肝癌主要以肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）为主，占所有肝癌病例的95%，是一种具有极强侵袭性的恶性肿瘤^[1]。根据国际癌症机构研究表明，2020年，全球有905700例肝癌病例，因肝癌死亡的病例有830200例。在全球90个国家中，肝癌是第六大常见的癌症，也是第三大常见的癌症死亡原因^[1]。预计2040年全球肝癌的新确诊病例和死亡人数可能会增加至55%。中国作为肝癌大国，肝癌确诊病例占世界肝癌病例的45.3%，肝癌死亡病例占世界肝癌死亡病例的47.1%^[1]，由于肝癌起病隐匿，临床诊断多为晚期，使得患者五年生存率仅为14.1%^[2]，严重影响了国人的身体健康。近年来，随着高通量测序技术的广泛应用，发现通路的异常激活可导致肝癌的发生，其中RAS-RAF信号通路在肝癌的发生发展中起着重要作用，该通路的ras基因在肝脏中发生突变（主要为12位甘氨酸变为缬氨酸）后，可引起下游信号通路的异常激活，导致肝细胞过度增殖从而诱导肝癌的发生^[3−4]。此外，该信号通路的激活能够调节血管内皮生长因子（VEGFAa）的表达。VEGF通过血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）刺激血管的生成，生成的血管可为肝癌提供生长过程中所需要的水分和营养物质，促进肝癌进一步生长与侵袭^[5−7]，该通路的发现为肝癌的临床治疗提供潜在的策略。临床上针对肝癌患者的常用靶向药物为索拉非尼，该药物通过抑制RAF激酶和血管内皮生长因子受体（VEGFR）来发挥抗肿瘤作用，大大地延长了患者的生存时间。但是索拉非尼引起的不良反应成为临床抗肿瘤中断的重要原因，包括高血压、胃穿孔、心肌梗塞等症状^[8−9]，因此寻找并开发一种靶点明确且副作用小的肝癌药物迫在眉睫。

氨基葡萄糖盐酸盐（GAH）是由天然甲壳素提取的产物，其中甲壳素主要来源于虾蟹壳^[10]，邱贵兴等^[11]研究发现，来源于虾蟹壳的氨基葡萄糖会对海鲜过敏者产生过敏反应。基于此，本研究从双孢蘑菇提取的氨基葡萄糖盐酸盐，避免了从虾蟹壳提取的GAH所带来的不良反应，适用人群大大增加^[12]。关于GAH的功能研究主要集中在治疗骨关节炎，改善软骨修复等领域，被广泛应用于食品保健领域，已有230类产品登记注册，骨密度保健食品注册占比55.2%^[13]。除此之外，已有相关文献报道关于GAH抗肝癌的作用，李运曼等^[14]发现GAH对小鼠移植肉瘤S180、肝癌腹水癌、EC腹水实体瘤具有显著抑制作用。Zhang等^[15]发现GAH能抑制肝癌细胞（SMMC27721）生长，然而上述研究仅能说明GAH能够对肝癌生长起到抑制作用，并未阐述GAH的抗肝癌作用机制，本实验将着重利用模式动物开展GAH抗肝癌机制研究。

近些年来，已有相关文献报道利用CRISPR-SONIC系统在敲除tp53基因的小鼠中导入kras基因构建的小鼠肝癌模型^[16]，但是此模型耗时长、成本高，不利于进行大规模药物筛选。斑马鱼与哺乳动物在肝脏发育过程中高度相似，同样可分为三个阶段：内胚层细胞的肝脏特化；肝脏萌芽和肝细胞分化；肝脏发育。除与人类肝脏发育相似外，斑马鱼还与人类肝癌发生有关的基因与信号通路上存在高度保守性^[17]，已有研究利用在肝脏中特异性表达的FABP10启动子连接（Green fluorescent protein，GFP）和kras^G12V构建的转基因载体，通过显微注射构建可诱导的斑马鱼肝癌模型，在该模型下，当斑马鱼幼鱼发育至3 d时，加入盐酸多西环素（Dox）持续诱导至7 d时即可导致早期肝癌的发生^[18−19]。此外，斑马鱼具有繁殖能力强，胚胎透明易观察，发育周期短等优势^[17]，相较于小鼠模型，更适合作为快速、高通量的抗肝癌药物的筛选模型，基于此，本研究以斑马鱼为模式，利用斑马鱼肝癌模型探讨双孢蘑菇来源的GAH的抗肝癌、抗肝癌血管生成功效，以期为GAH在抗肝癌领域研究提供实验基础。

