Optimization of the Extraction Process of Crude Polysaccharide from Guliao Tea and Evaluation of Its Immunomodulatory Activity
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摘要: 为探究姑辽茶粗多糖的最佳提取工艺并对其免疫活性进行评价。以姑辽茶为原料，固定超声功率400 W，在探究超声时间、提取温度、提取次数、料液比对姑辽茶粗多糖得率的影响的基础上，通过Box-Behnken响应面法对提取工艺参数进行优化；采用CCK-8法检测姑辽茶粗多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞增殖活性的影响，测定TNF-α、IL-6和NO的分泌水平以评价其免疫调节活性。结果表明：在超声时间32 min、提取温度64 ℃、提取4次、料液比1:44 g/mL的工艺条件下提取的姑辽茶粗多糖得率最高，为13.12%±0.11%；姑辽茶粗多糖中的总糖含量为61.8%±0.09%。姑辽茶粗多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞增殖活性影响作用微弱，基本无毒性作用，在50~400 μg/mL范围内对促进RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和NO呈现一定的量效关系。通过对姑辽茶粗多糖的最佳提取工艺优化及评价其免疫活性，为更好地挖掘姑辽茶多糖资源提供科学依据。Abstract: In order to investigate the optimal extraction process of crude polysaccharide from Guliao tea and evaluate its immunomodulatory activity, Guliao tea as the raw material and fixed the ultrasonic power at 400 W, the effects of parameters including ultrasonic time, extraction temperature, extraction times and solid-liquid ratio on the yield of Guliao tea crude polysaccharide were examined. The parameters were optimized by Box-Behnken response surface design. The impact of Guliao tea crude polysaccharide on the proliferation activity of RAW264.7 murine macrophages was detected by CCK-8 assay. The secretions of TNF-α, IL-6 and NO were measured to evaluate immunomodulatory activity. The results indicated that the highest yield of Guliao tea crude polysaccharide was 13.12%±0.11% under the conditions of 32 min of ultrasonic time, 64 ℃ of extraction temperature, four extraction circles and a 1:44 g/mL solid-liquid ratio. The total sugar amount in the crude polysaccharide from Guliao tea was 61.8%±0.09%. Guliao tea crude polysaccharide exhibited a slight effect on the proliferation activity of RAW264.7 murine macrophages with essentially no toxicity and demonstrated a dose-response relationship in promoting the secretion of TNF-α, IL-6, and NO within the range of 50~400 μg/mL. By optimizing the extraction process of crude polysaccharide from Guliao tea and evaluating its immunomodulatory activity, the study provided a scientific basis for more effective exploration and utilization of Guliao tea polysaccharide.
