Preparation and Characterization of Nanocellulose from Ulva prolifera by Different Methods
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摘要: 以绿潮优势藻浒苔为原料，通过碱处理、漂白处理提取浒苔纤维素（UPC），得率为23.61%。采用硫酸水解法、盐酸水解法和2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基（TEMPO）氧化法分别制备浒苔纳米纤维素（UPCNC-S、UPCNC-H和UPCNC-T），通过得率、傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）、热重分析（Thermogravimetric analysis，TGA）、扫描电镜（Scanning electron microscopy，SEM）、粒径、电位、色度对不同方法制备的纳米纤维素的结构及微观形貌进行表征和比较。结果表明：三种制备方法得到的纳米纤维素得率分别为10.07%（UPCNC-S）、32.48%（UPCNC-H）和26.63%（UPCNC-T），其晶型和结构均未破坏，并且结晶度较纤维素均有所提高，分别为72.11%（UPCNC-S）、77.16%（UPCNC-H）和66.53%（UPCNC-T）。硫酸水解不利于纳米纤维素的热稳定性，而盐酸水解得到的UPCNC-H热稳定性最佳。UPCNC-T和UPCNC-H均呈现短棒状形貌，粒径尺寸分别集中在430 nm和610 nm附近，硫酸水解法能够制备出短棒状和部分球形纳米纤维素，粒径尺寸最小，主要分布在300~400 nm之间。三种纳米纤维素的Zeta电位值均小于−30 mV，悬浮液均具有较佳的稳定性。UPCNC-S的颜色略微偏黄，白度值最低，而UPCNC-H和UPCNC-T整体颜色较为洁白。综上，本研究制备的浒苔纳米纤维素具有结晶度高、分散性好、粒径尺寸小等优良特性，为实现绿潮浒苔的高值化利用提供了一定的理论基础。Abstract: Ulva prolifera, as the dominant species of the green macro-algal bloom, was used as the raw material to prepare cellulose (UPC) by alkali extraction and bleaching treatment with a yield of 23.61%. Nanocelluloses of UPCNC-S, UPCNC-H, and UPCNC-T were prepared using sulfuric acid hydrolysis, hydrochloric acid hydrolysis, and TEMPO oxidation methods, respectively. The structure and micro-morphology of the prepared nanocelluloses were characterized and compared based on yield, fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), X-ray diffraction (XRD), thermogravimetric analysis (TGA), scanning electron microscopy (SEM), particle size, zeta potential, and chromaticity value. The results showed that the yields of the nanocelluloses prepared by three methods were 10.07% of UPCNC-S, 32.48% of UPCNC-H, and 26.63% of UPCNC-T, respectively. All three methods did not damage the crystal form and the structure of the cellulose showed, an increase in crystallinity and reached 72.11% (UPCNC-S), 77.16% (UPCNC-H), and 66.53% (UPCNC-T). The thermal stability of nanocellulose UPCNC-S produced by sulfuric acid was to the weakest, while that of UPCNC-H was the optimal. In terms of morphological features, both UPCNC-T and UPCNC-H exhibited short-shaped morphology, with particle sizes concentrated around 430 nm and 610 nm, respectively. In addition to the short rod structure, partially spherical nanocellulose was produced by sulfuric acid hydrolysis, with the smallest particle sizes ranging from 300 nm to 400 nm. The Zeta potential values of the three types of nanocellulose were all less than −30 mV, indicating good stability in suspension. Besides, the color of UPCNC-S was slightly yellowish with the lowest whiteness value, while UPCNC-H and UPCNC-T both showed the whitish appearance. In summary, the nanocellulose prepared from Ulva prolifera in this study exhibited excellent characteristics such as high crystallinity, good dispersion, and small particle sizes, which would provide a theoretical basis for the high-value utilization of Ulva prolifera.
