Optimization of Enzymatic Extraction Process and in Vitro Hypoglycemic Activity of Blackberry Polysaccharides
-
摘要: 为优化黑莓多糖的提取工艺，探究其体外降血糖活性，本研究采用酶法提取黑莓多糖，分析了果胶酶添加量、料液比、提取温度、提取时间对黑莓多糖得率的影响，在单因素实验结果基础上，采用响应面设计对黑莓多糖酶法提取工艺进行优化，运用红外光谱和单糖组分分析初步解析了黑莓多糖的结构，并研究了其体外抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性。结果显示，黑莓多糖的最佳提取条件为果胶酶添加量0.42%、料液比1:6 g/mL、提取温度55 ℃、提取时间84 min。此条件下，黑莓多糖得率为10.68%±0.03%，提取的黑莓多糖为含β-吡喃糖构型的酸性多糖，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有较好的抑制活性，其半抑制浓度分别为0.061和0.36 mg/mL。本研究得到的优化酶法提取工艺可以有效提取黑莓多糖，且提取的黑莓多糖具有较好的体外降血糖活性，可为黑莓多糖在降血糖功能食品开发中的潜在应用提供依据。Abstract: To optimize the extraction process of blackberry polysaccharide and investigate its hypoglycemic activity in vitro, this study used enzymatic extraction to extract blackberry polysaccharide. The effects of pectinase addition, material-liquid ratio, extraction temperature, and extraction time on the yield of blackberry polysaccharides were analyzed. Based on the results of the one-way experiments, the extraction of the blackberry polysaccharide enzyme was optimized using response surface design. The structure of blackberry polysaccharide was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy and monosaccharide composition analysis, and its inhibitory capacity on α-glucosidase and α-amylase in vitro were also studied. The results showed that, the optimal conditions for extracting blackberry polysaccharide were 0.42% pectinase, material-liquid ratio of 1:6 g/mL, extraction temperature of 55 ℃, and extraction time of 84 min. Under this condition, the yield of blackberry polysaccharide was 10.68%±0.03%. The extracted blackberry polysaccharide was an acidic polysaccharide with a β-pyranose configuration and exhibited good inhibitory activity against α-glucosidase and α-amylase. The semi-inhibitory concentrations were 0.061 and 0.36 mg/mL, respectively. The enzymatic extraction process optimized in this study can effectively extract blackberry polysaccharides. The extracted blackberry polysaccharides exhibit good in vitro hypoglycemic activity, providing a basis for the potential application of blackberry polysaccharides in the development of hypoglycemic functional foods.
-
Keywords:
- blackberry polysaccharides /
- extraction process /
- hypoglycemic effect /
- pectase /
- α-glucosidase /
- α-amylase
-
黑莓（Rubus fruticosus Pollich）又被称为露莓，原产于北美地区，自从80年代从美国引入种植后，我国已经成为亚洲黑莓主要种植区域[1−2]。黑莓具有丰富的营养功能成分，如花色苷、黄酮、多糖、维生素、特殊氨基酸和硒等物质，还具有一定的药用和保健功能，如延缓衰老、提高免疫力、促进新陈代谢、降压、降血脂和抗心律失常等作用[3]，深受消费者喜爱，具有广阔的开发和应用前景。
在国内的食品开发中，黑莓应用已较为广泛，涵盖复合饮料[4]、复合黑莓果酒加工[5]、黑莓果汁加工[6]和发酵[7]等多个领域。近些年来，黑莓的活性物质研究主要集中于花色苷[8]、黄酮和鞣花酸[9]等多酚类物质，而对黑莓多糖这一主要组成成分的研究仍显不足。HE等[10]使用黑莓多糖提升鸡胸肉品质，研究结果发现黑莓多糖改善了鸡胸肉的风味并提升了鸡肉品质，可作为天然肉质改良剂使用。WANG等[11]研究了多种植物多糖的结构特征及功能活性，提出黑莓多糖有显著的抗氧化活性和益生特性，DOU等[12]解析黑莓中一种杂多糖发现黑莓中的多糖构象会引起α-葡萄糖苷酶结构变化，推测黑莓多糖具有一定的降血糖潜力。这些研究均为黑莓多糖的开发利用提供了新视角。然而，对于黑莓多糖的其他潜在活性和应用，仍有待进一步深入研究和探索。
