Mechanism of Poria cocos Polysaccharide Regulating Autophagy and Chemotherapy Resistance of Hepatocellular Carcinoma Cells through LncRNAHCG11/miR-539-3p 539-3p
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摘要: 目的：探讨茯苓多糖（Poria cocos polysaccharide，PCP）对肝癌细胞增殖、自噬和化疗耐药的影响及机制。方法：对数期HepG-2/DDP细胞随机分组：对照组、PCP组（7.5、15、30 µg/mL PCP）、shNC 组、HCG11 siRNA组（转染50 nmol/L HCG1干扰序列）、pcDNA组（转染2 µg pcDNA）、pcDNA3.1-HCG11组（转染2 µg pcDNA3.1-HCG11）、PCP组（30 µg/mL）和PCP+pcDNA3.1-HCG11组（转染2 µg pcDNA3.1-HCG11+30 µg/mL PCP）。MTT检测肝癌细胞耐药情况和抑制率，Western blot检测Beclin-1、LC3 I和LC3 II水平，实时荧光定量PCR（Real time quantitative PCR，qRT-PCR）检测细胞株中LncRNA HCG11和miR-539-3p的水平，双荧光素酶报告实验检测LncRNA HCG11和miR-539-3p的靶向关系，裸鼠成瘤实验验证体内瘤体的瘤重、瘤体积及自噬相关蛋白水平。结果：4~128 µg/mL PCP抑制HepG-2/DDP细胞增殖，7.5、15、30 µg/mL的PCP能显著降低HepG-2/DDP细胞中MRP1、P-gp、Beclin-1、LC3II的水平，下调HCG11水平，增加miR-539-3p的表达水平（P<0.01）；与对照组比较，HCG11 siRNA 组HepG-2/DDP细胞HCG11相对表达水平、IC50（顺铂）、Beclin-1、LC3 II/ LC3 I比值显著降低，miR-539-3p水平和抑制率（顺铂）显著增加（P<0.01）；与PCP组比较，PCP+pcDNA3.1-HCG11处理组HCG11相对表达水平显著升高，Belin-1、LC3 II/LC3 I比值显著增加（P<0.01）；在不同浓度的顺铂处理下，与PCP组比较，PCP+pcDNA3.1-HCG11 组抑制率显著降低（P<0.01）；与PCP组比较，PCP+HCG11 shRNA 组肿瘤体积和肿瘤重量显著降低，Belin-1、LC3 II/LC3 I水平显著下调（P<0.05）。结论：PCP能通过LncRNA HCG11/miR-539-3p调控耐药和自噬，并影响肝癌细胞的增殖。
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关键词:
- 茯苓多糖 /
- LncRNA HCG11 /
- miR-539-3p /
- 化疗耐药性 /
- 自噬
Abstract: Objective: To explore the effects and mechanism of Poria cocos polysaccharide (PCP) on proliferation, autophagy and chemotherapy resistance of hepatocellular carcinoma cells. Methods: HepG-2/DDP cells in logarithmic phase were randomly divided into control group, PCP group (7.5, 15, 30 μg/mL PCP), shNC group, HCG11 siRNA group (transfection of 50 nmol/L HCG1 interference sequence), pcDNA group (transfection of 2 μg pcDNA), pcDNA3.1-HCG11 group (transfection of 2 μg pcDNA3.1-HCG11), PCP group (30 μg/mL PCP) and PCP+pcDNA3.1-HCG11 group (transfection of 2 μg pcDNA3.1-HCG11+30 μg/mL PCP). MTT assay was used to detect the drug resistance and inhibition rate of hepatocellular carcinoma cells, western blot was used to detect the levels of Beclin-1, LC3, and quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the