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Keywords:
- Ulva prolifera /
- nanocellulose /
- preparation /
- structure /
- characterization
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浒苔（Ulva prolifera）是一种大型绿藻，自2007年以来每年夏季都会在我国黄海海域大规模爆发，造成常态化绿潮灾害。浒苔绿潮爆发时间久、覆盖面积广，2021年其最大分布面积更是高达60000多平方千米，给附近沿海城市的旅游业、水产养殖及海洋生态等都带来了十分严重的影响[1]。因此，积极应对浒苔绿潮灾害、找寻对浒苔合适的开发利用方式，成为目前研究人员关注的方向。有研究者对浒苔化学组分进行研究，发现浒苔中富含碳水化合物，其中的水溶性多糖具有抗氧化、抗病毒、免疫调节等生物活性功能[2−3]，在功能食品、天然药物开发等领域具有应用前景。水溶性多糖提取之后仍剩余了较多不溶性的浒苔藻渣，其富含纤维素、半纤维素等成分[4]，但往往被当作废弃物填埋或丢弃，造成资源浪费。因此，在浒苔可溶性多糖被利用的同时，开发并利用浒苔纤维素，成为浒苔“变废为宝”的重要出路之一。
纳米纤维素是通过物理、化学或生物手段，将大分子纤维素降解为粒径尺寸较小的纳米级纤维或晶体，相较于纤维素具有高比表面积、高结晶度、高强度等特点，在材料、医疗、造纸、食品等领域均有十分广阔的应用空间[5]。目前制备纳米纤维素的方法主要有酸水解法、催化氧化法、酶水解法、离子液体法等，原料来源主要集中在木质或草本植物，对海藻纤维素的研究较少，对浒苔纳米纤维素的研究更是存在较多空白[6]。Zhang等[7]以浒苔为原料，采用机械研磨法制备纳米纤维素，但仅对其进行了红外光谱及扫描电镜的基础表征。王杰[8]以超声辅助盐酸水解的方式制备浒苔纳米纤化纤维素，但其主要关注不同改性方式对其结构上的影响，未尝试用其他方法制备纳米纤维素。
本研究以浒苔为原料，采用硫酸水解法、盐酸水解法、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基（TEMPO）氧化法三种经典方法制备浒苔纳米纤维素。通过傅里叶红外光谱、X射线衍射、热重分析、扫描电镜、粒径尺寸、电位、色度对所制备的纳米纤维素进行结构形貌及理化性质的表征，分析不同方法对纳米纤维素造成的影响，为研究浒苔纳米纤维素提供理论基础，也为生物量巨大的绿潮的资源化利用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
浒苔 2021年8月采集于山东省青岛市市南区第一海水浴场，经清水洗涤、铺平烘干、粉碎处理后过60目筛储存备用；氢氧化钠、过氧化氢（30%）、硫酸、盐酸等 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；TEMPO、溴化钠、次氯酸钠等 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。
Nicolet iS10傅立叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；D8 Advance X射线衍射仪 德国Bruker公司；Sigma 300扫描电子显微镜 德国ZEISS公司；TG 209热重分析仪 德国Netzsch公司；Nano ZS90纳米粒度分析仪 英国马尔文仪器公司；RM200QC便携式比色计 美国X-rite公司。
1.2 实验方法
1.2.1 浒苔基本成分测定
水分含量采用红外水分分析仪测定[9]。灰分采用550 ℃高温灼烧法测定[10]。蛋白质含量采用凯氏定氮法测定[11]。脂质含量根据石油醚浸提法测度[12]。水溶性多糖含量参考徐大伦等[13]的方法并进行适当修改。向浒苔粉中加入超纯水搅拌均匀（1:40，w/v），在120 ℃环境下高温高压提取2 h。冷却后将上清液倒出，加入80%乙醇冷藏过夜，最终将沉出的白色絮状物过滤、复溶、冻干即得浒苔水溶性多糖。水不溶性多糖含量采用差减法得出，即减去上述测得的基本成分含量后剩余部分为水不溶性多糖含量。
1.2.2 浒苔纤维素的提取
浒苔纤维素的提取参考Kazharska等[14]的方法并做出适当修改。称取20.000 g浒苔粉末置于烧杯中，加入5%的NaOH溶液（1:20，w/v），放在80 ℃水浴环境下搅拌反应2 h，去除浒苔中的蛋白质、半纤维素等物质。反应结束后，将悬浮液以4000 r/min的速度反复离心、洗涤，除掉多余的碱液直至pH为7.0。随后，将沉淀转移至烧杯中，加入7.5% H2O2溶液（1:20，w/v），放入60 ℃水浴锅搅拌反应2 h去除浒苔中的木质素和色素。同样以4000 r/min的速度多次离心、洗涤至中性，将下层白色沉淀进行冷冻干燥，48 h冻干结束后得到浒苔纤维素（Ulva prolifera cellulose，UPC），常温下密封储存。该方法提取的浒苔纤维素得率按公式（1）计算：
