Whole-cell Catalyzed Production of L-tyrosine in Recombinant Bacillus subtilis
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摘要: 目的：本研究构建一株重组枯草芽孢杆菌工程菌，实现以苯酚、丙酮酸和氨为底物全细胞生成L-酪氨酸（L-tyrosine，L-Tyr），并优化其细胞培养条件和催化反应条件，以期提高L-Tyr的产量。方法：将来源于Pantoea agglomerans的酪氨酸酚裂解酶（Tyrosine Phenol-Lyase，TPL）经密码子优化后在枯草芽孢杆菌中异源表达，通过单因素实验优化了重组菌诱导表达条件和全细胞转化条件，旨在提高L-Tyr产量。结果：重组枯草芽孢杆菌在20 ℃，2.0 g/L木糖诱导培养36 h时TPL活性最高达到4.65±0.15 U·g−1，在75 mmol/L苯酚、75 mmol/L丙酮酸钠、487 mmol/L氯化铵、2.0 g/L亚硫酸钠、2.0 g/L EDTA、0.08 g/L 磷酸吡哆醛（Pyridoxal Phosphat，PLP）、湿菌体50 g/L、pH=8.0、35 ℃的全细胞转化条件下，L-Tyr达到9.38 g/L，转化率为73.24%。为了进一步改善高浓度苯酚导致TPL酶活力下降问题，在全细胞转化环节采用分批补料方式，20 h后得到15.12 g/L L-Tyr，转化率为75.51%。结论：研究结果表明重组枯草芽孢杆菌可以成功转化苯酚、丙酮酸钠合成L-酪氨酸，为全细胞生物制备食品级L-酪氨酸提供了理论和技术基础，具有良好的应用前景。Abstract: Objective: This study conducted a recombinant Bacillus subtilis strain capable of producing L-Tyr utilizing phenol, sodium pyruvate, and ammonia. Moreover, the conditions of cell culture and catalytic reaction were optimized to improve L-Tyr production. Methods: The tyrosine phenol-lyase (TPL) gene from Pantoea agglomerans was codon-optimized and successfully over-expressed in B. subtilis. The conditions of induction and whole-cell transformation were optimized using single-factor experiments for L-Tyr production. Results: The highest TPL enzyme activity was achieved 4.65±0.15 U·g−1 in the recombinant B. subtilis at 20 ℃ with 2.0 g/L xylose after 36 hours. Under the whole-cell transformation conditions of 75 mmol/L phenol, 75 mmol/L sodium pyruvate, 487 mmol/L ammonium chloride, 2.0 g/L sodium sulfite, 2.0 g/L EDTA, 0.08 g/L pyridoxal phosphate (PLP), wet cell mass of 50 g/L, pH8, and 35 ℃, the L-Tyr production increased to 9.38 g/L with a conversion rate of 73.24%. Coping with the issue of decreased TPL enzyme activity caused by phenol resistance, a batch feeding strategy was implemented during the whole-cell transformation, resulting in a final L-Tyr production of 15.12 g/L with a conversion rate of 75.51% after 20 hours. Conclusion: These findings demonstrate the successful conversion of phenol and sodium pyruvate into L-Tyr by the recombinant B. subtilis strain. The study would provide a theoretical and technical foundation for the production of food-grade L-Tyr using whole-cell biocatalysis, highlighting its potential for practical applications.
