Improvement Effect and Mechanism of Total Flavonoids of Chuju on Hypercholesterolemia
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摘要: 目的：探究滁菊总黄酮对小鼠高脂饮食所致高胆固醇血症的改善作用，并通过网络药理学初步分析其作用机制。方法：采用高脂饲料构建小鼠高胆固醇血症模型，按照低、中、高（50、100、200 mg/kg）剂量分别灌胃给药，同时设置正常对照组、水飞蓟组及模型组。实验结束后检测相关血液生化指标，并取肝脏进行病理学检查，根据实验结果结合网络药理学实验初步筛选滁菊总黄酮改善高胆固醇血症的关键靶点及通路，预测其可能的作用机制。结果：高剂量给药组（200 mg/kg）与模型组相比，总胆固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平显著下降，谷丙转氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）活性显著降低，超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活性显著增高（P<0.05）。肝组织病理切片显示，与模型组相比，给药组小鼠肝细胞空泡水肿、炎性细胞浸润情况和脂滴明显减少。通过网络药理学从滁菊总黄酮中共筛选出异泽兰黄素、金合欢素等13个关键活性成分，以及AKT1、GAPDH、TNF等50个关键靶点，推测滁菊总黄酮可能通过PI3K-AKT信号通路、内分泌抵抗通路等改善高胆固醇血症。结论：滁菊总黄酮对高脂饲料所致小鼠高胆固醇血症具有一定的改善作用，其作用机制可能是13种关键成分作用于50个关键靶点上，通过PI3K-AKT信号通路等关键通路，起到抗氧化和减少脂质过氧化物产生的作用，从而避免了胆固醇在体内的过度蓄积。Abstract: Objective: To investigate the improvement effect of total flavonoids of Chuju (Chrysanthemum morifolium) on hypercholesterolemia induced by a high-fat diet in mice and explore its mechanism through network pharmacology. Methods: A well-established mouse model of hypercholesterolemia was established using a high-fat diet, administered intragastrically at low, medium or high (50, 100, 200 mg/kg) doses, together with normal control group, milk thistle group and model group. After completing the feeding interventions, appropriately related blood biochemical indexes were analyzed, and the liver was harvested for pathological examination. The results of these investigations were combined with network pharmacological experiments, and key targets and pathways of total flavonoids of Chuju in improving hypercholesterolemia were preliminarily screened, and its possible mechanism was predicted. Results: Compared with the model group, the levels of TC, LDL-C and MDA decreased significantly, ALT and AST activities decreased significantly, and the activities of SOD and GSH-Px increased significantly in the high dose administration group (P<0.05). Pathological sections of liver tissue showed that compared with the model group, the vacuolar edema, inflammatory cell infiltration and lipid droplets of hepatocytes in the administration group were significantly reduced. Through network pharmacology, 13 key active components such as isoprenin and acacetin and 50 key targets such as AKT1, GAPDH, TNF were screened from the total flavonoids of Chuju. Ultimately, it was postulated that the total flavonoids of Chuju might improve hypercholesterolemia through the PI3K-AKT signaling pathway and endocrine resistance pathway. Conclusion: Total flavonoids of Chuju improved hypercholesterolemia induced by a high-fat diet in mice. The mechanism of action appeared to involve 13 key components acting on 50 targets, which played an antioxidant role and reduced lipid peroxide production through key pathways such as the PI3K-AKT signaling pathway. The final result was prevention of excessive cholesterol accumulation in vivo.