(1) 式中，YUPC，浒苔纤维素提取得率，%；m1，冻干后纤维素的质量，g；m，提取所消耗浒苔的质量，g；m2，浒苔中的水分质量，g。
1.2.3 浒苔纳米纤维素的制备
1.2.3.1 硫酸水解法
设计预实验，使用不同浓度的硫酸对浒苔纤维素进行水解。根据获得纳米纤维素的颜色、电位值等结果，最终参考Doh等[15]以褐藻马尾藻为原料制备纳米纤维素的方法并进行适当修改。将提取的浒苔纤维素加入51% H2SO4溶液（1:20，w/v）中，45 ℃下水解反应30 min。反应结束后加入过量的蒸馏水，离心、过滤并用1 mol/L NaOH溶液调节悬浮液pH至中性，随后透析48 h以去除多余的盐。最后，将得到的纳米纤维素悬浮液超声震荡15 min，冻干后即获得最终样品并命名为UPCNC-S。
1.2.3.2 盐酸水解法
参考Zhang等[16]以绿潮浒苔为原料制备纳米纤维素的方法并做出适当修改。将提取的浒苔纤维素加入5% HCl溶液（1:20，w/v）中，60 ℃下水解反应6 h。反应结束后多次离心、洗涤并调节悬浮液pH至中性，随后透析48 h以去除多余的盐。最后，将得到的纳米纤维素悬浮液超声震荡15 min，冻干后即获得最终样品并命名为UPCNC-H。
1.2.3.3 TEMPO氧化法
参考Wu等[17]以褐藻海带为原料制备纳米纤维素的方法并做出适当修改。将1.000 g浒苔纤维素和水混合配成一定比例的悬浮液（1:100，w/v），磁力搅拌直至分散均匀。加入0.016 g TEMPO、0.100 g NaBr，搅拌至完全溶解，随后逐滴加入10 mL 10%浓度的NaClO溶液，用NaOH溶液和HCl溶液控制反应体系的pH为10.5，15 min内pH不再变化即加入无水乙醇终止反应。经过三次离心、洗涤后，将得到的纳米纤维素悬浮液超声震荡15 min，冻干后即获得最终样品并命名为UPCNC-T。
将上述冻干后得到的纳米纤维素样品在干燥条件下进行称量，按照公式（2）计算样品得率。
(2) 式中，YCNC，浒苔纳米纤维素制备得率，%；m1，冻干后纤维素的质量，g；m2，冻干后纳米纤维素的质量，g。
1.2.4 浒苔纤维素及纳米纤维素性质表征
1.2.4.1 傅里叶红外光谱（FTIR）测定
将2 mg左右的样品同KBr粉末混合均匀并压制成薄片，于400~4000 cm−1波长区域内进行FTIR扫描，分辨率4 cm−1。
1.2.4.2 X射线衍射（XRD）测定
称取100 mg左右的样品研磨成粉末状，在2θ=5°~45°扫描范围内以5°/min的速度进行XRD扫描测试。利用Segal公式（3）对样品结晶度进行计算[18]。
(3) 式中，CrI，结晶度指数，%；I002，2θ=22°时（200晶面）的衍射峰强度，即结晶区衍射强度；Iam，2θ=18°附近的衍射峰强度，即无定型区衍射强度。
1.2.4.3 扫描电镜（SEM）测定
向样品中加入适量的蒸馏水配制成浓度为0.01%的悬浮液，超声30 min后使其分散均匀。将悬浮液滴在铜板上，经过冷冻干燥、喷金处理后用SEM观察样品的表面形貌特征。
1.2.4.4 热重分析（TGA）测定
称取5 mg左右的样品在N2气体氛围下进行热重测试，测试条件为：温度范围30~600 ℃，升温速率10 ℃/min，N2流量50 mL/min[19]。
1.2.4.5 粒径与Zeta电位测定
配制质量分数为0.01%的样品分散液，使用马尔文粒径仪对样品的粒径大小和Zeta电位值进行测定。
1.2.4.6 色度测定
将待测纤维素及纳米纤维素置于凹槽比色皿中铺平，盖好盖片，确保样品间无明显缝隙存在，使用比色计测量浒苔纤维素和三种纳米纤维素的L*、a*、b*值，并利用Hunter公式（4）计算出白度指数WI[20]。
(4) 1.3 数据处理
所有实验均重复三次取平均值，结果使用平均值±标准差的形式表示。采用统计学分析软件SPSS 23.0和Origin 2023进行数据分析和绘图，P<0.05表示具有显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 浒苔化学组成分析
浒苔中基本营养成分如表1所示。实验测得清洗、烘干后的浒苔样品含水量为6.39%，其余营养成分中，灰分和蛋白质含量分别占浒苔干基的16.04%和7.98%，脂质含量占比最低为0.88%。碳水化合物为浒苔的主要成分，占浒苔干基质量的75.10%，其中水不溶性多糖占比约为32.41%，与其他海藻的基本化学成分相比，浒苔中的水不溶性多糖含量较高（见表1），具有较高的利用价值。有研究表明，海藻中的水不溶性多糖以纤维质为主，其中木质素含量较低，有利于水解过程的进行[21]，相较木质素含量较高的陆生植物而言，从藻类植物中提取纤维素的过程相对容易且处理成本更低[22]。因此，浒苔纤维素具有较高的研究价值和广阔的应用前景。
