Optimization of Intracellular Polysaccharide Extraction Process and Analysis of Antioxidant Activity in Co-cultures of Sanghuangporus vaninii and Pleurotus sapidus
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摘要: 本研究旨在探究超声波协同半仿生法提取杨树桑黄与紫孢侧耳液体共培养胞内多糖（CC-IPS）的工艺。通过单因素实验、Plackett-Burman设计和响应面设计试验，探究第1、2、3次的提取料液比、提取时间、提取温度和提取液pH这12个因素对CC-IPS提取量的影响，以DPPH和ABTS+自由基清除率评价CC-IPS的体外抗氧化能力。结果表明：最佳提取工艺参数为第1、2、3次提取料液比分别为1:17、1:40、1:30（g/mL），第1、2、3次提取时间分别为31、30、30 min，第1、2、3次提取温度分别为44、40、50 ℃，第1、2、3次提取液pH分别为3、8、10。在此最优工艺条件下，CC-IPS提取量为86.4921±1.1924 mg/g，与预测值85.3981 mg/g接近。CC-IPS对DPPH和ABTS+自由基清除率的IC50分别为0.2425和0.1376 mg/mL。该研究为真菌液体共培养胞内多糖的综合高效利用开发提供理论基础。Abstract: In this study, an ultrasonic synergistic semi-bionic method was explored to extract intracellular polysaccharides from Sanghuangporus vaninii and Pleurotus sapidus liquid co-cultures. By conducting single-factor experiments, Plackett-Burman design, and response surface design, the impact of 12 factors on co-culture intracellular polysaccharide (CC-IPS) extraction content, including extraction material-liquid ratios, extraction time, extraction temperature, and extraction solution pH were investigated. The antioxidant capacity of CC-IPS in vitro was evaluated by the DPPH and ABTS+ radical scavenging rates. Results showed that, the optimal extraction process parameters for the first, second, and third extractions, respectively, included material-to-liquid ratios of 1:17, 1:40, and 1:30 (g/mL), extraction times of 31, 30, and 30 min, extraction temperatures of 44, 40, and 50 ℃, and extraction solution pH levels of 3, 8, and 10. Under these optimal conditions, the CC-IPS extraction content was 86.4921±1.1924 mg/g, closed to the predicted value of 85.3981 mg/g. Additionally, the IC50 values of CC-IPS in the DPPH and ABTS+ free radical scavenging assays were determined to be 0.2425 and 0.1376 mg/mL, respectively. This study offers a theoretical foundation for the efficient utilization of intracellular polysaccharides in liquid fungal co-cultures.
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桑黄（Sanghuangporus spp.）隶属于桑黄孔菌属（Sanghuangporus）的一类多年生大型珍稀药用真菌[1]，被国际公认为抗癌效果最好的药用大型真菌之一[2]。桑黄多糖是桑黄发挥药理作用最重要的有效成分之一[3]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、保肝等药用功效[4]。紫孢侧耳（Pleurotus sapidus）隶属于侧耳属（Pleurotus）的一类食用菌，又称美味侧耳、美味北风菌、美味平菇[5]。侧耳多糖是一种重要的生物活性物质，具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、抑菌、降血糖等生理作用[6]。微生物共培养是一种将两种或两种以上菌株在同一个容器中进行培养的方法[7]。相对于单菌株纯培养，两种真菌共培养可能会相互影响各自的细胞结构以及代谢产物的特性。单菌株纯培养胞内多糖的提取方法，可能不太适用于共培养胞内多糖的提取。因此，为更加高效提取杨树桑黄与紫孢侧耳共培养的胞内多糖，需要对其的提取方法进行优化。
目前，真菌多糖提取方法包括热水浸提法、酸碱提取法、超声波提取法、微波提取法、酶解法、三相分离提取法、低共熔溶剂提取法等[6,8−9]。然而，传统的提取方法存在一些缺点，如提取率低、提取时间长、能耗大等[10−11]。采用有效的提取方法不仅能提高目标产物的产量，而且能保持生物活性。半仿生提取法（semi-bionic extraction，SBE）以水作为提取溶剂，通过模拟人体消化道转运中的外部条件，使目标提取物在接近机体环境的条件下获得提取[12−13]。半仿生提取法不仅符合中药使用指南，还能提高药效，且不破坏中药结构[14]。结合超声波的空化作用增大分子的运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高分子从基体中溶出的速度[15−16]。近年来，超声波协同半仿生法在大型真菌活性成分的提取已有少量报道。例如，郝慧敏等[10]采用超声波协同半仿生提取的黑木耳多糖提取率达到了22.52%；马婧嘉等[17]采用超声波协同半仿生提取的灵芝三萜提取率达到了2.99%。然而，在真菌液体共培养胞内多糖的提取研究却鲜有报道。
