择合适的发酵时间十分重要。发酵时间对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响由图4可知。当发酵时间在0~15 d时，氨基酸态氮含量随发酵时间增加呈先上升后下降的趋势，在10 d时氨基酸态氮含量最高，为0.94±0.01 g/100 g，15 d时氨基酸态氮含量有所下降，可能是过度发酵导致氨基酸被分解。因此，选择10 d为最佳发酵时间。
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图 4 发酵时间对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响Figure 4. Effect of fermentation time on amino nitrogen content in fermented silkworm pupae2.3 响应面试验
2.3.1 响应面试验设计与结果
以清酒乳杆菌接种量、发酵温度、发酵时间为因素，氨基酸态氮含量为响应值进行发酵工艺优化试验。响应面Box-Behnken实验设计及结果见表2。
表 2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2. Box-Behnken test design and results试验号 A接种量 B发酵温度 C发酵时间 氨基酸态氮含量
（g/100 g）1 −1 0 −1 0.69 2 0 0 0 0.95 3 1 1 0 0.89 4 1 −1 0 0.91 5 −1 −1 0 0.87 6 0 0 0 0.93 7 0 1 −1 0.74 8 0 −1 −1 0.72 9 1 0 1 0.74 10 0 0 0 0.93 11 0 −1 1 0.76 12 −1 0 1 0.75 13 1 0 −1 0.72 14 0 0 0 0.94 15 0 0 0 0.95 16 0 1 1 0.78 17 −1 1 0 0.91 利用Design-Expert 13统计软件对表2的试验数据进行多元回归拟合，得到氨基酸态氮含量（Y）对清酒乳杆菌接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）3个因素的二次多项回归模型：Y=0.9387+0.0043A+0.0065B+0.0185C−0.0158AB−0.0084AC+0.0009BC−0.0339A2−0.0084B2−0.181C2。
2.3.2 模型方差分析及响应面分析
对模型进行方差分析，结果见表3。从表3方差分析结果可以看出，模型极显著（P<0.0001），失拟项不显著（P=0.9143>0.05），说明回归模型对响应值拟合良好；回归方程的决定系数R2=0.9984，相关性较好。校正决定系数R2Adj=0.9964，变异系数C.V.%=0.70%，表明模型可信度高，预测值与试验值较为接近。说明优化后的回归模型能够较好地反映实际操作（接种量、发酵温度、发酵时间）与氨基酸态氮含量的实际关系，可用于蚕蛹最佳发酵工艺参数的确定。比较F值大小可知，影响蚕蛹发酵后的氨基酸态氮含量的因素顺序依次为C（发酵时间）>B（发酵温度）>A（接种量）。由P值可知，C、AB、A2和C2对氨基酸态氮含量的影响极显著（P<0.01）；B、AC和B2对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响显著（P<0.05）。
表 3 回归方程方差分析Table 3. Analysis of variances for developed regression equation方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 0.1521 9 0.0169 495.46 <0.0001** A接种量 0.0001 1 0.0001 4.38 0.0748 B发酵温度 0.0003 1 0.0003 10.05 0.0157* C发酵时间 0.0027 1 0.0027 80.57 <0.0001** AB 0.001 1 0.001 29.16 0.001** AC 0.0003 1 0.0003 8.27 0.0238* BC 3.31E-06 1 3.31E-06 0.0971 0.7644 A² 0.0048 1 0.0048 141.51 <0.0001** B² 0.0003 1 0.0003 8.78 0.021* C² 0.1379 1 0.1379 4042.14 <0.0001** 残差 0.0002 7 0 失拟项 0 3 8.79E-06 0.1656 0.9143 纯误差 0.0002 4 0.0001 总离差 0.1523 16 注：*表示差异显著P<0.05，**表示差异极显著P<0.01。 2.3.3 因素间交互作用分析
各因素间交互作用对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量影响的响应曲面和等高线如图5所示。等高线的形状呈椭圆形表明研究因素之间的交互作用影响显著[27]，AB和AC的等高线呈椭圆形，说明AB和AC的交互作用显著，这与方差分析结果一致。