表 1 浒苔及其他海藻的基本营养成分Table 1. Basic nutritional composition of Ulva prolifera and other seaweeds海藻种类 灰分（%） 粗脂肪（%） 粗蛋白（%） 碳水化合物（%） 参考文献 水溶性多糖（%） 水不溶性多糖（%） 浒苔 16.04±0.24 0.88±0.09 7.98±0.35 42.69±2.86 32.41±1.28 本研究 海带 43.48 1.27 8.20 22.22 24.83 [23−24] 裙带菜 35.32 1.87 14.31 28.78 19.72 [25] 羊栖菜 39.33 0.77 10.10 20.48 29.32 [25] 坛紫菜 36.00 0.50 24.69 18.50 20.31 [23,26] 龙须菜 21.00 0.73 30.00 27.80 20.47 [23,25] 缘管浒苔 36.97 1.60 6.35 38.90 16.18 [27] 石莼 30.09 1.11 22.03 20.22 26.55 [28−29] 注：表格中数值均以干基计算。 2.2 浒苔纤维素及三种纳米纤维素的制备得率
通过碱处理、漂白处理两步法，得到的浒苔纤维素得率为23.61%。该方法能够简单、快速地获得纯度较高的纤维素产品。从表2可知，三种纳米纤维素中，UPCNC-S、UPCNC-H和UPCNC-T的制备得率分别为10.07%、32.48%和26.63%。得率上的差异可能与三种方法的水解原理有关。酸水解法可以破坏纤维素大分子非结晶区中的糖苷键，保留结晶区部分，TEMPO氧化法则会使纤维素上的羟基被选择性氧化，以温和水解的形式改变纤维素的结构[30−31]。硫酸水解制备纳米纤维素的得率较低可能是因为高浓度的硫酸会使一部分纤维素水解为单糖等小分子，在洗涤过程中造成损失[31]。相较于其他研究，本文硫酸水解法得到的纳米纤维素得率较低，通过改变硫酸浓度、减小透析袋分子量等措施均未显著提升纳米纤维素得率，且发现高浓度硫酸水解会使纳米纤维素的颜色变深，影响后续利用，这可能与纳米纤维素的原料种类有关。Achaby等[19]以琼脂生产加工过程中得到的红藻（Gelidium sesquipedale）废弃物为原料制备纤维素，在64% H2SO4、50 ℃下分别水解30 min、40 min和80 min获得CNC30、CNC40和CNC80，其得率分别为13.76%、12.90%和11.18%（以红藻废弃物为基计算），本文实验结果与之相似。Zhang等[16]以浒苔为原料，用5% HCl水解提取得到的纤维素制备微纳米纤维素，最终得率为12%（以浒苔原料为基计算），相较本研究中的盐酸水解法得率偏高。
表 2 浒苔纤维素及三种纳米纤维素的得率、平均粒径和Zeta电位Table 2. Yield, average particle size, and zeta potential of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva prolifera样品 得率（%） 平均粒径（nm） Zeta电位（mV） UPC 23.61±1.61c − − UPCNC-S 10.07±1.82d 522.27±13.07c −36.20±1.73b UPCNC-H 32.48±1.53a 951.60±45.76a −21.97±1.20a UPCNC-T 26.63±1.24b 730.70±24.78b −40.30±2.09c 注：同列标有不同小写字母表示具有显著性差异（P<0.05）；UPC，浒苔纤维素；UPCNC-S，硫酸水解法制备的浒苔纳米纤维素；UPCNC-H，盐酸水解法制备的浒苔纳米纤维素；UPCNC-T，TEMPO氧化法制备的浒苔纳米纤维素。 2.3 浒苔、浒苔纤维素及三种纳米纤维素傅里叶变换红外光谱分析
浒苔、浒苔纤维素和制备的三种纳米纤维素的红外光谱图如图1所示。3420 cm−1附近呈现的宽峰代表纤维素中–OH伸缩振动，2920 cm−1和1050 cm−1处的吸收峰分别代表亚甲基中C–H和吡喃糖环中C–O–C的伸缩振动[32]，900 cm−1处的吸收峰与β-糖苷键弯曲振动有关[33]。以上吸收峰在所有样品谱图中均有出现，说明所制备的浒苔纤维素和纳米纤维素均保留了纤维素结构。此外，在浒苔纤维素及纳米纤维素谱图中，1535 cm−1附近代表蛋白酰胺结构中N–H弯曲振动和木质素芳香环内C=C双键伸缩振动的吸收峰明显减弱或消失[14,34]，1737 cm−1处表征半纤维素中木聚糖乙酰基上的C=O拉伸振动峰基本消失[35−36]，表示在制备过程中蛋白质、木质素、半纤维素等非纤维素物质均被去除。
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与此同时，UPCNC-S谱图中1120 cm−1处出现的小峰是硫酸基S=O伸缩振动的结果，UPCNC-T在1615 cm−1处出现较为明显的羧基吸收峰[37]，证明TEMPO氧化法可以将纤维素分子中的羟基氧化为羧基。相较原料浒苔和提取的纤维素样品，UPCNC-S和UPCNC-H在位于3420 cm−1的–OH吸收峰处均呈现出较大、较深的峰强度，这是因为在制备过程中纤维素中的氢键发生断裂，暴露出更多的–OH基团，而UPCNC-T在该波段处的峰强与另两种纳米纤维素相比较弱，可能与部分–OH被氧化成–COOH有关[38]。