基于此，本研究以杨树桑黄与紫孢侧耳液体共培养的菌丝体为研究对象。通过单因素实验、Plackett-Burman设计法和响应面法研究和优化共培养胞内多糖的提取工艺。在最优提取工艺条件下，提取共培养胞内多糖，并以VC为阳性对照，DPPH和ABTS+自由基清除率为指标，探究其体外抗氧化活性。为杨树桑黄与紫孢侧耳共培养多糖的高效提取提供了理论依据，也为后期大型真菌共培养活性成分的提取提供了一种可行的方法。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
杨树桑黄菌株（ST）、紫孢侧耳菌株（BLZ） 均来自延边大学农学院食（药）用真菌研究所；磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水乙醇、氢氧化钠、苯酚 天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸、硫酸 辽宁泉瑞试剂有限公司；抗坏血酸（VC） 国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖标准品（HPLC≥98%）、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 上海源叶生物科技有限公司；2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 福州飞净生物科技有限公司；过硫酸钾 上海易恩化学技术有限公司；所用试剂均为分析纯。
F-020S超声波清洗机 深圳福洋科技集团有限公司；U-1800紫外-可见光分光光度计 日本高新技术公司；PHS-3E pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；GP-2-500电热恒温干燥箱 湖北黄石市医疗器械厂；C11202高速离心机 无锡耐思生物科技有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市科欣仪器有限公司；HZQ-F160恒温振荡培养箱 常州诺基仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 共培养胞内多糖（CC-IPS）制备
培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）；种子培养基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉5 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH自然；共培养培养基：葡萄糖30 g/L、酵母浸粉6 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L，pH9。
将保存于试管中的杨树桑黄（ST）和紫孢侧耳（BLZ）菌株接种至新配制的PDA平板中，28 ℃培养。待菌丝长至平板的90%左右，分别取ST和BLZ直径为9 mm的菌块各5个和1个，接入100 mL/250 mL种子培养基中，置于恒温振荡培养箱中分别培养7 d和5 d，设置转速150 r/min，温度28 ℃。培养结束，将培养基和菌球进行匀浆，制成种子液，按照20%（v/v）接种量接入80 mL/250 mL种子培养基中，ST和BLZ分别培养2 d和0 d，得到种子预培养液。ST和BLZ分别按接种量6.9%和3.1%取种子预培养液，接入95 mL/250 mL共培养基中，培养5 d。培养好的发酵液经4层纱布过滤后，用蒸馏水将菌丝体冲洗干净，置于电热恒温干燥箱中60 ℃烘干至恒重，冷却，粉碎研磨过60目标准筛，即得CC-IPS待测样品。
1.2.2 CC-IPS提取
采用超声波协同半仿生法提取，提取溶剂为蒸馏水。用1 mol/L的NaOH和HCl调节pH。称取一定量的待测样品，分别在不同的料液比、提取时间、提取温度和提取液pH条件下进行三次提取。6000 r/min离心10 min，合并三次上清液，置于电热恒温干燥箱中浓缩至原体积的五分之一。加入4倍体积无水乙醇，4 ℃醇沉过夜，之后6000 r/min离心10 min，弃上清，留沉淀，将其置于60 ℃电热恒温干燥箱中去除残留的乙醇，用蒸馏水复溶定容，即得CC-IPS待测溶液。
1.2.3 单因素实验
本实验共考察12个因素对CC-IPS提取量的影响，固定超声功率120 W和超声频率40 kHz。基础提取条件包括：第1次、第2次和第3次提取料液比均为1:30（g/mL），第1次、第2次和第3次提取时间均为30 min，第1次、第2次和第3次提取温度均为50 ℃，第1次提取液pH为3，第2次提取液pH为8，第3次提取液pH为9。在考察某个因素时，基础提取条件中的其他11个因素的取值固定。
单因素实验各因素水平如下：第1次、第2次和第3次提取料液比均为：1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g/mL）；第1次、第2次和第3次提取时间均为：10、20、30、40、50 min；第1次、第2次和第3次提取温度均为：30、40、50、60、70 ℃；第1次提取液pH：1、2、3、4、5、6；第2次提取液pH：6、7、8、9、10、11；第3次提取液pH：7、8、9、10、11、12。
1.2.4 CC-IPS提取量测定
采用苯酚-硫酸法[18]测定，并稍微修改。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的0.1 mg/mL葡萄糖标准品溶液于试管中，加蒸馏水补至1.0 mL，混匀。向试管中依次加入5%苯酚1 mL、浓硫酸5 mL，混匀，沸水浴15 min，取出流水迅速冷却，室温放置10 min后，以蒸馏水为空白，于490 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，葡萄糖标准品线性回归方程为：Y=10.185X−0.0453（R2=0.9927）。CC-IPS提取量根据下列公式计算：
CC-IPS提取量(mg/g)=m1×V1m×V×N 式中：m1—从标准曲线计算得到的葡萄糖含量，mg；V1—定容体积，mL；N—稀释倍数；m—样品质量，g；V—测量时所取样品溶液体积，mL。
1.2.5 Plackett-Burman（PB）试验设计
利用PB试验设计，对上述12个单因素中影响CC-IPS提取量的关键因素进行筛选，分别对应于表1中的X1~X12。每个独立变量分别设置高水平（+）和低水平（−）两个级别，以CC-IPS提取量为响应值。