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图 5 不同因素交互作用对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响Figure 5. Effect of different factor interactions on the amino nitrogen content of fermented silkworm pupae2.3.4 模型验证
利用Design-Expert 13预测蚕蛹发酵最佳工艺条件为清酒乳杆菌接种量0.978%、发酵温度32.157 ℃、发酵时间10.266 d，预测氨基酸态氮含量为0.978 g/100 g。为方便实际操作，将优化发酵工艺条件的参数调整为接种量1.0%、发酵温度32 ℃、发酵时间10 d。以此条件下发酵蚕蛹进行验证，得到实际氨基酸态氮含量为0.95±0.02 g/100 g，与预测值的相对误差为2.86%，说明该模型准确度良好。
2.4 发酵前后游离氨基酸的变化
游离氨基酸是发酵食品中重要的呈味物质和风味化合物的前体，是食品中鲜味的重要来源，可与其他呈味物质协同，增强食品风味，是评价发酵产品风味的重要指标[29]。游离氨基酸本身具有风味特征，可分为四大类呈味氨基酸，分别为鲜味氨基酸（Asp、Glu）、甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala）、苦味氨基酸（Val、Ile、Leu、Met、Phe、Arg、His）和无味氨基酸（Cys、Pro、Lys）[30]。蚕蛹发酵前后游离氨基酸含量见表4。由表4可看出，蚕蛹发酵前后均检出17种游离氨基酸。经过发酵，游离氨基酸总量和各呈味氨基酸含量显著增加（P<0.05），氨基酸总量达52.19±0.11 mg/g，鲜味氨基酸为11.61±0.01 mg/g，占总量的22.25%。Lys是发酵蚕蛹中含量最高的氨基酸（6.06±0.36 mg/g），但本身不具有滋味，因此对发酵蚕蛹滋味的影响可忽略[31]，其次是Glu和Asp。发酵前后的蚕蛹中Thr、Ser、Arg和Pro的TAV值小于1，其他氨基酸的TAV值大于1。Glu的TAV值最高，发酵后达20.06，且Asp的TAV值也较高，说明发酵蚕蛹具有较强的鲜味；发酵后Gly和Ala的TAV值分别为1.87、7.95，对发酵蚕蛹的甜味有显著影响。
表 4 蚕蛹发酵前后游离氨基酸含量的变化Table 4. Changes in free amino acid content before and after silkworm pupa fermentation氨基酸 阈值（mg/g）[32] 未发酵 发酵后 含量（mg/g） TAV 含量（mg/g） TAV 天冬氨酸（Asp） 1 3.43±0.18b 3.43 5.60±0.06a 5.60 谷氨酸（Glu） 0.3 3.81±0.22b 12.70 6.02±0.06a 20.06 苏氨酸（Thr） 2.6 0.19±0.01a 0.07 0.14±0.00b 0.05 甘氨酸（Gly） 1.3 1.33±0.29b 1.02 2.43±0.01a 1.87 丝氨酸（Ser） 1.5 0.10±0.01b 0.06 0.15±0.01a 0.10 丙氨酸（Ala） 0.6 3.18±0.35b 5.29 4.77±0.07a 7.95 缬氨酸（Val） 0.4 3.30±0.08b 8.24 4.76±0.35a 11.90 异亮氨酸（Ile） 0.9 2.52±0.11b 2.80 3.57±0.26a 3.96 组氨酸（His） 0.2 2.28±0.10b 11.42 3.29±0.18a 16.46 苯丙氨酸（Phe） 0.9 2.11±0.38b 2.34 3.60±0.05a 4.00 亮氨酸（Leu） 1.9 3.95±0.13b 2.08 5.59±0.52a 2.94 精氨酸（Arg） 0.5 0.00±0.00b 0.00 0.02±0.00a 0.04 蛋氨酸（Met） 0.3 1.28±0.18b 4.26 1.86±0.24a 6.21 酪氨酸（Tyr） − 1.45±0.09b − 1.95±0.11a − 半胱氨酸（Cys） − 0.51±0.03b − 0.75±0.10 a − 赖氨酸（Lys） 0.5 3.82±0.15b 7.63 6.06±0.36 a 12.13 脯氨酸（Pro） 3 1.23±0.05b 0.41 1.64±0.01a 0.55 鲜味氨基酸 7.24±0.39b 11.61±0.01a 甜味氨基酸 4.89±0.70b 7.51±0.04 a 苦味氨基酸 16.87±0.64b 24.58±0.27a 氨基酸总量 34.47±0.56b 52.19±0.11a 注：同行不同字母表示差异显著（P<0.05），“−”表示物质阈值未见文献报道，表5同。 2.5 发酵前后核苷酸的变化
