Preparation, Characterization and in Vitro Antioxidant Activity of Low Molecular Weight Porphyra haitanensis Polysaccharides Nano-selenium
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摘要: 目的：制备低分子量坛紫菜多糖纳米硒（SPS-SeNPs），检测其形态特征及抗氧化活性。方法：以多糖浓度、反应时间、反应温度作为实验因素，采用双波长比色法测定SPS-SeNPs中纳米硒（SeNPs）的粒径变化，以SPS-SeNPs溶液的吸光度比值（A410/490）为评价指标，采用单因素及正交试验考察SPS-SeNPs的制备工艺。使用扫描电子显微镜、透射电子显微镜、X射线衍射和X射线光电子能谱分析对SPS-SeNPs进行结构表征。研究其总抗氧化活性、还原能力、DPPH自由基清除率。结果：制备SPS-SeNPs最佳条件为：多糖浓度2 mg/mL，反应温度为40 ℃，反应时间为0.5 h，该条件下制备出的SPS-SeNPs溶液吸光度比值为2.0487±0.0082。SPS-SeNPs中的SeNPs呈现出具有良好分散性的球形形态。确定了SPS-SeNPs的元素组成百分比为：C元素（42.00%）、O元素（41.35%）、Se元素（16.65%）。证实了SPS-SeNPs中的Se为0价态的无定形硒。通过稳定性考察发现SPS-SeNPs能在4 ℃避光保存30 d仍保持稳定。与亚硒酸钠（Na2SeO3）和低分子量坛紫菜多糖（SPS）相比，SPS-SeNPs表现出良好的总抗氧化能力、还原能力和DPPH自由基清除能力（IC50=31.45±1.16 µg/mL）。结论：SPS-SeNPs结合了多糖和纳米硒的优点，既具有多糖的抗氧化性，又具有纳米硒的高生物活性。这为进一步开发和利用坛紫菜粗多糖提供了重要的理论依据。Abstract: Objective: This study endeavors to synthesize selenium nanoparticles (SPS-SeNPs) by low molecular weight Porphyra haitanensis polysaccharide, with a primary focus on assessing their morphological attributes and antioxidant efficacy. Methods: Polysaccharide concentration, reaction time, and reaction temperature were systematically manipulated to optimize the preparation process. The preparation process of SPS-SeNPs was systematically investigated through both single-factor and orthogonal experiments. The determination of SeNPs particle size within SPS-SeNPs was executed via dual-wavelength colorimetry, with the absorbance ratio (A410/490) of the SPS-SeNPs solution serving as a pivotal evaluation metric. Structural elucidation encompassed scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), X-ray diffraction (XRD), and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The investigation extended to the assessment of total antioxidant activity, reducing power, and DPPH free radical scavenging rate. Results: The optimal conditions for SPS-SeNPs preparation were ascertained at a polysaccharide concentration of 2 mg/mL, a reaction temperature of 40 ℃, and a reaction time of 0.5 h, resulting in an absorbance ratio of 2.0487±0.0082. SeNPs within SPS-SeNPs exhibited a well-dispersed spherical morphology. The elemental composition percentages of SPS-SeNPs were found to be as follows: C (42.00%), O (41.35%), and Se (16.65%). The selenium within SPS-SeNPs was validated to be in an amorphous state with a zero valence, maintaining stability over 30 days at 4 ℃ under dark storage conditions. It demonstrated outstanding total antioxidant capacity, reducing power, and DPPH free radical scavenging ability (IC50=31.45±1.16 µg/mL), surpassing the performance of sodium selenite (Na2SeO3) and low molecular weight P. haitanensis polysaccharides (SPS). Conclusions: SPS-SeNPs synergistically harness the antioxidative properties of polysaccharides and the heighten biological activity of nano-selenium, thereby furnishing substantial theoretical underpinning for the progressive development and application of crude P. haitanensis polysaccharides.