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Keywords:
- L-tyrosine /
- B. subtilis /
- tyrosine phenol-lyase /
- whole-cell catalysis
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L-酪氨酸（L-tyrosine，L-Tyr）是一种酚羟基α-芳香族氨基酸，在体内由苯丙氨酸羟基化生成[1]，可以在动植物和微生物中从头合成，属于半必需氨基酸，又是许多蛋白质合成的前体物质，所以也属于营养必须氨基酸[2]。L-Tyr对内分泌激素具有调节作用，它是多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素以及甲状腺素等激素[3]生物合成的前体，当人们长期处在压力的情况下，补充酪氨酸被认为可以增加这些激素的水平，从而改善压力状况下的记忆力和表现，因此，L-Tyr可用作膳食补充剂[4]。此外，吴梦迪[5]的研究证实了L-Tyr和血红素混合物在有氧条件下具有协同抗氧化作用，这表明L-Tyr在抗氧化和抗衰老化妆品领域具有重要的应用价值。L-酪氨酸还可以作为酪醇[6]、左旋多巴[7]、香豆素[8]的合成中间体，而酪醇、左旋多巴和香豆素则是保健品和香料的主要成分[9]。
目前，国内外L-Tyr的生产仍然依靠从天然蛋白质中提取制得，即利用天然蛋白资源为原料，将其进行水解、浓缩、结晶、脱色等步骤的处理，分离提取L-Tyr，蛋白质水解法存在着生产原料有限、产品和工艺复杂、污染严重等缺点[10]。除了蛋白质水解法，L-Tyr的生产方式还包括化学合成法、发酵法和酶催化法。其中化学合成法制备的产物为外消旋的DL-酪氨酸，须进一步拆分。化学合成法的工艺流程复杂、效率低，一般不适用工业生产[11−12]。发酵法是指以生物质碳源为原料，通过优良的微生物菌种在合适的条件下发酵来累积L-酪氨酸，在Ping等[13]的研究中，通过调控大肠杆菌代谢途径和关键酶的表达，成功将碳通量导向莽草酸途径。再经过48 h的培养后得到7.11 g/L的L-Tyr。也有人尝试对谷氨酸棒杆菌进行代谢改造，使其碳通量更多地向L-酪氨酸的方向进行，实现可再生碳源生产L-Tyr，也只得到3.1 g/L L-Tyr[14]，发酵法生产的L-Tyr产量不高，不具备工业应用价值。酶催化法是指利用微生物细胞内酪氨酸酚裂解酶将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸[15]，反应方程式如图1所示。该方法绿色环保、对环境无污染且反应条件温和、便于操作，但也存在酶稳定性差、活性不高的问题。所以常俊俊等[16]在大肠杆菌中表达TPL后，用生物全细胞代替酶分子，通过全细胞转化的方式得到16.17 g/L L-Tyr。而Xu等[17]先筛选出催化性能优异的TPL并在大肠杆菌内表达，再通过底物分批补料获得了48.5 g/L的L-Tyr。Li等[18]也将L-乳酸氧化酶和TPL在大肠杆菌中共表达制备L-酪氨酸及其类似物。相较于其他方法酶催化法可以大规模制备L-Tyr，也更符合绿色发展的理念，在未来L-Tyr生产市场有良好前景。目前，生物酶法生产L-Tyr的研究都集中于大肠杆菌，大肠杆菌基因表达体系的调控机理研究透彻，培养物廉价。但大肠杆菌作为L-酪氨酸的生产工程菌存在着噬菌体污染和内毒素[19]等安全问题，这都将限制酶催化法制得的L-Tyr在食品、医药领域的应用。
枯草芽孢杆菌是一种公认安全的、可用于食品工业领域的食品安全生产菌株。枯草芽孢杆菌异源表达系统有许多优点，如易于遗传操作、在廉价底物上的高生长率以及发酵周期短等。该表达系统已经被广泛接受并应用于各种化学品、药品、食品、蛋白质和酶的生产[20]。本研究将来源于Pantoea agglomerans的酪氨酸酚裂解酶（GenBank：AAB24234.1）在枯草芽孢杆菌B. subtilis164T7P中克隆表达[21]，构建重组菌株B. subtilis164T7P-pMK4T7/TPL。将重组枯草芽孢杆菌B. subtilis164T7P-pMK4T7/TPL作为全细胞催化剂转化丙酮酸、苯酚和氨生成L-酪氨酸。同时为了提高L-Tyr的产量对诱导培养条件和全细胞转化条件进行研究。这是首次将枯草芽孢杆菌全细胞转化方式应用于L-Tyr的生产，为后续重组枯草芽孢杆菌全细胞生物催化制备L-酪氨酸的工业化应用提供了理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