不同的提取方式会影响多糖的特征结构和活性，为了进一步研究黑莓多糖的结构和功能，高效提取黑莓多糖显得尤为重要[13]。现有的多糖提取方法主要包括热水浸提、酸碱提取、酶解提取和超声/微波物理辅助提取等[14−16]。热水浸提法，方法简单成本低廉，但存在多糖纯化困难和高温破坏多糖结构导致产量低等问题。酸碱提法可提高多糖得率，但酸碱浓度过高会导致多糖中糖苷键大量破坏，从而降低多糖活性[17]。而酶法提取法因具有反应条件温和、专一性强和高效等诸多优点受到关注[18]。常用的酶有蛋白酶、果胶酶、纤维素酶等一种或多种混合酶，这些在多种食品原料的多糖提取中都得到了应用。黑莓细胞壁主要由果胶、纤维素和半纤维素组成，果胶与纤维素和半纤维素等相互交联。相对于刚性的纤维素，果胶作为细胞壁中结构最多变、最易被降解、最具动态性的多糖，其降解将显著改变细胞壁的通透性、持水性、机械特性和离子结合性等特性，有利于细胞内物质释放[19−20]。因此，选用果胶酶裂解黑莓细胞壁，有望提高黑莓多糖的得率。
本文通过单因素实验分别研究了果胶酶添加量、提取料液比、提取时间和提取温度对黑莓多糖得率的影响，进一步采用响应面法优化了黑莓多糖的提取工艺，并对黑莓多糖抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性进行研究。因此，优化提取工艺并深入研究黑莓多糖的活性，为综合利用黑莓开发出具有高附加值的新型产品提供参考思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
黑莓 产自江苏悠维有机食品有限公司种植基地，采收后8 h内速冻−20 ℃保存；AB-8吸附树脂、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（33.7 U/mg）、α-淀粉酶（4000 U/g）、阿卡波糖、DNS显色剂、标准品（甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-果糖、D-核糖、氨基半乳糖盐酸盐、L-古罗糖醛酸，D-甘露糖醛酸） 上海源叶生物科技有限公司；无水葡萄糖、无水乙醇、苯酚、硫酸、三氟乙酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；果胶酶（20500 U/mL） 夏盛（北京）生物科技开发有限公司。
3K15低速离心机 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；RE-3000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；E-poch酶标仪 美国BIO-TEK公司；FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪、ICS5000离子色谱仪 美国赛默飞世尔科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黑莓多糖的提取及纯化
将冷冻黑莓化冻后，按照料液比加入蒸馏水进行破碎，同时加入果胶酶于不同的提取温度和不同的提取时间下提取黑莓杂多糖。酶解结束后对黑莓杂多糖进行纯化。将酶解溶液放入离心机中以5000 r/min 离心10 min，取上清液。采用AB-8树脂吸附上清液中的色素，去除色素后浓缩液体至原体积1/3后，采用Sevage法除蛋白[21]。经透析后，按照1:1（v/v）加入无水乙醇对溶液进行醇沉，3500 r/min离心10 min获得黑莓多糖沉淀，冷冻干燥获得黑莓多糖冻干粉。
1.2.2 黑莓多糖的测定
依据硫酸-苯酚法测定黑莓多糖[22]。葡萄糖质量浓度（0.012、0.016、0.02、0.024、0.036 mg/mL）和490 nm处的吸光值A490 nm绘制葡萄糖标准曲线（y=10.27x+0.0418，R2=0.998），适当稀释多糖溶液后根据硫酸-苯酚法测定A490 nm，并代入标曲中计算多糖浓度。根据多糖的浓度计算多糖得率。
黑莓多糖得率(%)=溶液中多糖浓度×多糖溶液体积黑莓质量×100 1.2.3 单因素实验
分别考察果胶酶添加量（果胶酶0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，料液比为1:4 g/mL，提取时间90 min，提取温度50 ℃）、料液比（料液比为1:0、1:2、1:4、1:6、1:8 g/mL，果胶酶添加量0.3 %，提取时间90 min，提取温度50 ℃）、提取时间组（提取时间30、60、90、120、150 min，料液比为1:4 g/mL，果胶酶添加量0.3%，提取温度50 ℃）、提取温度（提取温度30、40、50、60、70 ℃，料液比为1:4 g/mL，果胶酶添加量0.3 %，提取时间为90 min）对黑莓多糖得率的影响，每个处理3个重复。
1.2.4 响应面试验设计
根据Box-Behnken试验设计原理，在1.2.3单因素实验结果的基础上，以多糖的得率为考察指标，采用Design Expert 8.0.6软件对影响黑莓多糖提取的因素果胶酶添加量（A）、提取料液比（B）、提取时间（C）和提取温度（D）进行四因素三水平的响应面优化设计[23]，试验因素与水平设计见表1。
表 1 响应面试验因素及水平Table 1. Response surface experiment factors and levels因素 水平 −1 0 1 A果胶酶添加量（%） 0.3 0.4 0.5 B料液比（g/mL） 1:4 1:6 1:8 C提取时间（min） 60 90 120 D提取温度（℃） 50 60 70 1.2.5 单糖组分分析
分别称取16种5 mg单糖标准品加入2 mL的3 mol/L三氟乙酸，120 ℃水解3 h，氮吹仪吹干，加入蒸馏水重悬混匀，配制成标准浓度（依次为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL）。精密称量5 mg样品，按照上述方法处理后加入5 mL水涡旋混匀制备样品溶液。吸取50 µL样品溶液加入950 µL去离子水，12000 r/min离心5 min，取上清使用离子色谱仪分析其单糖组分。离子色谱参数如下：色谱柱Dionex CarbopacTM PA20（3 mm×150 mm）；流动相A：H2O；B：15 mmol/L NaOH；C：15 mmol/L NaOH和100 mmol/L NaAc，梯度洗脱程序见表2；流速0.3 mL/min；进样量25 µL；柱温30 ℃。
