Polysaccharides from Sargassum horneri: Optimization of Preparation Technology and Influence of Bleaching on Their Properties
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摘要: 针对铜藻应用传统高温消化工艺提取褐藻多糖时存在的产品得率低、颜色深的问题，本研究尝试在60 ℃这一较低的Na2CO3消化温度下，通过响应面法对工艺条件进行优化，以褐藻胶、褐藻糖胶的得率及白度指数（whiteness index，WI）的综合评分为评价指标，确定最佳工艺条件。然后，在所得最佳提取条件下改变NaClO添加量，探究其对褐藻胶及褐藻糖胶性质的影响。结果表明，多糖综合评分与消化浓度、时间及NaClO添加量显著相关（P<0.01），最佳提取工艺为：消化时间7.0 h、消化浓度3.7%（w/v）、NaClO（4%，w/v）添加量2.7 mL，得到褐藻糖胶得率9.90%、褐藻胶得率19.95%、褐藻糖胶WI 62.10%、褐藻胶WI 87.83%、综合评分为44.84。漂白工艺对多糖性质影响的研究结果表明，NaClO的添加使褐藻胶分子量、黏度、M/G值下降，且NaClO的适度添加能提高其凝胶强度；同时，添加NaClO使褐藻糖胶的纯度提升，硫酸基含量及抗氧化活性显著提高（P<0.05）。本研究对铜藻褐藻胶及褐藻糖胶两种多糖的制备工艺进行了系统的研究，为铜藻资源的产业化利用提供了理论指导和实践经验。Abstract: To solve problems of the low yields and dark color of Sargassum horneri polysaccharides which were produced according to the traditional extraction method under the high-temperature and alkalic condition, this study attempted to produce S. horneri polysaccharides at a lower alkaline treatment temperature of 60 ℃ and optimize the process parameters by the response surface methodology. The combined scores of alginate and fucoidan yields and whiteness index (WI) were used as assessment indices to identify the optimal process condition. Under the optimal extraction condition, the concentration of NaClO addition was changed to investigate its effect on various characteristics of the produced alginate and fucoidan. The results showed that the polysaccharide comprehensive score was significantly correlated with the alkaline concentration, the extraction time, and the dosage of NaClO (P<0.01). The optimum reaction condition was extraction time of 7.0 h, alkaline concentration of 3.7% (w/v), and NaClO dosage of 2.7 mL (4%, w/v). Under this condition, the fucoidan yield was 9.90%, the alginate yield was 19.95%, the fucoidan WI was 62.10%, the alginate WI was 87.83%, and the comprehensive score was 44.84. The effect of a bleaching process on polysaccharide properties showed that the addition of NaClO decreased the molecular weight, viscosity, and M/G ratio of alginate, while the gel strength was increased with the moderate NaClO addition. Meanwhile, the purity of fucoidan was improved, the content of sulphate groups and the antioxidant activity were significantly increased (P<0.05). In this study, the preparation process of two polysaccharides from S. horneri was systematically investigated to provide theoretical guidance and practical experience for the industrial utilization of S. horneri resources.