枯草芽孢杆菌B. subtilis164T7P、质粒pMK4-T7[21]、质粒pET-28a（+）/TPL 为实验室保藏；大肠杆菌DH5α感受态细胞、高保真酶2ⅹphanta Master Mix、同源重组试剂盒 诺唯赞生物科技（南京）股份有限公司；限制性核酸内切酶 TaKaRa公司；AxyPrep TM Plasmid Miniprep Kit、AxyPrep PCR TM Cleanup Kit 爱思进生物技术（杭州）有限公司；改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒 生工（上海）生物股份有限公司；苯酚、丙酮酸钠、D-木糖、磷酸吡哆醛、亚硫酸钠、氯化铵、乙二胺四乙酸（EDTA）、考马斯亮蓝R-250 麦克林生化科技（上海）有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠 泰坦科技（上海）股份有限公司；L-酪氨酸 分析纯，索莱宝科技（北京）有限公司。
DK-8D型三孔电热恒温水浴锅 上海飞域实业国际贸易有限公司；EPS-100核酸电泳仪 上海天能科技有限公司；H1750R高速台式冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；GET3XG基因扩增仪 杭州柏恒科技有限公司；LC-20A高效液相色谱仪 Shimadzu（日本）公司；MLS-3780高压蒸汽灭菌器 SANYO（日本）公司；ZQZY-78BES振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基的配制
枯草芽孢杆菌培养基和发酵培养基均为LB培养基，其组分为5.0 g/L酵母粉、10 g/L蛋白胨、10 g/L氯化钠，双蒸水溶解，固体培养基在其基础上添加2%琼脂粉。
1.2.2 引物设计
以保藏的质粒pET-28a（+）/TPL为PCR模板，T7和T7t为引物，PCR扩增。PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min，循环1次；95 ℃变性15 s，循环30次；55 ℃退火15 s，循环30次；72 ℃延伸30次，2 kb/min；最后72 ℃延伸3 min，循环1次；16 ℃循环1次。将扩增产物送至上海杰李生物技术有限公司测序后进行Blast序列比对。根据比对结果显示的基因组信息，选择EcoRⅠ、BamHⅠ为酶切位点，设计并合成一对带有同源臂引物pMK4-TPL-F/pMK4-TPL-R，序列参考表1。
表 1 本研究中用到的引物Table 1. Primers used in this study引物名称 引物序列（5’-3’） 大小（bp） T7 TAATACGACTCACTATAGGG 20 T7t GCTAGTTATTGCTCAGCGG 19 pMK4-TPL-F GAAAGGAGGATATACCGGATCCATGAACTATCCTGCCGAGCCT 43 pMK4-TPL-R CGGGCTTTGTTAGCAGGAATTCTTAAATAAAGTCAAAACGCGCAG 45 T7N-TesF GTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAG 26 T7N-TesR GTACTGAGAGTGCACCATATGATCCG 26 注：酶切位点用下划线表示。 1.2.3 构建重组表达菌株
以质粒pET-28a（+）/TPL为模板，pMK4-TPL-F和pMK4-TPL-R为引物，PCR扩增。将质粒pMK4-T7用限制性内切酶EcoRⅠ/BamHⅠ切割。酶切产物和PCR产物都用AxyPrep PCRTM清洁试剂盒纯化回收DNA。然后按照同源重组试剂盒说明方法进行一步克隆连接。将连接产物转入E. coil DH5α 感受态细胞，涂布于100 mg/L氨苄抗性平板。37 ℃恒温培养过夜，E. coil DH5α 感受态细胞转化方式参考萨姆布鲁克[22]的方法。用引物T7N-TesF/T7N-TesR对阳性转化子PCR验证，PCR结果送至上海杰李测序生物技术有限公司，以验证重组质粒pMK4-T7/TPL是否成功构建。挑取测序结果正确的菌株提取质粒pMK4-T7/TPL，转入B. subtilis164T7P感受态中，涂布于100 mg/L氯霉素抗性平板，37 ℃过夜培养，B. subtilis164T7P感受态细胞的制备和转化方式参考Ji等[21]的方法。重新挑取阳性转化子进行PCR验证，验证结果送至上海杰李生物技术有限公司，将测序结果正确的重组菌株 B. subtilis164T7P-pMK4-T7/TPL命名为KC-TPL。
1.2.4 重组菌诱导培养及表达验证
选择原始表达菌株B. subtilis164T7P、空白质粒对照菌株B. subtilis164T7P-pMK4-T7和诱导表达菌株KC-TPL同时进行诱导表达验证，具体步骤如下。
1.2.4.1 菌体培养
将B. subtilis164T7P、B. subtilis164T7P-pMK4-T7、KC-TPL划线，挑取单克隆于3 mL的试管LB中，放在37 ℃恒温振荡培养箱、200 r/min培养10～11 h。以1%（V/V）的接种量转接100 mL LB培养基中，当OD600达到0.8~1.0后，加入终浓度为1 g/L的D-木糖诱导，接着在37 ℃、200 r/min培养箱中诱导培养24 h，培养结束后4 ℃， 8000 r/min离心 5 min收集菌体。