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高胆固醇血症作为高脂血症中的一种，是脂质或脂蛋白水平异常所导致的代谢紊乱疾病，其特点是血清（或血浆）中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇高于正常值。高胆固醇血症也是冠心病的主要诱发因素，有研究表明，血清总胆固醇水平降低1%，致命冠心病的发病率至少降低2%，血清总胆固醇水平平均降低10%，可降低非致死性和致死性心肌梗死的发病率[1−2]，因此血清胆固醇的控制是预防动脉粥样硬化性心血管疾病的中心目标[3]。Wu等[4]的研究发现肝脏的氧化应激是导致高胆固醇血症的主要原因之一，由此可见控制肝脏的氧化应激反应，可能是治疗高胆固醇血症的有效途径之一。目前，临床对于高胆固醇血症的治疗主要采用口服他汀类、贝特类等化学药物，这些化学药物虽在降血脂方面具有一定疗效，但长期使用此类药物可能会产生较大的副作用。因此，迫切需要寻找毒副作用小的天然药物。
现代研究表明，菊花具有较好的降血脂作用。Cui等[5]研究发现野菊花提取物可显著降低高脂饲料诱导的小鼠模型血清中胆固醇的含量。Cha等[6]研究证实菊花50%乙醇提取物可显著降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠的体重和血清脂质谱。滁菊是药用菊花的一种，在中医临床中常被用于治疗肝阳上亢所致的头晕目眩、高血压、高血脂、冠心病等症[7]。滁菊中含有挥发油、类黄酮、多糖和氨基酸等多种化合物[8−10]。本课题组在前期的研究中发现，滁菊总黄酮具有较显著的抗氧化应激作用[11]。
因此，本研究从滁菊总黄酮对高胆固醇血症的药效学研究出发，结合网络药理学探究其改善高胆固醇血症的潜在作用机制并通过分子对接进行验证，为后期研究提供理论及实验参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
60只SPF级KM小鼠 体质量（20±2）g，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物生产许可证：SCXK（鲁）20190003，动物合格证号：NO.3707266221101099349，正常饮水摄食；滁菊 滁州菊泰工贸有限公司，由亳州学院中药教研室孟祥松老师鉴定为正品滁菊；水飞蓟宾胶囊 20230203，晋城海斯制药有限公司；高脂饲料 20230530，协同生物科技有限公司；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒（20230810）、总胆固醇（TCH/T-CHO）测定试剂盒（20230728）、丙氨酸氨基转移酶（谷丙转氨酶/ALT/GPT）测定试剂盒（2023072）、天门冬氨酸氨基转移酶（谷草转氨酶/AST/GOT）测定试剂盒（20230729）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（20230727）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（20160824）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（20160824） 南京建成生物工程研究所；油红O染色液（G1015） 武汉赛维尔生物科技有限公司。
XPR2电子分析天平 梅特勒托利多科技（中国）有限公司；UV-1900i紫外可见分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；SPL-150生化培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州越欣仪器制造有限公司；JW-2019HR台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Genie-U12型超纯水机 上海乐枫生物科技有限公司；YD-12P单吊篮组织脱水机、YD-6L生物组织冷冻包埋 金华市益迪医疗设备有限公司；PM30冷冻切片机 浦和云检（沈阳）医疗科技有限公司；Axio Vert.a1倒置显微镜 德国蔡司；SpectraMax iD3酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 滁菊总黄酮的提取与纯化
采用超声提取法提取滁菊总黄酮[12]。称取滁菊粉末25 g加入烧杯中，加入20倍体积的70%乙醇，浸泡20 min，60 ℃超声波提取40 min，抽滤。旋转蒸发回收乙醇并浓缩，浓缩液过D-101大孔树脂柱，先用纯水洗去杂质，再用70%的乙醇以1 BV/h的流速洗脱，收集洗脱液浓缩，经冷冻干燥后，测总黄酮含量为86.60%，4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 滁菊总黄酮改善高胆固醇血症药理作用
1.2.2.1 分组与给药
60只SPF级KM小鼠随机分为正常对照组、模型组、滁菊总黄酮低、中、高（根据前期滁菊总黄酮安全性实验结果，分别设为50、100、200 mg/kg）剂量组、水飞蓟组（36 mg/kg，根据说明书上人的使用剂量换算得出），每组10只。适应性喂养1周，正常对照组小鼠给予普通饲料，其余各组小鼠均高脂饲料喂养8周以构建高胆固醇血症模型，试验期间所有小鼠均自由饮食饮水；造模同时，各给药组小鼠灌胃相应药液（均以生理盐水为溶剂），正常对照组和模型组小鼠灌胃相同体积的生理盐水，每日1次，连续8周。给药结束后，模型组小鼠的血清TC和LDL-C均高于正常对照组，说明高胆固醇血症模型造模成功。
1.2.2.2 血清TC、LDL-C、ALT、AST水平测定