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Keywords:
- Sargassum horneri /
- alginate /
- fucoidan /
- response surface methodology /
- bleach /
- characterization /
- antioxidant
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铜藻（Sargassum horneri）是隶属于褐藻门、墨角藻目、马尾藻科、马尾藻属的大型海藻[1]，为近年来东海和黄海海域频繁发生的大型藻华“金潮”的主要藻种[2]。据统计，东海、黄海海域铜藻年覆盖面积累计约为50万平方公里，最大月均生物量约为60.7万吨，且近年来其生物量有明显的增长趋势[3]。“金潮”现象给中国沿海省份的养殖业、旅游业和航运业造成重大经济损失[4]。漂浮的铜藻对其覆盖海域生态系统产生严重影响；捕捞后在海岸边大量堆积腐烂，又会威胁沿岸生态系统和居民生活[5]。因此，如何合理地利用爆发后的铜藻资源，使其“变废为宝”，是亟需解决的问题。
为解决该问题，亟需对铜藻资源化利用技术进行研究。已有报道表明，铜藻可作为食物来源，从中提取与健康相关的生物分子，制备肥料以用于农业，以及作为清洁能源的原料等[6]。在提取与健康相关的化合物中，多糖是最重要的目标分子。铜藻中的两种主要多糖为褐藻胶及褐藻糖胶，目前关于铜藻多糖的研究主要集中在其褐藻糖胶的生物活性上。研究发现，铜藻褐藻糖胶具有抗炎[7]、免疫调节[8]、抗肿瘤[9]及抗辐射[10]等活性。铜藻褐藻胶也可作为藻胶工业的原料，Campos等[11]使用碱提-乙醇沉淀法对铜藻进行提取，得到得率为16.03%的褐藻胶。因此，铜藻多糖具有较高的商业价值。海带、巨藻是目前藻胶工业的主要原料，针对其设置的传统消化工艺的消化温度为90 ℃[12−13]。然而，当铜藻在应用此工艺进行铜藻多糖的产业化制备时，存在产品色泽品质差的问题，且针对其在提取过程中颜色变深的原因及控制方法鲜有研究，严重限制了铜藻高品质多糖的产业化制备。研究表明，铜藻等马尾藻属海藻的多酚含量，显著高于海带、巨藻等褐藻中的多酚[14−15]。由此推测，“高温消化”工艺中多酚的氧化，是导致褐藻多糖颜色变深的分子基础。
为解决这一产业问题，本研究尝试在60 ℃这一较低的Na2CO3消化温度下，利用单因素实验结合响应面试验探究消化浓度、消化时间及NaClO添加量对铜藻褐藻胶、褐藻糖胶的得率、白度指数（whiteness index，WI）的影响，以褐藻胶、褐藻糖胶的得率及WI的综合评分为评价指标，确定最佳提取条件。并在最佳提取条件下改变NaClO添加量，深入探究漂白程度对其褐藻胶及褐藻糖胶性质的影响。本研究旨在建立高品质铜藻多糖的制备工艺，为铜藻多糖的产业化制备提供理论指导和实践经验，实现铜藻这一藻华海藻的资源化利用。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
铜藻 2022年6月采收自山东省荣成市；纤维素酶（700 EGU/g） 诺维信酶制剂公司；中性蛋白酶（50000 U/g） 庞博生物工程有限公司；次氯酸钠溶液（有效氯4.0%） 上海麦克林生化科技有限公司；所有试剂均为分析纯。
RM200QC色差仪 爱色丽色彩科技有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司；NDJ-5S数字式黏度计 上海越屏科学仪器有限公司；HC-3018质构仪 安徽中科中佳科学仪器有限公司；Pro Pulse 500 MHz核磁共振波谱仪 美国Agilent公司；Nicolet iS10傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Electron公司；Synergy H2酶标仪 美国BioTek仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 铜藻多糖提取工艺
铜藻多糖提取工艺流程见图1。具体流程为：采收的铜藻经水清洗后，于45 ℃烘箱中烘干，粉碎后过60目筛，−20 ℃储存备用。准确称取2.00 g铜藻粉末按1:40料液比加入55%乙醇溶液，室温下置于375 w超声清洗仪中超声处理1 h以去除色素。离心后取沉淀，以1:30料液比加入去离子水，再加入终浓度为0.1%纤维素酶（v/v）和1%中性蛋白酶（w/v），在最适条件下反应1.5 h后，加入Na2CO3于60 ℃进行消化。过滤去除藻渣，加入NaClO漂白20 min，调节pH到6，加入终浓度为2% CaCl2（w/v）溶液将褐藻酸转变成褐藻酸钙。过滤取上清，加入2倍体积95%乙醇，4 ℃过夜后离心，沉淀经冷冻干燥后得褐藻糖胶。褐藻酸钙经盐酸分步酸化后，加入NaOH中和，冷冻干燥后得褐藻胶。
1.2.2 多糖得率及色度测定
按照以下公式计算多糖得率：
褐藻胶得率(%)=褐藻胶质量铜藻质量×100 (1) 褐藻糖胶得率(%)=褐藻糖胶质量铜藻质量×100 (2) 参考Mohammed等[16]的方法，修改后用于测定褐藻胶及褐藻糖胶色度。将样品置于石英比色皿中进行测定，记录样品亮度值（L*）、红度值（a*）、黄度值（b*）。使用公式（3）计算白度指数（WI）。
WI(%)=100−√(100−L*)2+(a*)2+(b*)2 (3) 从两种多糖的得率和颜色两方面评价提取多糖工艺条件，因WI数值及差值大，所以降低其权重系数，使用公式（4）作为提取多糖综合评分。
