Exploring the Interaction Mechanism between Persimmon Proanthocyanidins and Mucin Based on Fluorescence Spectroscopy
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摘要: 为了解黏蛋白（Mucin）对柿原花青素肠道消化释放的影响，借助激光粒度仪、差示扫描量热仪、傅里叶红外光谱、荧光光谱等技术对柿原花青素-黏蛋白复合物的理化特征及两者相互作用机制进行分析。结果表明：复合物的粒径、电位绝对值与柿原花青素及其结构单元（ECG、EGCG）的浓度呈正相关关系；柿原花青素酚羟基的引入使得黏蛋白的热稳定性、表面疏水性随其浓度的增加而减少；红外光谱显示，氢键及游离的氨基参与两者反应；柿原花青素及其结构单元可以有效猝灭黏蛋白的内源荧光，以静态猝灭为主；根据Van’t Hoff方程获得的热力学参数∆G<0，∆H<0，∆S<0，表明柿原花青素及其结构单元与黏蛋白的结合是吉布斯自由能减少的自发反应，主要由氢键及范德华力驱动。综上所述，柿原花青素及其结构单元的添加诱导黏蛋白结构发生变化，其与黏蛋白主要通过氢键和范德华力发生强烈的相互作用，该研究为设计提高柿原花青素在肠道中生物利用率的智能递送系统提供参考依据。Abstract: To determine the influence of mucin on the intestinal digestion and release of proanthocyanidins derived from persimmon, the physicochemical characteristics of persimmon proanthocyanidins-mucin complexes and the interaction mechanisms between persimmon proanthocyanidins and mucin were analyzed using laser particle size analyzer, differential scanning calorimetry, Fourier-transform infrared spectroscopy, and fluorescence spectroscopy. Results indicated that the particle size and absolute ζ-potential of the complexes were positively correlated with the concentrations of persimmon proanthocyanidins and their structural units (epicatechin gallate and epigallocatechin gallate). The introduction of phenolic hydroxyl groups from persimmon proanthocyanidins decreased the thermal stability and surface hydrophobicity of mucin with an increase in persimmon proanthocyanidins concentration. Infrared spectroscopy revealed that hydrogen bonding and free amino groups participated in the reaction between mucin and persimmon proanthocyanidins. It was also found that persimmon proanthocyanidins and their structural units effectively quenched the intrinsic fluorescence of mucin, with static quenching being the dominant mechanism. Thermodynamic parameter values obtained using the Van’t Hoff equation were ∆G<0, ∆H<0, ∆S<0, demonstrating that the binding of persimmon proanthocyanidins and their structural units with mucin was a spontaneous reaction with a decrease in Gibbs free energy and was primarily driven by hydrogen bonding and van der Waals forces. In summary, the addition of persimmon proanthocyanidins and their structural units induced changes in the mucin structure and strong interactions that were primarily attributed to hydrogen bonding and van der Waals forces. The findings can serve as a reference for the design of intelligent delivery systems to enhance the bioavailability of persimmon proanthocyanidins in the intestine.