研究表明，对食品滋味有贡献的核苷酸衍生物有很多种，其中GMP和IMP的鲜味贡献最为典型[33]。IMP是核苷酸降解中的关键中间产物，本身具有强烈的鲜味，浓度非常低时，鲜味也会被激发出来，还可与天冬氨酸和谷氨酸协同，使鲜味增强，同时也能与甜味氨基酸协同，增强甜味[34]。蚕蛹发酵前后核苷酸的变化如表5所示。发酵后四种核苷酸含量均显著增加（P<0.05），呈鲜味的三种核苷酸（AMP、GMP和IMP）总量为0.88±0.01 mg/g，占核苷酸总量的87.13%，IMP是含量最高的核苷酸（0.41±0.01 mg/g），TAV值也是最高的，其次是AMP（0.26±0.02 mg/g），但TAV值仅为0.52，可与鲜味、甜味氨基酸产生协同效应，增强鲜味强度[35]。发酵后GMP的TAV值大于1，表明发酵能有效促进三磷酸腺苷的降解，有助于提升鲜味。核苷酸最终分解的产物是Hx，具有苦味，在发酵蚕蛹中的含量仅为0.15±0.01 mg/g，对发酵蚕蛹的滋味有一定影响。
表 5 蚕蛹发酵前后核苷酸含量的变化Table 5. Changes in nucleotide content before and after silkworm pupae fermentation核苷酸 阈值（mg/g）[36] 未发酵 发酵后 含量（mg/g） TAV 含量（mg/g） TAV AMP 0.5 0.15±0.00b 0.31 0.26±0.02a 0.52 GMP 0.125 0.05±0.00b 0.36 0.20±0.01a 1.60 IMP 0.25 0.08±0.01b 0.33 0.41±0.01a 1.65 Hx − 0.08±0.00b − 0.15±0.01a − 总量 0.37±0.00b 1.01±0.03a 2.6 发酵前后有机酸的变化
发酵后产生的有机酸的种类和含量取决于菌种、培养成分和生长条件[37]。蚕蛹发酵前后有机酸的变化如表6所示，共鉴定出6种有机酸。有机酸总量显著升高（P<0.05），由发酵前的39.15±6.68 mg/g升高至发酵后的65.54±1.61 mg/g，其中柠檬酸含量高达32.20±0.81 mg/g，占有机酸总量的49.13%，其次是琥珀酸和草酸，琥珀酸是具有鲜味的有机酸，对发酵蚕蛹的鲜味有增强作用。酒石酸、柠檬酸和琥珀酸的TAV值一直处于较高水平，是发酵蚕蛹中的主要滋味活性物质，它们之间相互协调，赋予发酵蚕蛹更丰富的口感。
表 6 蚕蛹发酵前后有机酸含量的变化Table 6. Changes in organic acid content before and after silkworm pupae fermentation有机酸名称 阈值（mg/g）[36] 未发酵 发酵后 含量（mg/g） TAV 含量（mg/g） TAV 草酸 0.504 13.64±2.93a 27.06 10.06±0.70ab 19.97 酒石酸 0.015 1.38±0.09a 91.95 1.10±0.04b 73.22 苹果酸 0.496 2.59±0.61ab 5.21 3.02±0.73a 6.08 乳酸 1.26 1.28±0.12b 2.01 4.42±0.32a 3.51 柠檬酸 0.45 7.81±0.11b 17.36 32.20±0.81a 71.55 琥珀酸 0.106 12.47±2.72ab 117.65 14.68±2.81a 138.47 有机酸总量 39.15±6.68b 65.54±1.61a 2.7 EUC值
EUC常被应用于食品鲜味强度的研究中。蚕蛹发酵前后的EUC值如图6所示。发酵前的EUC值仅为11.05 g MSG/100 g，发酵后的EUC值高达74.44 g MSG/100 g，是发酵前的6.74倍，说明发酵蚕蛹的鲜味强度得到极大提高，这归因于发酵后Asp、Glu、GMP和IMP含量的增加。这与呈味物质的TAV值分析的结论一致。
2.8 电子舌
蚕蛹发酵前后的八个味觉属性的强度如图7所示。蚕蛹发酵前后的鲜味响应值明显高于其他滋味，说明鲜味突出，具有开发鲜味剂等调味产品的潜质。发酵后蚕蛹的苦味、涩味、苦味回味、涩味回味响应值有所降低，其中苦味回味和涩味回味响应值在无味点0以下，酸味响应值在无味点-13以下，说明对滋味无影响。综上所述，发酵后的苦味和涩味有所减弱，蚕蛹滋味更纯厚，说明发酵可以改善蚕蛹滋味。
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图 7 蚕蛹发酵前后的电子舌雷达图Figure 7. Electronic tongue radar images of silkworm pupae before and after fermentation3. 结论
本研究以氨基酸态氮含量为考察指标，筛选出清酒乳杆菌为最佳发酵菌种，经单因素和响应面筛选出发酵蚕蛹的最佳工艺为清酒乳杆菌接种量1.0%、发酵温度32 ℃、发酵时间10 d，此时氨基酸态氮含量为0.95±0.02 g/100 g，与预测值仅相差2.86%，说明该模型有较高的可信度。清酒乳杆菌发酵蚕蛹后，天冬氨酸、谷氨酸、GMP、IMP和琥珀酸等呈鲜味物质含量显著增加（P<0.05），TAV值均大于1，特别是谷氨酸和琥珀酸，高达20.06和138.47，是发酵蚕蛹中鲜味的重要贡献者；发酵蚕蛹的EUC值高达74.44 g MSG/100 g，是发酵前的6.74倍，说明蚕蛹发酵后鲜味强度得到极大提高，电子舌测试结果表明蚕蛹发酵后的苦味和涩味得到较好改善，滋味更好。综上所述，经最佳工艺发酵后，蚕蛹的滋味更丰富，鲜味更突出。本研究为蚕蛹的开发提供了一种思路方法和理论依据，但蚕蛹发酵产品的营养风味、功能活性、应用方法仍有待进一步深入研究。