综合评分=褐藻糖胶得率+褐藻胶得率+0.1(褐藻糖胶WI+褐藻胶WI）×100 (4) 1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 消化浓度对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响
设定消化时间6 h，NaClO添加量2 mL，考察消化浓度1%、2%、3%、4%、5%对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响。
1.2.3.2 消化时间对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响
设定消化浓度3%，NaClO添加量2 mL，考察消化时间3、6、9、12、15 h对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响。
1.2.3.3 NaClO添加量对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响
设定消化浓度3%、消化时间6 h，考察NaClO添加量1、1.5、2、2.5、3 mL对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响。
1.2.4 多糖提取的响应面优化试验
在单因素实验的基础上，以消化浓度（A）、消化时间（B）和NaClO添加量（C）为自变量，根据Central Composite Design（CCD）模型中心复合试验设计原理，以综合评分（Y）为响应值，进行三因素三水平响应面试验，优化铜藻两种多糖的提取工艺条件，响应面因素水平见表1。
表 1 CCD响应面试验因素水平Table 1. Factors and levels of CCD response surface test水平 因素 A 消化浓度（%） B 消化时间（h） C NaClO添加量（mL） −1.682 0.48 0.96 0.32 −1 1.5 3 1 0 3 6 2 1 4.5 9 3 1.682 5.52 11.05 3.68 1.2.5 分子量测定
采用高效液相色谱（Agilent 1260 HPLC）联用多角度激光散射仪（DAWNHELEOS-Ⅱ型）测定褐藻胶及褐藻糖胶分子量。色谱条件为：Shodex OHpak LB-806M色谱柱，0.1 mol/L硫酸钠为流动相；柱温35 ℃；流速0.4 mL/min；进样体积100 μL。
1.2.6 褐藻胶黏度测定
参考李雅静等[17]的方法，配制1%（w/v）褐藻胶溶液，充分搅拌至均匀，在25 ℃下，选择合适的转子使用旋转黏度计进行测定，重复五次取平均值，单位MPa·s。
1.2.7 褐藻胶M/G值测定
参考Wu等[18]的方法，称取200 mg褐藻胶样品，超纯水溶解，加盐酸溶液调节pH至3.0，于沸水中降解1 h，冷却至室温后，加入NaOH溶液调节pH至中性，置于透析袋（1 kDa）中，透析，冻干。冻干样品用重水反复冻融三次并取40 mg溶于1 mL重水中，转移至核磁管，在25 ℃的温度下用Pro Pulse 500 MHz核磁共振波谱仪在500 MHz下记录1H NMR。根据Grasdalen等[19−21]的研究，确定1H NMR图谱中质子峰的化学位移、嵌段结构，并按照其公式进行M/G值的计算。
1.2.8 褐藻胶凝胶强度测定方法
参考Wu等[18]的方法，取10 mL 1%（w/v）的褐藻胶溶液于2% CaCl2（w/v）溶液中浸渍过夜，形成凝胶球，于质构仪进行测定。
1.2.9 褐藻糖胶傅里叶红外光谱测定
褐藻糖胶样品与烘干后的溴化钾以1:200的比例混合研磨后压片，在红外光谱的400~4000 cm−1范围内扫描。
1.2.10 褐藻糖胶化学组成测定
总糖含量测定采用硫酸苯酚法[22]，硫酸根含量测定采用明胶－BaCl2比浊法[23]。总酚含量测定参照Folin-Ciocalteu法[24]。
1.2.11 褐藻糖胶DPPH自由基清除率测定
参考Zhang等[25]的方法，稍加修改。将褐藻糖胶样品配置成1 mg/mL的样品，1:1（v/v）加入0.1 mg/mL的DPPH溶液，避光反应30 min后，515 nm波长处检测吸光度值，以甲醇做空白对照。
清除率(%)=(1−A样品−A样品空白A对照−A对照空白)×100 (5) 1.3 数据处理
采用GraphPad Prism 9软件进行图表绘制；利用SPSS 27.0软件进行数据统计分析；通过Design-Expert 13软件进行试验设计，对结果进行二次多元回归拟合和方差分析。所有实验至少重复3次，结果以均值±标准差表示。采用one-way ANOVA 进行单因素分析，以P<0.05为显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验的结果分析
消化浓度、消化时间和NaClO添加量对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响如图2所示。
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图 2 各因素对铜藻多糖得率和白度指数的影响注：Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ为得率，Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ为白度指数；不同小写字母之间表示各组褐藻糖胶具有显著性差异（P<0.05），不同大写字母之间表示各组褐藻胶具有显著性差异（P<0.05）。Figure 2. Effects of various factors on responses of S. horneri polysaccharides yield and whiteness index2.1.1 消化浓度对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响