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姑辽茶，是一种生长在广西扶绥县东门镇海拔600多米高山的山茶科细萼茶，茶叶色泽乌黑光润，经萎凋、做青、揉捻、发酵、烘干工序制得，茶汤清亮，是广西特有的历史名茶。现代研究已从姑辽茶叶中分离出茶多酚、儿茶素、咖啡因等天然成分[1]，但其潜在高附加值的天然产物未被充分挖掘，随着植物多糖在抗肿瘤、降血糖、降血脂、免疫调节、保护胃肠道等生物活性方面的深入研究，从姑辽茶中提取天然多糖可进一步拓展姑辽茶中天然产物活性物质的开发和利用[2−4]。
目前茶多糖在免疫调节活性方面的研究已有不少成果。研究发现绞股蓝茶多糖可以刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和NO等活性因子，这些因子可将靶细胞杀伤，调节机体免疫功能[5]；六堡砖茶多糖可以激活RAW264.7巨噬细胞核因子NF-кB和AMP依赖的蛋白激酶信号通路以及提高相关蛋白表达量，促使其产生的细胞因子发挥免疫调节活性[6]；李海珊等[7]设置江西婺源绿茶多糖的不同剂量组，并对正常C57/BL6小鼠进行21 d的灌胃处理，通过脾指数和胸腺内T淋巴细胞的增殖验证了茶多糖在小鼠体内发挥了免疫调节功能；而姑辽茶多糖的生物活性目前尚未见有报道。植物多糖的提取工艺已有诸多研究，水提醇沉法是最基础且常用的多糖提取方法，用热水作为溶剂使多糖溶出后醇沉提取，该方法环保但效率较低；超声辅助结合热水浸提法可使细胞充分破壁、多糖迅速溶解，是一种操作简单、应用广泛、耗时较短的提取方法；酸、碱提取法操作简易但过酸或过碱易使多糖水解；微波辅助提取法提取质量高、绿色环保，但所用设备仪器的要求较高，仍未普及[8]。
本文以姑辽茶为原料，采用超声辅助热水浸提法提取工艺，结合单因素实验与Box-Behnken法的响应面试验，以姑辽茶粗多糖得率为响应指标，优化姑辽茶粗多糖提取工艺，同时以RAW264.7小鼠巨噬细胞为模型，用CCK-8法检测姑辽茶粗多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞增殖的影响，并以TNF-α、IL-6和NO的表达水平为指标评价姑辽茶粗多糖免疫调节活性[9−10]。探究姑辽茶粗多糖的最佳提取工艺与免疫调节活性作用，可为姑辽茶多糖在医药与保健领域的进一步开发与应用提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
姑辽茶 崇左市扶绥县东门镇姑辽村提供；无水乙醇（CH3CH2OH） 分析纯，上海广诺化学科技有限公司；葡萄糖、浓硫酸、苯酚 均为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司；RAW264.7小鼠巨噬细胞 武汉普诺赛生命科技有限公司；TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒 武汉华联科生物技术有限公司；NO检测试剂盒 欣博盛生物科技有限公司；八肽胆囊收缩素（CCK-8）试剂盒 Sigma公司；胎牛血清（FBS） 上海逍鹏生物科技有限公司；DMEM Hyclone公司。
80-2电动离心机 金坛市医疗仪器厂；KQ-300DB超声波清洗机 昆明市超声仪器有限公司；UV-1601紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；Alpha 1-2冷冻干燥机 上海甄明科学仪器有限公司；HF100三气培养箱 上海力申科学仪器有限公司；F50全波长酶标仪 德国Tecan公司；SW-CJ-1F超净工作台 苏州净化设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 姑辽茶粗多糖提取工艺
姑辽茶叶经清洗沥干后置于95 ℃烘箱内烘干，粉碎并过60目筛网得姑辽茶微粉。固定功率400 W进行超声辅助热水浸提，冷却至室温，4500 r/min离心12 min，以收集提取液，用旋蒸法浓缩至原体积约1/3，并添加浓缩液体积约3倍的无水乙醇，静置于4 ℃的冷藏室中进行12 h醇沉，4500 r/min离心12 min并将所得的沉淀物用少量蒸馏水重新溶解，透析（分子量截留≥3500 Da）过程中每间隔2 h换水一次，至透析用水电导率接近蒸馏水，冻干即得姑辽茶粗多糖。姑辽茶粗多糖得率由以下公式计算：
姑辽茶粗多糖得率(%)=姑辽茶粗多糖质量原料总质量×100 1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 超声时间对姑辽茶粗多糖得率的影响
固定提取温度60 ℃、提取次数4次、料液比1:40 g/mL，设定超声时间10、20、30、40、50 min，探究超声时间对姑辽茶粗多糖得率的影响。
1.2.2.2 提取温度对姑辽茶粗多糖得率的影响
固定超声时间30 min、提取次数4次、料液比1:40 g/mL，设定温度30、40、50、60、70 ℃，探究提取温度对姑辽茶粗多糖得率的影响。
1.2.2.3 提取次数对姑辽茶粗多糖得率的影响
固定超声时间30 min、提取温度60 ℃、料液比1:40 g/mL，设定提取次数1、2、3、4、5次，探究提取次数对姑辽茶粗多糖得率的影响。
1.2.2.4 料液比对姑辽茶粗多糖得率的影响
固定超声时间30 min、提取温度60 ℃、提取次数4次，设定料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL，探究料液比对姑辽茶粗多糖得率的影响。