levels of LncRNA HCG11 and miR-539-3p in the cell lines. Double luciferase report experiment was used to detect the targeting relationship between LncRNA HCG11 and miR-539-3p, and nude mice tumorigenesis experiment was used to verify the influence of tumor weight, tumor volume and autophagy-related protein level in nude mice. Results: 4~128 µg/mL PCP had a certain inhibitory effect on HepG-2/DDP cells. PCP of 7.5, 15, 30 μg/mL could significantly decrease the levels of MRP1, P-gp, Beclin-1 and LC3II, decrease the level of HCG11 and increase the expression of miR-539-3p in HepG-2/DDP cells (P<0.01). Compared with the control group, the relative expression level of HCG11, IC50 (cisplatin), Beclin-1 and LC3II/LC3I in HCG11siRNA group decreased significantly, while the level of miR-539-3p and inhibition rate (cisplatin) increased significantly (P<0.01). Compared with PCP group, the relative expression level of HCG11 in PCP+pcDNA3.1-HCG11 group increased significantly, while the ratio of Belin-1 and LC3 II/LC3 I increased significantly (P<0.01). Compared with PCP group, the inhibition rate of PCP+pcDNA3.1+HCG11 group was significantly decreased under different concentrations of cisplatin (P<0.01). Compared with PCP group, tumor volume and tumor weight in PCP+HCG11shRNA group were significantly decreased, and the levels of Belin-1 and LC3II/LC3I were significantly decreased (P<0.05). Conclusion: PCP can affect the proliferation of hepatocellular carcinoma cells by regulating drug resistance and autophagy through LncRNA HCG11/miR-539-3p.-
Keywords:
- Poria cocos polysaccharide /
- LncRNA HCG11 /
- miR-539-3p /
- chemotherapy resistance /
- autophagy
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自噬是细胞维持稳态的一种机制，在饥饿、营养缺乏或生长因子枯竭的条件下可以降解微生物、受损的细胞器和无法被蛋白酶体降解的受损蛋白质[1−2]；相反，自噬可通过破坏细胞的基本成分诱导癌细胞凋亡和死亡，是肿瘤治疗的一种有效方法[3]。
研究表明，长链非编码RNA HLA复合物11（Long non-coding RNA HCG11，LncRNA HCG11）在许多癌组织样本中异常表达，参与肿瘤的进展，与预后不良有关[4−5]，并可通过自噬相关蛋白ATG12调控自噬[6]。研究显示，miR-539-3p是一组小的、长度为18~25个核苷酸的非编码 RNA，可在转录后负调控目标基因的异常表达，抑制肝细胞癌迁移和侵袭[7]，但其与肝细胞癌的自噬和耐药性相关研究较少。