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Keywords:
- Porphyra haitanensis polysaccharide /
- SeNPs /
- antioxidant /
- orthogonal experiment /
- stability
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坛紫菜（Porphyra haitanensis），是一种具有暖温特性的海藻，也是我国东南沿海地区重要的养殖品种。坛紫菜富含人体所必需的多种氨基酸、维生素和矿物质，被誉为“营养宝库”，具有极高的营养和经济价值[1]。坛紫菜多糖是坛紫菜中的主要营养成分，具有显著的抗氧化[2]、抗衰老[3]、神经保护[4]、降血脂[5]等生物活性，被广泛用于食品及医药行业。坛紫菜多糖的分子量是影响生物活性的关键因素之一，由于其高粘度和低水溶性，可能影响机体的吸收利用，需要进行降解处理[6]。研究表明，紫菜多糖的降解方法包括物理和化学处理，这些方法能够将紫菜多糖转变成分子量较小的紫菜寡糖，从而增强其溶解度，并且能有效地提升实际利用价值及扩大其适用范围[2]。
硒（Selenium，Se）是人体生命活动所必需的微量元素，其拥有众多的生理功能，例如抗氧化、防癌抗癌、增强免疫、拮抗重金属及调节机体新陈代谢过程等[7−9]。红色单质硒（纳米硒）被认为是一种新型的硒补充剂，与无机硒、有机硒等传统硒补充剂相比，纳米硒展现出更强的生物活性和吸收性[10]。纳米硒的合成方式包括物理、化学和生物方法，但是在合成过程中容易出现团聚失活现象。因此，在制备纳米硒的过程中，通常会加入模板物质，以提高纳米硒的稳定性，同时也能调整纳米硒的形状从而增强其生物活性[11]。
多糖纳米硒是将多糖与纳米硒结合的新型材料，具有更高的生物活性和稳定性。由于多糖类物质含有大量的羟基，因此可以利用氢键与纳米硒结合，进一步阻止纳米硒的积累，同时降低纳米颗粒间的交互性[12]。此外，多糖分子所含的多种功能基团和多种空间结构可调节纳米粒子的稳定性和功能性[13]。近年来，已有研究证实，多糖纳米硒具备多种生物活性，在抵抗氧化、抗衰老、降血糖、抗炎症和抗病毒等方面都展现出了优异的效果[14−16]。因此，多糖纳米硒作为一种新型的纳米材料，具有广阔的前景和研究价值。选用天然的结构、功能合适的分子作为模板，在控制纳米硒粒径和形貌的同时还可提高生物活性。杨梦涛[17]通过利用牡蛎多糖作为模板和分散剂，制备出均匀稳定且抗氧化活性好的牡蛎多糖纳米硒颗粒。胡程等[18]以从木耳中提取的β葡聚糖为模板制备出可以抑制肝癌细胞HepG2且粒径大小均值为34.50 nm的纳米硒复合物。目前，坛紫菜多糖已经用于多糖铁复合物[19]、多糖硒复合物[20]等复合材料的制备，在药品、化妆品等行业具有潜在前景。而低分子量坛紫菜多糖（SPS）是通过H2O2/VC体系得出的小分子多糖，可以与硒结合生成多糖纳米硒，与无机硒相比更安全，具有Se与多糖的天然价值。本文采用单因素及正交试验，探究低分子量坛紫菜多糖纳米硒的最佳制备条件，以建立低分子量坛紫菜多糖纳米硒的制备方法。并对制备的多糖纳米硒进行形态结构表征及抗氧化活性研究，突出纳米硒在抗氧化活性方面的优势，将为进一步拓宽坛紫菜多糖生物活性及优势提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
头水坛紫菜 采自温州苍南县；降解坛紫菜多糖（SPS） 主要成分为半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖等，实验室自制[21]；亚硒酸钠（Na2SeO3，>98%） Sigma-Aldrich公司；抗坏血酸（VC，≥99.7%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，>99%）、硫酸亚铁（AR）、磷酸钠（AR）、七水合钼酸铵（AR）、水杨酸（AR）、铁氰化钾（AR） 国药集团化学试剂有限公司。
BSA124S电子天平 赛多利斯（上海）贸易有限公司；HS-S顶制式电动搅拌机 郑州黑马仪器有限公司；DNM-9606酶标仪 北京普朗新技术有限公司；HH-M4D数显恒温水浴锅 江苏新春兰科学仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器 上海靳澜仪器制造有限公司；ALPHA 2-4LD plus真空冷冻干燥机 德国Christ；VersaProbe 4 X射线光电子能谱仪 ULVAC-PHI；XtaLAB PRO series X射线单晶衍射仪 Rigaku；SWPRATM55扫描电子显微镜 Zeiss Merlin。