消化浓度对铜藻褐藻胶及褐藻糖胶得率的影响如图2Ⅰ所示，随着消化浓度的提高，两种糖的得率均呈现先升高再降低的趋势。当其浓度为3%时，两种糖的得率均达到最大值，分别为18.92%和7.54%，之后浓度继续增大，得率开始下降。这是由于加入Na2CO3形成的碱性环境破坏了藻体细胞壁，从而使多糖从藻体中释放增加溶解度，但随着浓度进一步提高强碱环境下多糖分子链解离，形成小分子量多糖，使其在后续处理步骤中损失[26]。
消化浓度对铜藻褐藻胶及褐藻糖胶WI的影响如图2Ⅱ所示，随着消化浓度的提高，两种糖的WI都呈现增大趋势，可能是因为消化浓度提高，Na2CO3添加量增加使pH升高。产生的强碱环境抑制了与糖共提的色素、多酚在提取过程中的氧化反应，使多糖的WI提升。
2.1.2 消化时间对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响
消化时间对铜藻褐藻胶及褐藻糖胶得率的影响如图2Ⅲ所示，随着消化时间从3 h增加到6 h，两种糖的得率显著提高（P<0.05），然而，当消化时间超过6 h时，得率逐渐降低。这些结果表明，适当的提取时间有利于多糖的溶出，但较长的时间会导致多糖的热不稳定性降解[27]，降低得率。
消化时间对铜藻褐藻胶及褐藻糖胶WI的影响如图2Ⅳ所示，随着消化时间的延长，两种糖的WI都呈现下降趋势。原因考虑为多酚、色素等物质随着反应时间的延长发生氧化反应，产生深色物质[28]，使多糖的WI降低。
2.1.3 NaClO添加量对褐藻胶及褐藻糖胶的得率及WI的影响
NaClO添加量对铜藻褐藻胶及褐藻糖胶得率的影响如图2Ⅴ所示，随着NaClO添加量的增加，两种糖的得率都呈下降趋势，其中褐藻胶得率的下降趋势较明显。原因为NaClO作为一种强氧化剂，会降解多糖使其聚合度降低[29]，从而降低其得率。
NaClO添加量对铜藻褐藻胶及褐藻糖胶WI的影响如图2Ⅵ所示，随着NaClO添加量的增加，两种多糖的WI都明显提高。NaClO作为一种漂白剂，添加量越高，漂白效果越明显。
2.2 响应面试验结果分析
根据Central Composite Design试验设计原理，在单因素实验的基础上，以消化浓度、消化时间、NaClO添加量三个因素为自变量，综合评分为响应值，进行三因素三水平的响应面分析试验，共20个试验点。
2.2.1 试验结果
Central Composite Design试验设计方案及结果见表2。
表 2 Central Composite Design试验设计及结果Table 2. Experimental design and results of central composite design实验号 A B C 褐藻糖胶得率（%） 褐藻胶得率（%） 褐藻糖胶WI（%） 褐藻胶WI（%） 综合评分 1 1 −1 −1 8.71 17.63 31.69 72.91 36.80 2 −1 −1 1 7.18 15.21 56.47 89.62 37.00 3 1 1 −1 9.46 19.08 46.53 76.39 40.83 4 1 −1 1 8.46 17.09 54.85 83.51 39.39 5 0 0 1.682 8.71 18.52 70.11 89.71 43.21 6 −1 −1 −1 7.48 15.46 33.49 79.84 34.27 7 0 0 0 10.20 19.75 52.80 86.13 43.84 8 0 0 0 9.75 19.90 52.95 86.25 43.57 9 0 1.682 0 9.03 17.77 62.95 86.71 41.77 10 0 0 0 9.87 19.96 51.96 85.17 43.54 11 −1 1 −1 7.81 17.59 46.99 81.58 38.26 12 −1 1 1 7.54 16.95 74.59 88.51 40.80 13 −1.682 0 0 6.21 15.45 60.93 88.67 36.62 14 0 0 0 10.31 20.20 53.42 85.57 44.41 15 0 0 0 10.01 19.54 51.45 86.23 43.32 16 0 0 0 10.08 19.54 50.49 84.94 43.16 17 1.682 0 0 9.37 18.46 46.61 81.49 40.64 18 0 0 −1.682 9.32 19.70 38.88 66.66 39.57 19 1 1 1 9.12 18.77 65.46 85.07 42.94 20 0 −1.682 0 7.27 13.41 35.76 80.63 32.32 利用Design-Expert13软件进行回归分析，得到提取多糖综合评分（Y）的回归方程为：Y=43.64+1.2A+2.29B+1.18C−0.0262AB−0.0712AC−0.0837BC−1.76A2−2.32B2−0.7861C2。
2.2.2 模型的建立及方差分析
对回归模型进行方差分析，结果见表3。模型的高F值（67.45）、低P值（P<0.0001），表明该模型对提取多糖综合评分具有显著意义[27]。失拟项的F值（2.77）和P值（0.1435）说明试验误差小，可信度高。可用该回归方程进行试验分析。