1.2.4.2 菌体破碎及电泳条件
KC-TPL的破碎方法参照梁栋等[23]的报道。在破碎细菌之前，需要进行三次反复冻融以提高破碎效率。冻融完成后，将样品以5000 r/min的速度离心30 min，取得沉淀后用1 mol/L pH7.0的HEPES缓冲液重悬。整个破碎过程需要在冰浴条件下进行，超声破碎参数为：超声3 s，间隔5 s，共进行4次20 min，功率为130 W。破碎完成后，样品以12000 r/min的速度在4 ℃离心30 min。上清液使用生工改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度并将其稀释至相同浓度。将上清液与蛋白上样缓冲液混合后加热5 min，每孔添加10 μL样品到12%分离胶和5%浓缩胶中。电泳条件为先90 V运行20 min，然后切换到160 V电泳100 min。电泳结束后使用考马斯亮蓝溶液染色1 h，随后使用脱色液进行过夜处理。
1.2.5 酶活测定
TPL酶活力测定参照陈明亮等[24]报道的方法进行。取0.1 g KC-TPL湿菌体，加入10 mL反应体系：丙酮酸钠质量分数1%，苯酚质量分数1%，0.125 g/L PLP，氨水调pH7.4，温度为30 ℃，200 r/min条件下进行酶促反应，30 min后用浓盐酸终止酶促反应，利用高效液相色谱法（HPLC）检测反应液中L-Tyr的浓度。酶活定义为在上述条件下每分钟内催化生成1 μmol L-酪氨酸所需要的酶量为一个酶活单位（U）。
HPLC检测条件为：色谱柱Agilent C18柱（4.6×250 nm，5 μm）；流动相V（8.5 mmol/L乙酸钠溶液（磷酸调至pH=4））:V（甲醇）=4:1；紫外检测波长为230 nm；流速0.6 mL/min；进样量20 μL；柱温为室温[25]。
每克湿菌体所含酶活单位数为：A(U)=nT×m 式中：n为反应结束时反应液中L-Tyr的微摩尔数，μmol；T为反应时间，min；m为加入反应体系中湿菌体量，g；
1.2.6 酪氨酸酚裂解酶在枯草芽孢杆菌中表达优化
在木糖诱导阶段，选取对TPL表达影响较大的因素进行研究，分别是培养温度（20~40 ℃）、培养时间（12~60 h）和诱导剂浓度（0.5~2.5 g/L）。
1.2.7 全细胞转化合成L-酪氨酸反应体系建立及优化
将发酵24 h后的菌体离心收集菌体，冷藏16~24 h后在37 ℃摇床用1.0 g/L的CTAB处理1 h后洗涤两次放−20 ℃备用。全细胞转化反应体系（10 mL）：将100 mmol/L苯酚、100 mmol/L丙酮酸钠、650 mmol/L氯化铵、2.0 g/L Na2SO3、2.0 g/L EDTA、0.125 g/L PLP和50 g/L KC-TPL湿细胞投入0.1 mol/L磷酸缓冲液中，反应条件：T=30 ℃、pH=7.4，反应10 h后加入1.0 mol/L NaOH溶解沉淀，用HPLC检测反应液中L-Tyr的含量。全细胞转化阶段优化方案：苯酚毒性浓度（25~150 mmol/L）、湿细胞浓度（20~70 g/L）、反应温度（20~45 ℃）、反应初始pH（6~9）和最佳PLP浓度（0.06~0.14 g/L）。
1.3 数据处理
所有实验重复3次，液相数据导出后采用Excel 2019进行数据统计，利用IBM SPSS 25的单因素方差分析中的沃勒-邓肯多重比较进行显著性分析（P<0.05），用Origin 2022软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 重组枯草芽孢杆菌KC-TPL的鉴定
按照方法1.2.2所述方法扩增出TPL基因片段，Blast结果显示酪氨酸酚裂解酶长度为1371 bp，将TPL片段插入到pMK4-T7载体的EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点之间，得到质粒pMK4-T7/TPL，如图2所示。同时以未异源表达TPL基因的质粒pMK4-T7为对照，分别转化至B. subtilis164T7P中表达，核酸电泳结果如图3A所示，重组枯草芽孢杆菌特异性条带位置和目标片段大小相同，测序结果也显示未发生突变。接着将B. subtilis164T7P、B. subtilis164T7P-pMK4-T7、KC-TPL按照方法1.2.4诱导和破碎，SDS-PAGE结果图3B所示，与空白对照相比，重组菌在50 kDa位置有明显的特异性蛋白条带，与理论值基本一致，表明TPL基因在B. subtilis164T7P中成功表达。
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图 3 TPL的克隆（A）与表达（B）结果注：A.泳道M：DL 5000 marker；泳道1~2：TPL克隆结果；B. 泳道M：protein marker；泳道1：B. subtilis164T7P粗酶液；泳道2：KC-TPL粗酶液；泳道3：B. subtilis164T7P-pMK4-T7粗酶液。Figure 3. Results of TPL cloning and expression2.2 酪氨酸酚裂解酶在重组枯草芽孢杆菌中表达优化结果