2.4 浒苔纤维素及三种纳米纤维素X射线衍射分析
图2是浒苔纤维素和三种纳米纤维素的X射线衍射图谱。从图2中可以看出，所有样品在2θ=22°位置处均有一个较强的衍射峰，而三种纳米纤维素在2θ=31.8°处峰型尖锐，其中UPCNC-S和UPCNC-H在2θ=15.6°处可以观察到一个微弱的衍射峰。以上三处衍射峰是纤维素I型的特征晶面峰，分别代表纤维素中的（200）、（004）和（110）晶面[39]，说明三种制备纳米纤维素的方法均未破坏浒苔中的纤维素结构，与傅里叶红外光谱结果相一致。UPC图像中仅能观察到一个特征峰，可能与浒苔纤维素存在较多无定型区有关[40]。两种酸法制备的纳米纤维素在2θ=22°处的衍射峰强度明显增强，证明结晶度有所提高。利用式（3）计算结晶度可以得出，UPC的结晶度为55.29%，三种纳米纤维素的结晶度相较浒苔纤维素均有所提高，分别为72.11%（UPCNC-S）、77.16%（UPCNC-H）和66.53%（UPCNC-T），说明纳米纤维素制备过程中，无定型区被部分或完全去除，纤维素分子中结晶区比例升高，使纳米纤维素的结晶度整体提高。而UPCNC-T的结晶度相对较低，可能是TEMPO氧化过程中不仅去除了无定型区，还破坏了部分纤维素结晶区[34]。与其他陆生植物纤维素晶型谱图不同，本文在2θ=31.8°（004晶面）衍射峰十分尖锐，而2θ=15.6°（110晶面）衍射峰强度很低，纤维素晶型结构相对不明显，且经过多次方案调整、样品均一化重复检测后均为相似峰型，分析可能与原料相互间的差异有关。Zhang等[16]计算得出，盐酸法制备的浒苔纳米纤维素结晶度相较于纤维素提升了24.42%，Kazharska等[14]采用不同浓度的硫酸制备浒苔纳米纤维素，其结晶度最大提升了22.88%，本研究结果均与之相似。以上研究中浒苔纳米纤维素在110晶面位置的衍射峰较陆生植物而言均相对较弱，未来关于海藻纤维素仍需深入研究。
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图 2 浒苔纤维素和三种纳米纤维素的XRD图Figure 2. X-ray diffractogram of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva prolifera2.5 浒苔纤维素及三种纳米纤维素扫描电镜分析
通过扫描电镜图像可以分析浒苔纤维素和不同方法制备的浒苔纳米纤维素在微观形貌上的差异。从图3a中可以看出，UPC表面有规整的网格状结构。图3b表明，部分纤维束表面存在较多褶皱并聚集着部分纤维素颗粒，整体较为粗糙，直径可达十几微米。对比降解前后的电镜结果可知，三种纳米纤维素整体粒径尺寸均明显小于UPC，这与粒径测量结果一致，证明三种制备方法均能有效降低纤维素的尺寸大小。此外，不同方法制备的纳米纤维素在形貌上有所差别。如图3c~图3d展示了UPCNC-S的两种纳米纤维素形态，绝大多数UPCNC-S呈现短棒状结构（图3c），少量则呈现球形形态（图3d）；而图3e~图3f显示，UPCNC-H和UPCNC-T整体呈现短棒状形貌特点。有研究者发现硫酸水解纤维素可以制备出短棒状或针状的晶体物质，若辅以一些机械手段如超声、均质等，可以制备出近似球形的纳米纤维素，具有粒度均匀、聚集密度大、吸附性能好等优点[41]。Trilokesh等[42]将得到的菠萝蜜果皮纤维素在65% H2SO4、37 ℃下水解1 h，经过离心、透析（12~14 kD）及水浴超声后，获得了球形纳米纤维素晶体，本文制备方法与之类似。这可能是因为超声或均质过程会使纳米纤维素内外同时发生水解反应，从而使短棒状结构进一步发生松动，同时，空化作用产生的气泡在破裂时会破坏纤维素结构中的部分能量较低的键，使纳米纤维素粒度进一步减小，易形成球状结构[41]。
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图 3 UPC（a~b）、UPCNC-S（c~d）、UPCNC-H（e）、UPCNC-T（f）的扫描电镜图Figure 3. SEM images of cellulose (a~b), UPCNC-S (c~d), UPCNC-H (e) and UPCNC-T (f) from Ulva proliferaZhang等[7]对机械法制备的浒苔纳米纤维素进行扫描电镜分析，发现研磨获得的CNC主要为圆形或短棒颗粒，容易因为粒子间的氢键作用而产生聚集现象。Kazharska等[14]使用不同浓度的硫酸水解浒苔纤维素，发现较低浓度硫酸水解得到的纳米纤维素形态呈现短小、粗糙的晶体结构，而高浓度硫酸水解得到的纳米纤维素则是更加纤长、光滑的针状结构，其长径比高达59。Zhang等[16]通过盐酸水解制备浒苔微纳米纤维素，通过透射电镜测量其为长径比8.8的棒状结构。本文结果可以对浒苔纳米纤维素的结构观察起到补充作用，有利于后续选择不同方法制备不同形态需求的纳米纤维素。
2.6 浒苔纤维素及三种纳米纤维素热重分析