末次给药后禁食不禁水12 h，麻醉后（实验程序经安徽科技学院动物伦理委员会批准，动物伦理批号2023035），摘眼球取血，按4000 r/min，4 ℃离心10 min，取血清，按试剂盒说明分别测定小鼠血清中TC、LDL-C、ALT及AST水平。
1.2.2.3 肝组织HE染色、油红O染色
实验结束后，脱颈椎处死小鼠，摘取肝脏，置于10%的福尔马林溶液中浸泡48 h，依次用70%、80%、90%、无水乙醇梯度脱水，二甲苯使其透明，石蜡包埋切片后，进行HE染色。取部分新鲜肝组织固定后，依次用10%、20%、30%蔗糖进行梯度脱水，包埋，−20 ℃冷冻切片，按照染色液说明书进行染色。
1.2.2.4 血清 SOD、GSH-Px、MDA 水平测定
按1.2.2.2中所述方法分离血清，并按试剂盒操作说明测定血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量。
1.2.3 网络药理学预测
1.2.3.1 成分、疾病靶点的获取及潜在作用靶点
以“滁菊”为检索词，设置OB（Oral bioavailability）≥30%，类药性DL（Drug-like properties）≥0.18，在中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP数据库[13]（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中进行检索，筛选滁菊的活性成分，并结合相关文献补充。再以所得的滁菊总黄酮成分为目标对象，通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找对应的SMILES名称，利用Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）对相关成分的靶点进行搜索。以高胆固醇血症作为关键词，采用DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）和GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）进行查找获得疾病靶点。取成分与疾病靶点的共有部分，作为潜在的作用靶点。
1.2.3.2 药物调控网络关系
通过String数据库[14]（https://cn.string-db.org/）建立潜在作用靶点的蛋白质互作网络（PPI），选择物种为“Homosapiens”，置信度为0.4，将得到的蛋白相互作用信息导出，并保存节点信息，使用Cytoscape3.7.2软件对数据进行可视化操作。
1.2.3.3 GO功能富集和KEGG通路富集分析
将1.2.3.1项中获得的潜在作用靶点录入DAVID数据库（https://david.ncifcrf. gov/），设定“Official Gene Symbol”，物种选择“Homosapiens”，对数据进行GO和KEGG通路富集分析，并对排名前10的条目进行可视分析。
1.2.3.4 “药物-成分-疾病-靶点-通路”网络构建
运用Cytoscape 3.7.2软件将滁菊总黄酮、活性成分、潜在作用靶点和KEGG前20条通路联系起来，构建“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络，进行分析。
1.2.3.5 分子对接
为了进一步验证关键靶点与滁菊总黄酮活性成分间作用的可信度，选取滁菊总黄酮的关键活性成分为配体，蛋白相互作用网络中度值前5的靶蛋白为受体，通过PDB（https://www.rcsb.org/）数据库获得蛋白文件，通过Pubchem数据库下载关键活性成分的3D结构，再通过Autodock Tools1.5.6软件对配体和受体进行加氢、去水等操作后运用Autodock Vina软件进行分子对接，并将部分对接结果利用PyMOL和Ligplot绘图分析。
1.3 数据处理
采用SPSS19.0软件进行统计学处理，计量资料以平均值±标准差（x±s）表示，多组间数据比较用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 滁菊总黄酮改善高胆固醇血症作用
2.1.1 滁菊总黄酮对小鼠体质量和肝指数的影响
结果见表1。与正常对照组相比，模型组小鼠的体质量和肝指数极显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组相比，滁菊总黄酮低、中、高剂量给药组均可降低小鼠的体质量和肝指数，其中中剂量给药组体质量有显著差异（P<0.05），高剂量给药组体质量和肝指数均有极显著差异（P<0.01），但低剂量给药组无显著差异（P>0.05）。
表 1 滁菊总黄酮对高胆固醇血症小鼠体质量及肝指数的影响（x±s，n=10）Table 1. Effect of total flavonoids of Chuju on body mass and liver index in mice with hypercholesteremia (x±s, n=10)2.1.2 滁菊总黄酮对小鼠血清TC、LDL-C、ALT、AST水平的影响
结果见表2。与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠血清中的TC、LDL-C、ALT及AST水平均极显著增高（P<0.01），说明高脂饲料的饮食会导致小鼠产生高胆固醇血症。与模型组相比，滁菊总黄酮低、中、高剂量给药组小鼠血清中的TC、LDL-C、ALT、AST水平均有所降低，其中低剂量给药组无显著差异（P>0.05）；中剂量给药组小鼠血清中的TC、ALT水平存在显著差异（P<0.05）；高剂量给药组小鼠血清中的TC、ALT、AST水平有极显著差异（P<0.01）。LDL-C水平仅高剂量给药组有显著差异（P<0.05）。结果表明滁菊总黄酮在一定的剂量下可以起到降低TC、LDL-C、ALT、AST水平的作用。