1.2.3 响应面优化试验
以单因素实验为基础，通过Box-Behnken法对姑辽茶粗多糖提取工艺作进一步优化。探究超声时间（A）、提取温度（B）、提取次数（C）、料液比（D）四个变量因素对姑辽茶粗多糖得率的影响，因素和水平的设计如表1所示。
表 1 响应面试验设计因素与水平Table 1. Factors and levels of the response surface experiment因素 水平 −1 0 1 A超声时间（min） 25 30 35 B提取温度（℃） 55 60 65 C提取次数（次） 3 4 5 D料液比（g/mL） 1:35 1:40 1:45 1.2.4 姑辽茶粗多糖中总糖含量的测定
参考陈文博[11]的苯酚-硫酸法检测姑辽茶粗多糖中的总糖含量。配制不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液（0、2、4、6、8、10、12 mg/mL）各1.0 mL/管，通风条件下各管加入6%苯酚溶液0.5 mL，并迅速注入浓硫酸2.5 mL，振荡混匀，避光静置25 min后于490 nm处测定OD值。将葡萄糖标准溶液浓度和OD490值分别作为横、纵坐标拟合葡萄糖标准曲线，得到葡萄糖标准曲线方程：y=0.00724x+0.1362（R2=0.9914）。配制10 mg/mL姑辽茶粗多糖溶液1.0 mL，测定其OD490值，经代入葡萄糖标准曲线方程可得姑辽茶粗多糖中的总糖含量（以葡萄糖计）。
1.2.5 姑辽茶多糖免疫调节活性测定
1.2.5.1 RAW264.7小鼠巨噬细胞培养
参照胡美怡等[12]、马高兴等[13]的方法，略微修改，将冻存在液氮中的RAW264.7小鼠巨噬细胞取出，于37 ℃水浴恢复活性，随后移入装有5.0 mL DMEM培养基的无菌离心管中，1000 r/min离心4 min。清除上清液后注入新鲜的DMEM培养基（含10% FBS），将巨噬细胞轻微振荡混匀，转换至细胞培养皿中，置于恒定条件为5% CO2、95% O2、37 ℃的细胞三气培养箱中观察培养，并选用对数生长期的巨噬细胞进行下一步实验。
1.2.5.2 RAW264.7小鼠巨噬细胞存活率测定
参考郝正祺等[14]的方法，略微改动，按照50 μL每孔体积浓度为1×105个/mL的RAW264.7小鼠巨噬细胞，将其接种于96孔细胞培养板中。在恒定环境下5% CO2、95% O2、37 ℃的细胞三气培养箱内培养24 h后，移去上层原液，加入50 μL不同质量浓度姑辽茶粗多糖培养液（50、100、200、400、800 μg/mL），设置50 μL DMEM培养液替代多糖培养液作空白对照组，每组浓度重复设置3孔，在相同条件的细胞三气培养箱中培养24 h后，清除上层培养液，每孔均加入CCK-8试剂（50 μL）后继续培养1 h，检测其在450 nm波长下的OD值。RAW264.7巨噬细胞相对存活率（%）的计算公式如下：
巨噬细胞相对存活率(%)=AB×100 式中：A为各实验组OD值；B为空白对照组OD值。
1.2.5.3 NO、IL-6和TNF-α分泌量测定
参照李瑾等[15]的方法，稍作改动，在96孔细胞培养板中，以1×106个/孔接种巨噬细胞，于37 ℃、5% CO2条件的三气培养箱中培养24 h。随后将孔板中的上层液替换为50 μL不同质量浓度姑辽茶粗多糖培养液（50、100、200、400、800 μg/mL）或LPS（1 μg/mL）培养液，相同条件下培养24 h。汇集上层多糖培养液，依照TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒、NO测定试剂盒的操作教程分别测定RAW264.7小鼠巨噬细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、NO三种免疫因子的分泌量。
1.3 数据处理
实验数据均以3次测定值的平均值±标准差（SD）表示，P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著，采用Origin 2021软件进行数据统计及处理分析，采用Design-Expert 13软件和Box-Behnken法优化试验方案并作图。
2. 结果与分析
2.1 姑辽茶粗多糖提取工艺
2.1.1 超声时间对姑辽茶粗多糖得率的影响
超声时间是影响多糖提取得率的一个重要因素，一定范围内延长超声时间会使细胞充分破壁，有利于多糖迅速溶出[16]。图1显示，姑辽茶粗多糖得率随着超声时间的延长呈现由快至缓的上涨趋势。固定提取温度60 ℃、提取次数4次、料液比1:40 g/mL，超声时间为10 min时，姑辽茶粗多糖得率仅为9.53%±0.15%，超声时间延长至30 min时，姑辽茶粗多糖得率升至12.61%±0.08%，而后继续延长提取时间，粗多糖得率基本不上升，提取时间为40 min，姑辽茶粗多糖得率为12.64%±0.16%，较30 min与50 min的超声时间下的粗多糖得率无显著性差异（P>0.05）。在多糖溶出达到一定水平后，继续延长提取时间并不会明显提高多糖的溶出水平[17−18]。因此确定姑辽茶粗多糖提取时间在响应面优化中的水平为25、30、35 min。
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2.1.2 提取温度对姑辽茶粗多糖得率的影响