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柿子起源于中国，其产量占世界柿果总量的73%，在过去的二十年中，其全球产量增加了5倍[1]。柿果富含原花青素类物质，且结构独特、聚合度高、分子量较大，以表儿茶素没食子酸酸酯（（-）-Epicatechin gallate，ECG）及表没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-Epigallocatechin gallate，EGCG）结构单元为主，通过C4-C8或C2-O-C7进行连接[2]。柿原花青素具有抗氧化、抗辐射、抗动脉粥样硬化、抑菌、降血糖、降血压、抗癌等多种生理活性[3]，其功效的发挥取决于原花青素在肠道中的生物可及性和生物利用率。但柿原花青素的高聚合度、低水溶性和稳定性等特点会限制其在肠道中的生物效价。
肠黏液层是肠道屏障非免疫部分的组成部分，是以黏蛋白为主体构成的水凝胶体系，可防止抗原、毒素和细菌直接接触肠上皮细胞，对维持肠道稳态至关重要[4]。黏蛋白（Mucin）由杯状细胞产生分泌，是一种有串联重复结构存在的高分子糖蛋白，黏蛋白2作为其中最主要的类型，已有研究发现其结构中存在可能与大分子发生相互作用的结合位点[5]。另外，黏蛋白可以通过C端的二聚化和N端的三聚化形成庞大的网状聚合物，与疏水、阳离子或羟基等基团产生亲和作用，并影响物质在肠道中的运输情况[6]。此外，黏蛋白具有优秀的生物相容性、安全性和生物降解性，已被用于制备运载多酚的智能靶向纳米复合物，包括纳米粒子、纳米胶囊、纳米乳液等，具有降低宿主胞吐、提高活性物质的肠道利用率等作用[7]。如黏蛋白可有效包封苹果多酚，使其免受消化道强酸及消化酶的影响[8]。基于黏蛋白构建的山荆子多酚纳米运载体系可实现酚类物质在小肠中的持续释放[9]。因此，以黏蛋白为基础材料设计功能因子肠道输送的运载体系，可能是解决原花青素类物质低生物利用的一种新策略，研究柿原花青素与黏蛋白的互作机制，对于了解原花青素类物质在肠道中转运也具有一定意义。
因此，本实验选取柿原花青素与黏蛋白为研究对象，制备柿原花青素-黏蛋白复合物，借助激光粒度仪、差示扫描量热仪、傅里叶红外光谱、荧光光谱等技术表征其理化特性，并分析柿原花青素及其结构单元与黏蛋白的作用机制，该研究为进一步了解黏蛋白对柿原花青素在肠道中输送及释放的影响提供理论基础，并为构建基于黏蛋白的原花青素类化合物纳米运载体系提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
恭城月柿（Diospyros kaki L.） 购于果蔬农贸市场；柿原花青素结构单元EGCG（纯度≥95%）、ECG（纯度≥95%） 购自江苏南京春秋生物有限公司；黏蛋白Type II、二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO） 购自Sigma-Aldrich试剂公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（Anilinonaphthalene sulfonates，ANS） 购自上海麦克林生化科技有限公司；盐酸、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钠等试剂 均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；NANO-ZS90马尔文激光粒度仪 英国Malvern有限公司；DSC Q20差示扫描量热仪 美国TA仪器公司；Jasco-815圆二色谱仪 美国Jasco公司；Vertex70傅里叶红外光谱仪 美国赛默飞公司；F-7000荧光分光光度计 日立科学仪器（北京）有限公司；XY-FD-18真空冷冻干燥机 上海欣谕仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 柿原花青素的制备
柿原花青素制备参考Zou等[10]的方法，将采摘的柿果在100 ℃的开水中热烫5 min，置于−20 ℃冷冻保存备用。采用1%的盐酸-甲醇（v:v）作为浸提液，按料液比1:8于80 ℃冷凝回流提取3次，每次40 min，合并浸提液，35 ℃旋蒸浓缩去除甲醇；浓缩液经AB-8大孔树脂吸附40 min，分别经纯水、15%乙醇溶液洗脱去除糖类、低分子量酚类化合物后，采用95%乙醇洗脱，收集洗脱液进行旋蒸浓缩，真空冷冻干燥后得到柿原花青素样品。以甲醛沉淀法测得柿原花青素的纯度为96.52%，经检测所得柿原花青素平均聚合度为26，平均分子量为10.7 kDa[11]。
