槲皮素（Quercetin，Que）是从果蔬、中草药中提取而来食源性多羟基黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等广泛的生物作用，可治疗高血压、炎症、糖尿病等多种疾病，特别对心血管疾病药用价值较为突出^[1−2]。Que可改善双氧水（H₂O₂）介导的心肌细胞氧化损伤^[3]、小鼠缺血再灌注损伤^[4]、内毒素血症小鼠心肌损伤^[5]、多柔比星（Doxorubicin，Dox）所致的小鼠心肌损伤等^[6]，其中Dox引发的一系列心脏功能问题限制了其临床应用。Dox为蒽环类抗肿瘤药物，已被广泛用于多种实体瘤的临床治疗，Dox的心脏毒副作用伴随左室射血分数（LVEF）与左室短轴缩短率（LVFS）降低、心律失常、心力衰竭等症状^[7−8]。深入研究Dox所致的心脏损伤并积极寻找安全有效的防治措施是当前抗肿瘤防治的热点问题。Que可改善Dox所致的小鼠心肌损伤，但Que保护Dox引起的心肌损伤作用机制尚未明确，可能与抗氧化、抑制炎症，改善心肌细胞凋亡，减轻炎性反应等有关^[9−10]。PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路与调节心脏发育、血管生成、氧化应激及凋亡密切相关，通过影响下游多种效应分子的活化状态（Bax、Bcl-2、Caspase-3等），在细胞内发挥抗凋亡，促进细胞生存等功能^[11−12]。

因此，本实验通过建立Dox诱导的小鼠急性心肌损伤模型，探究Que能否激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路改善心肌损伤，完善Que发挥心肌保护作用的机制及途径，为开发天然功能性保健食品或药品预防和治疗抗肿瘤药物导致的心肌损伤提供理论依据与实验基础。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

C57BL/6小鼠　16~20 g，雄性50只，辽宁长生生物技术股份有限公司，生产许可证编号：SCXK（辽）2021-0001，符合牡丹江医学院实验动物伦理审查20210304-50；槲皮素　纯度≥95%，美国Sigma公司；盐酸多柔比星（纯度≥98%）、飞克特超敏ECL发光液　大连美仑生物技术公司；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）ELISA试剂盒　南京建成生物工程研究所；Tunel凋亡检测试剂盒　瑞士Roche公司；麦芽凝集素WGA试剂盒　美国Gene Tex公司；PVDF膜　美国Millipore公司；PAGE凝胶配制试剂盒　武汉赛维尔生物科技公司；PI3K p85 alpha抗体、Phospho-AKT1/2/3抗体、AKT1/2/3抗体、Phospho-GSK3 beta抗体、GSK3 beta抗体、beta Catenin抗体　上海亲科生物有限公司；Bax抗体、Bcl-2抗体、Cleaved Caspase 3抗体、GAPDH抗体　北京博奥森生物公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为三蒸水。

Vevo2100小动物超声影像系统　加拿大VisualSonics公司；TGL-16M高速冷冻离心机　长沙平凡仪器仪表有限公司；Synergy HT全自动多功能酶标仪　美国BioTek公司；CKX31光学显微镜、DM1400荧光显微镜　日本Olympus公司；DM4000B图像采集信号分析系统　德国Leica公司；VE-180型垂直电泳仪、Tanon-5200Multi凝胶成像系统　上海天能科技有限公司。

1.2   实验方法

1.2.1   动物分组与给药

将50只C57BL/6小鼠随机分为5组，即正常组（Control）、模型组（Dox）、槲皮素低、中、高剂量组（Que-L、Que-M、Que-H），每组10只。除Control组外分别在第1、4、7、10 d腹腔注射Dox，每次6 mg/kg，累计注射24 mg/kg，建立小鼠心肌损伤模型^[13−14]，Control组腹腔注射等体积生理盐水，Que-L、Que-M、Que-H组分别灌胃给予20、40、80 mg/kg的Que连续14 d^[15−16]，Control组与Dox组灌胃给予等体积蒸馏水。

1.2.2   小鼠心脏功能检测

在Dox刺激14 d后，进行超声心动图评估左心室功能。腹腔注射0.3%戊巴比妥钠10 mL/kg^[17]，麻醉后，固定在恒温板上，胸部脱毛，应用心脏超声检测仪，对各组小鼠进行心脏超声心动图检查，连续测量3个完整的心动周期，测量左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVEDs），数据取3次测量的平均值，计算左室射血分数（LVEF）与左室短轴缩短率（LVFS），评价小鼠心脏功能。