茯苓（Poria cocos）是一种功能性食药用真菌，茯苓多糖（Poria cocos polysaccharide，PCP）是茯苓的主要活性成分，具有中等分子量和良好的水溶性，主要由核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成[8]。先前的研究已经显示PCP的免疫调节以及抗肿瘤活性[9]，但其对肝癌自噬、耐药性的影响仍不清楚。另外本课题组前期预实验已经发现，HCG11的3'非翻译区（UTR）存在miR-539-3p的结合位点，但茯苓多糖能否通过LncRNA HCG11/miR-539-3p发挥作用仍不清楚。本研究主要探讨茯苓多糖对肝癌细胞以及体内肿瘤的影响，并分析其与LncRNA HCG11/miR-539-3p信号通路的关系，明确其机制。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
BALB/c裸鼠 SPF级，雄性，80只，5~6周龄，体重（16~20 g） 购自中国科学院上海动物实验中心，动物合格证号SCXK（沪）2017-0005，并经漯河医学高等专科学校实验动物伦理委员会审批，审批号：20220017；人肝癌HepG-2、HepG-2/DDP 均购自中国科学院上海细胞生物学研究所；SMMC-7721、Huh7、Bel-7405细胞株 齐氏生物科技有限公司。正常人永生化肝细胞L-02 中国科学院细胞库；茯苓 北京同仁堂；Trizol 试剂、兔抗人LC3、Beclin-1、MRP1、P-gp抗体、HRP标记的羊抗兔IgG二抗 上海碧云天生物技术有限公司；CFX系统SYBR混合液 美国Invitrogen公司；MTT细胞活力检测试剂盒 南京建成生物研究所；miR-NC、miR-539-3p mimics、HCG11 siRNA、siNC 北京科忠智生物技术开发有限公司；慢病毒 shRNA NC、HCG11 shRNA 稳转试剂盒 上海剑钝生物科技有限公司；WT、MUT荧光素报告载体 上海吉玛制药技术有限公司。
CKX41-C31B倒置荧光显微镜 奥林巴斯有限公司；ELx800全自动酶标仪 美国BioTek公司；免疫印迹化学发光成像系统 中国Tanon公司；CFX96 荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司；CO2细胞培养箱 美国Thermo公司。
1.2 实验方法
1.2.1 茯苓多糖提取
参考文献[10]的提取方法，用1000 mL蒸馏水提取500 g过40目的粉碎的茯苓粉末24 h，然后加入终体积浓度为80%的乙醇溶液，置于4 ℃下24 h。在2000 r/min 离心15 min后，通过Sevage方法去除沉淀物中的蛋白质。然后通过透析除去分子量<3500 Da的杂质。最后，通过冷冻干燥获得茯苓多糖。采用苯酚-硫酸法检测茯苓多糖的浓度[11]，其浓度为93.42%±0.12%。
1.2.2 细胞培养
肝癌HepG-2、HepG-2/DDP、SMMC-7721、Huh7、Bel-7405细胞株和人永生化肝细胞L-02均采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在CO2培养箱中孵育，细胞融合至85%左右，0.25%胰酶消化传代[12]。
1.2.3 MTT检测肝癌细胞耐药情况
选取对数生长期肝癌HepG-2、HepG-2/DDP细胞（5×103/孔）接种到96孔板，细胞贴壁后，更换含有0、5、10、20、30和40 μg/mL顺铂的培养基培养48 h，每孔加入20 μL MTT溶液，置于37 ℃、5%的CO2培养箱温育4 h。然后每孔加入200 µL二甲基亚砜（DMSO），酶标仪检测490 nm处的OD值[13]。根据下式计算细胞抑制率。
1.2.4 MTT法分析PCP对HepG-2/DDP细胞抑制率
选择对数生长期HepG-2/DDP细胞接种96孔板（5×103个/孔），贴壁后，加入终浓度分别为0、4、8、16、32、64、128 µg/mL PCP，同时只加培养基和细胞作为对照组，每组3个复孔，孵育48 h。向每个孔中加入20 µL MTT溶液，置于37 ℃ CO2培养箱温育4 h。然后将200 µL二甲基亚砜（DMSO）添加到每个孔中。采用酶标仪检测490 nm处的OD值并分析抑制率。
1.2.5 茯苓多糖对HepG-2/DDP细胞耐药的影响
设置顺铂组和顺铂+PCP（7.5 µg/mL）组，两大组均加入含有终浓度为0、5、10、20、30和40 μg/mL顺铂的培养基，在此基础上，顺铂+PCP（7.5 µg/mL）组加入终浓度为7.5 µg/mL PCP，培养48 h，MTT法分析抑制率。
1.2.6 Western blot检测耐药相关蛋白水平