表 1 PB试验设计的因素及水平Table 1. Factors and levels of the PB design experiment变量 水平 因素 名称 单位 −1 +1 X1 第1次提取料液比 g/mL 1:15 1:20 X2 第2次提取料液比 g/mL 1:31 1:40 X3 第3次提取料液比 g/mL 1:23 1:30 X4 第1次提取时间 min 23 30 X5 第2次提取时间 min 23 30 X6 第3次提取时间 min 23 30 X7 第1次提取温度 ℃ 31 40 X8 第2次提取温度 ℃ 31 40 X9 第3次提取温度 ℃ 38 50 X10 第1次提取液pH − 2.3 3 X11 第2次提取液pH − 6.2 8 X12 第3次提取液pH − 7.7 9 1.2.6 Box-Behnken试验设计
结合单因素实验和PB试验结果，以第1次提取料液比、第1次提取时间、第2次提取温度和第1次提取液pH为自变量，以CC-IPS提取量为响应值，进行4因素3水平的Box-Behnken试验。各因素水平见表2。
表 2 Box-Behnken试验因素水平设计Table 2. Box-Behnken test factor level design水平 A B C D 第1次提取料液比
（g/mL）第1次提取时间
（min）第2次提取温度
（℃）第1次提取液
pH−1 1:10 20 30 2 0 1:20 30 40 3 1 1:30 40 50 4 1.2.7 CC-IPS抗氧化能力测定
1.2.7.1 DPPH自由基清除能力测定
参考李冬香等[19]的方法并进行稍微修改。准确称取样品，加蒸馏水分别配制不同浓度的样品溶液。准确称取DPPH，加无水乙醇配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液。以VC作为阳性对照，各实验组的体系如表3所示，30 ℃避光放置30 min，于517 nm处测定吸光度。按以下公式计算DPPH自由基清除率：
表 3 DPPH自由基清除能力测定试验组Table 3. DPPH free radical scavenging capacity assay test group实验组 样品溶液（mL） DPPH溶液（mL） 蒸馏水（mL） VC溶液（mL） A样品 2 2 − − A对照 2 − 2 − A空白 − 2 2 − AVC − 2 − 2 DPPH自由基清除率(%)=(1−A样品−A对照A空白)×100 1.2.7.2 ABTS+自由基清除能力测定
参考谢佳函等[20]的方法并进行稍微修改。取等量7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的K2O8S2溶液，混合均匀，室温避光静置12 h，得到ABTS母液。用蒸馏水稀释ABTS母液直至其在734 nm处吸光度为0.7±0.02，记为A0，得到ABTS工作液。分别取1 mL不同浓度的样品溶液与4 mL ABTS工作液混合均匀，30 ℃避光放置6 min，在734 nm处测定吸光度，记为A样品，以VC作为阳性对照。按以下公式计算ABTS+自由基清除率：
ABTS+自由基清除率(%)=A0−A样品A0×100 1.3 数据处理
使用Excel进行数据整理；使用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析；使用Design Expert 13软件进行Plackett-Burman试验和响应面试验。*P<0.05和**P<0.01分别表示差异显著和差异极显著。所有实验均为3次重复。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 料液比对CC-IPS提取的影响
不同提取料液比对CC-IPS提取量的影响如图1所示。由图1可知，CC-IPS提取量呈先上升后下降的趋势，当第1次、第2次和第3次提取料液比分别为1:20、1:40和1:30 （g/mL）时，CC-IPS提取量分别达到最高，分别为78.5436、78.4120和76.0286 mg/g。分析出现这种情况的原因，料液比减小会增大细胞内外溶剂浓度差，导致多糖扩散系数增大，从而促进多糖更快、更多的溶解。同时，溶剂越多，超声波的作用范围越大，也有助于提高多糖的溶出量[21−22]。随后，随着料液比的继续减小，第1次和第3次提取料液比的CC-IPS提取量下降明显，而第2次料液比的CC-IPS提取量下降不显著。然而，继续减小料液比可能会导致其它杂质的溶出，降低超声的工作效率，阻碍多糖的溶解，导致多糖溶出的效率降低[23]。从节约溶剂及后期浓缩考虑，第1次、第2次和第3次提取料液比分别选择为1:20、1:40和1:30（g/mL）。
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图 1 不同提取料液比对CC-IPS提取量的影响注：图中不同小写字母表示相同次数不同料液比之间存在显著性差异，P<0.05。Figure 1. Effect of different extraction material-liquid ratios on CC-IPS extraction content2.1.2 提取时间对CC-IPS提取的影响
不同提取时间对CC-IPS提取量的影响如图2所示。由图2可知，CC-IPS提取量呈先上升后下降的趋势，当提取时间为30 min时，第1次、第2次和第3次提取时间的CC-IPS提取量均达到最大值，分别为76.4056、74.2830和75.0427 mg/g。分析的主要原因是超声波产生的热效应和空化效应可以促进细胞内的多糖溶出，加快提取破碎细胞中初期的多糖，有利于多糖的提取[24]。当提取时间超过30 min后，其3次提取时间的CC-IPS提取量均呈现下降趋势。而继续增加提取时间，破坏了多糖的结构并使其降解，导致提取量降低[25]。因此，第1次、第2次和第3次的提取时间均为30 min比较合适。
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图 2 不同提取时间对CC-IPS提取量的影响注：图中不同小写字母表示相同次数不同提取时间之间存在显著性差异，P<0.05。Figure 2. Effect of different extraction time on CC-IPS extraction content2.1.3 提取温度对CC-IPS提取的影响