表 3 回归模型和方差分析Table 3. Regression model and analysis of variance来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 224.7 9 24.97 67.45 <0.0001 ** A 19.67 1 19.67 53.15 <0.0001 ** B 71.57 1 71.57 193.35 <0.0001 ** C 18.96 1 18.96 51.23 <0.0001 ** AB 0.0055 1 0.0055 0.0149 0.9053 AC 0.0406 1 0.0406 0.1097 0.7473 BC 0.0561 1 0.0561 0.1516 0.7052 A² 44.73 1 44.73 120.86 <0.0001 ** B² 77.72 1 77.72 209.97 <0.0001 ** C² 8.9 1 8.9 24.06 0.0006 ** 残差 3.7 10 0.3701 失拟项 2.72 5 0.5442 2.77 0.1435 不显著 纯误差 0.9806 5 0.1961 总离差 228.4 19 注：*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）；R2=0.9838，R2adj=0.9692。 由方差分析结果可知，一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2均在1%水平内极显著（P<0.01），表明消化浓度、消化时间、NaClO添加量对提取多糖综合评分有极显著影响。由F值检验可知，影响顺序为：B>A>C。
2.2.3 响应面优化分析
图3为各因素间的交互作用对提取多糖综合评分的三维响应面图。三维响应面图中响应面坡度的陡峭程度反应该因素对提取多糖综合评分的影响程度。响应面越陡峭，说明影响程度越大；越平缓，影响程度越小，等高线图呈椭圆形，表明因素间交互作用显著，呈圆形则不显著[30]。综合以上并结合图3进行分析可以得出：单因素对提取多糖综合评分的影响大小顺序为：B>A>C，AB、AC、BC因素之间的交互作用不显著（P>0.05）。
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图 3 三个因素之间交互作用对综合评分的三维响应面图Figure 3. Three-dimensional response surface plots of the interaction of three factors on scores2.2.4 优化条件验证
利用Design-Expert 13软件进行分析得出最佳提取条件：消化时间6.97 h、消化浓度3.72%、NaClO添加量2.71 mL，在此条件下预测提取多糖综合评分为44.80。为实际操作方便，调整条件为消化时间7.0 h、消化浓度3.7%、NaClO添加量2.7 mL，在此条件下进行3次平行实验得到褐藻糖胶得率9.90%、褐藻胶得率19.95%、褐藻糖胶WI 62.10%、褐藻胶WI 87.83%、多糖综合评分为44.84。该结果与模型预测值十分接近，说明此模型是十分可靠的。
2.3 响应面优化前后铜藻多糖颜色对比
产品颜色是重要的感官品质，直接影响产品的售价及用途。传统工艺提取的铜藻多糖，具有藻类特有的棕色（图4）。在不对其颜色进行优化的情况下使用这种多糖，会对最终产品的色泽品质产生不利影响，从而降低消费者的接受度，限制其精深加工利用。
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图 4 响应面优化前后多糖颜色对比图注：A为褐藻胶；B为褐藻糖胶。Figure 4. Comparison of polysaccharide color before and after response surface optimization2.4 褐藻胶、褐藻糖胶性质分析
根据响应面结果，选定对提取多糖综合评分影响最小，但对WI影响较大的NaClO添加量为指标，进一步探究NaClO漂白对两种多糖性质的影响。
2.4.1 褐藻胶分子量、黏度分析
NaClO添加量对褐藻胶分子量的影响如图5。结果表明，分子量随NaClO添加量的增加呈下降趋势，这是由于NaClO在起漂白作用的同时，还会引起褐藻胶发生氧化降解使其分子量降低[31]，且呈现出强烈的负相关趋势。分子量从未漂白时的307 kDa降为175.8 kDa，但均在商业褐藻胶分子量的范围内（32~400 kDa）[32]。
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图 5 NaClO添加量对褐藻胶分子量的影响Figure 5. Effects of NaClO addition on molecular weight of alginate黏度是影响褐藻胶应用的关键指标。褐藻胶按其黏度大小可分为超低黏度（10~100 MPa·s）、低黏度（100~200 MPa·s）、中黏度（200~500 MPa·s）、高黏度（500~1000 MPa·s）和超高黏度（>1000 MPa·s）五个等级[33]。未漂白时黏度为517.17 MPa·s（高黏度），加入NaClO漂白后黏度从462.67 MPa·s（中黏度）降为83.67 MPa·s（超低黏度），可满足不同的使用需求。从图5及图6可以看出，NaClO漂白使褐藻胶分子量、黏度下降。其结果与Li等[34]使用H2O2漂白及Yamashita等[35]使用臭氧漂白褐藻胶的结果相似，表明漂白工艺在获得色泽品质良好的褐藻胶产品的同时，会导致产品分子量及黏度的降低。因此，为解决这一矛盾，需要建立最佳漂白工艺。
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图 6 NaClO添加量对褐藻胶黏度的影响注：不同小写字母表示不同NaClO添加量下褐藻胶黏度具有显著性差异（P<0.05）。Figure 6. Effects of NaClO addition on the viscosity of alginates2.4.2 褐藻胶M/G值分析