将HepG-2/DDP细胞分为对照组（培养基和细胞）、PCP组（7.5、15、30 µg/mL PCP），培养48 h。采用添加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，BCA™试剂盒定量。使用Bio-Rad Bis-Tris Gel系统建立Western blot系统，并将所有印迹转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并与MRP1（1:1000）、P-gp（1:1000）、Beclin-1（1:2000）、LC3（1:2000）一抗在4 ℃下孵育过夜，TBST洗涤三次，并与以辣根过氧化物酶（HRP，1:5000）标记的二抗在室温下孵育1 h，ECL化学发光显色液进行显色，Image Lab TM软件分析蛋白条带，以蛋白质/β-actin代表蛋白相对表达水平[14]。
1.2.7 实时荧光定量PCR（Quantitative Real time PCR，qRT-PCR）检测LncRNA HCG11和miR-539-3p表达
选择HepG-2、HepG-2/DDP、SMMC-7721、Huh7、Bel-7405、L-02细胞株，使用Trizol试剂提取总RNA，分光光度法测定RNA浓度，逆转录试剂盒逆转录生成cDNA。以GAPDH和U6为内参基因，使用SYBRH Select Master Mix for CFX进行实时定量PCR。HCG11 引物序列：上游序列：5´-TTGGGCGAGACCTACCTAGT-3´，下游序列：5´-GGCCTGTCATTCTACCA-3´；GAPDH 引物序列：上游序列：5´-TTCTTTTGCGTCGCCAGGTG-3´，下游序列：5´-GGAGGGAGAGAACAGTGAGC-3´；miR-539-3p 引物序列：上游序列：5´-TCGTTCGCTCATCAAGCT TGTTA-3´，下游序列：5´-CACGTTATGCTTGTTGACCT TCAC-3´；U6引物序列：上游序列：5´-CGGCACCATGTTGGTGGA-3´，下游序列：5´-AGGTACTTGATGGTGCTGCC-3´；PCR反应：95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共30个循环。2−ΔΔCt法计算HCG11和miR-539-3p的相对表达水平[15]。
1.2.8 茯苓多糖对LncRNA HCG11、miR-539-3p水平的影响
将HepG-2/DDP细胞接种到6孔板（5×105个/孔），分为对照组（0 µg/mL PCP）、PCP组（7.5、15、30 µg/mL PCP），培养48 h。qRT-PCR检测LncRNA HCG11和miR-539-3p水平，方法同1.2.7。
1.2.9 预测及荧光素酶报告基因实验分析
starbase 在线软件预测HCG11与miR-539-3p结合位点，利用Lipofectamine2000将构建含有miR-539-3p结合位点的HCG11野生型和突变型重组质粒（HCG11-WT/MUT）分别与miR-NC、miR-539-3p mimics共转染到HepG-2/DDP细胞中，48 h后，通过双重荧光素酶报告基因测定试剂盒评估荧光素酶活性[16]。
1.2.10 下调LncRNA HCG1对HepG-2/DDP细胞自噬、耐药性的影响
设置对照组（不做任何处理）、siNC组（转染50 nmol/L HCG1阴性序列）、HCG11 siRNA组（转染50 nmol/L HCG1干扰序列），分别将siNC、HCG11 siRNA共转染到HepG-2/DDP细胞中，三组均培养48 h，qRT-PCR 方法测定 HepG-2/DDP 细胞中LncRNA HCG1、miR-539-3p表达水平，MTT法检测HepG-2/DDP细胞抑制率，Western blot 法检测自噬蛋白的表达水平。
1.2.11 HCG11高表达逆转PCP对HepG-2/DDP细胞自噬、耐药性的影响
设置pcDNA组（转染2 µg pcDNA）、pcDNA3.1-HCG11组（转染2 µg pcDNA3.1-HCG11）、PCP组（30 µg/mL）和PCP+pcDNA3.1-HCG11 组（转染2 µg pcDNA3.1-HCG11并给予30 µg/mL PCP），培养48 h，qRT-PCR方法测定 HepG-2/DDP细胞中HCG11、miR-539-3p表达水平，MTT法检测HepG-2/DDP细胞对顺铂的耐药性，Western blot 法检测自噬蛋白的表达水平。
1.2.12 动物模型建立及分组
裸鼠标准动物房饲养，温度22±5 ℃，湿度57%±8%，光暗交替各12 h，自由获得标准的饲料和水。设置给药最小剂量（1.58 g/kg）和最大剂量（5.01 g/kg），按照等比数列设置5个组别（r=0.75），每组10只，每天灌胃1次，持续观察14 d，计算LD50[17]。
分别采用HCG11 shRNA（5´-UCAUUCUACCAUUUGUCUCUU-3´）和shRNA NC（5´-UUUCUAACAUUACAUUAAGGC-3´）稳定转染的HepG-2/DDP细胞建立肿瘤移植模型，每组10只。裸鼠皮下注射上述HepG-2/DDP细胞，每周测量肿瘤体积。当肿瘤达到50~100 mm3时，分为模型组（生理盐水）、PCP（50 mg/kg）组、HCG11 shRNA组、PCP（50 mg/kg）+HCG11 shRNA给药组、5-FU组（20 mg/kg，预实验获得），均为腹腔给药，1次/3 d，给药21 d后处死裸鼠，记录肿瘤重量。检测肿瘤组织中HCG11、miR-539-3p和自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3 I、LC3 II）的水平。