表 2 梯度洗脱程序Table 2. Gradient elution program洗脱梯度时间（min） A/B/C相体积比（v/v/v） 0~18 98.8:1.2:0 18.1~30 50:50:0 30.1~46 0:0:100 46.1~50 0:100:0 50.1~80 98.8:1.2:0 1.2.6 傅里叶红外光谱分析
使用傅里叶红外光谱分析仪测定黑莓多糖的特征峰。将冻干黑莓多糖粉末与溴化钾研磨成粉压制成片，傅里叶红外光谱波数范围为4000~500 cm−1，环境温度为25±0.2 ℃。
1.2.7 α-葡萄糖苷酶抑制实验
参考DOU等[24]的方法测定α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。将50 μL待测样品溶液（0.25~4 mg/mL）与50 μL α-葡萄糖苷酶（0.25 U/mL）混合，在37 ℃下孵育6 min，孵育完成后加入50 μL 5 mmol/L对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并在37 ℃下再孵育20 min，最终加入100 μL 0.2 mol/L碳酸钠溶液终止反应，检测405 nm处吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下：
α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=A样品−A空白A对照×100 式中：A样品为样品与α-葡萄糖苷酶、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷底物反应并终止后的吸光度；A空白为样品和α-葡萄糖苷酶混合物的吸光度；A对照为不加入待测样品时α-葡萄糖苷酶和对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷底物反应并终止后的吸光度。
1.2.8 α-淀粉酶抑制实验
参考CHEN等[25]的方法测定α-淀粉酶活性的抑制率。0.5 mL多糖溶液与0.5 mL α-淀粉酶溶液（2 U/mL）混匀，于37 ℃下反应10 min，反应结束后加入1 mL的1.5%可溶性淀粉溶液37 ℃下反应5 min，反应结束后加入1 mL DNS显色剂溶液，混合均匀后于沸水中加热5 min冷却至室温。采用PBS缓冲溶液（0.1 mol/L，pH6.8）稀释至合适倍数后室温下静置30 min，于540 nm处测定吸光度。测定公式如下：
α-淀粉酶抑制率(%)=1−(a−b)c−d×100 式中：a为待测样品与α-淀粉酶反应后的吸光度；b为仅含待测样品和可溶性淀粉溶液，不含α-淀粉酶的样品的吸光度；c为含α-淀粉酶和可溶性淀粉溶液，不含待测样品的吸光度；d为仅含DNS显色剂溶液和PBS缓冲溶液的吸光度。
1.3 数据处理
本实验中所有样品进行至少3次独立重复测定，确定平均值和标准偏差，结果以平均值±标准差表示。采用Origin 2020 64 Bit软件进行作图和SPSS 16.0进行实验数据显著性分析，采用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面试验并对数据进行回归分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
图1A为不同果胶酶添加量对黑莓多糖得率的影响。实验结果表明，果胶酶的添加量对得率影响显著（P<0.05）。当果胶酶添加量为0.1%~0.4%时，黑莓多糖得率随果胶酶添加量的增加而升高，可能是由于果胶酶的添加量提高，酶与底物接触机会增加，有利于果胶与纤维素等物质解聚，释放更多的多糖。当果胶酶添加量为0.4%时，黑莓多糖得率达到峰值，为8.51%±0.22%，而继续增加果胶酶添并没有显著提高黑莓多糖的得率（P<0.05），这可能由于酶分子过于饱和，部分果胶酶未能与底物结合，导致酶解效率降低[19]。此外，过量的果胶酶很可能导致其他组分降解或转化，从而影响了多糖的提取。
![]()
图 1 果胶酶添加量（A）、料液比（B）、提取时间（C）和提取温度（D）对黑莓多糖得率的影响注：不同小写字母表示显著性差异，P<0.05。Figure 1. Effects of pectinase addition (A), solid-liquid ratio (B), extraction time (C), and extraction temperature (D) on the yield of blackberry polysaccharides图1B为不同料液比对黑莓多糖得率的影响。料液比在1:0~1:6 g/mL之间时，多糖得率随着料液比的增加而增加，在1:6 g/mL时得率达到峰值9.64%±0.24%，而料液比大于1:6 g/mL时多糖得率趋于稳定。随着提取溶剂的比例增加，黑莓细胞中的多糖浓度与溶剂中多糖浓度相差较大，更容易析出。当溶剂达到一定量时，黑莓细胞中的多糖和溶剂中的多糖会达到一个动态平衡状态，即多糖在两相（黑莓细胞和溶剂）中的分配达到平衡。在此平衡状态下，多糖从黑莓细胞析出到溶剂的速率与多糖从溶剂回到黑莓细胞的速率相等，因此多糖得率不再上升。而当料液比达到1:8 g/mL时出现轻微下降可能是由于溶液中非糖物质溶解，导致多糖溶解受阻[26]，从而导致总多糖得率降低。
图1C为提取时间对黑莓多糖得率的影响，提取时间在30~90 min时，多糖得率由6.59%±0.15%缓慢提升至8.14%±0.27%，在90 min时，黑莓多糖得率达到最高值，但是继续增加提取时间并没有增加黑莓多糖的得率，这表明黑莓经过简单的果实破碎后，酶解过程中黑莓多糖析出需要一定时间，多糖分子于溶剂和果实中无规则运动，多糖得率不断增加，当达到一定提取时间后，多糖得率趋于平稳不再上升。提取时间对食品工业生产成本具有重要影响，为了提高提取效率应该尽可能减小提取时间。
图1D为不同提取温度对黑莓多糖得率的影响，多糖得率随着提取温度的上升而增加，当提取温度达到60 ℃时，得率由6.94%±0.33%到达峰值9.17%±0.21%，这表明，一定的加热温度可以加速细胞壁破裂，并加剧多糖分子无规则运动，使多糖从果实中快速析出，得率提高。而温度大于60 ℃后多糖得率下降，可能是高温会导致多糖降解活性降低。