2.2.1 培养温度对酪氨酸酚裂解酶的表达影响
培养温度对酶蛋白的转录翻译以及细菌的生长速率有较大影响。温度升高可加速蛋白质的扩散和碰撞速率，但温度上升到某一值后，酶蛋白逐渐变性，同样，温度过低也可能导致蛋白质的去折叠、聚集等问题。因此按照方法1.2.4.1加入诱导剂后，分别在温度20、25、30、35、40 ℃条件下诱导蛋白表达。比较TPL在不同温度诱导下的酶活，结果如图4所示。当培养温度为20 ℃时（酶活定为100%），TPL酶活明显高于其他温度，酶活从20 ℃到40 ℃随着培养温度的升高而降低，因此20 ℃为重组枯草芽孢杆菌最适培养温度。
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2.2.2 培养时间对酪氨酸酚裂解酶的表达影响
培养时间影响菌体的生长状态，对于重组蛋白的积累效率起着直接的影响。如果培养时间过短，酶蛋白积累量将会减少。而如果诱导时间过长，菌体的生长状态会受到影响，并且菌体自溶和宿主内源性蛋白酶的产生都会降低目标蛋白的积累，从而对酶活产生影响[26]。按照方法1.2.4.1加入诱导剂后，分别在12、24、36、48、60 h不同的诱导时间取一定量的菌体进行酶活测定，结果如图5所示。当培养时间低于36 h时，TPL酶活逐渐增加，36 h时达到最大值（酶活定义为100%），随后超过36 h后TPL酶活开始降低，可能是诱导蛋白表达后期的代谢副产物积累影响酶蛋白表达，因此将诱导表达36 h的重组枯草芽孢杆菌用于后续全细胞实验。
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图 5 培养时间对重组枯草芽孢杆菌中TPL表达的影响Figure 5. Influence of incubation time on the expression of TPL in recombinant B. subtilis2.2.3 诱导剂浓度对酪氨酸分裂解酶的表达影响
D-木糖作为诱导剂，一方面D-木糖浓度过低会达不到与阻遏蛋白结合的饱和浓度，另一方面浓度过高会导致酶蛋白折叠不完全形成包涵体，并抑制菌体生长，为了防止包涵体的生成[27]。按照方法1.2.4.1分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L终浓度的D-木糖诱导，测量重组枯草芽孢杆菌在不同浓度D-木糖诱导条件下的酶活，结果如图6所示。随着D-木糖浓度提高，TPL酶活也随之增加，当D-木糖浓度达到2.0 g/L（酶活定义为100%）时TPL的活性最高，此后随着D-木糖浓度加大，TPL的活性反而下降。
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图 6 D-木糖浓度对重组枯草芽孢杆菌中TPL表达的影响Figure 6. Influence of D-xylose concentration on the expression of TPL in recombinant B. subtilis2.3 全细胞转化条件优化结果
2.3.1 苯酚毒性浓度对全细胞催化合成L-酪氨酸的影响
一些文章报道指出，高浓度的苯酚会使蛋白质发生变质和沉淀，对细胞有直接损伤[28−29]，因此苯酚浓度是影响酶催化法生成L-Tyr的关键因素，为了研究苯酚浓度对全细胞转化体系的影响，按照方法1.2.7，在反应体系中加入不同浓度的苯酚后检测L-Tyr的产量，结果如图7所示。苯酚浓度在75 mmol/L时的L-Tyr产量最高达到6.5 g/L，当苯酚浓度高于75 mmol/L时，苯酚会对L-Tyr的合成产生明显抑制，苯酚浓度大于125 mmol/L时没有L-Tyr生成。
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2.3.2 细胞浓度对全细胞催化合成L-酪氨酸的影响
为了满足实际工业生产的效率需求并降低生产成本，需要对全细胞反应体系中的细胞浓度进行优化。不同细胞浓度代表不同的酶添加量，细胞浓度对于全细胞酶促反应起着正向的促进作用，但转化效率不会和菌体量成正比。为了控制成本和高效经济性，按照方法1.2.7，控制苯酚浓度为75 mmol/L，在全细胞转化体系中加入不同浓度的湿细胞，结果如图8所示。随着细胞浓度的提高L-Tyr产量也随之增加，当细胞浓度达到50 g/L后，进一步提高细胞浓度L-Tyr产量并没有明显提升，考虑到成本因素，全细胞转化细胞浓度确定为50 g/L。
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图 8 细胞浓度对KC-TPL全细胞转化合成L-酪氨酸的影响Figure 8. Influence of cell concentration on the synthesis of L-Tyr by whole-cell transformation of KC-TPL2.3.3 转化温度对全细胞合成L-酪氨酸的影响