1.2 实验方法
1.2.1 SPS-SeNPs、SeNPs的制备
低分子量坛紫菜多糖纳米硒（SPS-SeNPs）的制备方法参照杨梦涛[17]的报道进行修改。向100 mL烧杯中添加浓度为0.01 mol/L亚硒酸钠（Na2SeO3）溶液，不同浓度的低分子量坛紫菜多糖溶液，使用恒速电动搅拌器以400 r/min在适宜温度下搅拌20 min，使亚硒酸钠溶液与多糖溶液混合均匀。向烧杯中添加一定体积的0.03 mol/L的VC溶液，继续反应一定时间（VC与亚硒酸钠摩尔比为3:1）。反应结束后，将制得的SPS-SeNPs溶液装入500 Da透析袋中，进行48 h透析。透析完成后，浓缩溶液并在−80 ℃冰箱预冻12 h以上，然后使用冷冻干燥机将其冻干至粉末状。
将上述方法中的多糖溶液替换为蒸馏水并在相同的条件下制备纳米硒（SeNPs）溶液。反应结束后，用纱布过滤生成的黑色单质硒，将滤液装入500 Da透析袋中，进行48 h透析。透析完成后，浓缩溶液并在−80 ℃冰箱预冻12 h以上，然后使用冷冻干燥机冻干至粉末状。
1.2.2 SPS-SeNPs的最佳制备条件研究
按照1.2.1的方法，制备SPS-SeNPs溶液。采用单因素实验结合正交设计试验方法，研究低分子量坛紫菜多糖浓度、反应温度和反应时间对纳米硒稳定性的影响。根据胶体溶液的双波长比色法[22]，以制得的样品溶液在波长410 nm和490 nm处吸光度比值（A410/490）来筛选最优制备条件，比值越大，纳米硒的粒径越小，稳定性越高[23]。
1.2.2.1 单因素实验
设定亚硒酸钠的添加量为0.01 mol/L，VC与亚硒酸钠摩尔比为3:1。通过预实验分析选取反应温度、反应时间和多糖浓度三者进行单因素实验，探究多糖浓度（0.5、1、2、3、4 mg/mL）、反应时间（0.5、1、2、3、4 h）、反应温度（40、50、60、70、80 ℃）对多糖纳米硒稳定性的影响。每个因素设定五个水平，设置固定条件为：多糖浓度2.0 mg/mL、反应温度为60 ℃、反应时间为1 h。
1.2.2.2 正交试验设计
在选定的反应温度、反应时间和多糖浓度三个参数下，根据L9（34）正交表进行试验设计，综合分析得出SPS-SeNPs的最佳制备条件，正交试验因素水平见表1。
表 1 正交试验因素与水平Table 1. Orthogonal experimental factors and levels水平 因素 A反应温度（℃） B反应时间（h） C多糖浓度（mg/mL） 1 40 0.5 1.0 2 50 1 2.0 3 60 2 3.0 1.2.3 SPS-SeNPs的表征
X射线光电子能谱仪对SPS-SeNPs进行价态分析。X射线单晶衍射仪对SPS-SeNPs进行晶型分析。扫描电子显微镜及透射电子显微镜对SeNPs、SPS-SeNPs形貌进行观察。能量色散X射线光谱仪对SPS-SeNPs元素成分进行测定。
1.2.4 稳定性考察
测定比较SPS-SeNPs溶液在4 ℃和25 ℃黑暗条件下储存0~30 d（每隔5 d测定一次）后的吸光度比值（A410/490）。根据溶液颜色、吸光度比值大小变化趋势对SPS-SeNPs的稳定性进行考察评价[24]。
1.2.5 SPS-SeNPs的抗氧化活性研究
1.2.5.1 还原能力
参考文献方法[25]，配制0.01 mg/mL的SPS-SeNPs、Na2SeO3、VC、SPS溶液，取8支试管作为样品组，分别加入不同体积（100、200、300、400、500、600、700、800 μL）的样品溶液，并用PBS（pH6.6）补足至1 mL。随后，按顺序向每管中加入1 mL的1.0%铁氰化钾溶液，在50 ℃水浴中反应20 min后，加入2.00 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应。经过5 min水浴加热后，加入1.20 mL 0.1%三氯化铁溶液，并在室温放置30 min。最后，在波长为700 nm处测定各管的吸光度。使用PBS缓冲液替代样品进行空白管调零，记录各吸光度值，并以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作还原能力曲线。
1.2.5.2 总抗氧化能力