根据以上单因素结果分析，果胶酶添加量0.4%、料液比1:6 g/mL、提取时间90 min、提取温度60 ℃为黑莓多糖的提取条件。由此，选择响应面因素水平为：果胶酶（0.3%、0.4%、0.5%）、料液比（1:4、1:6、1:8 g/mL）、提取时间（60、90、120 min）、提取温度（50、60、70 ℃）。
2.2 响应面试验优化黑莓多糖的提取工艺
2.2.1 回归模型的建立与显著性分析
表3为不同条件下黑莓多糖得率的结果，通过拟合分析得到线性回归方程模型为：
表 3 响应面试验各处理参数及其黑莓多糖得率Table 3. Treatment parameters and corresponding blackberry polysaccharide yields through response surface optimization实验号 A酶添加量
（%）B料液比
（g/mL）C提取时间
（min）D提取温度
（℃）多糖得率
（%）1 0.3 1:4 90 60 9.17 2 0.5 1:6 120 60 8.46 3 0.3 1:6 120 60 7.89 4 0.4 1:4 90 70 7.34 5 0.4 1:6 120 70 6.53 6 0.4 1:6 90 60 10.57 7 0.5 1:6 90 70 7.57 8 0.4 1:6 60 70 7.55 9 0.4 1:8 90 50 9.10 10 0.4 1:8 90 70 7.44 11 0.5 1:6 90 50 9.19 12 0.4 1:6 60 50 9.44 13 0.5 1:6 60 60 9.55 14 0.3 1:6 90 70 7.50 15 0.5 1:4 90 60 9.34 16 0.4 1:6 120 50 8.65 17 0.4 1:4 90 50 9.00 18 0.5 1:8 90 60 9.55 19 0.4 1:4 120 60 8.32 20 0.4 1:8 60 60 8.55 21 0.4 1:8 120 60 8.31 22 0.4 1:6 90 60 10.34 23 0.4 1:4 60 60 8.61 24 0.3 1:8 90 60 9.34 25 0.3 1:6 90 50 9.60 26 0.3 1:6 60 60 8.70 27 0.4 1:6 90 60 10.62 Y=10.51+0.1217A+0.0425B−0.3533C−0.9208D+0.01AB−0.07AC+0.12AD+0.0125BC+0.0000BD−0.0575CD−0.5517A2−0.7754B2−1.21C2−1.42D2
从表4可知，回归模型F值为19.5，模型P<0.0001，回归方程极显著；失拟项F值为4.97，失拟项P值为0.1791（P>0.05）不显著，判定该回归方程是可信的，具备预测试验真实性的能力。模型拟合度为95.79%，可信度超过90%。综上所述，该模型用于预估黑莓多糖得率具有可行性。四因素中F值大小排序为FD>FC>FA>FB，因此，各因素对黑莓多糖得率的影响依次为温度>时间>酶添加量>料液比。依据响应面因素交互作用对响应值的影响大小顺序为AD>AC>CD>BC>AB>BD。依据模型预测的黑莓多糖的最佳提取工艺参数为：果胶酶添加量0.42%、料液比1:6 g/mL、提取时间84 min、提取温度55 ℃，此时回归模型的预测多糖得率为10.64%。
表 4 响应面回归方程及显著性分析Table 4. Response surface regression equation and significance analysis方差来源 总偏差
平方和自由度 平均偏差
平方和F值 P值 显著性 模型 26.22 14 1.87 19.5 <0.0001 极显著 A-果胶酶添加量 0.1776 1 0.1776 1.85 0.1988 B-料液比 0.0217 1 0.0217 0.2258 0.6432 C-时间 1.50 1 1.50 15.60 0.0019 显著 D-温度 10.18 1 10.18 105.98 <0.0001 极显著 AB 0.0004 1 0.0004 0.0042 0.9496 AC 0.0196 1 0.0196 0.2041 0.6595 AD 0.0576 1 0.0576 0.5999 0.4536 BC 0.0006 1 0.0006 0.0065 0.9370 BD 0.0000 1 0.0000 0.0000 1.0000 CD 0.0132 1 0.0132 0.1377 0.7170 A2 1.62 1 1.62 16.91 0.0014 显著 B2 3.21 1 3.21 33.4 <0.0001 极显著 C2 7.86 1 7.86 81.89 <0.0001 极显著 D2 10.76 1 10.76 112.07 < 0.0001 极显著 误差项 1.15 12 0.096 失拟项 1.11 10 0.1108 4.97 0.1791 不显著 纯误差 0.0446 2 0.0223 所有项 27.37 26 2.2.2 验证实验
为验证响应面试验的准确性和可行性，按照模型预测的最佳提取工艺参数（果胶酶添加量0.42%、料液比1:6 g/mL、提取时间84 min、提取温度55 ℃）进行实验，多糖实际得率为10.68%±0.03%，与模型预测结果相符。与文献[27]报道的盐法浸提（7.2%）以及酸提取（2.88%）黑莓多糖得率对比，酶法提取黑莓多糖得率明显提高。因此，响应面法对酶法辅助提取黑莓多糖的工艺优化是可行的，具有实际应用价值。
2.3 单糖组分分析
对提取的黑莓多糖分离纯化并进行单糖组分分析，结果如图2和表5所示。可以看出，本优化工艺条件下提取的黑莓多糖由阿拉伯糖（13.2%）、鼠李糖（2.9%）、半乳糖（6.4%）、半乳糖醛酸（75.6%）、甘露糖（0.5%）、葡萄糖（0.6%）和木糖（0.7%）7种单糖组成，糖醛酸比例大于50%，属于酸性多糖。研究表明半乳糖醛酸含量越高，多糖的生物活性越高[28]。实验中采用酶法提取的多糖，与DOU等[27]所采用的碱提法、盐提法和热水浸提法相比，不仅具有更高的半乳糖醛酸含量，还具有更丰富的多糖种类。因此，酶解法提取可保持黑莓多糖中单糖组分的丰富程度，从而有利于黑莓多糖保持更高的生物活性。
![]()