不同提取温度对CC-IPS提取量的影响如图3所示。由图3可知，CC-IPS提取量呈先上升后下降的趋势，当提取温度为40 ℃时，第1次和第2次提取温度的CC-IPS提取量均达到最高，分别为76.6604 mg/g和77.6687 mg/g；当提取温度为50 ℃时，第3次提取温度的CC-IPS提取量最高为75.1498 mg/g。这是由于超声的空化效应和热效应所致。随着温度升高，蒸气压升高，空化气泡能力增大，导致细胞破裂几率增大；同时，热效应增加溶剂向介质中扩散的速度，导致细胞结构膨胀和松散，加快多糖的溶出速度和溶出量[26]。随后，随着温度提高，第1次和第2次提取温度的CC-IPS提取量呈现下降趋势，而第3次提取温度的CC-IPS提取量趋于平稳状态。而继续升高温度会影响多糖的结构，导致其提取量下降[27]。因此，第1次、第2次和第3次提取温度分别为40、40和50 ℃比较合适。
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图 3 不同提取温度对CC-IPS提取量的影响注：图中不同小写字母表示相同次数不同提取温度之间存在显著性差异，P<0.05。Figure 3. Effect of different extraction temperature on CC-IPS extraction content2.1.4 第1次提取液pH对CC-IPS提取的影响
第1次提取液pH对CC-IPS提取量的影响如图4所示。由图4可知，CC-IPS提取量呈先上升后下降的趋势，当pH为3时，CC-IPS提取量最高为75.3479 mg/g。在酸性条件下，菌丝体的细胞壁容易破裂从而使多糖溶出，但强酸对多糖的糖苷键有一定的破坏力[8]，致使还原糖含量升高和多糖含量下降，从而影响CC-IPS的提取量[28]。因此，第1次提取液pH为3比较合适。
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2.1.5 第2次提取液pH对CC-IPS提取的影响
第2次提取液pH对CC-IPS提取量的影响如图5所示。由图5可知，CC-IPS提取量呈先上升后下降的趋势，当pH为8时，CC-IPS提取量最高为75.7617 mg/g。在碱性条件下，菌丝体的细胞壁容易破碎，降解粗纤维结构和细胞壁蛋白质与葡聚糖之间的可水解连接，从而释放细胞内多糖[29]。继续提高提取液的pH，CC-IPS提取量呈现下降趋势。而碱性过高容易破坏多糖结构，降低分子量，导致CC-IPS提取量降低[30]。因此，第2次提取液pH为8比较合适。
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图 5 第2次不同提取液pH对CC-IPS提取量的影响Figure 5. Effect of different pH of the second extraction solution on CC-IPS extraction content2.1.6 第3次提取液pH对CC-IPS提取的影响
第3次提取液pH对CC-IPS提取量的影响如图6所示。由图6可知，CC-IPS提取量呈先缓慢上升后下降的趋势，当pH为10时，CC-IPS提取量最高为78.9929 mg/g。因此，第3次提取液pH为10比较合适。
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图 6 第3次不同提取液 pH对CC-IPS提取量的影响Figure 6. Effect of different pH of the third extraction solution on CC-IPS extraction content2.2 PB试验设计
PB设计法能从有限的实验条件下同时探索多个变量，筛选出影响响应值的关键变量[31]。本研究通过PB试验设计，系统考察各个因素对CC-IPS提取量的影响，并筛选出对CC-IPS提取量产生显著影响的因素，试验设计及结果如表4所示。
表 4 PB试验设计及结果Table 4. PB experimental design and results试验号 因素 响应值 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 CC-IPS提取量（mg/g） 1 20 40 23 23 30 30 40 40 38 3 6.2 9 58.6577 2 20 40 30 30 23 30 31 40 38 2.3 6.2 7.7 78.8693 3 20 40 30 23 30 23 40 31 38 2.3 6.2 9 67.4226 4 20 40 23 30 30 23 31 40 50 3 8 7.7 53.7509 5 15 31 23 23 23 23 31 31 38 2.3 6.2 7.7 65.7358 6 15 31 30 30 30 30 31 40 38 3 6.2 7.7 47.6637 7 20 31 30 23 30 23 31 31 38 3 8 7.7 53.0472 8 15 31 23 30 30 23 40 40 38 2.3 8 9 58.2837 9 15 40 23 23 23 23 40 40 38 3 8 7.7 57.0018 10 15 40 30 30 30 23 40 31 50 2.3 6.2 7.7 73.5729 11 20 31 23 30 30 30 40 31 50 2.3 8 7.7 71.0720 12 15 40 30 23 23 30 40 40 50 2.3 8 7.7 59.3241 13 20 31 30 30 23 23 40 40 50 3 6.2 9 59.8968 14 15 31 23 23 30 30 31 40 50 2.3 6.2 9 54.3283 15 15 31 30 30 23 30 40 31 38 3 8 9 59.2144 16 20 40 23 30 23 30 31 31 38 2.3 8 9 80.9240 17 15 40 23 30 23 23 31 31 50 3 6.2 9 59.5136 18 15 40 30 23 30 30 31 31 50 3 8 9 46.8476 19 20 31 30 23 23 23 31 40 50 2.3 8 9 51.9744 20 20 31 23 23 23 30 40 31 50 3 6.2 7.7 63.0427 对实验数据进行方差分析，结果如表5所示。模型的R2和R2Adj值较高，表明模型拟合度较好，得到的结果具有较高的可信度。其中，X1、X4、X8和X10对响应值具有极显著的影响（P<0.01），X2、X5和X11对响应值具有显著的影响。因此，后续实验重点考察X1、X4、X8和X10这4个因素对响应值的影响，以确定最优的提取条件。