1.3 数据处理
采用SPSS21.0软件对实验数据进行统计分析。数据以平均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P<0.05时认为差异有统计学意义，采用GraphPad Prism 9.0绘图。
2. 结果与分析
2.1 肝癌细胞耐药情况分析
本研究中，选择HepG-2/DDP耐药株进行了分析，并与正常HepG-2细胞株进行了比较，如图1所示，结果显示，伴随浓度的增加，顺铂对HepG-2/DDP增殖的抑制率明显增加，呈现明显的浓度梯度效应。在同一浓度顺铂处理下，HepG-2/DDP细胞抑制率显著低于HepG-2细胞（P<0.01）。顺铂对HepG-2/DDP细胞的IC50值[（44.79±2.37）μg/mL]明显高于HepG-2细胞[（17.79±1.23）μg/mL]，说明HepG-2/DDP细胞株对顺铂的耐药效果明显，同时也说明顺铂耐药细胞模型建立成功，可以进行后续研究。
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图 1 HepG-2/DDP耐药分析注：与HepG-2比较，**表示P<0.01。Figure 1. Analysis of drug resistance of HepG-2/DDP2.2 茯苓多糖对细胞增殖、自噬蛋白和耐药的影响
如图2A所示，浓度为4~128 µg/mL的PCP对肝癌HepG-2/DDP细胞具有一定的抑制作用（P<0.05，P<0.01），并呈现明显的浓度效应，表明PCP具有广谱的抗癌效果[18]，其对肝癌HepG-2/DDP细胞的IC50值为29.25 µg/mL，考虑到后续实验效果的需要，设置7.5、15、30 µg/mL三个浓度梯度进行研究。
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图 2 茯苓多糖对细胞增殖、自噬蛋白和耐药的影响注：A. PCP抑制HepG-2/DDP细胞增殖；B. PCP对HepG-2/DDP细胞耐药的影响；C~D. PCP对HepG-2/DDP细胞耐药蛋白的影响；E~F. PCP对HepG-2/DDP细胞自噬蛋白的影响；与对照组（0 µg/mL的PCP）或顺铂组比较，**P<0.01。Figure 2. Effects of Poria cocos polysaccharide on cell proliferation, autophagy protein and drug resistance考虑到PCP对肝癌HepG-2/DDP细胞的抑制作用，本研究继续分析PCP对HepG-2/DDP细胞耐药的影响。结果显示，不同浓度的顺铂在结合7.5 µg/mL PCP的基础上，对HepG-2/DDP细胞的抑制率明显增加（图2B），说明HepG-2/DDP细胞的耐药性明显缓解。而MRP1为癌细胞中重要的化学抗性分子，而P-gp是一种耐药相关的肿瘤基因，P-gp的过表达能减少化疗药物在细胞内积累，增加多药耐药性[19]。本研究中，采用7.5、15、30 µg/mL的PCP能显著降低HepG-2/DDP细胞中MRP1、P-gp表达水平（图2C、图2D），这也进一步说明PCP能有效增加药物敏感性，降低耐药效果。
在致癌过程中，自噬能促进肿瘤细胞的耐药性，在此基础上，本研究针对自噬进行了研究，结果表明，7.5、15、30 µg/mL的PCP能显著降低自噬标记性蛋白Beclin-1、LC3II的水平（图2E、图2F），说明PCP能降低HepG-2/DDP细胞自噬，同时也说明当肿瘤细胞受到刺激时，肿瘤细胞可以将其自噬作为一种抵抗机制来逃避药物治疗，增加药物抵抗性。
2.3 茯苓多糖对LncRNA HCG11和miR-539-3p水平的影响
LncRNA HCG11[20]为一种常见的非编码RNA（ncRNA），在肿瘤形成、发展及免疫应答、炎症反应中发挥重要作用，参与了包括肝癌在内的多种类型癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡[21]。而miR-539-3p为常见的抑癌因子，调节肿瘤的发生和进展[22]。如图3所示，本研究中，与L-02相比，HepG-2、SMMC-7721、Huh7、Bel-7405、HepG-2/DDP中HCG11的表达水平显著增加，miR-539-3p的表达水平显著降低（P<0.01），提示癌细胞中HCG11水平显著增加，而miR-539-3p水平显著降低；与HepG-2比较，HepG-2/DDP中HCG11的表达水平显著增加，miR-539-3p的表达水平显著降低（P<0.05），这也进一步说明，伴随肝癌细胞耐药性的增加，HCG11和miR-539-3p的表达水平发生明显的变化；而浓度为7.5、15和30 µg/mL的PCP能显著降低HCG11水平，增加miR-539-3p的表达水平（P<0.01），表明PCP可能是通过调控LncRNA HCG11和miR-539-3p发挥抗肿瘤作用。