1.   材料和方法

1.1   材料与仪器

斑马鱼To（Kras^G12V）　中国海洋大学赵呈天与新加坡国立大学宫志远教授馈赠；斑马鱼Tg（flk:mCherry）　来自清华大学孟安明院士赠予；斑马鱼Tg（flk:mCherry;kras^G12V）　自交获得；本研究所用GAH是从双孢蘑菇中提取所得，经高效液相色谱分析，1 mg/mL标准GAH在1.21 min时的峰面积为1812.74768 mAU·s，而双孢蘑菇来源的GAH为1998.35132 mAU·s，表明纯度高于标准GAH^[20]；麻醉剂、甲基纤维素、低熔点琼脂糖　Sigma公司；Dox　BBI生命科学有限公司；VEGFAa、VEGFR2 ELISA试剂盒　赛默飞世尔科技公司；QIANGEN 74134 RNA提取试剂盒、qPCR cDNA逆转录试剂（R323-01）　诺唯赞。

TX323L日本岛津电子分析天平　上海仪田精密仪器有限公司；PYX-280-A生化培养箱　科力仪器有限公司；Quantstudio 6 Flex实时荧光定量PCR　Life Technologies；Nikon SMZ18体视荧光显微镜　尼康（上海）仪器有限公司；Leica TCS-SP8激光共聚焦显微镜　德国徕卡公司；3300型高速离心机　Kubota Corporation公司；JXFSTPRP-32L型全自动样品研磨仪　上海净信实业发展有限公司。

1.2   实验方法

1.2.1   斑马鱼胚胎的准备

挑选健康的雄性To（Kras^G12V）转基因斑马鱼成鱼与健康的雌性Tg（flk:mCherry）转基因斑马鱼成鱼杂交，收集受精的斑马鱼鱼卵于90 mm培养皿中加入Holfreter水（0.05 g/L KCl，0.1 g/L CaCl₂，0.025 g/L NaHCO₃，3.5 g/L NaCl）在28 ℃恒温培养箱内进行培养，发育至3 d时加入60 μg/mL Dox诱导，诱导至第3 d晚上时，在荧光显微镜下分别挑选带有绿色荧光蛋白的斑马鱼幼鱼To（Kras^G12V）、带有红色荧光蛋白的斑马鱼幼鱼Tg（flk:mCherry）与带有红色与绿色荧光蛋白的斑马鱼幼鱼Tg（flk:mCherry;kras^G12V），将不同荧光的斑马鱼幼鱼分别放入到事先准备好的3个90 mm培养皿中，其中带有红色荧光蛋白的斑马鱼幼鱼用Holf水培养，其余两孔继续加入Dox诱导培养，以备后续实验。

1.2.2   GAH工作浓度的选择

在前期的实验过程中确定了GAH的半致死剂量为0.324%^[20]，所以本文选用0.1% GAH（0.001 g/mL）和0.3% GAH（0.003 g/mL）两个浓度作为主要实验浓度。

1.2.3   共聚焦显微镜观察肝癌发展情况

随机挑选4条To（kras^G12V）3 d幼鱼，加入60 μg/mL Dox溶液诱导，每12 h换溶液，诱导至第5 d，将幼鱼转移到激光共聚焦拍照专用小皿，加入1滴0.03%三卡因待幼鱼失去活动能力，将麻醉剂吸干后，滴入琼脂糖覆盖整个底部，将幼鱼调整好位置后，待琼脂糖凝固后，利用Leica TCS-SP8激光共聚焦显微镜追踪并拍摄记录5~10 d的肿瘤进展。

1.2.4   GAH对肝癌的作用

收集To（Kras^G12V）3 d幼鱼，持续诱导至第5 d，在普通荧光显微镜下挑选带有绿色荧光的幼鱼，分为正常组（Ctr）；Dox组；0.1% GAH组；0.3% GAH组，每组20~25条鱼，除Ctr组外，其它三组继续加入Dox诱导建立肝癌模型，样品组分别加入不同浓度GAH处理5 d后，利用激光共聚焦拍照记录GAH对肝癌的影响。