温度对于酶的状态和稳定性都有重要影响，在一定范围内酶促反应速率随着温度的升高而增加，当温度升高到一定程度后，酶的结构会受到破坏而丧失活性，温度同时也是工业应用中需要控制的重要成本之一。按照方法1.2.7，同时控制湿细胞浓度为50 g/L、苯酚浓度为75 mmol/L，在不同温度环境下进行全细胞转化，结果如图9所示。随着转化温度梯度的变化，L-Tyr的产量呈现先升高再降低的趋势，反应温度在20~40 ℃时，L-Tyr产量都能保持在较高水平，当反应温度为35 ℃时L-Tyr的产量最高，约为8.02 g/L。当温度大于40 ℃时，L-Tyr产量开始下降。最佳转化温度和Kumagai等[30]研究中的酶最适温度相比偏低，可能是因为全细胞转化合成L-Tyr的时间较长，温度过高会加速苯酚的氧化和TPL的活性丧失。
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图 9 转化温度对KC-TPL全细胞转化合成L-酪氨酸的影响Figure 9. Influence of reaction temperature on the synthesis of L-Tyr by whole-cell transformation of KC-TPL2.3.4 反应初始pH对全细胞合成L-酪氨酸的影响
pH可以改变酶活性部位有关基团的解离状态，进而影响酶活性部位与底物的结合，为了使全细胞转化反应更加高效，按照方法1.2.7，同时控制细胞浓度为50 g/L、苯酚浓度75 mmol/L、反应温度35 ℃，对反应初始pH进行研究，结果如图10所示。重组枯草芽孢杆菌在弱碱性条件下表现出很强的催化能力，在转化pH为6~7.5时，L-Tyr产量随着pH升高而增加，当pH=8.0时L-Tyr的产量达到最高的8.5 g/L，之后当pH>8.0时L-Tyr产量逐渐减少。
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图 10 反应初始pH对KC-TPL全细胞转化合成L-酪氨酸的影响Figure 10. Influence of reaction pH on the synthesis of L-Tyr by whole-cell transformation of KC-TPL2.3.5 PLP浓度对全细胞合成L-酪氨酸的影响
PLP是一种重要的辅酶，在酪氨酸酶酚裂解酶催化的反应中，PLP起到“中间桥梁”的作用，可以与TPL活性中心形成内醛亚胺结构，维持底物α羧基的稳定[18]。适宜浓度的PLP可以有效保证TPL酶活，为了控制成本的同时保证酶活性，按照方法1.2.7，控制细胞浓度为50 g/L、底物浓度为75 mmol/L、反应温度35 ℃、反应初始pH8.0，在全细胞转化反应中加入不同浓度的PLP进行研究，结果如图11所示。当PLP浓度达到0.08 g/L后，L-Tyr基本维持在9.38 g/L左右，因此考虑到成本因素，PLP在全细胞转化反应中的添加浓度为0.08 g/L。
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图 11 PLP浓度对重组菌KC-TPL全细胞转化合成L-酪氨酸的影响Figure 11. Influence of PLP concentration on the synthesis of L-Tyr by whole-cell transformation of KC-TPL2.3.6 苯酚分批补料合成L-酪氨酸
分批补料是指将补充的物料分成若干份加入到反应体系中。当底物的浓度降低到一定水平时，开始第一次补料，补料以后该底物浓度会有所升高，由于酶促反应的消耗，该底物浓度将再次降低，于是进行第二次补料，以此类推，直至全细胞转化结束[31]，分批补料可以有效减少底物抑制的影响。在TPL催化的全细胞反应中，苯酚对于TPL的抑制作用是影响全细胞转化反应的关键因素，尤其是当初始苯酚浓度达到125 mmol/L时L-酪氨酸的产量为零，因此将苯酚维持在一个较低的浓度可以保持酶的催化能力。在其他条件都为最优情况下，首次投料25 mmol/L苯酚和丙酮酸钠，分4次补料，每隔4 h补加25 mmol/L，共投料125 mmol/L底物。反应20 h后结果如图12所示，L-酪氨酸的产量达到15.12 g/L，转化率为75.51%。
3. 结论