表 5 PB试验结果的一阶多项式模型分析Table 5. First order polynomial model analysis of PB test results来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 1622.18 12 135.18 11.88 0.0016** X1 第1次提取料液比 163.43 1 163.43 14.36 0.0068** X2 第2次提取料液比 133.26 1 133.26 11.71 0.0111* X3 第3次提取料液比 29.96 1 29.96 2.63 0.1487 X4 第1次提取时间 213.72 1 213.72 18.78 0.0034** X5 第2次提取时间 129.29 1 129.29 11.36 0.0119* X6 第3次提取时间 19.49 1 19.49 1.71 0.2319 X7 第1次提取温度 60.67 1 60.67 5.33 0.0543 X8 第2次提取温度 183.87 1 183.87 16.16 0.0051** X9 第3次提取温度 56.1 1 56.1 4.93 0.0618 X10 第1次提取液pH 529.12 1 529.12 46.5 0.0002** X11 第2次提取液pH 69.43 1 69.43 6.1 0.0428* X12 第3次提取液pH 33.84 1 33.84 2.97 0.1283 残差 79.66 7 11.38 总计 1701.84 19 注：R2=0.9582，R2Adj=0.873；*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著。 2.3 响应面试验优化
2.3.1 Box-Benhnke试验设计与结果
本研究采用Box-Benhnken试验设计，以A（第1次提取料液比）、B（第1次提取时间）、C（第2次提取温度）和D（第1次提取液pH）为变量参数，以CC-IPS提取量为响应值，设计4因素3水平试验，对提取条件进行优化，结果如表6所示。
表 6 Box-Benhnke试验设计与结果Table 6. Box-Benhnke experimental design and results试验号 A：第1次
提取料液比
（g/mL）B：第1次
提取时间
（min）C：第2次
提取温度
（℃）D：第1次
提取液pHCC-IPS
提取量
（mg/g）1 1:20 30 40 3 83.1735 2 1:20 40 40 2 54.2268 3 1:10 30 40 2 64.1173 4 1:20 30 50 4 66.8322 5 1:10 30 30 3 57.1189 6 1:20 20 40 2 63.2396 7 1:20 40 30 3 56.1063 8 1:10 30 40 4 66.9285 9 1:30 20 40 3 61.5948 10 1:20 20 50 3 65.2551 11 1:10 20 40 3 69.0925 12 1:20 30 50 2 69.9963 13 1:20 30 40 3 83.2191 14 1:10 30 50 3 82.3515 15 1:20 40 40 4 69.1268 16 1:20 30 40 3 84.7465 17 1:10 40 40 3 65.5170 18 1:20 30 40 3 83.4609 19 1:20 30 40 3 84.3513 20 1:20 20 30 3 62.1797 21 1:20 30 30 2 55.6821 22 1:30 30 40 2 60.2667 23 1:30 30 50 3 68.2446 24 1:20 40 50 3 73.0228 25 1:30 30 30 3 64.7820 26 1:20 20 40 4 55.0887 27 1:30 40 40 3 65.6804 28 1:20 30 30 4 58.2523 29 1:30 30 40 4 64.6304 将CC-IPS提取量输入Design Expert 13软件进行分析与拟合，计算获得CC-IPS提取量（Y）的回归方程如下：
Y=−272.82+4.22A+3.17B+7.92C+63.69D+0.02AB−0.05AC+0.04AD+0.03BC+0.58BD−0.14CD−0.07A2−0.11B2−0.09C2−12.49D2
响应面模型的方差分析结果如表7所示。失拟项的P值为0.083，大于0.05，表明模型的拟合度较好。模型的R2与R2Adj分别为0.9904和0.9808，说明理论值与实际测量值之间存在良好的拟合。A、B、C和D的F值分别为18.87、2.48、243.53和8.45，表明这些因素对CC-IPS提取量影响的顺序为：C>A>D>B。因素A和C以及交互项AC、BC和BD对CC-IPS提取量的影响在统计上呈极显著（P<0.01），因素D以及交互项AB和CD对CC-IPS提取量的影响在统计上呈显著（P<0.05）。而因素B以及交互项AD对CC-IPS提取量的影响不显著（P>0.05）。
表 7 拟合二次多项式模型的方差分析Table 7. ANOVA for the fitted quadratic polynomial model来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 2534.13 14 181.01 103.24 <0.0001** A 33.09 1 33.09 18.87 0.0007** B 4.36 1 4.36 2.48 0.1373 C 426.99 1 426.99 243.53 <0.0001** D 14.81 1 14.81 8.45 0.0115* AB 14.67 1 14.67 8.37 0.0118* AC 118.48 1 118.48 67.58 <0.0001** AD 0.6 1 0.6 0.34 0.5671 BC 47.89 1 47.89 27.32 0.0001** BD 132.84 1 132.84 75.76 <0.0001** CD 8.22 1 8.22 4.69 0.0481* A2 340.33 1 340.33 194.1 <0.0001** B2 787.39 1 787.39 449.08 <0.0001** C2 474.85 1 474.85 270.83 <0.0001** D2 1011.17 1 1011.17 576.71 <0.0001** 残差 24.55 14 1.75 失拟 22.5 10 2.25 4.4 0.083 纯误差 2.04 4 0.51 总计 2558.68 28 注：R2=0.9904，R2Adj=0.9808；*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著。 2.3.2 响应面分析