1.2.5   检测肝癌相关基因及肝癌血管相关基因的表达

收集10 d幼鱼，按照每组25条幼鱼，转移到1.5 mL无核酶离心管，先用ddH₂O洗2遍后，再用无核酶水洗两遍，吸至尽干（也可不吸至尽干，但要保持每组水量一致），放入−80 ℃冰箱，过夜后，按照QIANGEN RNA提取试剂盒方法操作提取RNA。将提取的RNA按照诺唯赞qPCR cDNA逆转录试剂盒提供的方法进行逆转录得到cDNA，加入80 μL无核酶水使其总体积为100 μL后充分混匀后进行qPCR实验。分别将不同组别的cDNA、引物和SYBR Green Master Mix加入对应八连管，混合均匀，上机操作，程序为：95 ℃ 20 s（变性）； 95 ℃ 15 s（变性）， 60 ℃ 20 s（退火，延伸），变性、退火、延伸总循环40次。本次选用的参照基因为：gapdh。本研究中所有基因序列从斑马鱼数据库http://zfin.org/上下载而来，引物设计用Primer Express3.0.1设计，引物序列详见表1。

表  1  相关引物

Table  1.  Related primers

基因名	上游引物（5’→ 3’）	下游引物（5’→ 3’）
tiam1a	GCCCTCCAAGTTCGCAATC	GTGAACGATCTCACACATTGCA
kat5b	AGCGGCACCTCCGAATC	CCCTCTTGCTCCAGTCTTTAGG
prmt5	CGGTTTCGCTGGGTA	AAAGATGTGGGAGTAGGC
vegfr2	CGCAGAATTTTCATCAGTCTACCTACT	GATGAGGGTGTCACCGACAAG
vegfaa	CTCTCCTCCATCTGTCTGCTGTAA	GGGATACTCCTGGATGATGTCTACC
gapdh	GACGCTGGTGCTGGTATTGC	TTGCTGTAACCGAACTCATTGTCAT

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1.2.6   GAH对肝癌血管的作用

收集Tg（flk:mCherry;kras^G12V）3 d斑马鱼幼鱼，采取如“1.2.4”所述方法，挑选带有红绿双荧光的幼鱼，每组约16~23条幼鱼，发育至第10 d，利用激光共聚焦拍照记录GAH对肝癌血管的影响。

1.2.7   5~10 d肝癌面积的计算及GAH对肝癌及肝癌血管的活性评价

利用Image pro plus计算肿瘤及肿瘤血管的面积，单位以标尺的平方表示（1×10⁴ μm）。5~10 d肝癌进展相对面积的计算=（对应天数肝癌面积/5 d肝癌面积）×10⁴ μm；GAH对于肝癌的影响=（实验组肝癌面积/模型组肝癌面积）×10⁴ μm；GAH对于肝癌血管的影响=（实验组肝癌血管总面积/模型组肝癌血管总面积）×10⁴ μm。

1.2.8   ELISA检测血管相关蛋白的表达

收集10 d幼鱼，按照每组25条幼鱼，将幼鱼转移到1.5 mL离心管中，用ddH₂O洗2遍后，吸至尽干（也可不吸至尽干，但要保持每组水量一致），放入−80 ℃冰箱过夜，过夜后，每组离心管加入两颗无菌小铁球后加入300 μL生理盐水（每条12 μL生理盐水），将样品放入事先预冷的研磨仪专用铁块（内有凹槽，可放置样品）中，按照60 Hz条件下研磨60 s停顿10 s记为1次。研磨10次后，取出样品，放入预冷的冰盒上防止蛋白降解，然后将铁块放入−80 ℃冷冻20 min后继续研磨，再次研磨8次后，按照3000 r/min 10 min离心，转移到新的离心管后使用EBios的Vegfaa、Vegfr2 ELISA试剂盒提供的说明书检测相关组别Vegfaa、Vegfr2蛋白含量。

1.2.9   TIMER2在线数据库分析

利用TIMER2在线数据库^[21]进行基因相关性分析，进入TIMER2后，点击Exploration选项后，点击Gene_Corr，分别分析prmt5、tiam1、kat5与vegfaa、vegfr2关系，以及prmt5、kat5与TGF-β的关系。

1.3   数据处理

利用Excel软件进行数据统计分析，数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示，模型组与对照组组、GAH恢复组与模型组进行双样本T检验分析，*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异高度显著（P<0.01）；***表示差异极显著（P<0.001）。