提取温度升高会破坏植物的细胞壁使得细胞膜渗透性改变，进而加快多糖的溶出[19]。由图2可以看出，随着提取温度由30 ℃升高至70 ℃，姑辽茶粗多糖得率呈现先升高后趋于平缓的趋势。固定超声时间30 min、料液比1:40 g/mL、提取次数4次，在30 ℃的提取温度下，姑辽茶粗多糖得率仅为9.61%±0.12%，当提取温度上升至60 ℃时，姑辽茶粗多糖得率为12.60%±0.08%，而温度继续上升至70 ℃，姑辽茶粗多糖的得率为12.67%±0.05%，所得粗多糖得率与60 ℃下的无显著性差异（P>0.05），这是由于温度升高虽能提高分子迁移的速率，促进多糖溶出，但多糖分子处于较高温度下也被破坏而降解，因而温度的继续升高对多糖得率的提高并非绝对的促进作用[20−21]。因此确定姑辽茶粗多糖的提取温度在响应面优化中的因素水平为55、60、65 ℃。
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图 2 提取温度对姑辽茶粗多糖得率的影响Figure 2. Effect of extraction temperature on the yield of crude polysaccharide from Guliao tea2.1.3 提取次数对姑辽茶粗多糖得率的影响
随着提取次数的增加，多糖的得率也随之增加[22]。从图3可知，姑辽茶粗多糖得率随提取次数的增加其增速呈由快至缓的趋势，固定超声时间30 min、提取温度60 ℃、料液比1:40 g/mL，在其增速拐点的提取次数为4次时，姑辽茶粗多糖的得率由第1次时的9.22%±0.06%快速上升至第4次时的12.57%±0.12%，这是由于反复提取会使得多糖在细胞内外产生新的浓度差进而残存的多糖继续溶出[23]；第5次的提取得率为12.62%±0.13%，可以看出继续增加提取次数姑辽茶粗多糖得率并没有明显上升，与第4次的得率相比无显著性差异（P>0.05），因此确定响应面优化提取次数因素水平为3、4、5次。
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图 3 提取次数对姑辽茶粗多糖得率的影响Figure 3. Effect of extraction times on the yield of crude polysaccharide from Guliao tea2.1.4 料液比对姑辽茶多糖得率的影响
料液比对细胞膜内外渗透速率有一定影响，扩大料液比能促进多糖的溶出，但同时也会增加后续浓缩的成本[24−25]。图4显示，固定超声时间30 min、提取温度60 ℃、提取次数4次，料液比在1:10~1:40 g/mL范围内时，姑辽茶粗多糖得率呈现显著上升的趋势，由1:10 g/mL时的9.12%±0.16%增加至1:40 g/mL时的12.58%±0.09%；而当料液比提高至1:50 g/mL时，姑辽茶粗多糖得率的增加缓慢，为12.89%±0.11%，较1:40 g/mL时的得率无显著性差异（P>0.05），说明再继续增大料液比，姑辽茶粗多糖得率增加变的缓慢，因为料液比越大，多糖在溶质与溶剂之间的浓度差异越大，多糖浸出速率越快，而在溶剂量大到一定程度后，当溶剂的用量继续增加时，多糖得率的增量也变的缓慢[26−27]。兼顾料液比的提高对多糖得率的增加以及后续浸提液浓缩的成本的增加，因此响应面优化料液比的水平设置为1:35、1:40、1:45 g/mL。
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图 4 料液比对姑辽茶粗多糖得率的影响Figure 4. Effect of solid-liquid ratio on the yield of crude polysaccharide from Guliao tea2.2 响应面法优化试验分析
2.2.1 响应面优化结果与方差分析
通过单因素实验，确定了超声时间、提取温度、提取次数、料液比等4个考察因素的优化水平，并以姑辽茶粗多糖得率作为响应值，采用Box-Behnken Design响应面设计29组提取条件，各因素变量水平和粗多糖得率结果如表2所示。
表 2 响应面优化设计试验结果Table 2. Results of response surface optimization design test试验号 A超声时间 B提取温度 C提取次数 D料液比 粗多糖得率
（%）1 −1 −1 0 0 11.53±0.13 2 1 0 1 0 12.81±0.11 3 −1 0 0 −1 11.83±0.07 4 0 0 0 0 12.75±0.02 5 0 1 0 1 12.81±0.12 6 1 1 0 0 12.66±0.21 7 0 1 1 0 12.72±0.04 8 0 0 1 −1 12.26±0.09 9 0 0 0 0 12.56±0.14 10 1 0 0 −1 12.29±0.08 11 0 −1 1 0 12.51±0.11 12 −1 1 0 0 12.32±0.15 13 1 0 −1 0 12.39±0.05 14 −1 0 0 1 12.64±0.03 15 0 −1 −1 0 11.54±0.12 16 0 0 −1 −1 11.71±0.10 17 0 0 0 0 12.63±0.06 18 −1 0 1 0 12.53±0.15 19 0 0 −1 1 12.49±0.02 20 0 0 0 0 