参考文献方法[26]，配制0.5 mg/mL的SPS-SeNPs、Na2SeO3、VC、SPS溶液，取5支试管作为样品组，每管分别加入（100、200、300、400、500 μL）样品溶液，并用蒸馏水补足至1 mL。另取一支试管加入1 mL蒸馏水作为空白调零，依次向各管内加入钼酸铵反应溶液4 mL，摇匀，置于95 ℃水浴中加热90 min，随后在冰水浴中冷却，并在波长695 nm下测定吸光度值，以吸光度值反映样品的总抗氧化能力。
1.2.5.3 DPPH自由基清除实验
参考文献方法[27−28]，配制0.01 mg/mL的SPS-SeNPs、Na2SeO3、VC、SPS溶液，取6支试管作为样品组，分别加入不同体积（100、200、300、400、500、600 μL）的样品溶液，用50%甲醇补足至1.00 mL。随后，每管加入4.00 mL DPPH溶液。另取1支试管中加入3 mL 50%甲醇溶液和1 mL DPPH溶液作为对照管，以及1支试管加入5 mL 50%甲醇溶液作为空白。所有试管在暗处放置20 min后，在517 nm波长下测定吸光度。通过下式计算DPPH自由基清除率，以浓度为横坐标，以清除率为纵坐标，制作自由基清除能力曲线。
DPPH自由基清除率(%)=A0−(A1−A2)A0×100 式中：A0 为对照组的吸光度值；A1 为样品组的吸光度值；A2 为样品本底组的吸光度值。
1.3 数据处理
运用IBM SPSS Statistics 26对数据结果进行正交设计及方差分析，采用Ducan’s多重比较法对单因素实验结果进行比较分析，结果以“平均值±标准误差”表示，P<0.05表示差异显著，使用GraphPad Prism 9进行图片绘制。
2. 结果与分析
2.1 不同多糖浓度对SPS-SeNPs溶液吸光度比值的影响
如图1所示，随着SPS的浓度的增加，SPS-SeNPs溶液的A410/490比值呈现先增加后略有下降的趋势，其中在SPS浓度为2 mg/mL时A410/490达到最大2.0314±0.00849。随着SPS浓度的进一步增加，SPS-SeNPs溶液的A410/490比值有所下降。实验结果表明，适量的多糖能够有效抑制SeNPs的聚集，导致纳米硒SeNPs的粒径减小。这可能是由于多糖中的羟基与纳米硒通过氢键作用结合，从而阻止了SeNPs的聚集现象[29]。然而，随着多糖浓度的增加，多糖之间发生聚集，导致游离的羟基数量减少，从而降低了吸附SeNPs的能力。结合A410/490比值数据及经济效益分析，选择1.0、2.0、3.0 mg/mL作为正交试验多糖浓度。
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2.2 不同反应时间对SPS-SeNPs溶液吸光度比值的影响
反应时间对纳米硒粒径的调控有重要影响，随着反应时间的延长，反应体系中生成的纳米硒增多[30]。溶液逐渐由黄色变为橙色最后变为红色，颜色的变化会导致吸光度值的增加。若反应时间过长则会导致体系中SeNPs发生聚集致使粒径增大、吸光度比值减小。本实验固定反应温度为60 ℃，从图2的结果来看，随着反应时间的延长，制备出的SPS-SeNPs溶液的A410/490比值先升高后降低，反应时间为1 h与4 h下制备的SPS-SeNPs差异显著（P<0.05）。在反应时间为1 h时A410/490达到最大2.0314±0.0084。本实验吸光值变化趋势与杨梦涛[17]、胡程等[18]的报道一致。从控制纳米硒粒径及时间成本考虑，选择0.5、1、2 h作为正交试验时间梯度。
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图 2 反应时间对SPS-SeNPs溶液A410/490的影响Figure 2. Effects of reaction time on the A410/490 ratio of SPS-SeNPs solutions2.3 不同反应温度对SPS-SeNPs溶液吸光度比值的影响
反应温度对纳米硒粒径的调控有重要影响，温度过低或过高都不利于纳米硒粒径的控制。由图3可知，A410/490比值随着反应温度从40 ℃逐渐升高至70 ℃呈现先上升后下降的趋势，当反应温度为50 ℃时，A410/490达到最大2.0387±0.0033。当反应温度为80 ℃时，反应后烧杯壁有明显红色物质聚集，A410/490显著变小（P<0.05）。这可能是由于高温使纳米颗粒剧烈运动，增加碰撞机会导致纳米粒子不断聚集，最终使得粒径增大，A410/490比值减小[31]。结合A410/490比值数据及反应现象分析，选择40、50、60 ℃作为正交试验反应温度。