2.   结果与分析

2.1   kras^G12V在肝脏中过表达导致肝癌的发生和发展

为观察Dox诱导所引起的肝癌发生与发展过程，采用如“1.2.3”所述方法，利用激光共聚焦拍照观察5~10 d肝癌发生发展过程，如图1所示，5 d时幼鱼在肝脏可观察到GFP的表达（图1A1），随着Dox的进一步诱导，6~7 d时，GFP表达强度明显增强，腹腔处阴影面积开始出现，相较于GFP的表达区域应属于肝脏膨大造成腹腔隆起（图1B2~图1B3），表明Kras^G12V的过表达导致肝脏细胞过度增殖，肝脏的增生进一步发展导致早期肝癌的发生（图1A2~图1A3）。8~9 d时，GFP的表达范围进一步扩大，并伴随着阴影区域逐渐加深引起腹腔继续膨大，提示肝癌开始向周围组织侵袭，这种占位行为在第10 d时尤为明显（图1A4~图1A6，图1B4~图1B6）。进一步通过Image Pro Plus对5~10 d肿瘤的相对面积进行统计，与观察到的结果一致，肿瘤相对面积是呈逐步扩大的发展趋势，与第6 d相比，第10 d肝癌相对面积增加了约3倍以上。综上，Dox的持续诱导可引起肝癌的发生发展，并向周围组织不断侵袭。

图  1  斑马鱼To（Kras^G12V）肝癌进展图

注：A1~A6为肝癌进展图；B1~B6为明场图；C1~C6为叠加图；D为肿瘤相对面积；***表示差异极显著（P<0.001）。

Figure  1.  Progression diagram of zebrafish To(Kras^G12V) liver cancer

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2.2   GAH抑制肝癌的生长

基于前面的实验结果，本研究想要验证GAH对肝癌的生长与侵袭是否具有抑制作用。采用如“1.2.4”所述方法，利用激光共聚焦显微镜观察GAH对肝癌的影响，结果如图2所示，与正常组相比（图2A），经过Dox持续诱导至第10 d时，Dox组GFP表达很强，腹腔处异常膨大，此时肝癌侵袭至肝脏周围组织（图2B1~图2B2）。加入不同浓度的GAH干预5 d后，观察第10 d 0.1% GAH组中，大约有50%的幼鱼出现GFP表达强度减弱，表达范围变小，腹腔处膨大消退，表明侵袭性减弱（图2C1~图2C2），而在高浓度的0.3% GAH组中，表现出更优的效果，GFP表达强度明显减弱，腹腔处膨大明显消退，肝癌的增殖受到明显抑制，受到抑制的比例进一步增加至66%（图2D1~图2D2）。进一步通过对肿瘤相对面积的分析，与Dox组相比，随着GAH浓度的增加，肝癌相对面积随着药物浓度的增加而逐渐降低，其中高浓度0.3% GAH组的面积缩小了约60%。以上结果表明GAH能够抑制肝癌生长与侵袭，呈浓度依赖性。

图  2  不同浓度的GAH对肝肿瘤生长的影响

注：A为正常组；B为模型组（B1为白光图，B2为荧光与白光叠加图）；C、D分别为0.1% GAH、0.3% GAH恢复组（C1、D1为白光图，C2、D2为荧光与白光叠加图）；E为肿瘤相对面积；***表示差异极显著（P<0.001）。

Figure  2.  Effect of different concentrations of GAH on the growth of liver tumors

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2.3   GAH抑制肝癌相关基因表达

精氨酸甲基转移酶5（prmt5）是PRMT家族最重要的成员之一，参与细胞增殖、调节细胞周期等过程，在肝癌中抑制prmt5的表达能降低肝癌细胞的增殖能力^[22−23]。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（tiam1）是Dbl基因家族成员之一，高表达时可加速癌症的发生和发展，研究表明，在肝癌中下调该基因的表达能减少肝癌细胞的侵袭和转移^[24−25]。乙酰基转移酶Tip60（kat5）属于MYSTATE家族^[26−27]，其高表达可通过不同信号通路促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，增加其恶性程度。因此，本研究通过检测上述三个基因的表达变化研究GAH抑制肝癌的作用方式。