浒苔纤维素和三种纳米纤维素的TG和DTG曲线如图4所示。TG图可以反应样品重量随温度变化的关系，图中各样品的重量损失可以大致分为三个阶段，分别是30~120 ℃、120~450 ℃和450~600 ℃。120 ℃以下质量的初始下降主要是样品表面吸附的水分蒸发所导致，而在120~450 ℃温度阶段，各样品质量快速下降，这一现象是纤维素和纳米纤维素在高温环境下发生自身热解引起的。第三阶段是在温度达到450 ℃以后，纤维素分子链继续分解但速率放缓，最终碳质残留物继续燃烧带来质量损失[43−44]。从图中可以看出，三种纳米纤维素发生主要质量损失时的初始温度分别为156 ℃（UPCNC-S）、212 ℃（UPCNC-H）和183 ℃（UPCNC-T），其中UPCNC-H和UPCNC-T的降解温度较UPC（167 ℃）相比有所升高，证明这两种方法制备的纳米纤维素热稳定性较好且UPCNC-H热稳定性最佳，与Tarchoun等[45]的研究结果一致。而UPCNC-S的降解温度低于UPC，说明硫酸水解过程对纳米纤维素的热稳定性有不利影响。Kargarzadeh等[46]的研究中也发现了同样的现象，以65%浓度的H2SO4溶液水解红麻韧皮纤维，发现得到的纳米纤维素的热稳定性均低于原纤维素，且热解温度随着水解时间的延长而降低，分析原因可能是高浓度硫酸水解过程引入磺酸酯团，降低纤维素水解过程的活化能，与傅里叶红外光谱结果相一致。同时较为剧烈的水解条件使浒苔纤维素的分子量快速下降，无定型区和部分有缺陷的结晶区均被破坏，使得到的纳米纤维素热稳定性有所下降[43,47]。扫描电镜结果中，UPCNC-S出现部分粒径尺寸较小的球形纳米纤维素，也可以证明硫酸水解可以剧烈破坏纤维素非晶区结构，影响纳米纤维素的热稳定性。
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图 4 浒苔纤维素及三种纳米纤维素的TG（a）和DTG（b）图Figure 4. TG (a) and DTG (b) curves of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva proliferaDTG图反映了样品的质量损失速率随温度变化的关系。浒苔纤维素及三种纳米纤维素降解速率最大时的热分解温度分别为232 ℃（UPC）、324 ℃（UPCNC-H）和250 ℃（UPCNC-T），其中UPCNC-S出现两个降解阶段，分别与纤维素中葡萄糖脱水和糖苷键的断裂有关[48]，对应降解峰的峰谷温度为208、289 ℃，与TG曲线图的变化趋势相似，二者共同证明了盐酸水解和TEMPO氧化处理可以提高浒苔纳米纤维素的热稳定性，而硫酸水解会使纳米纤维素的热稳定性变差。
2.7 三种浒苔纳米纤维素粒径与Zeta电位分析
表2和图5分别展示了三种纳米纤维素的平均粒径尺寸和粒径分布拟合曲线图。可以看出，不同的制备方法会影响最终纳米纤维素的粒径尺寸。三种纳米纤维素中，UPCNC-S的粒径尺寸分布范围最广，主要集中在300~400 nm之间，其平均粒径尺寸在三种纳米纤维素中最小为522.27 nm，这可以归因于高浓度硫酸较强的水解能力使大部分无定型区发生断裂，从而使大分子纤维素酸解成较多更小尺寸的纳米纤维素。UPCNC-T的粒径尺寸分布较为集中，主要在430 nm附近，UPCNC-H的粒径尺寸集中区域数值最大，达到610 nm，这可能与UPCNC-H在水中易发生聚集有关。粒径分布图与平均尺寸有一定差异的原因可能是部分纤维素大分子未分解完全，造成个别粒子粒径较大，且在测量过程中，部分纳米纤维素会产生聚集现象，影响平均粒径的测量[37]。Zhang等[16]采用5% HCl水解浒苔纤维素得到微纳米纤维素悬浮液，平均粒径尺寸大于1 μm，分析其原因可能与纤维素十分容易自发团聚有关。Zhang等[7]同样以浒苔为原料，采用机械研磨法制备CNC，粒径尺寸范围集中在500 nm~2 μm。陈欢等[37]通过原子力显微镜拍摄并测量了柑橘纳米纤维素的平均粒径，发现随着TEMPO质量摩尔浓度的提高，纤维素的粒径尺寸由>10 μm减小为540.70 nm。和以上研究相比，本文采用的三种制备纳米纤维素的方法均能够有效降低纤维素的粒径尺寸，达到制备纳米纤维素的目的和效果。
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图 5 三种纳米纤维素的粒径分布图Figure 5. Distribution of particle size of three types of nanocellulose from Ulva proliferaZeta电位值可以用来分析分散体系的稳定性，一般而言绝对值大于25 mV的分散体系被认为是稳定的[20]。从表2中数据可以看出，三种纳米纤维素的电位值均为负值，这与其表面富含带负电荷的羟基基团有关。UPCNC-T和UPCNC-S的电位值绝对值都大于30，其中UPCNC-T的电位值绝对值最大为40.30 mV，证明这两种纳米纤维素的悬浮液体系均较为稳定。