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图 3 反应温度对SPS-SeNPs溶液A410/490的影响Figure 3. Effects of reaction temperature on the A410/490 ratio of SPS-SeNPs solutions2.4 正交试验设计优化SPS-SeNPs制备条件
基于上述单因素实验的结果，以反应温度（A）、反应时间（B）、多糖浓度（C）为变量，选择最适宜的条件作为试验水平，各设三个水平，将制备完成的SPS-SeNPs溶液的A410/490比值作为因变量进行正交试验设计。正交试验结果详见表2。
表 2 正交试验结果Table 2. Results of orthogonal experiment试验号 因素 A410/490 A反应温度 B反应时间 C多糖浓度 空白 1 1 1 1 1 2.0395±0.0092 2 1 2 2 2 2.0376±0.0093 3 1 3 3 3 2.0311±0.0033 4 2 1 2 3 2.0391±0.0055 5 2 2 3 1 2.0233±0.0032 6 2 3 1 2 1.9285±0.0214 7 3 1 3 2 1.9985±0.0026 8 3 2 1 3 1.8741±0.0436 9 3 3 2 1 2.0121±0.0090 K1 18.3247 18.2312 17.5262 18.2244 K2 17.9727 17.8047 18.2663 17.8939 K3 17.6539 17.9152 18.1587 17.8329 k1 2.0361 2.0257 1.9474 2.0249 k2 1.9970 1.9783 2.0296 1.9882 k3 1.9615 1.9906 2.0176 1.9814 R 0.0745 0.0474 0.0822 0.0435 较优水平 A1 B1 C2 因素主次 C>A>B 以空白组作为误差项，由方差分析结果（表3）可看出，多糖浓度、反应时间和反应温度均对纳米硒的稳定性产生显著影响（P<0.01）。这三个因素的主次关系为C（多糖浓度）>A（反应温度）>B（反应时间），得出的最佳制备工艺条件为A1B1C2。
表 3 方差分析表-主体间效应检验Table 3. Analysis of variance table-intersubjective effect test方差来源 III类平方和 自由度 均方差 F 显著性 修正模型 0.071a 6 0.012 15.659 截距 107.804 1 107.804 141821.575 A 0.025 2 0.013 16.447 *** B 0.011 2 0.005 7.162 ** C 0.036 2 0.018 23.368 *** 误差 0.015 20 0.001 总计 107.891 27 修正后总计 0.087 26 注：**表示P<0.01，***表示P<0.001。 进行验证实验，得出最佳制备条件下多糖纳米硒的吸光度比值A410/490为2.0487±0.0082，高于正交试验中最高第一组的A410/490的数值2.0395±0.0092，因此最终得出的最佳制备条件为：反应温度40 ℃，反应时间0.5 h，多糖浓度2.0 mg/mL。
2.5 SPS-SeNPs的表征
2.5.1 SeNPs、SPS-SeNPs 的形貌考察
如图4（a）所示，在扫描电镜下，多糖呈多孔状结构，便于吸附亚硒酸根离子（SeO32−）。由图4（b）和图5（a）可知，在没有SPS作为分散剂和稳定剂的情况下，SeNPs呈现为不规则颗粒聚集物，且粒径较大，图5（a）表明SeNPs易聚集，分散性差。由图4（c）和图5（b）可知，SPS-SeNPs呈均一分散球形，这与牡蛎、桔梗、舌状蜈蚣藻、枸杞多糖纳米硒的形状一致[17,32−35]，表明SeNPs经SPS修饰后，多糖结构中的游离活性羟基能吸附包裹生成的纳米硒，因此提高SeNPs的分散性。
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图 4 SPS（a）、SeNPs（b）和SPS-SeNPs（c）的SEM图Figure 4. SEM images of SPS (a), SeNPs (b) and SPS-SeNPs (c)2.5.2 SPS-SeNPs的表面元素分析
如图6所示，SPS-SeNPs的元素组成百分比为：C元素（42.00%）、O元素（41.35%）、Se元素（16.65%）。SPS-SeNPs的EDX谱图中出现了很强的C、O和Se元素峰，证明了由SPS和SeNPs组成的纳米复合体系的成功合成[35]。