采用如“1.2.5”所述方法，结果如图3所示，与Ctr组相比，在Dox组中，prmt5、tiam1a和kat5b的mRNA明显上调，约为对照组的1.5~1.8倍，通过不同浓度的GAH处理后，相较于Dox组，表达量均有所下降。在0.1% GAH组中，prmt5、tiam1a下降至Dox组的50%左右，而在0.3% GAH组中prmt5与tiam1a表达量进一步下降，甚至低于Ctr组，kat5b的表达也恢复至Ctr组水平。GAH的处理后引起的变化表明：GAH可能通过抑制prmt5、kat5b、tiam1的表达，抑制肝癌细胞的增殖与侵袭。

图  3  GAH抑制肝癌相关基因的表达

注：*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异高度显著（P<0.01）；***表示差异极显著（P<0.001）。

Figure  3.  GAH inhibits the expression of liver cancer related genes

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2.4   GAH 抑制肝肿瘤诱发的新生血管

肝癌的生长与侵袭过程中常常伴随着肝癌血管的不断生成，为此，本研究进一步探讨GAH是否通过抑制肝癌血管的生成，从而阻止肝癌的生长与侵袭。采用如“1.2.4”所述方法，利用激光共聚焦显微镜观察GAH对肝癌血管的影响，结果如图4所示，相较于Ctr组正常的血管网络（图4A），在Dox组中，肝癌及其周围伴随着大量血管的生成且呈紊乱分布（图4B1），经过不同浓度的GAH处理后，在0.1% GAH组中，当GFP表达减弱时，可观察到肝癌处血管荧光强度有所减弱（图4C、图4C2），在0.3% GAH组中，随着GFP表达进一步减弱，可看到该表达区域的肝癌血管部分减少（图4D、图4D2）。通过对不同组别血管相对面积的计算，相较于Ctr组，Dox组肝癌血管相对面积显著增加（P<0.05），约为对照组的3倍，经过不同浓度GAH处理后，与Dox组相比，肝癌血管相对面积随着药物浓度的增加而逐渐降低，具有显著性差异（P<0.05）。结果表明：GAH通过抑制肝癌间血管的生成，进一步阻止肝癌的生长与侵袭。

图  4  GAH 对肝脏肿瘤及肿瘤间血管的影响

注：A为正常组血管图；B、B1分别为Dox诱导后肿瘤及肿瘤血管的变化，B2为两者叠加图；C、D和C1、D1分别为不同加药组肿瘤及肿瘤血管变化图；C2与D2为不同加药组叠加图；E为肿瘤相对面积，框选血管区域如图所示（根据肿瘤大小，选取框选区域，后对血管相对面积进行统计后进行计算）；*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异高度显著（P<0.01）；***表示差异极显著（P<0.001）。

Figure  4.  Effect of GAH on liver tumors and blood vessels between tumors

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2.5   GAH抑制肝癌中VEGF通路成员的mRNA和蛋白水平

本研究继续探讨GAH是否通过抑制肝癌血管生成标记基因的表达从而抑制肝癌的生长与侵袭。采用如“1.2.8”所述方法，通过qPCR和ELISA检测vegfaa、vegfr2基因和蛋白水平的表达，结果如图5所示，与Ctr组相比，Dox组中vegfaa和vegfr2 mRNA水平明显增加，均上调至对照组的3倍左右；与Dox相比，在不同浓度的加药组中，上述基因表达量都显著降低（P<0.05），其中高浓度处理组的表达下降至Dox组的2/3水平（图5A）。进一步通过蛋白水平的检测，结果与mRNA变化趋势一致，肝癌模型组Vegfaa、Vegfr2的蛋白表达量上升至对照组的2倍左右；与Dox相比，在药物处理组中，高浓度组进一步下降至Dox组的1/2水平（图5B）。在癌症中，VEGFAa是血管生成的最主要调节因子，通过VEGFR2（KDR）受体，刺激血管的生成，诱导肿瘤的增殖、迁移、侵袭等过程^[28]。上述实验结果表明，GAH通过抑制vegfaa与vegfr2 mRNA和蛋白水平的表达，进一步抑制肿瘤的增殖与侵袭。

图  5  GAH对肝癌VEGF通路成员的mRNA和蛋白水平的影响

注：A为不同组别血管基因表达量；B为不同组别血管蛋白表达量；*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异高度显著（P<0.01）；***表示差异极显著（P<0.001）；图6同。