图 2 黑莓多糖单糖组分离子色谱图注：A为标准混合单糖离子色谱；B为黑莓多糖离子色谱。Figure 2. Ion chromatogram of blackberry polysaccharide components表 5 黑莓的单糖组成分析Table 5. Content of blackberry polysaccharide and chromatographic analysis单糖 峰面积 保留时间
（min）摩尔百分比
（%）含量
（μg/mg）鼠李糖（Rha） 1.573 10.442 2.9 15.66 阿拉伯糖（Ara） 11.764 10.909 13.2 64.84 半乳糖（Gal） 4.022 13.525 6.4 37.93 葡萄糖（Glc） 0.876 15.325 0.6 3.63 木糖（Xyl） 0.672 17.667 0.7 3.62 甘露糖（Man） 0.285 18.125 0.5 3.12 半乳糖醛酸（GalA） 20.804 46.392 75.6 479.80 2.4 傅里叶红外光谱分析
根据HONG等[29]的研究可知，多糖的特征吸收峰有4大区域，分别为4000~2500 cm−1（3600~3000 cm−1处出现强而宽的条带，3000~2500 cm−1出现中等条带）、1800~1500 cm−1（双键拉伸区域与COO-相关）、1500~1200 cm−1（局部对称区域与C-O-H变形相关）、1200~800 cm−1（与多糖中糖苷键相关）。
黑莓多糖的傅里叶红外检测结果如图3所示。从图中可以看出，3371 cm−1为黑莓多糖糖残基中-OH伸缩振动吸收峰；2938 cm−1为C-H的伸缩振动峰；1744 cm−1为乙酰基C=O拉伸振动，1628 cm−1与去质子化的羧基COO-有关；1231 cm−1对应C-O-C；1145 cm−1 对应C-O-H；1104 cm−1 对应C-C振动；919 cm−1 和635 cm−1处显示明显的吸收峰，表明此多糖为β-吡喃糖构型[30]（图3）。上述吸收峰位置均处于多糖的四大特征吸收峰内。
2.5 黑莓多糖降血糖活性研究
生物活性化合物抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性可以发挥降血糖作用[31]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶直接参与淀粉及糖原的代谢途径，能够水解葡萄糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖等低分子糖类，抑制酶的活性可以有效减缓葡萄糖生成的速度、减少和延缓小肠对葡萄糖的吸收，从而有效降低血糖[32−33]。结果如图4所示，在0.25~4 mg/mL的黑莓多糖浓度范围内，随着浓度的增加，黑莓多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率呈剂量依赖性增长，其IC50（半抑制浓度）分别为0.061 mg/mL和0.36 mg/mL。与临床药物阿卡波糖（阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的IC50分别为1.16 mg/mL和0.45 mg/mL）相比，黑莓多糖展现出更强的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性。因此，黑莓多糖具有一定降低血糖的作用。
![]()
图 4 黑莓多糖体外降血糖活性注：A为α-葡萄糖苷酶抑制作用；B为α-淀粉酶抑制作用。Figure 4. Hypoglycaemic effect of blackberry polysaccharides3. 结论
本研究针对黑莓多糖的提取工艺进行了系统优化，并对其体外降血糖作用和单糖组成及结构进行了初步探讨。通过单因素实验发现，果胶酶的添加量、料液比、提取时间和温度对多糖得率有显著影响。基于这一结果采用了响应面设计，优化了提取工艺。最佳提取条件为：果胶酶添加量0.42%、料液比1:6 g/mL、提取时间84 min和提取温度55 ℃。在此条件下，黑莓多糖的得率达到10.68%±0.03%。通过红外光谱分析及单糖组分得知黑莓多糖为一种β-吡喃糖构型的酸性多糖。此外，针对提取得到的黑莓多糖进行了体外降血糖研究，黑莓多糖能够有效抑制α-葡萄糖苷酶（IC50=0.061 mg/mL）和α-淀粉酶（IC50=0.36 mg/mL），具有辅助降血糖的功效。对比酸碱提取、热水浸提和盐浸提法，酶法提取黑莓多糖的得率更高且能更好地保持黑莓多糖结构和较高的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性。本文研究结果对黑莓多糖的开发和利用具有重要意义，也为相关产品的研发和应用提供参考。为进一步提高黑莓多糖得率，后续研究可采用非热加工技术如超声或微波等方法辅助酶法提取。此外，黑莓多糖的结构还需运用化学和波谱手段详细解析，以期为黑莓多糖的活性研究提供依据。
-
![]()
图 1 果胶酶添加量（A）、料液比（B）、提取时间（C）和提取温度（D）对黑莓多糖得率的影响
注：不同小写字母表示显著性差异，P<0.05。
Figure 1. Effects of pectinase addition (A), solid-liquid ratio (B), extraction time (C), and extraction temperature (D) on the yield of blackberry polysaccharides
![]()
图 2 黑莓多糖单糖组分离子色谱图
注：A为标准混合单糖离子色谱；B为黑莓多糖离子色谱。
Figure 2. Ion chromatogram of blackberry polysaccharide components
![]()
图 4 黑莓多糖体外降血糖活性
注：A为α-葡萄糖苷酶抑制作用；B为α-淀粉酶抑制作用。
Figure 4. Hypoglycaemic effect of blackberry polysaccharides
表 1 响应面试验因素及水平
Table 1 Response surface experiment factors and levels
因素 水平 −1 0 1 A果胶酶添加量（%） 0.3 0.4 0.5 B料液比（g/mL） 1:4 1:6 1:8 C提取时间（min） 60 90 120 D提取温度（℃） 50 60 70 