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图 2 清酒乳杆菌接种量对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响
Figure 2. Effect of inoculation amount on amino nitrogen content in fermented silkworm pupae
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图 3 发酵温度对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响
Figure 3. Effect of fermentation temperature on amino nitrogen content in fermented silkworm pupae
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图 4 发酵时间对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响
Figure 4. Effect of fermentation time on amino nitrogen content in fermented silkworm pupae
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图 5 不同因素交互作用对发酵蚕蛹中氨基酸态氮含量的影响
Figure 5. Effect of different factor interactions on the amino nitrogen content of fermented silkworm pupae
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图 7 蚕蛹发酵前后的电子舌雷达图
Figure 7. Electronic tongue radar images of silkworm pupae before and after fermentation
表 1 响应面试验因素与水平
Table 1 Response surface test factors and levels
因素 水平 −1 0 1 清酒乳杆菌接种量（%） 0.5 1 1.5 发酵温度（℃） 25 30 35 发酵时间（d） 5 10 15 
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表 2 Box-Behnken实验设计及结果
Table 2 Box-Behnken test design and results
试验号 A接种量 B发酵温度 C发酵时间 氨基酸态氮含量
（g/100 g）1 −1 0 −1 0.69 2 0 0 0 0.95 3 1 1 0 0.89 4 1 −1 0 0.91 5 −1 −1 0 0.87 6 0 0 0 0.93 7 0 1 −1 0.74 8 0 −1 −1 0.72 9 1 0 1 0.74 10 0 0 0 0.93 11 0 −1 1 0.76 12 −1 0 1 0.75 13 1 0 −1 0.72 14 0 0 0 0.94 15 0 0 0 0.95 16 0 1 1 0.78 17 −1 1 0 0.91
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表 3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variances for developed regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 0.1521 9 0.0169 495.46 <0.0001** A接种量 0.0001 1 0.0001 4.38 0.0748 B发酵温度 0.0003 1 0.0003 10.05 0.0157* C发酵时间 0.0027 1 0.0027 80.57 <0.0001** AB 0.001 1 0.001 29.16 0.001** AC 0.0003 1 0.0003 8.27 0.0238* BC 3.31E-06 1 3.31E-06 0.0971 0.7644 A² 0.0048 1 0.0048 141.51 <0.0001** B² 0.0003 1 0.0003 8.78 0.021* C² 0.1379 1 0.1379 4042.14 <0.0001** 残差 0.0002 7 0 失拟项 0 3 8.79E-06 0.1656 0.9143 纯误差 0.0002 4 0.0001 总离差 0.1523 16 注：*表示差异显著P<0.05，**表示差异极显著P<0.01。