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图 3 LncRNA HCG11和miR-539-3p 的表达水平比较注：与L-02比较，**P<0.01；与HepG-2比较，#P<0.05。Figure 3. Comparison of expression levels of LncRNA HCG11 and miR-539-3p2.4 LncRNA HCG11和miR-539-3p靶向关系
Starbase在线软件预测到HCG11与miR-539-3p存在结合位点（图4A），提示LncRNA HCG11具有“分子海绵”功能，能通过调控miR-539-3p表达水平，调节肿瘤发生和进展[23]。另外，如图4B所示，与miR-NC组比较，miR-539-3p mimics组HCG11-WT的荧光素酶活性显著降低（P<0.05），而HCG11-MUT荧光素酶活性差异无统计学意义（P>0.05），进一步证明LncRNA HCG11和miR-539-3p存在一定的靶向关系。
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图 4 LncRNA HCG11和miR-539-3p靶向关系注：A：LncRNA HCG11和miR-539-3p的相互作用；B：转染miR-539-3p mimics对HepG-2/DDP细胞中荧光素酶活性的影响；与miR-NC组比较，**表示P<0.01。Figure 4. Targeting relationship between LncRNA HCG11 and miR-539-3p2.5 HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞增值、自噬及耐药
图5A结果显示，与对照组比较，HCG11 siRNA 组HepG-2/DDP细胞HCG11相对表达水平明显降低，miR-539-3p水平明显增加（P<0.01），提示HCG11低表达细胞模型建立成功。图5B结果显示，与对照组（2.12%±0.11%）比较，HCG11 siRNA组（55.12%±2.32%）HepG-2/DDP细胞抑制率显著增加（P<0.01），HCG11 siRNA 组HepG-2/DDP 细胞的 IC50值[（28.78±2.12）μmol/L]明显低于siNC组[（54.33±1.27）μmol/L]、对照组[（56.07±1.33）μmol/L]，提示HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞增殖，降低HepG-2/DDP细胞对顺铂的耐药性，说明HCG11可作为肝癌治疗的基因靶点。
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图 5 HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞增值、自噬及耐药注：A. 转染HCG11 siRNA后，HepG-2/DDP细胞中LncRNA HCG11、miR-539-3p表达水平；B. HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞增值；C. HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞耐药；D~E. HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞自噬；与对照组比较，**表示P<0.01。Figure 5. Low expression of HCG11 inhibits proliferation, autophagy and drug resistance of HepG-2/DDP cells鉴于上述的研究结果，本研究继续针对自噬进行了分析。如图5C、图5D，与对照组比较，HCG11 siRNA 组HepG-2/DDP细胞Beclin-1、LC3 II/ LC3 I比值显著降低（P<0.01），说明HCG11 siRNA促进癌细胞敏化，可能与抑制自噬有关，增加抗肿瘤药物的细胞毒性。
2.6 HCG11高表达逆转PCP对耐药性和自噬的影响