下载: 导出CSV
表 2 梯度洗脱程序
Table 2 Gradient elution program
洗脱梯度时间（min） A/B/C相体积比（v/v/v） 0~18 98.8:1.2:0 18.1~30 50:50:0 30.1~46 0:0:100 46.1~50 0:100:0 50.1~80 98.8:1.2:0
下载: 导出CSV
表 3 响应面试验各处理参数及其黑莓多糖得率
Table 3 Treatment parameters and corresponding blackberry polysaccharide yields through response surface optimization
实验号 A酶添加量
（%）B料液比
（g/mL）C提取时间
（min）D提取温度
（℃）多糖得率
（%）1 0.3 1:4 90 60 9.17 2 0.5 1:6 120 60 8.46 3 0.3 1:6 120 60 7.89 4 0.4 1:4 90 70 7.34 5 0.4 1:6 120 70 6.53 6 0.4 1:6 90 60 10.57 7 0.5 1:6 90 70 7.57 8 0.4 1:6 60 70 7.55 9 0.4 1:8 90 50 9.10 10 0.4 1:8 90 70 7.44 11 0.5 1:6 90 50 9.19 12 0.4 1:6 60 50 9.44 13 0.5 1:6 60 60 9.55 14 0.3 1:6 90 70 7.50 15 0.5 1:4 90 60 9.34 16 0.4 1:6 120 50 8.65 17 0.4 1:4 90 50 9.00 18 0.5 1:8 90 60 9.55 19 0.4 1:4 120 60 8.32 20 0.4 1:8 60 60 8.55 21 0.4 1:8 120 60 8.31 22 0.4 1:6 90 60 10.34 23 0.4 1:4 60 60 8.61 24 0.3 1:8 90 60 9.34 25 0.3 1:6 90 50 9.60 26 0.3 1:6 60 60 8.70 27 0.4 1:6 90 60 10.62
下载: 导出CSV
表 4 响应面回归方程及显著性分析
Table 4 Response surface regression equation and significance analysis
方差来源 总偏差
平方和自由度 平均偏差
平方和F值 P值 显著性 模型 26.22 14 1.87 19.5 <0.0001 极显著 A-果胶酶添加量 0.1776 1 0.1776 1.85 0.1988 B-料液比 0.0217 1 0.0217 0.2258 0.6432 C-时间 1.50 1 1.50 15.60 0.0019 显著 D-温度 10.18 1 10.18 105.98 <0.0001 极显著 AB 0.0004 1 0.0004 0.0042 0.9496 AC 0.0196 1 0.0196 0.2041 0.6595 AD 0.0576 1 0.0576 0.5999 0.4536 BC 0.0006 1 0.0006 0.0065 0.9370 BD 0.0000 1 0.0000 0.0000 1.0000 CD 0.0132 1 0.0132 0.1377 0.7170 A2 1.62 1 1.62 16.91 0.0014 显著 B2 3.21 1 3.21 33.4 <0.0001 极显著 C2 7.86 1 7.86 81.89 <0.0001 极显著 D2 10.76 1 10.76 112.07 < 0.0001 极显著 误差项 1.15 12 0.096 失拟项 1.11 10 0.1108 4.97 0.1791 不显著 纯误差 0.0446 2 0.0223 所有项 27.37 26
下载: 导出CSV
表 5 黑莓的单糖组成分析
Table 5 Content of blackberry polysaccharide and chromatographic analysis
单糖 峰面积 保留时间
（min）摩尔百分比
（%）含量
（μg/mg）鼠李糖（Rha） 1.573 10.442 2.9 15.66 阿拉伯糖（Ara） 11.764 10.909 13.2 64.84 半乳糖（Gal） 4.022 13.525 6.4 37.93 葡萄糖（Glc） 0.876 15.325 0.6 3.63 木糖（Xyl） 0.672 17.667 0.7 3.62 甘露糖（Man） 0.285 18.125 0.5 3.12 半乳糖醛酸（GalA） 20.804 46.392 75.6 479.80
下载: 导出CSV
-
[1] STRIK B C, CLARK J R, FINN C E, et al. Worldwide blackberry production[J]. Hort Technology,2007,17(2):205−213.
[2] ZHAO H, WU Y, WU W, et al. Screening and evaluation of excellent blackberry cultivars and strains based on nutritional quality, antioxidant properties, and genetic diversity[J]. Plants,2023,12(16):2982. doi: 10.3390/plants12162982
[3] 孙洋, 钟良. 黑莓营养成分及功能研究进展[J]. 江苏调味副食品,2023(1):12−16,44. [SUN Yang, ZHONG Liang. Research progress of nutrient composition and function of blackberry[J]. Jiangsu Flavored Non-staple Food,2023(1):12−16,44.] SUN Yang, ZHONG Liang. Research progress of nutrient composition and function of blackberry[J]. Jiangsu Flavored Non-staple Food, 2023（1）: 12−16,44.