褐藻胶是由甘露糖醛酸（M）和古罗糖醛酸（G）组合的线性多糖，且两者的比例和序列决定了其用途和性能[32]。通常，高M/G比（>1）和低含量的M嵌段产生弹而软的凝胶，而低M/G比（<1）和较高含量的G嵌段产生强而硬的凝胶[36]。不同种类、不同季节、不同处理条件都会影响褐藻胶M/G值[37−38]。NaClO添加量对褐藻胶M/G值的影响如表4，结果显示，NaClO添加导致FM下降、FG升高、M/G值降低，且呈正比关系。原因考虑为NaClO对M嵌段的破坏程度大于G嵌段。此结果与Mohammed等[16]研究结果一致。但该研究仅对比了漂白前后的褐藻胶不同嵌段比例及M/G值变化，并未根据漂白程度的不同进行深入研究。值得关注的是，本研究发现NaClO漂白有利于G嵌段含量的增加，又因凝胶形成强烈依赖于G嵌段，因此NaClO漂白有利于铜藻褐藻胶凝胶强度的提高。
表 4 NaClO添加量对褐藻胶糖醛酸序列的影响Table 4. Effects of NaClO addition on the uronic acid sequence for sodium alginateNaClO添加量（mL） FM FG M/G值 0 0.749 0.251 2.990 1 0.726 0.274 2.654 1.5 0.707 0.293 2.408 2 0.664 0.336 1.974 2.5 0.663 0.337 1.971 3 0.630 0.370 1.700 2.4.3 褐藻胶凝胶强度分析
褐藻胶分子结构、凝胶制备条件及复配体系均会影响褐藻胶凝胶强度[39]。分子结构中的M/G值、分子量会影响凝胶强度[40]。褐藻胶凝胶强度随M/G值减小而升高，随分子量减少而降低。由表4和图5可知，经NaClO处理后，褐藻胶M/G值降低、分子量减小，凝胶强度呈先增后降的趋势。由图7可以看出，凝胶强度随NaClO添加量增加最终呈现出先增长后下降的趋势。在2.5 mL添加量下凝胶强度（1314.46 g/cm2）开始低于未漂白褐藻胶凝胶强度（1366.59 g/cm2）。在1 mL添加量下凝胶强度（1721.47 g/cm2）最大，较未漂白处理的凝胶强度提升了25.97%，表明加入适量NaClO不仅可以提高褐藻胶WI还能增强其凝胶强度。
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图 7 NaClO添加量对褐藻胶凝胶强度的影响注：不同小写字母表示不同NaClO添加量下褐藻胶凝胶强度具有显著性差异（P<0.05）。Figure 7. Effects of NaClO addition on the gel strength of alginates2.4.4 褐藻糖胶红外分析
未经漂白的褐藻糖胶：在3400 cm−1附近的O-H强伸缩振动峰；2940 cm−1附近的C-H伸缩振动峰；1423 cm−1处的糖类C-H变角振动；1052 cm−1附近的C-O-H中的C-O伸缩振动峰，为糖类物质的吸收峰。1640 cm−1处的C=O伸缩振动峰，证明其中有蛋白质存在。1250及823 cm−1处为硫酸基团的吸收峰[41]，669 cm−1处的芳基取代苯环的拉伸振动峰，为多酚物质的吸收峰[42]。
如图8所示，除了特征吸收峰强度的变化外，经NaClO漂白处理得到的褐藻糖胶与未处理的褐藻糖胶的红外光谱几乎相同，表明NaClO没有明显改变褐藻糖胶糖链及基团组成。未漂白褐藻糖胶在669 cm−1处能明显看出多酚吸收峰，而经漂白处理后此峰明显减小甚至消失，说明漂白对于褐藻糖胶中的多酚有明显清除或破坏作用，也进一步证实了多酚的存在及其在提取过程中发生的氧化反应，是铜藻褐藻糖胶颜色变深的分子机制。
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图 8 不同NaClO添加量下制备的褐藻糖胶红外光谱比较分析Figure 8. Comparative analysis of infrared spectrum of fucoidans prepared with different NaClO dosages2.4.5 褐藻糖胶化学组成分析
NaClO添加量对褐藻糖胶总糖、硫酸基、总酚含量的影响如图9。结果显示，总体上看，随着NaClO添加量增加，总糖、硫酸基含量增加，总酚含量减少。并结合红外光谱结果，考虑原因为NaClO的加入破坏多酚和多糖之间的连接键，使多酚在后续醇沉步骤中被分离，进而提高褐藻糖胶纯度，使总糖和硫酸基含量增加。
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图 9 NaClO添加量对褐藻糖胶基本化学组成的影响注：不同字母之间表示具有显著性差异（P<0.05）。Figure 9. Effects of NaClO addition on the basic chemical composition of fucoidans2.4.6 褐藻糖胶DPPH自由基清除能力
由图10可知，NaClO添加量增加，褐藻糖胶DPPH自由基清除率升高。当NaClO添加量由0 mL增加至3 mL时，DPPH自由基清除率由30.01%±0.05%升至80.04%±0.02%（P<0.05）。考虑其活性提高的原因有两点：通过2.4.5的含量测定可知，加入NaClO后，总糖含量提高、活性基团硫酸基含量提高，使DPPH自由基清除率升高。Husni等[43]研究发现，总糖含量越高，与糖结合的硫酸根离子就越多，含较高硫酸盐基团的褐藻糖胶会表现出更强的抗氧化性；由于NaClO的强氧化性，使褐藻糖胶降解，分子量降低，从而提高其抗氧化性。这是首次将NaClO漂白应用于褐藻胶及褐藻糖胶的联合提取工艺中，并对经NaClO漂白后得到的褐藻糖胶进行了性质研究。之前仅有NaClO应用于褐藻胶漂白工艺的研究，许小娟等[44]将NaClO应用于褐藻胶提取并对其漂白效果进行评价，Mohammed等[16]将经过NaClO漂白前后得到的褐藻胶与商业褐藻胶进行性质对比研究。
