Preparation, Safety Evaluation of Yeast-derived Nano-selenium and Its Milk Tablets Development
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摘要: 为降低无机砷毒性并提高硒的生物利用率，本文利用利用酵母菌将无机硒转化为纳米硒，通过对七株益生酵母菌的筛选，最终确定酿酒酵母ATCC 18824为最佳的硒转化菌株，并建立了其最佳纳米硒转化条件。利用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）、透射电子显微镜（TEM）及X射线光电子能谱（XPS）等技术对合成的纳米硒进行结构和形态的观察及特性表征，并通过小鼠30 d喂养实验验证了纳米硒的安全性。结果表明，ATCC 18824合成的纳米硒表现出良好的分散性，呈现大小均一、饱满的圆球形的Se0纳米硒单质，Na2SeO3添加量控制在0.5~1.5 mg/mL，30 ℃，60~72 h培养时为最优。研究还发现，纳米硒在胞内合成，随时间延长逐渐释放胞外，可在72 h完全排出胞外。30 d喂养实验表明纳米硒对小鼠体重变化、脏器指数、血液常规和生化分析、主要脏器组织等均无显著性影响，验证了其体内安全性。基于此，本研究成功研发了感官评价良好、营养成分丰富的酵母菌源纳米硒奶片，硒含量为12.67 μg/g、16.67 μg/g和33.33 μg/g，营养价值高于部分市售奶片，展示了其在食品加工业中作为新型安全食品添加剂的潜在应用价值。Abstract: In order to reduce the toxicity of inorganic arsenic and improve the bioavailability of selenium, this study used yeast to convert inorganic selenium into synthesize selenium nanoparticles (SeNPs). Through the screening of seven probiotic yeast strains, Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824 was finally screened as the best nano-selenium synthesized strain and its optimal nano-selenium synthesized conditions were established. The synthesized nano-selenium was observed and characterized in terms of structure and morphology using field emission scanning electron microscopy (FE-SEM), transmission electron microscopy (TEM) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). In addition, the safety of nano-selenium was verified by feeding experiments in mice for 30 days. ATCC 18824 synthesized nano-selenium exhibited good dispersion, presenting Se0 nano selenium monoliths of uniform size and full spherical shape, and the Na2SeO3 addition was controlled to be optimal at 0.5~1.5 mg/mL, 30 °C, and 60~72 h incubation. It was also found that nano-selenium was synthesized intracellularly and gradually released over time, ultimately excreted within 72 hours. The 30 days feeding experiment showed that nano-selenium had no significant effect on body weight change, organ index, blood routine and biochemical analysis, and major organ tissues in mice, verifying the safety of nano-selenium. Based on the results of the study, the present study successfully developed yeast-derived nano-selenium milk tablets with good sensory evaluation and rich nutritional content of 12.67 μg/g, 16.67 μg/g, and 33.33 μg/g of selenium, its nutritional value was higher than part of the commercially available milk tablets, showing its potential as a novel and safe food additive in the food processing industry application value in the food processing industry.
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硒元素作为一种人体所必需的微量元素[1]，在预防心血管疾病和构成含硒蛋白等方面具有关键作用[2]，具有重要的生物学功能[3]。鉴于我国73%的国土面积处在低硒和缺硒地带，缺硒是导致克山病形成的一个重要因素[4]。因此，对于缺硒地区人群进行有针对性的补硒显得尤为迫切。纳米硒（selenium nanoparticles，SeNPs）因其低细胞毒性和高生物利用度，成为硒元素研究领域的热点之一[5]。由于纳米硒的粒径小，生物黏附性高，所以纳米硒的生物利用率远高于其他形式的硒。相比于化学还原方法和物理合成法，通过微生物合成法生产的纳米硒颗粒更稳定，生物活性更高，且实验成本较低，原料易获得，是近年来主要的研究方向[6]。