12.51±0.12 21 0 1 −1 0 11.96±0.04 22 0 0 1 1 12.86±0.11 23 1 −1 0 0 12.56±0.18 24 0 1 0 −1 12.53±0.20 25 0 0 0 0 12.54±0.17 26 0 −1 0 1 12.82±0.06 27 −1 0 −1 0 11.24±0.22 28 1 0 0 1 12.86±0.15 29 0 −1 0 −1 11.67±0.23 利用表2响应面试验数据进行回归拟合，得姑辽茶粗多糖得率Y对超声时间、提取温度、提取次数、料液比的回归方程模型为：Y=12.6+0.2900A+0.1975B+0.3633C+0.3492D−0.1725AB−0.2175AC−0.0600AD−0.0525BC−0.2175BD−0.0450CD−0.1557A2−0.1594B2−0.2357C2−0.0169D2。从表3中的回归方差（ANOVA）结果可以看出，模型P<0.0001，为极显著（P<0.01），而失拟项不显著P>0.05。模型决定系数R2=0.9562，说明模型的拟合度高，模型调整系数为R2adj=0.9124，与R2值接近，说明模型准确度高，可用于优化姑辽茶粗多糖提取工艺分析和预测。由各项F值可得影响姑辽茶粗多糖响应值4个因素显著性顺序为：C（提取次数）>D（料液比）>A（超声时间）>B（提取温度）；由该模型的P值可得，影响姑辽茶粗多糖得率的各个因素中，一次项A、B、C、D表现为差异极显著（P<0.01），二次项A2表现为差异显著（P<0.05），B2、C2表现为差异极显著（P<0.01），交互项AC、BD表现为差异极显著（P<0.01），AB表现为差异显著（P<0.05）。
表 3 二次回归模型的方差分析Table 3. ANOVA for the secondary regression model来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 5.59 14 0.3991 21.83 <0.0001 ** A超声时间 1.01 1 1.01 55.2 <0.0001 ** B提取温度 0.4681 1 0.4681 25.6 0.0002 ** C提取次数 1.58 1 1.58 86.64 <0.0001 ** D料液比 1.46 1 1.46 80.02 <0.0001 ** AB 0.119 1 0.119 6.51 0.0231 * AC 0.1892 1 0.1892 10.35 0.0062 ** AD 0.0144 1 0.0144 0.7876 0.3898 BC 0.011 1 0.011 0.603 0.4504 BD 0.1892 1 0.1892 10.35 0.0062 ** CD 0.0081 1 0.0081 0.443 0.5165 A2 0.1572 1 0.1572 8.6 0.0109 * B2 0.1648 1 0.1648 9.02 0.0095 ** C2 0.3603 1 0.3603 19.7 0.0006 ** D2 0.0019 1 0.0019 0.1015 0.7547 残差 0.256 14 0.0183 失拟项 0.2193 10 0.0219 2.39 0.2079 不显著 误差 0.0367 4 0.0092 总离度 5.84 28 注：*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。 2.2.2 响应面交互作用分析
由图5可以看出，提取次数与超声时间交互作用的3D响应曲面坡度弯曲陡峭，且等高线较为密集，表明提取次数与超声时间的交互作用对姑辽茶粗多糖得率影响显著，这与表3的方差分析数据显著性检验中提取次数和超声时间交互作用差异极显著（P<0.01）的结果相符。当料液比、提取温度取零水平，提取次数在3~5次以内并保持不变，随着超声时间的增多，姑辽茶粗多糖的得率呈现先快速升高后缓慢上升趋缓的特征，提取次数相比于超声时间的轴向曲面更为陡峭，表明提取次数因素对姑辽茶粗多糖得率的影响要大于超声时间因素。
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图 5 不同因素交互作用对姑辽茶粗多糖得率影响的响应面图Figure 5. Response surface diagram of influence of interaction of different factors on yield of crude polysaccharide from Guliao tea超声时间和提取温度交互作用的3D响应曲面呈现弯扁陡峭，二维等高线较为集中，说明超声时间和提取温度交互作用对姑辽茶粗多糖得率影响显著，这与表3的方差分析数据显著性检验中超声时间和提取温度交互作用差异显著（P<0.05）结果一致。当提取次数、料液比取零水平，超声时间在25~35 min并保持不变，提取温度增加对姑辽茶粗多糖得率的影响呈现先上升后趋于平缓；与提取温度的响应曲面相比，超声时间的轴向曲面更加陡峭，这说明超声时间因素对姑辽茶粗多糖得率的影响要大于提取温度的影响。