而UPCNC-H的电位值绝对值最小为21.97 mV，相较于另两种纳米纤维素而言悬浮液稳定性较差，会出现少量凝絮现象。这可能与盐酸水解不能为CNC表面提供较多电荷有关。有研究表明，硫酸水解纤维素的过程可以在CNC表面引入硫酸基团，增强CNC分子之间的静电斥力从而达到较好的分散效果[49]。Doh等[15]以51%硫酸水解制备得到的褐藻纳米纤维素，其Zeta电位值测量为−37.40 mV，本文测量数值与之相近。Cudjoe等[50]以巨芒为原料，使用不同方法制备纳米纤维素，发现硫酸水解法制备的MxG-CNC-OSO3−和TEMPO氧化法制备的MxG-CNC-COOH在以水为溶剂的环境下均能保持长时间的分散，且MxG-CNC-COOH的最大分散浓度比MxG-CNC-OSO3−高，本文研究结果与之一致。
2.8 浒苔纤维素及三种纳米纤维素色度分析
利用Lab颜色空间对制备的浒苔纤维素和三种纳米纤维素进行颜色表征，其中L*值代表亮度，数值越大亮度越高；a*代表红绿值，a*>0代表颜色偏红，a*<0代表颜色偏绿；b*代表黄蓝值，b*>0代表颜色偏黄，b*<0代表颜色偏蓝[51]。从表3中可以看出，相较于浒苔纤维素，UPCNC-S和UPCNC-T的亮度值略低，而UPCNC-S的a*值和b*值较其他两种纳米纤维素显著偏大（P<0.05），说明硫酸水解法制备的纳米纤维素成品偏红、偏黄，与实际观察结果相一致（见图6）。UPCNC-T的a*值为负，证明颜色略微偏绿。根据Hunter公式计算样品的白度值，数值越接近100代表颜色越接近标准白度。从表3中可以看出，提取的浒苔纤维素白度值最高为88.16，证明该提取方法可以有效去除浒苔中原有的色素。三种纳米纤维素中，UPCNC-H、UPCNC-T的白度值均在80.00以上，肉眼观察与纤维素颜色差别不大。UPCNC-S的白度值最低为76.81，这可能与高浓度硫酸较强的水解能力有关。Zhang等[16]在NaClO2和CH3COOH混合体系下对浒苔粉末进行漂白处理，并且使用5% HCl对样品进行水解，所得到的纤维素及纳米纤维素呈现浅黄褐色。Achaby等[19]以红藻废料为原料，通过高浓度硫酸法最终制备出了纯白色的纳米纤维素。不同研究中纳米纤维素颜色的差异可能与纳米纤维素的原料及制备过程的温度、时间等因素有关。综上所述，本文中制备得到的纳米纤维素白度值均大于75.00，颜色较浅，有利于后续的加工及应用。
表 3 浒苔纤维素和三种纳米纤维素的L*、a*、b*值及白度值Table 3. L*, a*, b* and WI values of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva prolifera样品 L* a* b* WI UPC 88.96±1.04a 0.27±0.15b 3.73±0.32c 88.16±0.85a UPCNC-S 83.18±0.75b 1.14±0.40a 15.90±0.86a 76.81±0.75c UPCNC-H 88.30±0.62a 0.13±0.05b 5.82±0.15b 86.93±0.55a UPCNC-T 83.90±1.80b −0.84±0.27c 3.27±0.29c 83.54±1.78b 注：同列不同小写字母表示各数值的显著性差异（P<0.05）。 ![]()
图 6 浒苔纤维素和三种纳米纤维素的样品实物图Figure 6. Sample physical images of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva prolifera3. 结论
本文以绿潮浒苔为原料，通过硫酸水解法、盐酸水解法和TEMPO氧化法三种方法制备纳米纤维素。三种纳米纤维素均保留I型纤维素结构，结晶度明显提高，其中UPCNC-H结晶度最高达77.16%。UPCNC-H和UPCNC-T的热稳定性较浒苔纤维素有所升高，而UPCNC-S的热分解温度则有所下降。三种纳米纤维素的平均粒径均小于1 μm，大多呈短棒状形貌，UPCNC-S有少部分呈球形，且粒径尺寸最小，主要集中在300~400 nm。所有纳米纤维素在水中均较为稳定，UPCNC-T的Zeta电位绝对值最大为40.30 mV。外观上，UPCNC-S样品颜色偏黄，UPCNC-H和UPCNC-T样品白度值较高。整体实验表明，浒苔可作为天然纤维素的来源之一，其纳米纤维素晶体具有结晶度高、粒径尺寸小、分散性高等优点，在食品包装、复合材料、生物医药等多个领域均有广泛的应用前景。
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图 2 浒苔纤维素和三种纳米纤维素的XRD图
Figure 2. X-ray diffractogram of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva prolifera
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图 3 UPC（a~b）、UPCNC-S（c~d）、UPCNC-H（e）、UPCNC-T（f）的扫描电镜图