响应面是响应值对应各试验因素所构成的三维空间的曲面图，能够更加形象的描述回归方程，曲面的坡度大小能够直观反应各因素对响应值的影响程度[20]。三维响应面曲面图越陡峭说明交互作用越显著[32]。由图7可知，各因素两两交互的响应面开口均向下，表明CC-IPS提取量随着A（第1次提取料液比）、B（第1次提取时间）、C（第2次提取温度）和D（第1次提取液pH）的增加而呈现先上升后下降的趋势。从响应面看，B和D交互作用的响应曲面最陡峭（图7e），表明B和D的交互作用对CC-IPS提取量的影响最为明显；而A和D的交互作用响应面最平缓（图7c），表明A和D的交互作用对CC-IPS提取量的影响相对较小。结果与方差分析结果一致。
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图 7 两因素交互作用对CC-IPS提取量影响的响应面图Figure 7. Response surface plot for the effect of the interaction between two factors on the extraction content of CC-IPS2.3.3 响应面优化与验证
利用Design Expert 13软件对CC-IPS提取工艺进行优化，结果表明CC-IPS提取的最佳工艺为：第1次提取料液比为1:17.29 g/mL，第1次提取时间为30.83 min，第2次提取温度为44.49 ℃，第1次提取液pH为3.03，此时CC-IPS提取量预测值为85.3981 mg/g。考虑到实际操作情况，调整为：第1次提取料液比为1:17（g/mL），第1次提取时间为31 min，第2次提取温度为44 ℃，第1次提取液pH为3。按此条件结合单因素实验结果进行实验，测得CC-IPS提取量为86.4921±1.1924 mg/g，与预测值的偏差仅为1.28%，表明模型对CC-IPS提取工艺具有实际的可行性。
2.4 抗氧化活性分析
2.4.1 DPPH自由基清除能力
DPPH自由基具有非常稳定和强烈颜色的特性，其被广泛用于测定饮料、纯物质、食品和草药等提取物的抗氧化能力，是评估化合物和草药提取物抗氧化能力的最方便和最常见的自由基去除方法[33]。由图8可看出，随着CC-IPS质量浓度的增大，其对DPPH自由基的清除率随着增大。当CC-IPS质量浓度为0.02 mg/mL时，其DPPH自由基的清除率为5.93%；当CC-IPS质量浓度增加至0.4 mg/mL时，自由基清除率迅速增加到了65.34%，而后清除率维持在67%左右。VC浓度为0.01 mg/mL时，DPPH自由基清除率已经到78.74%，随着质量浓度的增加，其清除率增加缓慢。为了评价抗氧化剂的抗氧化性能和清除自由基的能力，通常选择清除率为50%时抗氧化剂的质量浓度（IC50）作为评价指标，IC50越小，抗氧化剂清除自由基的能力越强[34−35]。根据拟合得到的线性方程计算CC-IPS的IC50为0.2425 mg/mL，VC的IC50为0.0059 mg/mL。由此说明，CC-IPS对DPPH自由基具有较好的清除作用。
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图 8 CC-IPS和VC样品对DPPH自由基的清除能力Figure 8. Scavenging capacity of CC-IPS and VC samples for DPPH free radicals2.4.2 ABTS+自由基清除能力
ABTS+自由基是一种以氮为中心的合成自由基阳离子，通过ABTS与过硫酸钾氧化产生[36]。ABTS+自由基脱色测定法是评估食品、植物提取物和生物液体抗氧化能力，以及单个化合物抗氧化活性最常用的方法之一[37]。由图9可看出，随着CC-IPS质量浓度的增大，其对ABTS+自由基的清除率随着增大。当CC-IPS质量浓度为0.02 mg/mL时，其ABTS+自由基的清除率为25.19%；当CC-IPS质量浓度增加至0.6 mg/mL时，自由基清除率迅速增加到了97.62%，而后清除率维持在98%左右。VC浓度0.02 mg/mL时，ABTS+自由基清除率已经达到92.29%，随着质量浓度的增加，其清除率逐渐增加到了100%。根据拟合的线性方程计算CC-IPS的IC50为0.1376 mg/mL，VC的IC50为0.0082 mg/mL。由此说明，CC-IPS对ABTS+自由基具有很好的清除作用。
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图 9 CC-IPS和VC样品对ABTS+自由基的清除能力Figure 9. Scavenging capacity of CC-IPS and VC samples for ABTS+ free radicals3. 结论
本研究采用超声波协同半仿生法，以CC-IPS提取量为筛选指标，通过单因素实验、Plackett-Burman设计法和响应面法优化，得到最佳提取工艺为：第1、2、3次提取料液比分别为1:17、1:40、1:30（g/mL）；第1、2、3次提取时间分别为31、30、30 min；第1、2、3次提取温度分别为44、40、50 ℃；第1、2、3次提取液pH分别为3、8、10。在此条件下CC-IPS提取量为86.4921±1.1924 mg/g，与预测值相近。优化后的提取工艺综合反应了各因素之间的关系，说明该方法提取CC-IPS具有一定的可行性，为进一步开发杨树桑黄与紫孢侧耳共培养的胞内其他活性成分提供了理论基础。体外抗氧化实验表明，CC-IPS对DPPH和ABTS+自由基的IC50分别为0.2425和0.1376 mg/mL，表明CC-IPS具有一定的抗氧化能力。
综上所述，本研究通过优化提取工艺，得到高提取量的CC-IPS，其具有一定的抗氧化活性。然而，本研究仍存在一些问题，主要集中在CC-IPS提取和分析方面。首先，本实验研究范围仅限于胞内多糖，菌丝体中的其他活性成分仍需深入研究；其次，所得到的最佳提取工艺仅是在标准实验室条件下确定的，而在工业化生产中的可行性和适用性还需进一步验证；另外，本研究仅评估了CC-IPS清除DPPH和ABTS+自由基的体外抗氧化能力，其它作用还需进一步深入研究。为解决上述问题，后续可以从以下几个方面进行研究：首先，对菌丝体中的其它活性成分如多酚、三萜和黄酮等进一步研究，探索提高杨树桑黄与紫孢侧耳共培养胞内活性成分的利用效率和经济效益的提取与分析方法；其次，深入研究超声波协同半仿生法提取技术在工业化中的应用推广和优化，以确保其可行性和适用性。最后，利用细胞系和小鼠实验，评估CC-IPS体内和体外抗肿瘤、降血糖等的活性，为其在食品和药物等领域的应用，提供理论基础和实验依据。
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图 1 不同提取料液比对CC-IPS提取量的影响