提取温度与料液比相互作用的3D响应曲面弯曲陡峭，等高线密集且随着交互作用因素水平的递增，更接近椭圆状，表明提取温度与料液比交互作用显著，这与表3的方差分析数据显著性检验中提取温度与料液比交互作用差异极显著（P<0.01）的结果相符。当提取次数、超声时间取零水平，料液比在1:35~1:45 g/mL内并保持不变，提取温度增加对姑辽茶粗多糖得率的影响呈现先上升后趋于平缓；料液比相对提取温度的上升趋势更为陡峭，即料液比因素对姑辽茶粗多糖得率的影响大于提取温度。
2.2.3 最佳工艺的确定
利用Design-Expert 13软件处理实验数据得到回归方程模型，经拟合得姑辽茶粗多糖的最佳提取条件为：超声时间32.03 min，提取温度63.97 ℃，提取次数4.20次，料液比1:43.67 g/mL，且预测姑辽茶粗多糖最高得率的理论值为12.96%±0.05%。综合考虑实验方案的实现程度，优化其工艺参数为：超声时间32 min、提取温度64 ℃、提取次数4次、料液比1:44 g/mL，重复实验三次取平均值，得到姑辽茶粗多糖的实际得率为13.12%±0.11%，对比理论值相差甚微，说明优化后的工艺参数所得的实验数据可信度高。用超声辅助热水浸提得到的姑辽茶粗多糖尚未脱除脂质、蛋白、色素等杂质，经苯酚硫酸法测算出姑辽茶粗多糖中的总糖含量为61.8%±0.09%。本文将提取得到的姑辽茶粗多糖用于进一步探究其免疫调节活性。
2.3 姑辽茶粗多糖的体外免疫活性
2.3.1 姑辽茶粗多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞活力的影响
多糖是一种潜在的免疫调节剂，通过巨噬细胞上对特定受体的识别并且激活受体，从而促进TNF-α、IL-6和NO等细胞免疫调节因子的进一步表达[28]。利用CCK-8试剂盒检测不同浓度姑辽茶粗多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞增殖的影响，如图6所示。与空白对照组相比，姑辽茶粗多糖浓度在50~800 μg/mL均表现出增殖效果小于空白对照组，在50 μg/mL时，RAW264.7小鼠巨噬细胞的存活率最高，达到94.7%±0.04%，最低组仍有90%以上的存活率，可见姑辽茶粗多糖对小鼠巨噬细胞无明显毒性，对巨噬细胞的增殖活性影响不大，可通过小鼠巨噬细胞模型进一步探究姑辽茶粗多糖的免疫调节活性。
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图 6 姑辽茶粗多糖浓度对RAW264.7小鼠巨噬细胞相对存活率的影响Figure 6. Effect of crude polysaccharide concentration of Guliao tea on the relative survival rate of RAW264.7 murine macrophages2.3.2 姑辽茶粗多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞因子分泌的影响
TNF-α是一种由巨噬细胞分泌的免疫细胞因子，可以增强机体的免疫功能[29]。姑辽茶粗多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α的影响如图7所示，相较于空白组，添加姑辽茶粗多糖的处理组均能显著增加TNF-α的表达水平（P<0.05），且在50~400 μg/mL的范围内，随着姑辽茶粗多糖浓度的提高，TNF-α分泌水平也随之增高，50 μg/mL的姑辽茶粗多糖浓度下，TNF-α分泌水平达486±25 pg/mL，略高于同浓度江西婺源绿茶多糖实验组下TNF-α的分泌水平352±24 pg/mL，经上述分析得出姑辽茶多糖相比于江西婺源绿茶多糖免疫增强活性更为突出[30]；而在400 μg/mL的姑辽茶粗多糖浓度下，TNF-α分泌水平可达1134±34 pg/mL，显著高于空白组的248 μg/mL（P<0.05），而在800 μg/mL的姑辽茶粗多糖浓度下，TNF-α分泌水平为1146±28 pg/mL，较前者无显著性差异（P>0.05），各粗多糖处理组均显著低于LPS阳性对照组的表达量（P<0.05）。结果表明，在50~400 μg/mL质量浓度范围内的姑辽茶粗多糖能够提高RAW264.7小鼠巨噬细胞的TNF-α分泌水平，且呈现一定的量效关系。
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图 7 姑辽茶粗多糖对RAW264.7细胞TNF-α分泌的影响Figure 7. Effect of Guliao tea crude polysaccharide on the secretion of TNF-α in RAW264.7 cellsIL-6是诱导免疫细胞产生适应性免疫反应的关键细胞因子[31]。姑辽茶粗多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌细胞因子IL-6的影响如图8所示。同空白组对比，50~800 μg/mL质量浓度范围IL-6的分泌水平均有显著提高（P<0.05），50 μg/mL的姑辽茶粗多糖浓度下，IL-6分泌水平达262±29 pg/mL，显著高于江西婺源绿茶多糖实验组下IL-6的分泌水平62±2.4 pg/mL（P<0.05），其原因可能是姑辽茶粗多糖相比于江西婺源绿茶多糖对IL-6的释放量具有更高的促进作用[30]；而在400 μg/mL的姑辽茶粗多糖浓度下，IL-6分泌水平可达457±29 pg/mL，姑辽茶粗多糖浓度为800 μg/mL时，IL-6分泌水平为463±30 pg/mL，较前者无显著差异（P>0.05），在50~400 μg/mL下IL-6分泌水平与姑辽茶粗多糖质量浓度呈现量效关系，但各多糖处理组均显著低于LPS阳性对照组的表达量（P<0.05）。表明不同质量浓度（50~400 μg/mL）的姑辽茶粗多糖能促进RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌IL-6，进而调节细胞免疫活性。