1.2.2 柿原花青素及其结构单元-黏蛋白复合物的制备
将黏蛋白溶于PBS缓冲液（10 mmol/L，pH7.0）中，使其充分溶解，配制成浓度为2 mg/mL的黏蛋白储备液。将柿原花青素及其结构单元（EGCG、ECG）溶于DMSO中，使其充分溶解配制成浓度为160 mg/mL的储备液备用。
复合物制备：使用PBS缓冲液稀释柿原花青素及其结构单元（EGCG、ECG）储备液，与黏蛋白储备液按1:1（v:v）混合，使其终浓度分别为5、10、20、40、80 μg/mL工作液，黏蛋白终浓度为1 mg/mL，25 ℃振荡2 h。将制备好的样品，置于真空冷冻干燥机中冻干22 h，取出放入干燥皿中备用。
1.2.3 粒径及ζ-电位测定
将黏蛋白及其与柿原花青素的复合物分别置于NANO-ZS90马尔文激光粒度仪中进行测定，测定温度37 ℃，光散射角90°，每个样品重复测定3次，取平均值。
1.2.4 表面疏水性测定
参考Wang等[12]的方法并略作修改。取3 mL复合物溶液加入30 μL的8 mmol/L ANS溶液，室温下避光静置30 min后，采用荧光分光光度计进行检测，测定激发波长设置为390 nm，发射波长为475 nm。
1.2.5 热稳定性测定
参考Ebrahim等[13]的方法并略作修改。分别称取冻干后的复合物粉末3 mg，放置样品坩埚中并密封，以密封空铝盘作为参比。测试条件为升温范围为25~100 ℃，升温速率为10 ℃/min，记录每个样品的DSC曲线。利用TA60分析软件计算样品的变性峰温度（Td）、变性焓值（∆H）、起始温度（Ton）、终止温度（Toff）。
1.2.6 傅里叶变换红外光谱（FTIR）测定
制备傅里叶红外光谱所需样品，将KBr与冻干粉末样品按100:1的比例混合，用玛瑙研磨成均匀粉末进行红外光谱检测，分辨率4 cm−1，扫描范围为4000~400 cm−1，扫描64次。
1.2.7 荧光光谱分析
1.2.7.1 荧光光谱的测定
参考Huang等[14]的方法并略作修改。将黏蛋白储备液按1:1（v:v）滴加至柿原花青素及其结构单元工作液中，终浓度分别为5、10、20、40、80 μg/mL工作液，黏蛋白终浓度为1 mg/mL，充分振荡，水浴30 min，温度分别设置为291、298、310 K。荧光光谱仪参数设置：激发波长280 nm，发射波长320~500 nm。
1.2.7.2 荧光猝灭类型分析
利用Stern-Volmer方程[15]分析柿原花青素及其结构单元对黏蛋白的荧光猝灭类型。如式（1）所示：
F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q] (1) 式中：F为添加猝灭剂后的黏蛋白荧光强度；F0为无猝灭剂时黏蛋白的荧光强度；Kq为速率常数（L/（mol·s））；τ0为无猝灭剂时生物大分子的平均荧光寿命，取其值为10−8 s；[Q]为猝灭剂浓度（mol/L）；Ksv为Stern-Volmer猝灭常数（L/mol）。
1.2.7.3 结合位点及结合常数
黏蛋白与柿原花青素、ECG、EGCG相互作用过程中的结合位点及结合常数按式（2）计算[16]：
lg[(F0−F)/F]=lgKb+nlg[Q] (2) 式中：Kb为结合常数（L/mol）；n为结合位点数。
1.2.7.4 热力学参数
按式（3）、（4）[16]计算热力学参数：
lnKb=−ΔH/R+ΔS/R (3) ΔG=ΔH−TΔS (4) 式中：R为气体常数，约为8.314 J/（mol·K）；T为实验温度（K）；Kb为与温度T对应的结合常数（L/mol）；∆G为吉布斯自由能（kJ/mol）；∆H为焓变（kJ/mol）；∆S为熵变（J/（mol·K））。
1.3 数据处理
所有实验重复3次，数据结果以平均值±标准偏差表示，采用Origin8.5软件进行作图处理及数据分析，使用SPSS9.4软件进行统计分析，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 粒径分析
柿原花青素及其结构单元对黏蛋白粒径的影响如图1所示。黏蛋白的平均粒径为807±32 nm，与柿原花青素及其结构单元（EGCG、ECG）结合后，粒径增大，其中在相同浓度下柿原花青素对黏蛋白的影响最大，当柿原花青素添加量在80 μg/mL时复合物的粒径增加到1256±18 nm，其次为EGCG和ECG，当EGCG和ECG在80 μg/mL时复合物的粒径分别增加到1037±27、962±16 nm，表明复合物的粒径与原花青素的结构、聚合度等因素相关，高聚合度的柿原花青素会增强其对蛋白质的聚沉作用。复合物的粒径大小随着柿原花青素及其结构单元浓度的增加而增大，其中柿原花青素的影响最大。研究表明葡萄籽原花青素对玉米醇溶蛋白粒径的影响也与其浓度呈正相关关系[17]，与本实验研究结果一致。