注：图中不同小写字母表示相同次数不同料液比之间存在显著性差异，P<0.05。
Figure 1. Effect of different extraction material-liquid ratios on CC-IPS extraction content
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图 2 不同提取时间对CC-IPS提取量的影响
注：图中不同小写字母表示相同次数不同提取时间之间存在显著性差异，P<0.05。
Figure 2. Effect of different extraction time on CC-IPS extraction content
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图 3 不同提取温度对CC-IPS提取量的影响
注：图中不同小写字母表示相同次数不同提取温度之间存在显著性差异，P<0.05。
Figure 3. Effect of different extraction temperature on CC-IPS extraction content
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图 5 第2次不同提取液pH对CC-IPS提取量的影响
Figure 5. Effect of different pH of the second extraction solution on CC-IPS extraction content
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图 6 第3次不同提取液 pH对CC-IPS提取量的影响
Figure 6. Effect of different pH of the third extraction solution on CC-IPS extraction content
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图 7 两因素交互作用对CC-IPS提取量影响的响应面图
Figure 7. Response surface plot for the effect of the interaction between two factors on the extraction content of CC-IPS
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图 8 CC-IPS和VC样品对DPPH自由基的清除能力
Figure 8. Scavenging capacity of CC-IPS and VC samples for DPPH free radicals
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图 9 CC-IPS和VC样品对ABTS+自由基的清除能力
Figure 9. Scavenging capacity of CC-IPS and VC samples for ABTS+ free radicals
表 1 PB试验设计的因素及水平
Table 1 Factors and levels of the PB design experiment
变量 水平 因素 名称 单位 −1 +1 X1 第1次提取料液比 g/mL 1:15 1:20 X2 第2次提取料液比 g/mL 1:31 1:40 X3 第3次提取料液比 g/mL 1:23 1:30 X4 第1次提取时间 min 23 30 X5 第2次提取时间 min 23 30 X6 第3次提取时间 min 23 30 X7 第1次提取温度 ℃ 31 40 X8 第2次提取温度 ℃ 31 40 X9 第3次提取温度 ℃ 38 50 X10 第1次提取液pH − 2.3 3 X11 第2次提取液pH − 6.2 8 X12 第3次提取液pH − 7.7 9 
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表 2 Box-Behnken试验因素水平设计
Table 2 Box-Behnken test factor level design
水平 A B C D 第1次提取料液比
（g/mL）第1次提取时间
（min）第2次提取温度
（℃）第1次提取液
pH−1 1:10 20 30 2 0 1:20 30 40 3 1 1:30 40 50 4
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表 3 DPPH自由基清除能力测定试验组
Table 3 DPPH free radical scavenging capacity assay test group
实验组 样品溶液（mL） DPPH溶液（mL） 蒸馏水（mL） VC溶液（mL） A样品 2 2 − − A对照 2 − 2 − A空白 − 2 2 − AVC − 2 − 2
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表 4 PB试验设计及结果
Table 4 PB experimental design and results
试验号 因素 响应值 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 CC-IPS提取量（mg/g） 1 20 40 23 23 30 30 40 40 38 3 6.2 9 58.6577 2 20 40 30 30 23 30 31 40 38 2.3 6.2 7.7 78.8693 3 20 40 30 23 30 23 40 31 38 2.3 6.2 9 67.4226 4 20 40 23 30 30 23 31 40 50 3 8 7.7 53.7509 5 15 31 23 23 23 23 31 31 38 2.3 6.2 7.7 65.7358 6 15 31 30 30 30 30 31 40 38 3 6.2 7.7 47.6637 7 20 31 30 23 30 23 31 31 38 3 8 7.7 53.0472 8 15 31 23 30 30 23 40 40 38 2.3 8 9 58.2837 9 15 40 23 23 23 23 40 40 38 3 8 7.7 57.0018 10 15 40 30 30 30 23 40 31 50 2.3 6.2 7.7 73.5729 11 20 31 23 30 30 30 40 31 50 2.3 8 7.7 71.0720 12 15 40 30 23 23 30 40 40 50 2.3 8 7.7 59.3241 13 20 31 30 30 23 23 40 40 50 3 6.2 9 59.8968 14 15 31 23 23 30 30 31 40 50 2.3 6.2 9 54.3283 15 15 31 30 30 23 30 40 31 38 3 8 9 59.2144 16 20 40 23 30 23 30 31 31 38 2.3 8 9 80.9240 17 15 40 23 30 23 23 31 31 50 3 6.2 9 59.5136 18 15 40 30 23 30 30 31 31 50 3 8 9 46.8476 19 20 31 30 23 23 23 31 40 50 2.3 8 9 51.9744 20 20 31 23 23 23 30 40 31 50 3 6.2 7.7 63.0427