鉴于PCP对HepG-2/DDP细胞增值、自噬及耐药以及HCG11、miR-539-3p水平的影响，本研究继续探讨HCG11表达水平在调控耐药性、自噬等方面的影响。如图6A，与pcDNA组比较，pcDNA3.1-HCG11组HepG-2/DDP细胞HCG11相对表达水平明显增加，miR-539-3p水平明显降低（P<0.01），提示HCG11高表达细胞模型建立成功。同样，在PCP的参与下，PCP+pcDNA3.1-HCG11组HCG11相对表达水平较PCP组显著升高（P<0.01），说明HCG11可能是PCP发挥抗肝癌作用的靶点。而且从耐药性方面进行分析显示，如图6B，在不同浓度的顺铂处理下，PCP+pcDNA3.1-HCG11组抑制率显著低于PCP组（P<0.01），这也进一步说明PCP可以通过HCG11进一步影响顺铂的功效，增加细胞对化疗药的敏感性，同时也说明HCG11可能与肝癌细胞化疗耐药有关。
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图 6 HCG11高表达逆转PCP对耐药性、自噬的影响注：A：HCG11高表达对HepG-2/DDP细胞中LncRNA HCG11、miR-539-3p表达水平影响；B：HCG11高表达逆转PCP对耐药性的影响；C~D：HCG11高表达逆转PCP对自噬的影响；与pcDNA组比较，**表示P<0.01；与PCP组比较，#表示P<0.05。Figure 6. Effects of HCG11 overexpression reversing PCP on drug resistance and autophagyLncRNA与自噬和肿瘤进展密切相关[24]，并影响肿瘤细胞耐药过程[25]。如图6C和图6D，本研究中，PCP组的HepG-2/DDP细胞Belin-1、LC3 II/LC3 I比值较pcDNA组明显降低，而PCP+pcDNA3.1-HCG11组Belin-1、LC3 II/LC3 I比值较PCP组显著增加（P<0.01），说明自噬可能在HepG-2/DDP细胞发生和发展中发挥着重要作用[26]，并可帮助HepG-2/DDP细胞抵抗微环境的压力，提高细胞存活率[27]。
2.7 体内茯苓多糖通过HCG11调控自噬影响肝癌进程
实验结果如表1显示，给药PCP后，小鼠无死亡发生，活动量未见减少，食量、体重没有变化。由于小鼠未死亡，因此无法计算100%死亡药物剂量，因此无法测得LD50，也说明茯苓多糖基本是无毒的。依据预实验，后续给药剂量选择50 mg/kg。
表 1 急性毒性实验Table 1. Acute toxicity tests剂量（g/kg） 死亡个数 死亡率（%） 5.01 0 0 3.75 0 0 2.81 0 0 2.12 0 0 1.58 0 0 为了证明HCG11作为具有巨大临床潜力的治疗靶点，本文分析了敲低HCG11表达水平对肿瘤生长的影响。结果显示，HCG11低表达促进了PCP对肿瘤大小和肿瘤重量的影响（图7A、图7B）。此外HCG11低表达也影响PCP对肿瘤中的自噬蛋白Belin-1、LC3 II/LC3 I水平的表达（图7C、图7D），提示PCP可能通过调控HCG11表达水平，并进一步影响肿瘤细胞自噬，并最终发挥抑瘤活性。
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图 7 LncRNA HCG1通过miR-539-3p增强体内自噬促进肝癌进程注：A：肿瘤体积的比较；B：肿瘤质量比较；C~D：自噬蛋白相对表达水平；与模型组比较，**表示P<0.01；与PCP组比较，#表示P<0.05。Figure 7. LncRNA HCG1 enhances autophagy in vivo and promotes the progress of liver cancer through miR-539-3p3. 讨论与结论
LncRNA HCG11在癌组织和细胞中高表达[28]，HCG11基因过表达可促进胃癌细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡，并可通过调节miR-144-3p/PBX3促进卵巢癌的细胞进展，并成为卵巢癌治疗的全新靶标[29]。本研究中，HCG11在肝癌细胞中明显上调，而且miR-539-3p是LncRNA HCG11的结合靶点，可通过结合互补位点负调控miR-539-3p表达水平，并进一步影响耐药和自噬。为了证实PCP对HepG-2/DDP细胞增殖、耐药和自噬的影响，并分析其机制。本研究采用HCG11高表达分析PCP对耐药性、自噬的影响，结果显示，在不同浓度的顺铂处理下，PCP+pcDNA3.1-HCG11组抑制率显著低于PCP组，说明HCG11高表达影响了HepG-2/DDP细胞耐药效果，降低了细胞对化疗药的敏感性。同样，本研究中，PCP+pcDNA3.1-HCG11组Belin-1、LC3 II/LC3 I比值较PCP组显著增加，HCG11高表达促进了HepG-2/DDP细胞自噬，说明HCG11能调控HepG-2/DDP细胞对外界微环境的适应。而且通过体内HCG11敲除导致的miR-539-3p上调、自噬相关蛋白的水平下调，包括LC3II，并进一步影响PCP对肿瘤细胞的药效，提示PCP可能通过LncRNA HCG11/miR-539-3p调节耐药和自噬，从而发挥抗癌效果。