表 2 滁菊总黄酮对高胆固醇血症小鼠血清TC、LDL-C、ALT、AST水平的影响（x±s，n=10）Table 2. Effect of total flavonoids of Chuju on content of TC, LDL-C, ALT, AST of serum in mice with hypercholesteremia (x±s, n=10)组别 TC（mmol/L） LDL-C（mmol/L） ALT（U/L） AST（U/L） 正常对照组 2.16±0.19 0.50±0.12 28.92±3.74 94.50±28.21 模型组 4.37±0.65** 1.09±0.28** 55.45±6.13** 191.39±36.54** 水飞蓟组 2.86±0.29*## 0.65±0.15## 36.10±3.74## 116.01±17.70## 滁菊总黄酮低剂量组 4.07±0.55** 1.00±0.23** 47.06±6.29** 168.51±35.33** 滁菊总黄酮中剂量组 3.58±0.41**# 0.78±0.14 42.38±6.42**# 147.70±29.20* 滁菊总黄酮高剂量组 3.02±0.49**## 0.69±0.12# 39.03±5.56**## 124.30±36.00## 2.1.3 滁菊总黄酮对小鼠肝脏的影响
如图1所示，正常对照组的小鼠肝细胞核圆，轮廓完整，肝窦结构规则，肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射性分布。高脂饲料模型组小鼠肝细胞索排列紊乱，肝窦结构不规则，细胞空泡水肿，炎性细胞浸润（红箭头），脂类物质沉积明显。滁菊总黄酮低、中、高剂量给药组细胞索排列趋势明显趋于正常，细胞水肿逐渐减轻，空泡减少，炎性细胞浸润减轻，细胞脂肪沉积逐渐改善。结果表明，滁菊总黄酮可以减轻炎症情况，改善脂质在肝脏中的蓄积。
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图 1 滁菊总黄酮对KM小鼠肝脏肝组织病理（HE染色）和肝组织脂滴累积（油红O染色）的影响注：a组为正常对照组，b组为模型组，c组为水飞蓟组，d组为滁菊总黄酮高剂量组，e组为滁菊总黄酮中剂量组，f组为滁菊总黄酮低剂量组；第二行为HE染色，第三行为油红O染色。Figure 1. Effect of Chuju total flavonoids on liver tissue pathology (HE staining) and lipid droplet accumulation (oil red O staining) in the liver of KM mice2.1.4 滁菊总黄酮对小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA水平的影响
结果见表3。与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠血清中的SOD、GSH-Px水平均极显著降低（P<0.01），MDA极显著增高（P<0.01），说明高脂饲料饮食会导致小鼠产生脂质过氧化损伤。与模型组比较，滁菊总黄酮低、中、高剂量给药组小鼠血清MDA含量均明显降低，低剂量给药组无显著差异（P>0.05）；中、高剂量给药组有极显著差异（P<0.01）。滁菊总黄酮低、中、高剂量给药组小鼠血清中SOD、GSH-Px的活性均明显升高，其中对于SOD活性，低剂量给药组存在显著差异（P<0.05）；中、高剂量给药组有极显著差异（P<0.01）。而GSH-Px活性在低剂量给药组差异无统计学意义（P>0.05）；中、高剂量给药组有极显著差异（P<0.01）。上述结果表明，在一定剂量下滁菊总黄酮具有抗脂质过氧化损伤作用。水飞蓟组在SOD、MDA、GSH-Px水平上与模型组比较均存在极显著差异（P<0.01）。
表 3 滁菊总黄酮对高胆固醇血症小鼠血清 SOD、GSH-Px 活性及 MDA 水平的影响（x±s，n=10）Table 3. Effect of total flavonoids of Chuju on activities of SOD, GSH-Px and content of MDA of serum in mice with hypercholesteremia (x±s, n=10)组别 SOD
（U/mL）MDA
（nmoL/mL）GSH-Px
（U/mL）正常对照组 95.14±2.56 8.11±1.25 572.33±54.27 模型组 65.66±5.83** 14.15±2.38** 313.83±39.44** 水飞蓟组 80.29±4.39**## 9.02±1.08## 502.43±56.80## 滁菊总黄酮低剂量组 73.36±4.46**# 11.89±1.45** 342.23±54.27** 滁菊总黄酮中剂量组 76.94±6.54**## 10.37±1.60## 497.33±65.75## 滁菊总黄酮高剂量组 82.64±5.94**## 8.78±1.01## 524.27±60.38## 肝脏是脂质代谢的重要器官，胆固醇的吸收与排泄都与肝脏有着密不可分的联系。内源性的胆固醇合成在肝脏中进行，外源性的胆固醇代谢也主要通过肝脏[15−17]。ALT与AST在肝细胞中承担转运氨基酸的作用，两者均是肝细胞损伤的标记物。当脂肪摄入量过高时，代谢不完全的脂肪会在肝脏中沉积，从而引起肝质量增加和肝细胞损伤进而诱发炎症，最终导致血清中TC、LDL-C、ALT和AST的升高[18−19]。肝组织病理切片则显示为细胞形态改变，肝索排列紊乱，炎性细胞浸润及轻度的脂肪病变[20]。大量研究发现，肝指数、肝组织病理切片、TC、LDL-C、AST和ALT水平，是用来评价高胆固醇血症的重要指标[21−25]。本研究结果显示，滁菊总黄酮在一定的剂量下可降低高胆固醇血症小鼠的体质量和肝指数，使肝细胞结构和肝索排列趋于正常化，减轻炎性细胞浸润，降低血清TC、LDL-C、AST和ALT水平。说明滁菊总黄酮可以减轻肝细胞损伤，进而改善高胆固醇血症。