2.5.3 晶型和价态分析
如图7（a）所示，Na2SeO3在2θ为18°、33°、37°和55°出现了四个强而尖锐的衍射峰，而图7（c）所示的XRD图谱中，在较低角度（38°）出现代表无定形态较宽的衍射峰，与文献中报道[10,36-37]的无定形Se的XRD图谱基本一致，表明制备出的SPS-SeNPs为无定形硒。SPS-SeNPs的XPS图谱如图8（a）所示，SPS-SeNPs的Se光谱结合能为56.44 eV，与文献报道的基本一致[38−39]，说明SPS-SeNPs中的Se处于基本态。此外，根据Bai等[39]的报道，Se（IV）的典型Se 3d信号在59.5 eV处有峰值，而SPS-SeNPs在59.5 eV处未发现峰值，Na2SeO3在58.8 eV处有峰值（图8（b）），经过对比证实Se（IV）被完全还原为零价硒（Se0）。
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图 7 Na2SeO3（a）、SPS（b）和SPS-SeNPs（c）的XRD图谱Figure 7. XRD patterns of Na2SeO3 (a), SPS (b) and SPS-SeNPs (c)![]()
图 8 SPS-SeNPs（a）、Na2SeO3（b）的XPS光谱图Figure 8. XPS spectra of SPS-SeNPs (a) and Na2SeO3 (b)2.6 SPS-SeNPs的稳定性考察
纳米硒（SeNPs）的稳定性是其应用价值的关键因素之一。如图9（a）所示，将SPS-SeNPs溶液分别在4 ℃和25 ℃黑暗条件下放置0~30 d，观察并记录颜色和测定A410/490比值的变化。在4 ℃避光储存的条件下，SPS-SeNPs溶液的颜色较为稳定，A410/490比值随着时间的延长略有下降后逐渐趋于稳定。而在25 ℃条件下储存时，SPS-SeNPs溶液的粒径随着储存时间的增加而变大，溶液逐渐变浑浊并且底部出现红色沉淀。这是由于25 ℃室温环境下，储存时环境温度升高使得多糖粘度降低且SeNPs表面电荷减弱，溶液稳定性降低[40]。结果表明，利用SPS作为分散剂和稳定剂制备的SPS-SeNPs溶液能在4 ℃避光保存30 d仍保持稳定。
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图 9 SPS-SeNPs在4 ℃和25 ℃黑暗条件下放置0~30 d的溶液颜色变化（a）和A410/490比值变化（b）Figure 9. Changes in solution colour (a) and A410/490 ratio (b) of SPS-SeNPs at 4 ℃ and 25 ℃ in the dark for 0~30 d2.7 SPS-SeNPs抗氧化活性研究
2.7.1 还原能力
还原能力的测定原理是将铁氰化钾中的铁离子（Fe3+）还原成亚铁离子（Fe2+），亚铁氰化钾再与Fe3+作用生成普鲁士蓝，在700 nm处测定吸光度值，吸光度值越高，则说明还原能力越强[41]。图10显示了在以VC为阳性对照的情况下，SPS-SeNPs、Na2SeO3、SPS的还原能力。在10~80 µg/mL浓度范围内，SPS-SeNPs的还原能力与浓度呈正相关。相比之下，SPS在10~80 µg/mL浓度范围内几乎未表现出还原能力，SPS-SeNPs中SeNPs占比16.65%，这表明SPS与SeNPs在抗氧化方面起协同作用[17]。
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图 10 SPS-SeNPs、Na2SeO3、VC、SPS的还原能力Figure 10. Reducing power of SPS-SeNPs, Na2SeO3, VC and SPS2.7.2 总抗氧化能力
采用钼蓝法[42]评价样品的总抗氧化能力大小。在硫酸和磷酸钠的存在下，+6价的钼（Mo）会被还原成在695 nm处有最大吸收峰且显蓝色的+5价复合物。当有样品存在时，Mo与样品竞争被还原，所以样品的抗氧化能力可以通过695 nm下钼蓝的生成量多少评价。图11显示，在50~250 µg/mL浓度范围内，SPS-SeNPs、VC的总抗氧化能力与浓度呈量效关系，而Na2SeO3几乎没有总抗氧化能力。SPS-SeNPs的总抗氧化能力仅次于VC，SPS-SeNPs的浓度越高，总抗氧化能力越接近VC，表明SPS-SeNPs结合了多糖和纳米硒的优点，既具有多糖的抗氧化性，又具有纳米硒的高生物活性。