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2.2 ζ-电位分析
采用ζ-电位描述蛋白质在溶液中的带电性质，可反映蛋白质复合物生成情况和蛋白构象改变等信息[18]。图2为柿原花青素及其结构单元对黏蛋白ζ-电位的影响，黏蛋白带负电荷，原始电位为−6.72±0.72 mV，与柿原花青素及其结构单元结合后ζ-电位绝对值增大，其中在相同浓度下柿原花青素对黏蛋白的影响最大，当柿原花青素添加量在80 μg/mL时复合物的ζ-电位绝对值增加到16.24±1.68 mV，黏蛋白表面电荷增加。Zhang等[19]研究发现柿原花青素二聚体造成PLA2表面负电荷增加是由于酚羟基去质子化而产生的。因此，黏蛋白表面负电荷的增加也有可能是由于柿原花青素及其结构单元等所引入的酚羟基去质子化后产生负电荷而引起的。另外，黏蛋白ζ-电位的改变也可能是由于原花青素与黏蛋白通过疏水相互作用，改变了黏蛋白的构象，使原来掩埋在分子内部的带电氨基酸残基暴露出来[20]。已有研究表明相比于带正电荷的纳米颗粒，带负电的纳米颗粒在肠道黏液层的黏附性较低，且滞留时间较短[21]，因此，柿原花青素与黏蛋白结合后，其所带负电荷将降低原花青素在黏液层中的黏附，使其更易穿越黏液层与肠上皮细胞接触。
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图 2 柿原花青素及其结构单元对黏蛋白ζ-电位的影响Figure 2. Effect of persimmon proanthocyanidins and their structural units on the ζ-potential of mucin2.3 表面疏水性分析
ANS可以与蛋白质中的疏水基团相结合，借助荧光光谱检测，以荧光强度来反映表面疏水性大小[22]。由图3可知，柿原花青素-黏蛋白复合物的荧光强度降低，黏蛋白的表面疏水性随着柿原花青素及其结构单元浓度的增加而降低，可能是因为柿原花青素及其结构单元与黏蛋白结合后，吸附于蛋白表面，引入大量羟基，从而降低了蛋白的表面疏水性[23]。另外，多酚通过与蛋白质疏水腔的氨基酸残基发生疏水相互作用，疏水性残基被掩埋，导致蛋白的疏水性下降[24]。
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图 3 柿原花青素及其结构单元对黏蛋白表面疏水性的影响Figure 3. Effect of persimmon proanthocyanidins and their structural units on the surface hydrophobicity of mucin2.4 热稳定分析
采用DSC分析柿原花青素及其结构单元-黏蛋白复合物的热稳定性。如表1所示，黏蛋白的热变性峰温度为69.15±0.58 ℃，与柿原花青素及其结构单元相互作用后，变性温度随着柿原花青素及其结构单元浓度的增加而降低，说明柿原花青素降低了黏蛋白的热稳定性，黏蛋白处于更易伸展的变性态。另外，酚羟基的引入可能会与蛋白分子骨架及侧链上的基团形成氢键，从而破坏或阻止蛋白质分子内氢键的形成，使得蛋白质热稳定性下降[25]。柿原花青素的添加（0~80 μg/mL）使得黏蛋白的变性焓从3.60 J/g降低至2.72 J/g，说明了柿原花青素的添加导致了非极性基团的暴露从而降低了蛋白的热稳定性。Zhang等[19]研究发现柿原花青素特征结构单元（A型连接ECG二聚体与A型连接EGCG二聚体）与磷脂酶A2等相互作用后，其热稳定性下降，并证实酚类物质的引入增加了蛋白多肽链的可移动性与柔性。
表 1 柿原花青素及其结构单元-黏蛋白复合物的变性温度及变性焓Table 1. Denaturation temperature and enthalpy of persimmon proanthocyanidins and their structural units-mucin complexes样品 浓度
（μg/mL）Ton（℃） Td（℃） Toff（℃） ΔH（J/g） 柿原花青