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图 10 NaClO添加量对褐藻糖胶DPPH自由基清除能力的影响注：不同小写字母表示不同NaClO添加量下褐藻糖胶DPPH自由基清除能力具有显著性差异（P<0.05）。Figure 10. Effects of NaClO addition on DPPH free radical scavenging ability of fucoidans3. 结论
本研究建立了铜藻多糖的低温消化工艺，并发现NaClO漂白可提高褐藻胶的凝胶强度并提升褐藻糖胶的纯度及活性。通过单因素实验和响应面试验，以得率和白度指数两个指标优化了铜藻中两种多糖的提取条件，得出的最佳提取条件为消化时间7.0 h、消化浓度3.7%、NaClO添加量2.7 mL，在此条件下得到褐藻糖胶得率9.90%、褐藻胶得率19.95%、褐藻糖胶WI 62.10%、褐藻胶WI 87.83%、综合评分为44.84。与预测综合评分相差在1%范围内，说明模型十分可靠。通过对褐藻胶及褐藻糖胶性质测定，发现NaClO漂白使褐藻胶分子量、黏度下降，但在白度指数上升到88.09%时，各指标在商品化褐藻胶品质指标范围内。M/G值下降结合分子量降低，使凝胶强度在适度NaClO添加量下提高，因此NaClO漂白有利于提高褐藻胶的凝胶强度。同时，NaClO漂白还有利于褐藻糖胶纯度的提升及硫酸基含量、抗氧化活性的提高。本研究揭示了褐藻糖胶中多酚的存在，说明本研究建立的低温消化工艺，有利于获得优良色泽品质的褐藻糖胶。下一步将对本研究建立的工艺进行中试和产业化，以期实现铜藻的资源化利用。
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图 2 各因素对铜藻多糖得率和白度指数的影响
注：Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ为得率，Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ为白度指数；不同小写字母之间表示各组褐藻糖胶具有显著性差异（P<0.05），不同大写字母之间表示各组褐藻胶具有显著性差异（P<0.05）。
Figure 2. Effects of various factors on responses of S. horneri polysaccharides yield and whiteness index
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图 3 三个因素之间交互作用对综合评分的三维响应面图
Figure 3. Three-dimensional response surface plots of the interaction of three factors on scores
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图 4 响应面优化前后多糖颜色对比图
注：A为褐藻胶；B为褐藻糖胶。
Figure 4. Comparison of polysaccharide color before and after response surface optimization
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图 5 NaClO添加量对褐藻胶分子量的影响
Figure 5. Effects of NaClO addition on molecular weight of alginate
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图 6 NaClO添加量对褐藻胶黏度的影响
注：不同小写字母表示不同NaClO添加量下褐藻胶黏度具有显著性差异（P<0.05）。
Figure 6. Effects of NaClO addition on the viscosity of alginates
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图 7 NaClO添加量对褐藻胶凝胶强度的影响
注：不同小写字母表示不同NaClO添加量下褐藻胶凝胶强度具有显著性差异（P<0.05）。
Figure 7. Effects of NaClO addition on the gel strength of alginates
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图 8 不同NaClO添加量下制备的褐藻糖胶红外光谱比较分析
Figure 8. Comparative analysis of infrared spectrum of fucoidans prepared with different NaClO dosages
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图 9 NaClO添加量对褐藻糖胶基本化学组成的影响
注：不同字母之间表示具有显著性差异（P<0.05）。
Figure 9. Effects of NaClO addition on the basic chemical composition of fucoidans