[4] 葛永辉, 汪玲, 姜天丽, 等. 黑莓玫瑰复合饮料的制备及其抗氧化活性[J]. 食品研究与开发,2023,44(7):121−128. [GE Yonghui, WANG Ling, JIANG Tianli, et al. Preparation and antioxidant activity of blackberry-rose compound beverage[J]. Food Research and Development,2023,44(7):121−128.] GE Yonghui, WANG Ling, JIANG Tianli, et al. Preparation and antioxidant activity of blackberry-rose compound beverage[J]. Food Research and Development, 2023, 44（7）: 121−128.
[5] 赵慧芳, 刘洪霞, 赵俸艺, 等. 黑莓、蓝莓复合果酒的加工工艺及贮藏稳定性研究[J]. 酿酒科技,2021(7):89−94. [ZHAO Huifang, LIU Hongxia, ZHAO Xingyi, et al. Processing technology and stability during storage of blackberry-blueberry[J]. Winemaking Technology,2021(7):89−94.] ZHAO Huifang, LIU Hongxia, ZHAO Xingyi, et al. Processing technology and stability during storage of blackberry-blueberry[J]. Winemaking Technology, 2021（7）: 89−94.
[6] 赵慧芳, 刘洪霞, 闾连飞, 等. 黑莓原汁加工工艺及贮藏稳定性研究[J]. 食品安全质量检测学报,2021,12(6):2139−2145. [ZHAO Huifang, LIU Hongxia, LÜ Lianfei, et al. Research on processing technology and storage stability of blackberry juice[J]. Journal of Food Safety and Quality Testing,2021,12(6):2139−2145.] ZHAO Huifang, LIU Hongxia, LÜ Lianfei, et al. Research on processing technology and storage stability of blackberry juice[J]. Journal of Food Safety and Quality Testing, 2021, 12（6）: 2139−2145.
[7] 戴意强, 吴寒, 单成俊, 等. 红茶菌发酵对黑莓汁理化性质的影响[J]. 生物加工过程,2021,19(6):686−692. [DAI Yiqiang, WU Han, SHAN Chengjun, et al. Physicochemical properties of blackberry juice fermented by a Kombucha microbial consortium[J]. Bioprocessing,2021,19(6):686−692.] DAI Yiqiang, WU Han, SHAN Chengjun, et al. Physicochemical properties of blackberry juice fermented by a Kombucha microbial consortium[J]. Bioprocessing, 2021, 19（6）: 686−692.
[8] 王晶晶, 赵则月, 张晓霞, 等. 黑莓果渣花青素降血糖、降血脂及抗氧化研究[J]. 中国食品添加剂,2023,34(8):214−219. [WANG Jingjing, ZHAO Zeyue, ZHANG Xiaoxia, et al. Study on the hypoglycemic, hypolipidemic and antioxidant effects of anthocyanins from blackberry pomace[J]. China Food Additives,2023,34(8):214−219.] WANG Jingjing, ZHAO Zeyue, ZHANG Xiaoxia, et al. Study on the hypoglycemic, hypolipidemic and antioxidant effects of anthocyanins from blackberry pomace[J]. China Food Additives, 2023, 34（8）: 214−219.
[9] ROBINSON J A, BIERWIRTH J E, GREENSPAN P, et al. Blackberry polyphenols:Review of composition, quantity, and heal-th impacts from in vitro and in vivo studies[J]. Journal of Food Bioactives,2020,9:40−51.
[10] HE Y, ZHANG C, ZHENG Y, et al. Effects of blackberry polysaccharide on the quality improvement of boiled chicken breast[J]. Food Chemistry:X,2023,18:100623.
[11] WANG Z, ZHENG Y, LAI Z, et al. Effect of monosaccharide composition and proportion on the bioactivity of polysaccharides:A review[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2024,254:127955. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2023.127955
[12] DOU Z M, CHEN C, HUANG Q, et al. The structure, conformation, and hypoglycemic activity of a novel heteropolysaccharide from the blackberry fruit[J]. Food & Function,2021,12(12):5451−5464.
[13] XUE H, WANG W, BIAN J, et al. Recent advances in medicinal and edible homologous polysaccharides:Extraction, purification, structure, modification, and biological activities[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2022,222:1110−1126. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2022.09.227
[14] ZHANG W, DUAN W, HUANG G, et al. Ultrasonic-assisted extraction, analysis and properties of mung bean peel polysaccharide[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2023,98:106487. doi: 10.1016/j.ultsonch.2023.106487
[15] 邹胜, 徐溢, 张庆. 天然植物多糖分离纯化技术研究现状和进展[J]. 天然产物研究与开发,2015,27(8):1501−1509. [ZOU Sheng, XU Yi, ZHANG Qing. Review on extraction and purification technology of polysaccharides from natural plants[J]. Natural Products Research and Development,2015,27(8):1501−1509.] ZOU Sheng, XU Yi, ZHANG Qing. Review on extraction and purification technology of polysaccharides from natural plants[J]. Natural Products Research and Development, 2015, 27（8）: 1501−1509.
[16] TEPSONGKROH B, THAIHUTTAKIJ C, SUPAWONG S, et al. Impact of high pressure pre-treatment and hot water extraction on chemical properties of crude polysaccharide extract obtained from mushroom (Volvariella volvacea)[J]. Food Chemistry:X,2023,19:100864.