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表 5 PB试验结果的一阶多项式模型分析
Table 5 First order polynomial model analysis of PB test results
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 1622.18 12 135.18 11.88 0.0016** X1 第1次提取料液比 163.43 1 163.43 14.36 0.0068** X2 第2次提取料液比 133.26 1 133.26 11.71 0.0111* X3 第3次提取料液比 29.96 1 29.96 2.63 0.1487 X4 第1次提取时间 213.72 1 213.72 18.78 0.0034** X5 第2次提取时间 129.29 1 129.29 11.36 0.0119* X6 第3次提取时间 19.49 1 19.49 1.71 0.2319 X7 第1次提取温度 60.67 1 60.67 5.33 0.0543 X8 第2次提取温度 183.87 1 183.87 16.16 0.0051** X9 第3次提取温度 56.1 1 56.1 4.93 0.0618 X10 第1次提取液pH 529.12 1 529.12 46.5 0.0002** X11 第2次提取液pH 69.43 1 69.43 6.1 0.0428* X12 第3次提取液pH 33.84 1 33.84 2.97 0.1283 残差 79.66 7 11.38 总计 1701.84 19 注：R2=0.9582，R2Adj=0.873；*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著。
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表 6 Box-Benhnke试验设计与结果
Table 6 Box-Benhnke experimental design and results
试验号 A：第1次
提取料液比
（g/mL）B：第1次
提取时间
（min）C：第2次
提取温度
（℃）D：第1次
提取液pHCC-IPS
提取量
（mg/g）1 1:20 30 40 3 83.1735 2 1:20 40 40 2 54.2268 3 1:10 30 40 2 64.1173 4 1:20 30 50 4 66.8322 5 1:10 30 30 3 57.1189 6 1:20 20 40 2 63.2396 7 1:20 40 30 3 56.1063 8 1:10 30 40 4 66.9285 9 1:30 20 40 3 61.5948 10 1:20 20 50 3 65.2551 11 1:10 20 40 3 69.0925 12 1:20 30 50 2 69.9963 13 1:20 30 40 3 83.2191 14 1:10 30 50 3 82.3515 15 1:20 40 40 4 69.1268 16 1:20 30 40 3 84.7465 17 1:10 40 40 3 65.5170 18 1:20 30 40 3 83.4609 19 1:20 30 40 3 84.3513 20 1:20 20 30 3 62.1797 21 1:20 30 30 2 55.6821 22 1:30 30 40 2 60.2667 23 1:30 30 50 3 68.2446 24 1:20 40 50 3 73.0228 25 1:30 30 30 3 64.7820 26 1:20 20 40 4 55.0887 27 1:30 40 40 3 65.6804 28 1:20 30 30 4 58.2523 29 1:30 30 40 4 64.6304
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表 7 拟合二次多项式模型的方差分析
Table 7 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 2534.13 14 181.01 103.24 <0.0001** A 33.09 1 33.09 18.87 0.0007** B 4.36 1 4.36 2.48 0.1373 C 426.99 1 426.99 243.53 <0.0001** D 14.81 1 14.81 8.45 0.0115* AB 14.67 1 14.67 8.37 0.0118* AC 118.48 1 118.48 67.58 <0.0001** AD 0.6 1 0.6 0.34 0.5671 BC 47.89 1 47.89 27.32 0.0001** BD 132.84 1 132.84 75.76 <0.0001** CD 8.22 1 8.22 4.69 0.0481* A2 340.33 1 340.33 194.1 <0.0001** B2 787.39 1 787.39 449.08 <0.0001** C2 474.85 1 474.85 270.83 <0.0001** D2 1011.17 1 1011.17 576.71 <0.0001** 残差 24.55 14 1.75 失拟 22.5 10 2.25 4.4 0.083 纯误差 2.04 4 0.51 总计 2558.68 28 注：R2=0.9904，R2Adj=0.9808；*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著。
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