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图 10 NaClO添加量对褐藻糖胶DPPH自由基清除能力的影响
注：不同小写字母表示不同NaClO添加量下褐藻糖胶DPPH自由基清除能力具有显著性差异（P<0.05）。
Figure 10. Effects of NaClO addition on DPPH free radical scavenging ability of fucoidans
表 1 CCD响应面试验因素水平
Table 1 Factors and levels of CCD response surface test
水平 因素 A 消化浓度（%） B 消化时间（h） C NaClO添加量（mL） −1.682 0.48 0.96 0.32 −1 1.5 3 1 0 3 6 2 1 4.5 9 3 1.682 5.52 11.05 3.68 
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表 2 Central Composite Design试验设计及结果
Table 2 Experimental design and results of central composite design
实验号 A B C 褐藻糖胶得率（%） 褐藻胶得率（%） 褐藻糖胶WI（%） 褐藻胶WI（%） 综合评分 1 1 −1 −1 8.71 17.63 31.69 72.91 36.80 2 −1 −1 1 7.18 15.21 56.47 89.62 37.00 3 1 1 −1 9.46 19.08 46.53 76.39 40.83 4 1 −1 1 8.46 17.09 54.85 83.51 39.39 5 0 0 1.682 8.71 18.52 70.11 89.71 43.21 6 −1 −1 −1 7.48 15.46 33.49 79.84 34.27 7 0 0 0 10.20 19.75 52.80 86.13 43.84 8 0 0 0 9.75 19.90 52.95 86.25 43.57 9 0 1.682 0 9.03 17.77 62.95 86.71 41.77 10 0 0 0 9.87 19.96 51.96 85.17 43.54 11 −1 1 −1 7.81 17.59 46.99 81.58 38.26 12 −1 1 1 7.54 16.95 74.59 88.51 40.80 13 −1.682 0 0 6.21 15.45 60.93 88.67 36.62 14 0 0 0 10.31 20.20 53.42 85.57 44.41 15 0 0 0 10.01 19.54 51.45 86.23 43.32 16 0 0 0 10.08 19.54 50.49 84.94 43.16 17 1.682 0 0 9.37 18.46 46.61 81.49 40.64 18 0 0 −1.682 9.32 19.70 38.88 66.66 39.57 19 1 1 1 9.12 18.77 65.46 85.07 42.94 20 0 −1.682 0 7.27 13.41 35.76 80.63 32.32
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表 3 回归模型和方差分析
Table 3 Regression model and analysis of variance
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 224.7 9 24.97 67.45 <0.0001 ** A 19.67 1 19.67 53.15 <0.0001 ** B 71.57 1 71.57 193.35 <0.0001 ** C 18.96 1 18.96 51.23 <0.0001 ** AB 0.0055 1 0.0055 0.0149 0.9053 AC 0.0406 1 0.0406 0.1097 0.7473 BC 0.0561 1 0.0561 0.1516 0.7052 A² 44.73 1 44.73 120.86 <0.0001 ** B² 77.72 1 77.72 209.97 <0.0001 ** C² 8.9 1 8.9 24.06 0.0006 ** 残差 3.7 10 0.3701 失拟项 2.72 5 0.5442 2.77 0.1435 不显著 纯误差 0.9806 5 0.1961 总离差 228.4 19 注：*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）；R2=0.9838，R2adj=0.9692。
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表 4 NaClO添加量对褐藻胶糖醛酸序列的影响
Table 4 Effects of NaClO addition on the uronic acid sequence for sodium alginate
NaClO添加量（mL） FM FG M/G值 0 0.749 0.251 2.990 1 0.726 0.274 2.654 1.5 0.707 0.293 2.408 2 0.664 0.336 1.974 2.5 0.663 0.337 1.971 3 0.630 0.370 1.700
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