素-黏蛋白0 49.91±0.69a 69.15±0.58a 78.37±0.33a 3.60±0.07a 5 49.36±0.56ab 59.35±0.23b 68.36±0.32b 3.40±0.25a 10 48.96±0.48ab 58.36±0.24bc 67.96±0.29bc 3.01±0.09b 20 48.56±0.48ab 57.46±0.13cd 67.07±0.25c 2.97±0.63bc 40 47.81±0.40ab 56.65±0.49d 66.88±0.44c 2.92±0.52bc 80 47.13±0.31b 56.50±0.53d 66.02±0.49c 2.72±0.40c EGCG-
黏蛋白0 49.91±0.69a 69.15±0.58a 78.37±0.33a 3.60±0.07a 5 49.00±0.12a 61.60±0.25b 68.10±0.37b 3.12±0.06b 10 48.50±0.39ab 60.28±0.34bc 67.37±0.30b 2.86±0.05bc 20 48.00±0.28ab 59.36±0.31bc 66.85±0.43b 2.52±0.10c 40 47.65±0.17bc 58.12±0.68d 65.38±0.54c 2.36±0.12d 80 46.82±0.16c 56.70±0.37d 64.30±0.36c 1.87±0.10d ECG-
黏蛋白0 49.91±0.69a 69.15±0.58a 78.37±0.33a 3.60±0.07a 5 48.87±0.06a 61.32±0.27b 68.02±0.50b 3.52±0.05a 10 48.36±0.32a 60.83±0.22b 67.20±0.49b 3.35±0.05b 20 47.98±0.01ab 60.05±0.38bc 66.27±0.24bc 3.21±0.45bc 40 47.39±0.19c 59.28±0.38cd 65.72±0.16c 3.05±0.35c 80 46.52±0.24c 58.27±0.39d 64.26±0.27d 2.85±0.05d 注：同列中不同字母代表存在显著性差异（P<0.05）。 2.5 FTIR分析
利用FTIR进一步表征复合物的二级结构变化，结果见图4。酰胺I带（1600~1700 cm−1）和酰胺II带（1500~1600 cm−1）的光谱位移与蛋白质二级结构变化息息相关，酰胺A带（3300~3600 cm−1，N-H伸缩振动）通常可以表示蛋白分子内及分子间-H、O-H、C-H伸缩振动的强度[26]。柿原花青素及其结构单元与黏蛋白相互作用后，复合物的酰胺I带附近的吸收峰发生11~17 cm−1的位移，其中柿原花青素组蓝移程度最大，表明有更多的氢键参与相互作用，这可能是由于柿原花青素聚合度高，含有更多的羟基官能团[27]。柿原花青素及其结构单元-黏蛋白复合物在酰胺A带附近的吸收峰发生6~15 cm−1的位移，表明黏蛋白游离的氨基参与了反应。柿原花青素及其结构单元-黏蛋白复合物酰胺A带、酰胺I带均发生了位移，说明柿原花青素及其结构单元可能通过疏水相互作用、氢键等与蛋白质中的C=O、O-H结合，改变了蛋白质的二级结构[28]。
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2.6 荧光光谱分析
荧光光谱可用于表征蛋白质三级结构的变化。由图5可知，黏蛋白的最大发射波长为356 nm，主要是由黏蛋白的酪氨酸和色氨酸残基产生。随着柿原花青素及其结构单元浓度的增加，黏蛋白的荧光强度逐渐降低，并出现发射峰红移现象，表明黏蛋白与柿原花青素及其结构单元之间发生了强烈的相互作用。这是由于柿原花青素及其结构单元中均含有邻苯酚二级结构，其具有较强的氢键结合能力，与黏蛋白结合后，形成疏水性较低的复合物，因此荧光光谱出现红移[27]。因此，根据数据结果推测柿原花青素及其结构单元的芳香环与黏蛋白的色氨酸或酪氨酸残基结合，芳香族氨基酸残基微环境改变，极性增强，使黏蛋白的内源荧光发生猝灭[28−29]。
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图 5 柿原花青素及其结构单元对黏蛋白的荧光猝灭光谱图注：下标1. 291 K；2. 298 K；3. 310 K；1~6：0、5、10、20、40、80 μg/mL。Figure 5. Fluorescence quenching spectra of mucin by persimmon proanthocyanidins and their structural units2.7 荧光猝灭类型分析