Figure 3. SEM images of cellulose (a~b), UPCNC-S (c~d), UPCNC-H (e) and UPCNC-T (f) from Ulva prolifera
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图 4 浒苔纤维素及三种纳米纤维素的TG（a）和DTG（b）图
Figure 4. TG (a) and DTG (b) curves of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva prolifera
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图 5 三种纳米纤维素的粒径分布图
Figure 5. Distribution of particle size of three types of nanocellulose from Ulva prolifera
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图 6 浒苔纤维素和三种纳米纤维素的样品实物图
Figure 6. Sample physical images of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva prolifera
表 1 浒苔及其他海藻的基本营养成分
Table 1 Basic nutritional composition of Ulva prolifera and other seaweeds
海藻种类 灰分（%） 粗脂肪（%） 粗蛋白（%） 碳水化合物（%） 参考文献 水溶性多糖（%） 水不溶性多糖（%） 浒苔 16.04±0.24 0.88±0.09 7.98±0.35 42.69±2.86 32.41±1.28 本研究 海带 43.48 1.27 8.20 22.22 24.83 [23−24] 裙带菜 35.32 1.87 14.31 28.78 19.72 [25] 羊栖菜 39.33 0.77 10.10 20.48 29.32 [25] 坛紫菜 36.00 0.50 24.69 18.50 20.31 [23,26] 龙须菜 21.00 0.73 30.00 27.80 20.47 [23,25] 缘管浒苔 36.97 1.60 6.35 38.90 16.18 [27] 石莼 30.09 1.11 22.03 20.22 26.55 [28−29] 注：表格中数值均以干基计算。 
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表 2 浒苔纤维素及三种纳米纤维素的得率、平均粒径和Zeta电位
Table 2 Yield, average particle size, and zeta potential of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva prolifera
样品 得率（%） 平均粒径（nm） Zeta电位（mV） UPC 23.61±1.61c − − UPCNC-S 10.07±1.82d 522.27±13.07c −36.20±1.73b UPCNC-H 32.48±1.53a 951.60±45.76a −21.97±1.20a UPCNC-T 26.63±1.24b 730.70±24.78b −40.30±2.09c 注：同列标有不同小写字母表示具有显著性差异（P<0.05）；UPC，浒苔纤维素；UPCNC-S，硫酸水解法制备的浒苔纳米纤维素；UPCNC-H，盐酸水解法制备的浒苔纳米纤维素；UPCNC-T，TEMPO氧化法制备的浒苔纳米纤维素。
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表 3 浒苔纤维素和三种纳米纤维素的L*、a*、b*值及白度值
Table 3 L*, a*, b* and WI values of cellulose and three types of nanocellulose from Ulva prolifera
样品 L* a* b* WI UPC 88.96±1.04a 0.27±0.15b 3.73±0.32c 88.16±0.85a UPCNC-S 83.18±0.75b 1.14±0.40a 15.90±0.86a 76.81±0.75c UPCNC-H 88.30±0.62a 0.13±0.05b 5.82±0.15b 86.93±0.55a UPCNC-T 83.90±1.80b −0.84±0.27c 3.27±0.29c 83.54±1.78b 注：同列不同小写字母表示各数值的显著性差异（P<0.05）。
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