超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的内源性金属酶，它可以将超氧自由基转化为过氧化氢，然后在谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的作用下继续转化为水，从而清除过量的氧自由基[26]。然而，在肝损伤过程中，大量的氧自由基产生，会抑制SOD和GSH-Px的活性。未被清除的氧自由基会攻击细胞膜脂质，引发脂质过氧化的连锁反应。丙二醛（MDA）作为该反应的终产物，能间接反映机体受到自由基攻击的程度[27−29]。本研究结果显示，滁菊总黄酮能提高高胆固醇血症小鼠的血清SOD、GSH-Px活性，降低血清MDA水平，说明滁菊总黄酮具有抗氧化功能，从而对肝细胞起到保护作用。
2.2 网络药理学分析滁菊总黄酮改善高胆固醇血症作用机制
2.2.1 滁菊总黄酮的有效成分及潜在靶点
如表4所示，经TCMSP数据库搜索结合相关文献检索，共获得金合欢素、异泽兰黄素、芹菜素、槲皮素、香叶木素、木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-（6’-O-丙二酸单酰）-β-D-葡萄糖苷等32种滁菊总黄酮活性成分。通过PubChem数据库搜索上述滁菊总黄酮活性成分的潜在作用靶点，共得到221个成分靶点，通过对高胆固醇血症疾病搜索获得了2046个疾病靶点。取成分与疾病靶点的共有部分为潜在作用靶点，共得105个靶点。
表 4 滁菊总黄酮成分分析Table 4. Component analysis in total flavonoids from Chuju序号 英文名称 中文名称 化学式 CAS号 1 Acacetin 金合欢素 C16H12O5 480-44-4 2 Acacetin-7-O-Rutinoside 蒙花苷 C28H32O14 480-36-4 3 Acacetin-7-O-Glucoside 香清兰苷 C22H22O10 4291-60-5 4 Acacetin-7-O-Glucuronide 金合欢素-7-O-葡萄糖醛酸苷 C22H20O11 38226-83-4 5 Apigenin 芹菜素 C15H10O5 520-36-5 6 Apigenin 7-O-（6''-O-malonylglucoside） 芹菜素7-O-（6”-O-丙二酸单酰）-β-D-葡萄糖苷 C24H22O13 86546-87-4 7 Apigenin-7-O-Glucuronide 芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷 C21H18O11 29741-09-1 8 Apigenin-7-O-Rutinoside 异野漆树苷 C27H30O14 552-57-8 9 Apigenin-7-O-Glucoside 芹甙元-7-葡萄糖苷 C21H20O10 578-74-5 10 Acacipetalin 金合欢苷 C11H17NO6 644-68-8 11 Artemetin 艾黄素 C20H20O8 479-90-3 12 Axillarin 槲皮万寿菊素-3,6-二甲醚 C17H14O8 5188-73-8 13 Cirsiliol 条叶蓟素 C17H14O7 34334-69-5 14 Chrysosplenol D 猫眼草酚D C18H16O8 14965-20-9 15 Diosmetin 香叶木素 C16H12O6 520-34-3 16 Diosmetin-7-O-Rutinoside 香叶木素-7-O-Β-D-芸香苷 C28H32O15 520-27-4 17 Diosmetin-7-O-Glucoside 香叶木素-7-O-Β-D-葡萄糖苷 C22H22O11 20126-59-4 18 Diosmetin-7-O-Glucuronide 香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 C22H20O12 35110-20-4 19 Eupatilin 异泽兰黄素 C18H16O7 22368-21-4 20 Eriodictyol 圣草酚 C15H12O6 552-58-9 21 Luteolin 木犀草素； 3',4',5,7-四羟基黄酮 C15H10O6 491-70-3 22 Luteolin-7-O-Glucuronide 木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷 C21H18O12 29741-10-4 23 Luteolin-7-O-Rutinoside 木犀草素-7-O-芸香糖苷 C27H30O15 3563-98-2 24 Luteolin-7-O-Glucoside 木犀草素-7-O-葡萄糖苷 C21H20O11 5373-11-5 25 Luteolin-7-O-6 -Malonylglucoside 木犀草素-7-O-6-丙二酰葡萄糖苷 C24H22O14 98767-38-5 26 Quercetin 槲皮素 C15H10O7 117-39-5 27 Isorhamnetin 3-O-b-D-glucoside 异鼠李素-3-O-葡萄糖苷 C22H22O12 5041-82-7 28 Pyracanthoside 圣草酚-7-O-葡萄糖苷 C21H22O11 38965-51-4 29 Spinacetin 菠叶素 C17H14O8 3153-83-1 30 Marein 马里苷 C21H22O11 535-96-6 31 Kaempferol 山奈酚 C15H10O6 520-18-3 32 Rutin 芦丁 C27H30O16 153-18-4 2.2.2 PPI网络的构建