总之，PCP能通过LncRNA HCG11/miR-539-3p调控耐药和自噬，并影响肝癌细胞的增殖，这将为PCP的开发提供新的研究思路。
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图 1 HepG-2/DDP耐药分析
注：与HepG-2比较，**表示P<0.01。
Figure 1. Analysis of drug resistance of HepG-2/DDP
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图 2 茯苓多糖对细胞增殖、自噬蛋白和耐药的影响
注：A. PCP抑制HepG-2/DDP细胞增殖；B. PCP对HepG-2/DDP细胞耐药的影响；C~D. PCP对HepG-2/DDP细胞耐药蛋白的影响；E~F. PCP对HepG-2/DDP细胞自噬蛋白的影响；与对照组（0 µg/mL的PCP）或顺铂组比较，**P<0.01。
Figure 2. Effects of Poria cocos polysaccharide on cell proliferation, autophagy protein and drug resistance
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图 3 LncRNA HCG11和miR-539-3p 的表达水平比较
注：与L-02比较，**P<0.01；与HepG-2比较，#P<0.05。
Figure 3. Comparison of expression levels of LncRNA HCG11 and miR-539-3p
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图 4 LncRNA HCG11和miR-539-3p靶向关系
注：A：LncRNA HCG11和miR-539-3p的相互作用；B：转染miR-539-3p mimics对HepG-2/DDP细胞中荧光素酶活性的影响；与miR-NC组比较，**表示P<0.01。
Figure 4. Targeting relationship between LncRNA HCG11 and miR-539-3p
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图 5 HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞增值、自噬及耐药
注：A. 转染HCG11 siRNA后，HepG-2/DDP细胞中LncRNA HCG11、miR-539-3p表达水平；B. HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞增值；C. HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞耐药；D~E. HCG11低表达抑制HepG-2/DDP细胞自噬；与对照组比较，**表示P<0.01。
Figure 5. Low expression of HCG11 inhibits proliferation, autophagy and drug resistance of HepG-2/DDP cells
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图 6 HCG11高表达逆转PCP对耐药性、自噬的影响
注：A：HCG11高表达对HepG-2/DDP细胞中LncRNA HCG11、miR-539-3p表达水平影响；B：HCG11高表达逆转PCP对耐药性的影响；C~D：HCG11高表达逆转PCP对自噬的影响；与pcDNA组比较，**表示P<0.01；与PCP组比较，#表示P<0.05。
Figure 6. Effects of HCG11 overexpression reversing PCP on drug resistance and autophagy
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图 7 LncRNA HCG1通过miR-539-3p增强体内自噬促进肝癌进程
注：A：肿瘤体积的比较；B：肿瘤质量比较；C~D：自噬蛋白相对表达水平；与模型组比较，**表示P<0.01；与PCP组比较，#表示P<0.05。
Figure 7. LncRNA HCG1 enhances autophagy in vivo and promotes the progress of liver cancer through miR-539-3p
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