式中，LVESV为左室收缩末期容积；LVEDV为左室舒张末期容积；LVIDd为左心室舒张期内径；LVIDs为左心室收缩期内径。

1.2.3   ELISA法检测小鼠血清中LDH、CK-MB、SOD、MDA含量

采用内眦静脉采血，颈椎脱臼处死小鼠，取心脏组织，一部分保存于4%多聚甲醛溶液中，另一部分−80 ℃冷冻保存，以备后续实验。小鼠血以3000 r/min离心10 min，取上层血清，按试剂盒说明书操作检测血清中LDH、CK-MB、SOD、MDA含量，以检测小鼠心肌损伤及氧化损伤情况。

1.2.4   HE染色观察小鼠心肌组织病理学形态

取“1.2.3”中4%多聚甲醛溶液中组织，常规脱水、透明，石蜡包埋^[18]，连续切片（5 μm），制片。苏木精染色液染色5 min，洗净，分化，洗净，返蓝；伊红染色5 min，染色后采用纯酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察各组小鼠心脏组织病理变化情况。

1.2.5   WGA染色检测小鼠心肌细胞

取“1.2.4”石蜡切片，脱蜡水化后，滴加WGA-FITC染色液，每块组织滴加WGA-FITC染色液30 µL（10 µmol/L），避光37 ℃摇床孵育30 min；弃反应液，PBS清洗5 min，3次；滴加DAPI反应液，复染细胞核，室温避光反应10 min，PBS清洗5 min、3次^[19]，荧光显微镜拍摄观察，采用Image J软件分析细胞大小，检测心肌细胞是否肿胀。

1.2.6   Tunel染色检测小鼠心肌组织凋亡

取“1.2.4”石蜡切片，脱蜡水化后滴加Proteinase K工作液（0.02%）静置30 min，除去组织中蛋白，PBS清洗5 min、3次，滴加Tunel检测液40 µL于37 ℃避光反应60 min后滴加DAPI染色液，复染细胞核，室温避光反应10 min后，滴入抗荧光淬灭剂封片，PBS清洗5 min、3次^[20]，荧光显微镜拍摄，通过Image J软件分析计算细胞凋亡率。

1.2.7   免疫荧光检测小鼠心肌组织p-GSK-3β蛋白表达

取“1.2.4”石蜡切片，脱蜡水化，微波炉枸橼酸抗原修复4次，冷却后用5% BSA于37 ℃封闭30 min，滴加p-GSK-3β一抗（1:100），4 ℃过夜；吸去一抗，PBS冲洗3次，滴加CY5标记二抗，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗，滴加DAPI染核，37 ℃孵育10 min后，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜扫片^[21]，观察免疫荧光标记蛋白表达情况。

1.2.8   小鼠心肌组织中PI3K/AKT/GSK-3β信号通路检测

取“1.2.3”中−80 ℃心肌组织50 mg，加入500 μL裂解液与蛋白酶抑制剂5 μL于研磨器中，均匀研磨后，超声破碎，冰浴30 min，4 ℃ 12000 r/min离心10 min，取上清液，蛋白样品与Loading Buffer混匀后煮沸10 min；蛋白样品上样量20 μg，进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1.5 h，弃去封闭液，滴加一抗PI3K（1:1000）、AKT（1:1000）、p-AKT（1:1000）、GSK-3β（1:1500）、p-GSK-3β（1:2000）、β-catenin（1:1000）、Bax（1:1000）、Bcl-2（1:1000）、Cleaved Caspase-3（1:2000）、GAPDH（1:10000），4 ℃过夜；次日，回收抗体，TBST洗膜4次，每次5 min，加入对应二抗（1:7000），37 ℃摇床孵育1 h，TBST洗膜4次，ECL显影；采用软件Image J对蛋白条带分析结果。

1.3   数据处理

数据均表示为平均值±标准差（x±s，n=3），用GraphPad Prism 8.3.0软件进行统计分析。多组间采用单因素方差分析（One Way ANOVA），组间两两比较采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.   结果与分析