通过Cytoscape3.7.2软件制作可视化的PPI网络图（图2），其中共包括105个节点及441条相互作用连线，节点的平均度值为19.8。对网络图分析处理后依据度值、中介中心性和接近中心性三者来进行挑选，选取其中高于三者平均值的靶点，得到了50个关键靶点，其中排名前几位的分别是AKT1、GAPDH、TNF、PPARG等，上述关键靶点可能在滁菊总黄酮改善高胆固醇血症中发挥着重要作用。
2.2.3 GO和KEGG富集分析
对筛选出的靶点进行GO富集分析，共涉及314条目，以P<0.05为筛选条件进行选取，将其中前10的条目可视化分析。由图3可知，滁菊总黄酮可能通过MAP激酶活性的正调控（positive regulation of MAP kinase activity）、对外源性刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）、质膜（plasma membrane）、酶结合（enzyme binding）等方式改善高胆固醇血症。
KEGG富集分析中共涉及96条通路，按显著性P<0.05排序，将前10的关键通路进行展示（图4）。KEGG分析结果表明，改善高胆固醇血症的关键是依靠PI3K-AKT信号通路（PI3K-AKT signaling pathway）、脂质与动脉粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、内分泌抵抗通路（Endocrine resistance）等起作用。
2.2.4 “药物-成分-疾病-靶点-通路”网络构建
在网络图（图5）中，节点和度值（degree）成正比，节点大则代表度值大，在网络中起到的作用可能就越大，故按degree值高于平均值进行筛取，得出异泽兰黄素（degree=53）、艾黄素（degree=53）、金合欢素（degree=52）、菠叶素（degree=52）、条叶蓟素（degree=52）、猫眼草酚D（degree=52）、槲皮万寿菊素-3,6-二甲醚（degree=51）、槲皮素（degree=50）、芹菜素（degree=49）、山奈酚（degree=48）、木犀草素（degree=47）、香叶木素（degree=47）和圣草酚（degree=42）这13个成分可能是滁菊总黄酮改善高胆固醇血症的关键活性成分。此外，由“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络中可看出槲皮素和异泽兰黄素这两个成分共同作用于AKT1，而异泽兰黄素又可以同时作用于EGFR和AKT1靶点，这印证了中药在改善疾病时是通过多成分与多靶点共同作用的，展现了中药的多成分、多靶点特点。
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图 5 “药物-成分-疾病-靶点-通路”网络图注：图中黄色的三角形代表中药滁菊；绿色正方形代表活性成分；红色箭头形代表疾病高胆固醇血症；蓝色圆形代表交集靶点；紫色平行四边形代表通路。Figure 5. "Drug-Component-Disease-Target-Pathway" network diagram2.2.5 分子对接结果
结果见表5，利用Autodock Vina软件将滁菊总黄酮中关键活性成分异泽兰黄素（Eupatilin）、艾黄素（Artemetin）、金合欢素（Acacetin）与关键靶点AKT1、GAPDH、TNF等进行分子对接，选取其中结合能较高的四个对接结果进行可视化展示（见图6）。一般认为结合能得分数值越低，代表受体与配体间的结合作用越强，发生结合的概率越高，其中对接结果表明，异泽兰黄素与GAPDH、TNF等的对接结果良好，其结合能为−8.6 kcal/mol，表明异泽兰黄素与各靶点中氨基酸残基结合稳定。结果说明滁菊总黄酮可能是通过关键活性成分异泽兰黄素、艾黄素、金合欢素等作用治疗高胆固醇血症。
表 5 分子对接结果Table 5. Molecular docking results活性成分 靶点 PDB ID 结合能（kcal/mol） Eupatilin AKT1 7FCV −7.9 GAPDH 6IQ6 −8.6 TNF 2AZ5 −8.6 TP53 6UPT −6.7 EGFR 3IKA −8.3 Artemetin AKT1 7FCV −6.9 GAPDH 6IQ6 −8.2 TNF 2AZ5 −7.5 TP53 6UPT −6.5 EGFR 3IKA −7.6 Acacetin AKT1 7FCV −8.1 GAPDH 6IQ6 −8.5 TNF 2AZ5 −8.2 TP53 6UPT −7.2 EGFR 3IKA −8.6 ![]()
图 6 蛋白相互作用模式分析注：A：Eupatilin-GAPDH；B：Eupatilin-TNF；C：Acacetin-GAPDH；D：Acacetin-TNF。Figure 6. Protein interaction mode analysis网络药理学基于大规模数据和计算机技术从整体的角度出发，研究药物对生物体内多种靶点和通路的影响，揭示药物的作用机制和作用规律[30−31]。分子对接技术基于药物与蛋白质分子呈现锁钥关系，通过计算机模拟对配体与受体之间作用位点以及作用力强弱进行分析[32]。本研究通过网络药理学结果显示，滁菊总黄酮改善高胆固醇血症的作用机制可能是通过总黄酮中的异泽兰黄素、金合欢素等13种关键活性成分，作用于AKT1、GAPDH、TNF等关键靶点，调控PI3K-AKT等信号通路来实现的。同时防止饮食诱导的肥胖。AKT1被认为是营养代谢途径的关键节点，在内分泌抵抗过程中发挥作用[33−34]。GAPDH是糖酵解中起限速作用的关键酶，与各种代谢性疾病的发病机制有关[35]。TNF可以影响脂质代谢中的脂蛋白脂肪酶、肝脏脂肪酸合成和脂解从而调节血脂水平[36−37]。PI3K-AKT信号通路具有调控胰岛素信号转导的作用，与胰岛素抵抗密切相关，可有效改善肝脏糖脂代谢[38]。脂质与动脉粥样硬化通路被激活后，可促进LDL进入血管内皮细胞氧化修饰成ox-LDL，进而促进斑块生长及加重炎症反应[39]。内分泌抵抗通路能调节高脂血症大鼠脂质沉积的作用，改善脂代谢紊乱[40]。分子对接结果证明了关键活性成分异泽兰黄素、艾黄素、金合欢素与AKT1、GAPDH、TNF等蛋白的结合作用。