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图 8 姑辽茶粗多糖对RAW264.7细胞IL-6分泌的影响Figure 8. Effect of Guliao tea crude polysaccharide on the secretion of IL-6 in RAW264.7 cellsNO可诱导多种细胞因子的生成，参与机体的各种生理、病理过程，是机体免疫细胞激活的一个重要指标[32]。由图9可知，RAW264.7小鼠巨噬细胞在不同质量浓度（50~800 μg/mL）姑辽茶粗多糖中培养24 h后，与空白组相比，NO释放量均有增加趋势，在400 μg/mL的姑辽茶粗多糖浓度下，NO释放水平达到22±0.9 μmol/L，而在800 μg/mL的姑辽茶粗多糖浓度下，NO释放量达到最大值为23±0.8 μmol/L，同前者相比无显著性差异（P>0.05），但各多糖处理组均显著低于LPS阳性对照组的表达量（P<0.05），这与张佳欣等[33]研究茯砖茶多糖免疫调节活性的结果基本一致，茯砖茶多糖能够有效促进巨噬细胞增强NO的分泌。实验结果表明姑辽茶粗多糖可激活RAW264.7小鼠巨噬细胞，促进巨噬细胞中NO的产生，有限度地增强免疫应答。
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图 9 姑辽茶粗多糖对RAW264.7细胞NO分泌的影响Figure 9. Effect of Guliao tea crude polysaccharide on the secretion of NO in RAW264.7 cells3. 结论
本文利用单因素分析法及响应面法优化姑辽茶粗多糖热水提取工艺，固定超声功率400 W条件下得到姑辽茶粗多糖的最优提取条件为：超声时间为32 min、提取温度64 ℃、提取次数4次、料液比1:44 g/mL，在最佳提取条件下姑辽茶粗多糖得率为13.12%±0.11%，经苯酚硫酸法计算得到姑辽茶粗多糖中的总糖含量为61.8%±0.09%。提取的姑辽茶粗多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞无明显毒性，增殖活性影响甚微，但其促进RAW264.7小鼠巨噬细胞中TNF-α、IL-6、NO的分泌水平，均显著高于空白对照组（P<0.05），且在50~400 μg/mL质量浓度范围内存在量效关系，可增强RAW264.7小鼠巨噬细胞的免疫调节活性。本文研究成果可为姑辽茶多糖的开发应用提供理论依据和技术支持。
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图 2 提取温度对姑辽茶粗多糖得率的影响
Figure 2. Effect of extraction temperature on the yield of crude polysaccharide from Guliao tea
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图 3 提取次数对姑辽茶粗多糖得率的影响
Figure 3. Effect of extraction times on the yield of crude polysaccharide from Guliao tea
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图 4 料液比对姑辽茶粗多糖得率的影响
Figure 4. Effect of solid-liquid ratio on the yield of crude polysaccharide from Guliao tea
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图 5 不同因素交互作用对姑辽茶粗多糖得率影响的响应面图
Figure 5. Response surface diagram of influence of interaction of different factors on yield of crude polysaccharide from Guliao tea
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图 6 姑辽茶粗多糖浓度对RAW264.7小鼠巨噬细胞相对存活率的影响
Figure 6. Effect of crude polysaccharide concentration of Guliao tea on the relative survival rate of RAW264.7 murine macrophages
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图 7 姑辽茶粗多糖对RAW264.7细胞TNF-α分泌的影响