[17] MOHANTA B, SEN D J, MAHANTI B, et al. Recent advances in the extraction, purification, and antioxidant activities of fruit polysaccharides:A review[J]. Food Hydrocolloids for Health,2023,4:100163. doi: 10.1016/j.fhfh.2023.100163
[18] CHEN R, ZHOU X, DENG Q, et al. Extraction, structural characterization and biological activities of polysaccharides from mulberry leaves:A review[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2023,257:128669.
[19] ZHANG C, XIONG Z, YANG H, et al. Changes in pericarp morphology, physiology and cell wall composition account for flesh firmness during the ripening of blackberry (Rubus spp.) fruit[J]. Scientia Horticulturae,2019,250:59−68. doi: 10.1016/j.scienta.2019.02.015
[20] DU J, ANDERSON C T, XIAO C. Dynamics of pectic homogalacturonan in cellular morphogenesis and adhesion, wall integrity sensing and plant development[J]. Nature Plants,2022,8(4):332−340. doi: 10.1038/s41477-022-01120-2
[21] 杨斌旺, 刘平古, 刘龙飞, 等. 药桑叶多糖的脱蛋白工艺与抗氧化活性研究[J]. 食品研究与开发, 2020, 41(10):156−160. [YANG Binwang, LIU Pinggu, LIU Longfei, et al. Study on deprotrinization process and antioxidant activity of polysaccharide from Morus nigra leaves[J]. Food Research and Development, 2020, 41(10):156−160.] YANG Binwang, LIU Pinggu, LIU Longfei, et al. Study on deprotrinization process and antioxidant activity of polysaccharide from Morus nigra leaves[J]. Food Research and Development, 2020, 41（10）: 156−160.
[22] 王彦平, 娄芳慧, 陈月英, 等. 苯酚-硫酸法测定紫山药多糖含量的条件优化[J]. 食品研究与开发,2021,42(4):170−174. [WANG Yanping, LOU Fanghui, CHEN Yueying, et al. Optimization of analytical conditions for the determination of polysaccharides contents in purple yam by phenol-sulfuric acid method[J]. Food Research and Development,2021,42(4):170−174.] WANG Yanping, LOU Fanghui, CHEN Yueying, et al. Optimization of analytical conditions for the determination of polysaccharides contents in purple yam by phenol-sulfuric acid method[J]. Food Research and Development, 2021, 42（4）: 170−174.
[23] FAN T, HU J, FU L, et al. Optimization of enzymolysis-ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from Momordica charabtia L. by response surface methodology[J]. Carbohydrate Po-lymers,2015,115:701−706. doi: 10.1016/j.carbpol.2014.09.009
[24] DOU Z, CHEN C, FU X. The effect of ultrasound irradiation on the physicochemical properties and α-glucosidase inhibitory effect of blackberry fruit polysaccharide[J]. Food Hydrocolloids,2019,96:568−576. doi: 10.1016/j.foodhyd.2019.06.002
[25] CHEN Y, TANG S, CHEN Y, et al. Structure-activity relationship of procyanidins on advanced glycation end products formation and corresponding mechanisms[J]. Food Chemistry,2019,272:679−687. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.08.090
[26] LIU Y, SHI Z, PENG X, et al. A polysaccharide from the seed of Gleditsia japonica var. delavayi:Extraction, purification, characterization and functional properties[J]. LWT,2024,191:115660. doi: 10.1016/j.lwt.2023.115660
[27] DOU Z M, CHEN C, HUANG Q, et al. Comparative study on the effect of extraction solvent on the physicochemical properties and bioactivity of blackberry fruit polysaccharides[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2021,183:1548−1559. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2021.05.131
[28] LI C, HUANG Q, FU X, et al. Characterization, antioxidant and immunomodulatory activities of polysaccharides from Prunella vulgaris Linn[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2015,75:298−305. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2015.01.010
[29] HONG T, YIN J Y, NIE S P, et al. Applications of infrared spectroscopy in polysaccharide structural analysis:Progress, challenge and perspective[J]. Food Chemistry:X,2021,12:100168.
[30] XU Y Q, GUO Y Y, DUAN S Y, et al. Effects of ultrasound irradiation on the characterization and bioactivities of the polysaccharide from blackcurrant fruits[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2018,49:206−214. doi: 10.1016/j.ultsonch.2018.08.005
[31] LÜ Q Q, CAO J J, LIU R, et al. Structural characterization, α-amylase and α-glucosidase inhibitory activities of polysaccharides from wheat bran[J]. Food Chemistry,2021,341:128218. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.128218
[32] JIA Y, XUE Z, WANG Y, et al. Chemical structure and inhibition on α-glucosidase of polysaccharides from corn silk by fractional precipitation[J]. Carbohydrate Polymers,2021,252:117185. doi: 10.1016/j.carbpol.2020.117185
[33] TEJEDOR-CALVO E, MORALES D, MORILLO L, et al. Pressurized liquid (PLE) truffle extracts have inhibitory activity on key enzymes related to type 2 diabetes (α-glucosidase and α-amylase)[J]. Foods,2023,12(14):2724. doi: 10.3390/foods12142724
-
期刊类型引用(0)
其他类型引用(1)
下载:
计量
- 文章访问数: 0
- HTML全文浏览量: 0
- PDF下载量: 0
- 被引次数: 1