3. 结论
综上所述，在一定剂量下滁菊总黄酮具有预防和改善高脂饮食诱导的小鼠高胆固醇血症的作用，通过网络药理学和分子对接技术发现其作用机制可能是异泽兰黄素、艾黄素和金合欢素等成分与AKT1、GAPDH和TNF等蛋白靶点相结合，进而影响PI3K-AKT信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路和内分泌抵抗等信号通路，最终起到降低小鼠高胆固醇血症的作用。这也为后续作用机制的研究提供一定的参考。
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图 1 滁菊总黄酮对KM小鼠肝脏肝组织病理（HE染色）和肝组织脂滴累积（油红O染色）的影响
注：a组为正常对照组，b组为模型组，c组为水飞蓟组，d组为滁菊总黄酮高剂量组，e组为滁菊总黄酮中剂量组，f组为滁菊总黄酮低剂量组；第二行为HE染色，第三行为油红O染色。
Figure 1. Effect of Chuju total flavonoids on liver tissue pathology (HE staining) and lipid droplet accumulation (oil red O staining) in the liver of KM mice
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图 5 “药物-成分-疾病-靶点-通路”网络图
注：图中黄色的三角形代表中药滁菊；绿色正方形代表活性成分；红色箭头形代表疾病高胆固醇血症；蓝色圆形代表交集靶点；紫色平行四边形代表通路。
Figure 5. "Drug-Component-Disease-Target-Pathway" network diagram
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图 6 蛋白相互作用模式分析
注：A：Eupatilin-GAPDH；B：Eupatilin-TNF；C：Acacetin-GAPDH；D：Acacetin-TNF。
Figure 6. Protein interaction mode analysis
表 1 滁菊总黄酮对高胆固醇血症小鼠体质量及肝指数的影响（x±s，n=10）
Table 1 Effect of total flavonoids of Chuju on body mass and liver index in mice with hypercholesteremia (x±s, n=10)
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表 2 滁菊总黄酮对高胆固醇血症小鼠血清TC、LDL-C、ALT、AST水平的影响（x±s，n=10）
Table 2 Effect of total flavonoids of Chuju on content of TC, LDL-C, ALT, AST of serum in mice with hypercholesteremia (x±s, n=10)
组别 TC（mmol/L） LDL-C（mmol/L） ALT（U/L） AST（U/L） 正常对照组 2.16±0.19 0.50±0.12 28.92±3.74 94.50±28.21 模型组 4.37±0.65** 1.09±0.28** 55.45±6.13** 191.39±36.54** 水飞蓟组 2.86±0.29*## 0.65±0.15## 36.10±3.74## 116.01±17.70## 滁菊总黄酮低剂量组 4.07±0.55** 1.00±0.23** 47.06±6.29** 168.51±35.33** 滁菊总黄酮中剂量组 3.58±0.41**# 0.78±0.14 42.38±6.42**# 147.70±29.20* 滁菊总黄酮高剂量组 3.02±0.49**## 0.69±0.12# 39.03±5.56**## 124.30±36.00##
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表 3 滁菊总黄酮对高胆固醇血症小鼠血清 SOD、GSH-Px 活性及 MDA 水平的影响（x±s，n=10）
Table 3 Effect of total flavonoids of Chuju on activities of SOD, GSH-Px and content of MDA of serum in mice with hypercholesteremia (x±s, n=10)
组别 SOD
（U/mL）MDA
（nmoL/mL）GSH-Px
（U/mL）正常对照组 95.14±2.56 8.11±1.25 572.33±54.27 模型组 65.66±5.83** 14.15±2.38** 313.83±39.44** 水飞蓟组 80.29±4.39**## 9.02±1.08## 502.43±56.80## 滁菊总黄酮低剂量组 73.36±4.46**# 11.89±1.45** 342.23±54.27** 滁菊总黄酮中剂量组 76.94±6.54**## 10.37±1.60## 497.33±65.75## 滁菊总黄酮高剂量组 82.64±5.94**## 8.78±1.01## 524.27±60.38##