Figure 7. Effect of Guliao tea crude polysaccharide on the secretion of TNF-α in RAW264.7 cells
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图 8 姑辽茶粗多糖对RAW264.7细胞IL-6分泌的影响
Figure 8. Effect of Guliao tea crude polysaccharide on the secretion of IL-6 in RAW264.7 cells
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图 9 姑辽茶粗多糖对RAW264.7细胞NO分泌的影响
Figure 9. Effect of Guliao tea crude polysaccharide on the secretion of NO in RAW264.7 cells
表 1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of the response surface experiment
因素 水平 −1 0 1 A超声时间（min） 25 30 35 B提取温度（℃） 55 60 65 C提取次数（次） 3 4 5 D料液比（g/mL） 1:35 1:40 1:45 
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表 2 响应面优化设计试验结果
Table 2 Results of response surface optimization design test
试验号 A超声时间 B提取温度 C提取次数 D料液比 粗多糖得率
（%）1 −1 −1 0 0 11.53±0.13 2 1 0 1 0 12.81±0.11 3 −1 0 0 −1 11.83±0.07 4 0 0 0 0 12.75±0.02 5 0 1 0 1 12.81±0.12 6 1 1 0 0 12.66±0.21 7 0 1 1 0 12.72±0.04 8 0 0 1 −1 12.26±0.09 9 0 0 0 0 12.56±0.14 10 1 0 0 −1 12.29±0.08 11 0 −1 1 0 12.51±0.11 12 −1 1 0 0 12.32±0.15 13 1 0 −1 0 12.39±0.05 14 −1 0 0 1 12.64±0.03 15 0 −1 −1 0 11.54±0.12 16 0 0 −1 −1 11.71±0.10 17 0 0 0 0 12.63±0.06 18 −1 0 1 0 12.53±0.15 19 0 0 −1 1 12.49±0.02 20 0 0 0 0 12.51±0.12 21 0 1 −1 0 11.96±0.04 22 0 0 1 1 12.86±0.11 23 1 −1 0 0 12.56±0.18 24 0 1 0 −1 12.53±0.20 25 0 0 0 0 12.54±0.17 26 0 −1 0 1 12.82±0.06 27 −1 0 −1 0 11.24±0.22 28 1 0 0 1 12.86±0.15 29 0 −1 0 −1 11.67±0.23
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表 3 二次回归模型的方差分析
Table 3 ANOVA for the secondary regression model
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 5.59 14 0.3991 21.83 <0.0001 ** A超声时间 1.01 1 1.01 55.2 <0.0001 ** B提取温度 0.4681 1 0.4681 25.6 0.0002 ** C提取次数 1.58 1 1.58 86.64 <0.0001 ** D料液比 1.46 1 1.46 80.02 <0.0001 ** AB 0.119 1 0.119 6.51 0.0231 * AC 0.1892 1 0.1892 10.35 0.0062 ** AD 0.0144 1 0.0144 0.7876 0.3898 BC 0.011 1 0.011 0.603 0.4504 BD 0.1892 1 0.1892 10.35 0.0062 ** CD 0.0081 1 0.0081 0.443 0.5165 A2 0.1572 1 0.1572 8.6 0.0109 * B2 0.1648 1 0.1648 9.02 0.0095 ** C2 0.3603 1 0.3603 19.7 0.0006 ** D2 0.0019 1 0.0019 0.1015 0.7547 残差 0.256 14 0.0183 失拟项 0.2193 10 0.0219 2.39 0.2079 不显著 误差 0.0367 4 0.0092 总离度 5.84 28 注：*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。
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