2.1   Que改善Dox损伤小鼠心脏功能

小鼠超声心动图检测结果如图1所示，与Conrol组比较，Dox组小鼠LVEF与LVFS极显著下降，LVEDd与LVEDs极显著增加（P<0.01），表明小鼠心脏功能受损，造模成功；与Dox组比较，Que不同剂量组LVEF与LVFS极显著升高，LVEDd与LVEDs极显著降低（P<0.01），表明Que可改善Dox引起的小鼠心脏功能受损，其中Que-H组效果最佳。

图  1  小鼠超声心动图检测结果（n=6）

注：Control.正常组；Dox：模型组；Que-L：槲皮素低剂量组；Que-M：槲皮素中剂量组；Que-H：槲皮素高剂量组；与Control组比较，##P<0.01，差异极显著；与Dox组比较，**P<0.01，差异极显著；图2~图7同。

Figure  1.  Results of echocardiography in mice (n=6)

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2.2   Que对Dox心肌损伤小鼠血清生化指标的影响

Que改善小鼠心肌损伤血清生化指标如图2所示，与Conrol组比较，Dox组小鼠CK-MB与LDH含量极显著升高（P<0.01），SOD极显著降低（P<0.01），MDA极显著升高（P<0.01），表明Dox组小鼠出现明显的心肌损伤同时伴有氧化应激失衡；与Dox组比较，Que各剂量组CK-MB与LDH极显著降低（P<0.01），SOD极显著增加（P<0.01），MDA极显著降低（P<0.01），表明Que可改善Dox引起的心肌损伤同时提高机体抗氧能力，且Que-H组效果最佳。

图  2  槲皮素对心肌损伤小鼠血清CK-MB、LDH、SOD、MDA的影响（n=6）

Figure  2.  Effects of quercetin on serum CK-MB, LDH, SOD and MDA in mice with myocardial injury (n=6)

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2.3   Que对Dox诱导的心肌损伤小鼠心肌组织形态的影响

HE染色结果如图3所示，Control组小鼠心肌细胞排列均匀，形态正常，未见异常形态细胞。与Control组比较，Dox组小鼠出现心肌细胞肿胀，空泡变性，心肌纤维排列紊乱，伴有间质纤维化，如图中箭头所示；与Dox组比较，Que各剂量组心肌细胞排列较均匀，肿胀减轻，空泡变性减少，心肌纤维排列有序。结果说明Que可减轻Dox所致心肌细胞损伤程度，其中Que-H组效果最为显著。

图  3  小鼠心肌组织形态学结果（400×）

Figure  3.  Results of myocardial histomorphology in mice (400×)

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2.4   Que对Dox诱导的小鼠心肌组织横截面积影响

WGA染色结果如图4所示，绿色荧光为WGA染色，WGA可特异性结合心肌细胞膜上的糖蛋白，对心肌细胞进行膜染色，DAPI为细胞核染色，绿色荧光所围成面积为细胞横截面积，通过Image J软件分析计算细胞横截面积。与Control组比较，Dox组小鼠心肌细胞横截面积极显著增加（P<0.01），表明Dox所致心肌损伤伴随一定的心肌肿胀。与Dox组比较，Que各剂量组小鼠心肌细胞横截面积极显著降低（P<0.01），表明Que可减少Dox引起的心肌肿胀，Que-H组效果最为显著。

图  4  小鼠心肌细胞横截面积检测（400×）

Figure  4.  Detection of myocardial cell cross-sectional area in mice (400×)

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2.5   Que对Dox诱导的小鼠心肌组织凋亡影响

小鼠心肌组织Tunel染色结果如图5所示，绿色荧光为Tunel染色，可与细胞核中断裂的DNA反应，反映心肌细胞凋亡程度，通过Image J软件分析计算细胞凋亡率。与Control组比较，Dox组心肌细胞凋亡率极显著增加（P<0.01）；与Dox组比较，Que各剂量组心肌细胞凋亡率极显著降低（P<0.01），表明Que可改善Dox引起的心肌细胞凋亡，从而缓解心肌损伤，且Que-H组效果最佳。

图  5  小鼠心肌组织凋亡结果（400×）

Figure  5.  Results of myocardial apoptosis in mice (400×)