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表 4 滁菊总黄酮成分分析
Table 4 Component analysis in total flavonoids from Chuju
序号 英文名称 中文名称 化学式 CAS号 1 Acacetin 金合欢素 C16H12O5 480-44-4 2 Acacetin-7-O-Rutinoside 蒙花苷 C28H32O14 480-36-4 3 Acacetin-7-O-Glucoside 香清兰苷 C22H22O10 4291-60-5 4 Acacetin-7-O-Glucuronide 金合欢素-7-O-葡萄糖醛酸苷 C22H20O11 38226-83-4 5 Apigenin 芹菜素 C15H10O5 520-36-5 6 Apigenin 7-O-（6''-O-malonylglucoside） 芹菜素7-O-（6”-O-丙二酸单酰）-β-D-葡萄糖苷 C24H22O13 86546-87-4 7 Apigenin-7-O-Glucuronide 芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷 C21H18O11 29741-09-1 8 Apigenin-7-O-Rutinoside 异野漆树苷 C27H30O14 552-57-8 9 Apigenin-7-O-Glucoside 芹甙元-7-葡萄糖苷 C21H20O10 578-74-5 10 Acacipetalin 金合欢苷 C11H17NO6 644-68-8 11 Artemetin 艾黄素 C20H20O8 479-90-3 12 Axillarin 槲皮万寿菊素-3,6-二甲醚 C17H14O8 5188-73-8 13 Cirsiliol 条叶蓟素 C17H14O7 34334-69-5 14 Chrysosplenol D 猫眼草酚D C18H16O8 14965-20-9 15 Diosmetin 香叶木素 C16H12O6 520-34-3 16 Diosmetin-7-O-Rutinoside 香叶木素-7-O-Β-D-芸香苷 C28H32O15 520-27-4 17 Diosmetin-7-O-Glucoside 香叶木素-7-O-Β-D-葡萄糖苷 C22H22O11 20126-59-4 18 Diosmetin-7-O-Glucuronide 香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 C22H20O12 35110-20-4 19 Eupatilin 异泽兰黄素 C18H16O7 22368-21-4 20 Eriodictyol 圣草酚 C15H12O6 552-58-9 21 Luteolin 木犀草素； 3',4',5,7-四羟基黄酮 C15H10O6 491-70-3 22 Luteolin-7-O-Glucuronide 木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷 C21H18O12 29741-10-4 23 Luteolin-7-O-Rutinoside 木犀草素-7-O-芸香糖苷 C27H30O15 3563-98-2 24 Luteolin-7-O-Glucoside 木犀草素-7-O-葡萄糖苷 C21H20O11 5373-11-5 25 Luteolin-7-O-6 -Malonylglucoside 木犀草素-7-O-6-丙二酰葡萄糖苷 C24H22O14 98767-38-5 26 Quercetin 槲皮素 C15H10O7 117-39-5 27 Isorhamnetin 3-O-b-D-glucoside 异鼠李素-3-O-葡萄糖苷 C22H22O12 5041-82-7 28 Pyracanthoside 圣草酚-7-O-葡萄糖苷 C21H22O11 38965-51-4 29 Spinacetin 菠叶素 C17H14O8 3153-83-1 30 Marein 马里苷 C21H22O11 535-96-6 31 Kaempferol 山奈酚 C15H10O6 520-18-3 32 Rutin 芦丁 C27H30O16 153-18-4
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表 5 分子对接结果
Table 5 Molecular docking results
活性成分 靶点 PDB ID 结合能（kcal/mol） Eupatilin AKT1 7FCV −7.9 GAPDH 6IQ6 −8.6 TNF 2AZ5 −8.6 TP53 6UPT −6.7 EGFR 3IKA −8.3 Artemetin AKT1 7FCV −6.9 GAPDH 6IQ6 −8.2 TNF 2AZ5 −7.5 TP53 6UPT −6.5 EGFR 3IKA −7.6 Acacetin AKT1 7FCV −8.1 GAPDH 6IQ6 −8.5 TNF 2AZ5 −8.2 TP53 6UPT −7.2 EGFR 3IKA −8.6
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期刊类型引用(1)
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