蛋白质荧光猝灭类型可分为2种：一为静态猝灭，即为蛋白与猝灭剂形成非荧光络合物，二为动态猝灭，蛋白质与猝灭剂发生动态碰撞使荧光猝灭[30]。如图6所示，随着体系温度的升高，黏蛋白的荧光强度随着柿原花青素及其结构单元浓度的增大而降低，且温度越高，荧光强度降低幅度越大，表明温度对两者间的结合有明显的影响。以F0/F对[Q]作图，可得不同温度下柿原花青素及其结构单元对黏蛋白的Stern-Volmer方程曲线（图6），所得斜率即为猝灭常数Ksv（表2）。从表2可知，在291、298和310 K三个温度下，柿原花青素及其结构单元与黏蛋白结合形成复合物的猝灭常数Ksv逐渐增大，柿原花青素及其结构单元与黏蛋白结合形成复合物的速率常数Kq均大于动态猝灭中的最大碰撞猝灭常数（2.0×1010 L/（mol·s）），此结果与荧光图谱最大波长红移结果一致。一般情况下动态猝灭只是影响猝灭分子的激发态，而不会改变猝灭物质的吸收光谱[31]，因此，柿原花青素及其结构单元对黏蛋白的猝灭机制均以静态猝灭占主导地位。林金瓯等[32]发现EGCG与天然乳清蛋白的相互作用机制的研究中，EGCG对天然乳清蛋白的猝灭机制也属于静态猝灭。
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图 6 不同温度下柿原花青素及其结构单元与黏蛋白相互作用的Stern-Volmer方程曲线图Figure 6. Stern-Volmer diagram of persimmon proanthocyanidins and their structural units interacting with mucin at different temperatures2.8 结合常数与结合位点数
柿原花青素及其结构单元与黏蛋白的结合常数及结合位点可根据荧光强度lg[（F0−F）/F]对lg[Q]的线性关系（图7）求得。如表2所示，随着体系温度的升高，柿原花青素及其结构单元的结合常数逐渐降低，结合常数Kb均在107 L/mol以上，表明两者之间能形成稳定的复合物，由结合位点数n在1附近可知两者结合产生的复合物为1:1型。高瑾等[33]研究发现玉米醇溶蛋白与EGCG、ECG的Kb也均在107 L/mol以上，结合位点n也在1附近，两者结合产生的复合物为1:1型。
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图 7 不同温度下柿原花青素及其结构单元对黏蛋白相互作用的双对数曲线Figure 7. Double logarithmic plots of the interaction between persimmon proanthocyanidins and their structural units with mucin at different temperatures2.9 热力学分析
通过Van’t Hoff公式计算可得到相应的热力学参数，从而进一步判断蛋白与多酚间的相互作用力类型。一般氢键及范德华力作用体系∆H<0、∆S<0，疏水作用力的体系∆H>0、∆S>0，静电相互作用的体系∆H≈0、∆S>0[34]。根据表2可知，其∆G<0，表明两者之间的反应均为自发反应，同时根据∆H<0，可以确定柿原花青素、EGCG、ECG与黏蛋白的作用是放热反应。柿原花青素与黏蛋白结合的∆H小于EGCG、ECG组的∆H，表明在反应过程中，柿原花青素与黏蛋白的结合释放出更多的热量。∆S<0表明柿原花青素及其结构单元与黏蛋白在结合过程中的熵变减少，其中ECG与黏蛋白在结合过程中熵变减少的最多，其次为柿原花青素、EGCG。因此，根据∆H<0、∆S<0，柿原花青素及其结构单元与黏蛋白之间作用力主要是氢键和范德华力。
表 2 不同温度下柿原花青素及其结构单元与黏蛋白相互作用的结合常数、结合位点及热力学参数Table 2. Binding constants, binding sites and thermodynamic parameters of persimmon proanthocyanidins and their structural units interacting with mucin at different temperatures复合物 温度
（K）Ksv
（104 L/mol）Kq
（1012 L/（mol·s））Kb
（107 L/mol）n R2 △H
（kJ/mol）△G
（kJ/mol）△S