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表 4 蚕蛹发酵前后游离氨基酸含量的变化
Table 4 Changes in free amino acid content before and after silkworm pupa fermentation
氨基酸 阈值（mg/g）[32] 未发酵 发酵后 含量（mg/g） TAV 含量（mg/g） TAV 天冬氨酸（Asp） 1 3.43±0.18b 3.43 5.60±0.06a 5.60 谷氨酸（Glu） 0.3 3.81±0.22b 12.70 6.02±0.06a 20.06 苏氨酸（Thr） 2.6 0.19±0.01a 0.07 0.14±0.00b 0.05 甘氨酸（Gly） 1.3 1.33±0.29b 1.02 2.43±0.01a 1.87 丝氨酸（Ser） 1.5 0.10±0.01b 0.06 0.15±0.01a 0.10 丙氨酸（Ala） 0.6 3.18±0.35b 5.29 4.77±0.07a 7.95 缬氨酸（Val） 0.4 3.30±0.08b 8.24 4.76±0.35a 11.90 异亮氨酸（Ile） 0.9 2.52±0.11b 2.80 3.57±0.26a 3.96 组氨酸（His） 0.2 2.28±0.10b 11.42 3.29±0.18a 16.46 苯丙氨酸（Phe） 0.9 2.11±0.38b 2.34 3.60±0.05a 4.00 亮氨酸（Leu） 1.9 3.95±0.13b 2.08 5.59±0.52a 2.94 精氨酸（Arg） 0.5 0.00±0.00b 0.00 0.02±0.00a 0.04 蛋氨酸（Met） 0.3 1.28±0.18b 4.26 1.86±0.24a 6.21 酪氨酸（Tyr） − 1.45±0.09b − 1.95±0.11a − 半胱氨酸（Cys） − 0.51±0.03b − 0.75±0.10 a − 赖氨酸（Lys） 0.5 3.82±0.15b 7.63 6.06±0.36 a 12.13 脯氨酸（Pro） 3 1.23±0.05b 0.41 1.64±0.01a 0.55 鲜味氨基酸 7.24±0.39b 11.61±0.01a 甜味氨基酸 4.89±0.70b 7.51±0.04 a 苦味氨基酸 16.87±0.64b 24.58±0.27a 氨基酸总量 34.47±0.56b 52.19±0.11a 注：同行不同字母表示差异显著（P<0.05），“−”表示物质阈值未见文献报道，表5同。
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表 5 蚕蛹发酵前后核苷酸含量的变化
Table 5 Changes in nucleotide content before and after silkworm pupae fermentation
核苷酸 阈值（mg/g）[36] 未发酵 发酵后 含量（mg/g） TAV 含量（mg/g） TAV AMP 0.5 0.15±0.00b 0.31 0.26±0.02a 0.52 GMP 0.125 0.05±0.00b 0.36 0.20±0.01a 1.60 IMP 0.25 0.08±0.01b 0.33 0.41±0.01a 1.65 Hx − 0.08±0.00b − 0.15±0.01a − 总量 0.37±0.00b 1.01±0.03a
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表 6 蚕蛹发酵前后有机酸含量的变化
Table 6 Changes in organic acid content before and after silkworm pupae fermentation
有机酸名称 阈值（mg/g）[36] 未发酵 发酵后 含量（mg/g） TAV 含量（mg/g） TAV 草酸 0.504 13.64±2.93a 27.06 10.06±0.70ab 19.97 酒石酸 0.015 1.38±0.09a 91.95 1.10±0.04b 73.22 苹果酸 0.496 2.59±0.61ab 5.21 3.02±0.73a 6.08 乳酸 1.26 1.28±0.12b 2.01 4.42±0.32a 3.51 柠檬酸 0.45 7.81±0.11b 17.36 32.20±0.81a 71.55 琥珀酸 0.106 12.47±2.72ab 117.65 14.68±2.81a 138.47 有机酸总量 39.15±6.68b 65.54±1.61a
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