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图 11 SPS-SeNPs、Na2SeO3、VC、SPS的总抗氧化能力Figure 11. Total antioxidant capacity of SPS-SeNPs, Na2SeO3、VC and SPS2.7.3 DPPH自由基清除能力
DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一种稳定的自由基，可被抗氧化剂中和。通过DPPH自由基清除实验可以探究SPS-SeNPs对DPPH自由基的清除效果，为后续的研究提供重要的参考依据[43]。由图12可以看出，在10~60 µg/mL浓度区间内，SPS-SeNPs对DPPH自由基的清除率随着浓度的升高而增大（IC50=31.45±1.16 µg/mL）。而当SPS-SeNPs的浓度为60 µg/mL时，DPPH自由基清除效率达到最大，清除率为91.37%。而SPS在浓度范围内对DPPH自由基几乎没有清除能力，而纳米硒占比16.65%的SPS-SeNPs对DPPH自由基表现出高清除活性，结果表明SPS-SeNPs对DPPH自由基的清除能力与SeNPs直接相关。
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图 12 SPS-SeNPs、Na2SeO3、VC、SPS的DPPH自由基清除能力Figure 12. DPPH radical scavenging ability of SPS-SeNPs, Na2SeO3, VC and SPS3. 结论
本文采用氧化还原法制备低分子量坛紫菜多糖纳米硒（SPS-SeNPs）。研究发现，在多糖浓度为2.0 mg/mL，反应温度40 ℃，反应时间0.5 h的条件下，制备的SPS-SeNPs粒径小且性质稳定。结构表征结果显示，SPS-SeNPs呈现分散球形，这表明SeNPs经SPS修饰后，多糖结构中的游离活性羟基能吸附包裹生成的纳米硒，因此提高SeNPs的分散性。同时使用EDX元素分析明确了SPS-SeNPs的元素组成为C元素（42.00%）、O元素（41.35%）、Se元素（16.65%），且证实了SPS-SeNPs中的Se为0价态的无定形硒。稳定性方面，SPS-SeNPs在4 ℃避光保存30 d仍保持稳定，而在25 ℃条件下，SPS-SeNPs的稳定性降低，表明在最佳制备条件下可以制备出高稳定性的SPS-SeNPs。通过对其抗氧化实验发现，SPS-SeNPs具备优异的总抗氧化能力、还原能力、DPPH自由基清除能力。本研究表明，SPS-SeNPs具有良好的稳定性和抗氧化活性，为进一步研究坛紫菜多糖纳米硒的生物活性提供了重要的理论依据。这使得紫菜多糖纳米硒在生物医学和食品工业中具有广阔的应用前景，为提高坛紫菜这一经济红藻的高值化利用奠定基础。
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图 2 反应时间对SPS-SeNPs溶液A410/490的影响
Figure 2. Effects of reaction time on the A410/490 ratio of SPS-SeNPs solutions
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图 3 反应温度对SPS-SeNPs溶液A410/490的影响
Figure 3. Effects of reaction temperature on the A410/490 ratio of SPS-SeNPs solutions
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图 4 SPS（a）、SeNPs（b）和SPS-SeNPs（c）的SEM图
Figure 4. SEM images of SPS (a), SeNPs (b) and SPS-SeNPs (c)
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图 7 Na2SeO3（a）、SPS（b）和SPS-SeNPs（c）的XRD图谱
Figure 7. XRD patterns of Na2SeO3 (a), SPS (b) and SPS-SeNPs (c)
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图 8 SPS-SeNPs（a）、Na2SeO3（b）的XPS光谱图