本次研究将TPL基因在枯草芽孢杆菌中克隆表达，成功构建重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 164T7P-pMK4-T7/TPL，首先通过培养条件优化实现了TPL在重组枯草芽孢杆菌中的高效表达，接着对重组枯草芽孢杆菌全细胞转化条件优化，最终在35 ℃、pH8、细胞浓度为50 g/L、底物苯酚75 mmol/L、丙酮酸钠75 mmol/L、氯化铵487 mmol/L、亚硫酸钠2.0 g/L、EDTA 2.0 g/L和PLP 0.08 g/L条件下全细胞转化得到9.38 g/L L-Tyr，转化率为73.24%。进一步为了解除高浓度底物苯酚对于TPL的抑制，通过分批补料策略，在20 h内分批补料4次，每次补料25 mmol/L苯酚，最终获得15.12 g/L的L-Tyr，转化率为75.51%。不同于以往用大肠杆菌作为L-Tyr生产工程菌，本研究首次将TPL在枯草芽孢杆菌中异源表达，开发了一种食品安全级酶催化生产L-Tyr的方法，通过全细胞转化方式生产L-Tyr，保证L-Tyr安全性的同时，也避免了酶反应的复杂操作，简化了工艺流程。本次研究得到的L-酪氨酸产量相对较低，后续需要对补料间隔时间和补料量做进一步研究，更好发挥重组工程菌的生产潜力。
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图 3 TPL的克隆（A）与表达（B）结果
注：A.泳道M：DL 5000 marker；泳道1~2：TPL克隆结果；B. 泳道M：protein marker；泳道1：B. subtilis164T7P粗酶液；泳道2：KC-TPL粗酶液；泳道3：B. subtilis164T7P-pMK4-T7粗酶液。
Figure 3. Results of TPL cloning and expression
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图 5 培养时间对重组枯草芽孢杆菌中TPL表达的影响
Figure 5. Influence of incubation time on the expression of TPL in recombinant B. subtilis
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图 6 D-木糖浓度对重组枯草芽孢杆菌中TPL表达的影响
Figure 6. Influence of D-xylose concentration on the expression of TPL in recombinant B. subtilis
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图 8 细胞浓度对KC-TPL全细胞转化合成L-酪氨酸的影响
Figure 8. Influence of cell concentration on the synthesis of L-Tyr by whole-cell transformation of KC-TPL
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图 9 转化温度对KC-TPL全细胞转化合成L-酪氨酸的影响
Figure 9. Influence of reaction temperature on the synthesis of L-Tyr by whole-cell transformation of KC-TPL
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图 10 反应初始pH对KC-TPL全细胞转化合成L-酪氨酸的影响
Figure 10. Influence of reaction pH on the synthesis of L-Tyr by whole-cell transformation of KC-TPL
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图 11 PLP浓度对重组菌KC-TPL全细胞转化合成L-酪氨酸的影响
Figure 11. Influence of PLP concentration on the synthesis of L-Tyr by whole-cell transformation of KC-TPL
表 1 本研究中用到的引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 引物序列（5’-3’） 大小（bp） T7 TAATACGACTCACTATAGGG 20 T7t GCTAGTTATTGCTCAGCGG 19 pMK4-TPL-F GAAAGGAGGATATACCGGATCCATGAACTATCCTGCCGAGCCT 43 pMK4-TPL-R CGGGCTTTGTTAGCAGGAATTCTTAAATAAAGTCAAAACGCGCAG 45 T7N-TesF GTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAG 26 T7N-TesR GTACTGAGAGTGCACCATATGATCCG 26 注：酶切位点用下划线表示。 
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