（J/（mol·K））柿原花青素-黏蛋白 291 8.52 8.52 9.92 1.18 0.97 −38.97 298 13.63 13.63 6.66 0.54 0.90 −60.51 −38.92 −73.57 310 27.96 27.96 2.21 0.38 0.91 −37.65 EGCG-黏蛋白 291 0.18 0.18 4.94 0.88 0.90 −37.28 298 0.23 0.23 3.65 0.74 0.94 −52.91 −37.46 −53.20 310 3.56 3.56 1.34 0.45 0.95 −36.36 ECG-黏蛋白 291 0.20 0.20 4.33 0.84 0.99 −36.97 298 0.26 0.26 3.84 0.81 0.99 −7.50 −37.56 −100.59 310 0.70 0.70 3.55 0.70 0.98 −38.87 3. 结论
原花青素类物质由于聚合度不同，其理化性质及与生物大分子间的相互作用机制存在较大区别，因此，本研究以柿原花青素及其结构单元为研究对象，对柿原花青素及其结构单元-黏蛋白复合物进行结构表征，并探索两者间的互作机制。结果发现柿原花青素及其结构单元的添加可改变黏蛋白的粒径、电位、表面疏水性、热稳定性等理化特性，傅里叶红外光谱表明柿原花青素诱导黏蛋白二级结构发生变化，与其结构单元相比，柿原花青素对黏蛋白的粒径、电位、二级结构的影响更大。根据荧光光谱分析发现柿原花青素及其结构单元与黏蛋白的结合以静态猝灭为主；从热力学参数可知两者间的相互作用是由焓驱动的自发结合，主要驱动力为氢键和范德华力。高聚合度促使柿原花青素与黏蛋白发生强烈的相互作用，该结果有助于构建以黏蛋白为运载材料的纳米递送体系，因此，两者间互作机制的研究可为原花青素的智能递送或新型功能性食品的开发提供一定的理论基础。
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图 2 柿原花青素及其结构单元对黏蛋白ζ-电位的影响
Figure 2. Effect of persimmon proanthocyanidins and their structural units on the ζ-potential of mucin
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图 3 柿原花青素及其结构单元对黏蛋白表面疏水性的影响
Figure 3. Effect of persimmon proanthocyanidins and their structural units on the surface hydrophobicity of mucin
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图 5 柿原花青素及其结构单元对黏蛋白的荧光猝灭光谱图
注：下标1. 291 K；2. 298 K；3. 310 K；1~6：0、5、10、20、40、80 μg/mL。
Figure 5. Fluorescence quenching spectra of mucin by persimmon proanthocyanidins and their structural units
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图 6 不同温度下柿原花青素及其结构单元与黏蛋白相互作用的Stern-Volmer方程曲线图
Figure 6. Stern-Volmer diagram of persimmon proanthocyanidins and their structural units interacting with mucin at different temperatures
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图 7 不同温度下柿原花青素及其结构单元对黏蛋白相互作用的双对数曲线
Figure 7. Double logarithmic plots of the interaction between persimmon proanthocyanidins and their structural units with mucin at different temperatures
表 1 柿原花青素及其结构单元-黏蛋白复合物的变性温度及变性焓