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2.6   小鼠心肌组织p-GSK-3β蛋白表达变化

免疫荧光检测小鼠心肌组织p-GSK-3β蛋白表达如图6所示，图中红色荧光为p-GSK-3β特异性染色，与Control组比较，Dox组心肌组织中p-GSK-3β表达极显著降低（P<0.01），与Dox组比较，Que各剂量组心肌组织中p-GSK-3β表达极显著增加（P<0.01），Que-H组最为显著。结果表明，Que可增加Dox心肌损伤小鼠组织中p-GSK-3β的表达。

图  6  免疫荧光检测小鼠心肌组织p-GSK-3β表达（400×）

Figure  6.  Detection of p-GSK-3β expression in myocardial tissue of mice by immunofluorescence (400×)

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2.7   Que对Dox小鼠心肌组织中PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路的影响

Western blot结果如图7所示，与Control组比较，Dox组心肌组织中PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、β-catenin表达极显著降低（P<0.01），Bax/Bcl-2与Cleaved Caspase-3表达极显著升高（P<0.01），表明凋亡水平增加；与Dox组比较，Que各剂量组PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、β-catenin表达极显著增加（P<0.01），Bax/Bcl-2与Cleaved Caspase-3表达极显著降低（P<0.01），表明凋亡水平降低，结果表明Dox所致的心肌损伤会抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路，Que可通过激活PI3K/AKT/GSK-3β通路改善心肌损伤，且Que-H组效果最佳。

图  7  PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白检测（$\stackrel{-}{{{\mathrm{x}}}}$±s，n=3）

Figure  7.  Detection of PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin pathway protein ($\stackrel{-}{\mathrm{x}}$±s，n=3)

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3.   讨论与结论

Dox作为临床抗肿瘤药物会引起一系列的心肌损伤症状，Dox引起心肌损伤作用机制较为复杂，包括氧化应激、细胞凋亡、钙超载、线粒体功能障碍等^[22−23]；其中细胞凋亡等机制是其关键环节之一，Dox通过降解丝氨酸苏氨酸蛋白酶（AKT），促进Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3等凋亡因子释放引起心肌细胞凋亡造成心肌功能受损，心肌纤维化等症状^[24−25]。

槲皮素（Que），是一种具有多种生物活性的多羟基黄酮类化合物，具有抗氧化、抑制炎症、降血压、扩张血管等生物学效应而发挥心血管保护作用^[24−25]。本实验通过Que干预Dox诱导小鼠心肌损伤模型后发现，Dox引发的心肌损伤主要表现心脏功能减弱、两种心肌损伤标志物CK-MB与LDH含量增加的同时伴随机体氧化应激失衡，病理检测结果提示小鼠心肌细胞肿胀凋亡加重，心肌纤维化增加，其原因可能是Dox进入心肌细胞后被线粒体NADH氧化还原酶催化为带有一个电子的半醌代谢物，半醌代谢物极不稳定，在氧化还原循环过程中会产生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），ROS增多触发心肌细胞凋亡通路，导致一系列心脏功能问题^[26−27]。通过Que干预后可保护小鼠心肌损伤，增加血清中SOD含量同时降低MDA含量，清除机体内过度的活性氧（ROS）提高机体抗氧化能力，改善细胞膜的通透性阻止CK-MB与LDH的释放^[28]，恢复心肌细胞状态，减轻心肌细胞肿胀与凋亡；Que通过增加PI3K与磷酸化AKT（p-AKT）表达抑制AKT降解，同时激活GSK-3β的9号Ser位点磷酸化（p-GSK-3β），p-GSK-3β表达增多可抑制β-连环蛋白（β-catenin）的降解，β-catenin是多功能蛋白质，β-catenin可进入细胞核抑制Bax表达、减少Cleaved Caspase-3释放，抑制Cleaved Caspase-3介导的心肌细胞凋亡级联反应^[29−30]，减少心肌细胞凋亡从而发挥其保护心肌功能的作用。

综上所述，槲皮素对Dox诱导的急性心脏损伤有保护作用，主要表现在保护心功能、减轻心肌细胞氧化损伤、减少心肌细胞肿胀与凋亡等方面；其作用机制为激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路，抑制Bax/Bcl-2与Cleaved Caspase-3表达，降低心肌凋亡水平。但由于条件限制，本研究未在细胞水平进行分析，此外，心肌损伤机制复杂，槲皮素作用靶点繁多，能否通过其它途径改善心肌损伤将在后续展开研究。