Figure  5.  Effect of GAH on mRNA and protein levels of VEGF pathway members in liver cancer

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2.6   tgf-β与prmt5、tiam1、kat5、vegfaa、vegfr2相关性分析

在癌症中，癌细胞通过自分泌产生TGF-β1因子，激活TGF-β通路，促进癌症的进展、侵袭及血管生成等过程^[29]。为此，课题组旨在判断GAH是否通过影响TGF-β通路，来抑制肝癌及肝癌血管的生成。有研究表明PRMT5可通过甲基化SMAD4激活TGF-β信号通路促进结直肠癌血管的生成；KAT5可介导SMAD3乙酰化促进黑色素瘤的进展和侵袭。在甲状腺癌中TGF-β的表达能够促进TIAM1表达，增强上皮间质细胞转化（EMT），促进甲状腺癌的侵袭^[30−32]。过去的研究发现，GAH可以通过促进BMP信号，即TGF-β亚家族成员，促进斑马鱼骨骼损伤修复^[20]。最近，课题组发现GAH可以通过BMP信号调控VEGF信号促进血管损伤修复^[33]。基于此，本研究利用肿瘤相关的生信数据库TIMER2在线分析TCGA数据库中371例肝癌患者prmt5、tiam1、kat5与血管生成相关基因的表达关系以及TGF-β与上述肝癌相关调控因子的关系，结果如图6所示，vegfaa、vegfr2（kdr）表达量都随着prmt5、tiam1、kat5的表达量增加而增加，且r值>0，表明prmt5、tiam1、kat5的表达与血管生成呈正相关性（图6A~图6F）；在prmt5、kat5、tiam1与tgf-β1的关系中，prmt5、tiam1、kat5与tgf-β1也呈正相关，表明prmt5、tiam1a、kat5的表达依赖于tgf-β1的变化（图6G~图6I）。进一步通过检测Tgf-β1蛋白水平的表达，发现Dox模型组中Tgf-β1蛋白水平确实存在高表达，与Dox组相比，随着GAH浓度的增加，Tgf-β1表达水平呈现逐渐降低趋势（P<0.05），具有浓度依赖性（图6J）。以上结果表明：GAH可能通过调控TGF-β信号影响肝癌相关基因的表达，从而抑制肝癌血管的生成，但具体的作用靶点及调控机制还需要在后续的研究工作通过多种实验手段进行验证。

图  6  利用肿瘤相关的生信数据库TIMER2分析基因的相关表达关系及Tgf-β1的蛋白表达量

注：A~C为prmt5、tiam1、kat5与vegfaa的相关性；D~F为prmt5、tiam1、kat5与kdr的相关性；G~I为prmt5、kat5与tgfβ1的相关性；J为Tgf-β1蛋白表达量。

Figure  6.  Analysis of the correlation between gene expression and the protein expression level of Tgf-β1 by tumor-related bioinformatics database TIMER2

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3.   结论

本研究着重利用To（Kras^G12V）构建的可诱导型肝癌模型，探究了双孢蘑菇来源的GAH抗肝癌作用机制，首先通过激光共聚焦显微镜观察了5~10 d肝癌的发生发展，发现肿瘤进展到6~7 d时，肝脏迅速增殖膨大，第10 d侵袭性明显增强。在Dox诱导的同时加入GAH进行抗肿瘤作用机制研究发现，GAH通过抑制prmt5、tiam1、kat5、vegfaa、vegfr2 mRNA和蛋白水平的表达，对肿瘤及肿瘤血管的生长均具有显著的抑制作用，最后结合生物信息学分析得出GAH可能通过调控TGF-β信号通路影响肝癌及肝癌血管相关基因的表达，该研究为GAH作为潜在的抗肿瘤药物以及保肝护肝的膳食补充剂开发提供实验依据。

在研究过程中课题组发现，此模型诱导下的幼鱼，由于5 d时卵黄囊储备已基本耗尽，喂养草履虫幼虫会出现拒食现象，这可能是实验进展到第10 d出现幼鱼大量死亡的主要因素。因此，在接下来的研究中，可以考虑优化该模型的培养条件，观察10 d以后在Dox的持续诱导下肝癌发展及侵袭情况。由于时间关系，本研究关于GAH的抗肿瘤作用方式研究较为粗浅，在接下来的研究中，可通过病理切片观察、蛋白水平及分子互作等方面深入验证GAH的作用机制。