Figure 8. XPS spectra of SPS-SeNPs (a) and Na2SeO3 (b)
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图 9 SPS-SeNPs在4 ℃和25 ℃黑暗条件下放置0~30 d的溶液颜色变化（a）和A410/490比值变化（b）
Figure 9. Changes in solution colour (a) and A410/490 ratio (b) of SPS-SeNPs at 4 ℃ and 25 ℃ in the dark for 0~30 d
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图 10 SPS-SeNPs、Na2SeO3、VC、SPS的还原能力
Figure 10. Reducing power of SPS-SeNPs, Na2SeO3, VC and SPS
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图 11 SPS-SeNPs、Na2SeO3、VC、SPS的总抗氧化能力
Figure 11. Total antioxidant capacity of SPS-SeNPs, Na2SeO3、VC and SPS
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图 12 SPS-SeNPs、Na2SeO3、VC、SPS的DPPH自由基清除能力
Figure 12. DPPH radical scavenging ability of SPS-SeNPs, Na2SeO3, VC and SPS
表 1 正交试验因素与水平
Table 1 Orthogonal experimental factors and levels
水平 因素 A反应温度（℃） B反应时间（h） C多糖浓度（mg/mL） 1 40 0.5 1.0 2 50 1 2.0 3 60 2 3.0 
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表 2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiment
试验号 因素 A410/490 A反应温度 B反应时间 C多糖浓度 空白 1 1 1 1 1 2.0395±0.0092 2 1 2 2 2 2.0376±0.0093 3 1 3 3 3 2.0311±0.0033 4 2 1 2 3 2.0391±0.0055 5 2 2 3 1 2.0233±0.0032 6 2 3 1 2 1.9285±0.0214 7 3 1 3 2 1.9985±0.0026 8 3 2 1 3 1.8741±0.0436 9 3 3 2 1 2.0121±0.0090 K1 18.3247 18.2312 17.5262 18.2244 K2 17.9727 17.8047 18.2663 17.8939 K3 17.6539 17.9152 18.1587 17.8329 k1 2.0361 2.0257 1.9474 2.0249 k2 1.9970 1.9783 2.0296 1.9882 k3 1.9615 1.9906 2.0176 1.9814 R 0.0745 0.0474 0.0822 0.0435 较优水平 A1 B1 C2 因素主次 C>A>B
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表 3 方差分析表-主体间效应检验
Table 3 Analysis of variance table-intersubjective effect test
方差来源 III类平方和 自由度 均方差 F 显著性 修正模型 0.071a 6 0.012 15.659 截距 107.804 1 107.804 141821.575 A 0.025 2 0.013 16.447 *** B 0.011 2 0.005 7.162 ** C 0.036 2 0.018 23.368 *** 误差 0.015 20 0.001 总计 107.891 27 修正后总计 0.087 26 注：**表示P<0.01，***表示P<0.001。
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