Table 1 Denaturation temperature and enthalpy of persimmon proanthocyanidins and their structural units-mucin complexes
样品 浓度
（μg/mL）Ton（℃） Td（℃） Toff（℃） ΔH（J/g） 柿原花青
素-黏蛋白0 49.91±0.69a 69.15±0.58a 78.37±0.33a 3.60±0.07a 5 49.36±0.56ab 59.35±0.23b 68.36±0.32b 3.40±0.25a 10 48.96±0.48ab 58.36±0.24bc 67.96±0.29bc 3.01±0.09b 20 48.56±0.48ab 57.46±0.13cd 67.07±0.25c 2.97±0.63bc 40 47.81±0.40ab 56.65±0.49d 66.88±0.44c 2.92±0.52bc 80 47.13±0.31b 56.50±0.53d 66.02±0.49c 2.72±0.40c EGCG-
黏蛋白0 49.91±0.69a 69.15±0.58a 78.37±0.33a 3.60±0.07a 5 49.00±0.12a 61.60±0.25b 68.10±0.37b 3.12±0.06b 10 48.50±0.39ab 60.28±0.34bc 67.37±0.30b 2.86±0.05bc 20 48.00±0.28ab 59.36±0.31bc 66.85±0.43b 2.52±0.10c 40 47.65±0.17bc 58.12±0.68d 65.38±0.54c 2.36±0.12d 80 46.82±0.16c 56.70±0.37d 64.30±0.36c 1.87±0.10d ECG-
黏蛋白0 49.91±0.69a 69.15±0.58a 78.37±0.33a 3.60±0.07a 5 48.87±0.06a 61.32±0.27b 68.02±0.50b 3.52±0.05a 10 48.36±0.32a 60.83±0.22b 67.20±0.49b 3.35±0.05b 20 47.98±0.01ab 60.05±0.38bc 66.27±0.24bc 3.21±0.45bc 40 47.39±0.19c 59.28±0.38cd 65.72±0.16c 3.05±0.35c 80 46.52±0.24c 58.27±0.39d 64.26±0.27d 2.85±0.05d 注：同列中不同字母代表存在显著性差异（P<0.05）。 
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表 2 不同温度下柿原花青素及其结构单元与黏蛋白相互作用的结合常数、结合位点及热力学参数
Table 2 Binding constants, binding sites and thermodynamic parameters of persimmon proanthocyanidins and their structural units interacting with mucin at different temperatures
复合物 温度
（K）Ksv
（104 L/mol）Kq
（1012 L/（mol·s））Kb
（107 L/mol）n R2 △H
（kJ/mol）△G
（kJ/mol）△S
（J/（mol·K））柿原花青素-黏蛋白 291 8.52 8.52 9.92 1.18 0.97 −38.97 298 13.63 13.63 6.66 0.54 0.90 −60.51 −38.92 −73.57 310 27.96 27.96 2.21 0.38 0.91 −37.65 EGCG-黏蛋白 291 0.18 0.18 4.94 0.88 0.90 −37.28 298 0.23 0.23 3.65 0.74 0.94 −52.91 −37.46 −53.20 310 3.56 3.56 1.34 0.45 0.95 −36.36 ECG-黏蛋白 291 0.20 0.20 4.33 0.84 0.99 −36.97 298 0.26 0.26 3.84 0.81 0.99 −7.50 −37.56 −100.59 310 0.70 0.70 3.55 0.70 0.98 −38.87
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