近年来，硒元素在健康领域的研究取得了显著进展。国际上涌现出许多关于硒生物学功能、生物利用度和安全性的研究，但在硒的微观转化机制、生物体内相互关系等方面仍存在大量知识空白。此外，国内外相关领域的研究对于富硒酵母的富集及转化机理，以及富硒食品的研发尚有不足之处。因此，有必要深入探讨这些问题，为硒元素的应用提供更加全面的科学依据。酵母菌能够通过将含硫氨基酸替代为硒，合成硒代氨基酸，实现无机硒向对人体无害的有机硒的有效转化。诸多研究表明酵母菌具有富集及转化硒的能力。富硒酵母菌具有广阔的应用前景，是当今的一个研究热点。王春安[7]利用一株富硒酿酒酵母菌株为发酵菌株、亚硒酸钠为硒源，利用酵母菌发酵技术，通过生物转化将亚硒酸钠变成植物酵母硒，研究生产酵母硒的硒含量达3000~6000 mg/kg。孙朝阳等[8]对诱变出的两株酵母菌进行富硒条件的研究，确定了酵母菌的最佳的培养温度、转速、接种量、装液量和亚硒酸钠的最佳添加时间、亚硒酸钠质量浓度和最佳富硒培养时间。近些年来，多篇研究已将富硒酵母应用于食品发酵，以满足人们对硒元素日常摄入需求。涂青等[9]以富硒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY2为发酵菌种，利用5 L发酵罐培养富硒酵母，硒的转化率可达82.7%。汪锡武等[10]通过对啤酒酵母WX-01进行诱变筛选得到了一株高富硒酵母菌，其有机硒产量和转化率分别为7658 μg/L和97.1%。然而，对于酵母菌转化产生的纳米硒较少有文献报道其体内安全性。
本研究利用酵母菌还原亚硒酸钠筛选获得酵母菌纳米硒最佳还原菌株并确定最佳生产条件，并对纯化后的纳米硒进行结构形态观察及特性表征，对富硒酵母产生纳米硒机理进行初探。在经过对酵母菌源纳米硒安全性评价后，将其应用于富硒奶片生产中，研发出具有风味好、保质期长、易储藏、便携带等优点的纳米硒奶片，满足消费者对食品产品的多样化需求。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
酵母菌Sacharomyces cerevisiae ATCC 18824、Kluyveromyces lactis 1773、Sacharomyces cerevisiae 1870 均购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心；Pichia guilliermondii S15-8、Candida melibiosica J9-3、Candida metapsilosis T10-2、Candida catenulateJ4-9 分别为实验室前期在酱油、啤酒及乳制品自然发酵过程中分离鉴定所得，以上7株菌株均保存于甘油管中置于−80 ℃冰箱；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉 分析纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化钠、硫化钠、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、乙醇、正己烷、细胞裂解液、戊二醛 分析纯，购于成都科隆化学品有限公司；YPD液体培养基 购于海博生物技术有限公司；昆明小鼠 健康状态良好，6周龄，体重为18~22 g，雌雄各12只，共24只，购于西安交通大学实验动物中心（动物许可证号为SCXK（陕）2018-001）；小鼠饲料 购于协同生物，符合1993AIN M标准。
HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；HC-3018R真空冷冻干燥机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；XW-80A高速振荡混合器 其林贝尔仪器制造有限公司；MLS-3030CH高温高压灭菌锅 日本三洋电器股份有限公司；BSD-YX2200智能精密摇床 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Trace DSQ型气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）联用仪（配置Triplus自动进样器）、AXIS ULTRA X-射线光电子能谱仪 赛默飞世尔科技公司；TECNAI G2 F20场发射扫描电子显微镜 FEI公司；Leica UC7 超薄切片机 德国徕卡显微系统公司；JEM-2100Plus 透射电子显微镜 日本电子株式会社；S3500激光粒度分析仪 美国麦奇克仪器有限公司。
1.2 酵母菌的培养及优良纳米硒转化菌株的筛选
1.2.1 菌株的活化及扩大培养
将冻存酵母菌室温解冻，振荡混匀使其完全溶解，接种于100 mL酵母菌液体培养基中。完成后，将菌液放于转速为120 r/min的摇床培养，温度设置为30 ℃培养24 h，获得种子液。将5 g YPD液体培养基粉末溶于100 mL蒸馏水中，121 ℃灭菌15 min，制酵母菌无菌培养基100 mL，称取亚硒酸钠粉末100 mg（紫外光照灭菌30 min），配制质量浓度为1 mg/mL的亚硒酸钠培养基。将活化后的种子液以5%的接种量接种于含亚硒酸钠的液体培养基中，120 r/min，30 ℃条件下培养60 h。
1.2.2 酵母菌生物量的测定
将培养好的纳米硒培养液置于6000 r/min高速冷冻离心机内离心5 min获得沉淀，蒸馏水清洗2~3次。将所得菌泥置于−80 ℃冰箱中冷冻48 h后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥处理24 h，得到酵母菌干燥粉末，称量后计算获得其生物量（mg/100 mL）。
1.2.3 纳米硒的提取及检测
分别称取0、2、4、6、8、10 μmol亚硒酸钠置于6支试管中，在每支试管中加入200 μ/L 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液、1 mL 1 mol/L硫化钠，混匀后在通风橱中静置1 h。再分别从6支试管中吸取200 μL溶液打入96孔板，每个质量浓度做三组平行，用分光光度计检测500 nm处吸光度并记录数值绘制Se标准曲线（y=0.1517x−0.1255，R2=0.9955，x为硒标准溶液浓度，单位为μmol/mL，y为吸光度值OD500）。
参考Rasouli[11]的方法提取纳米硒，将获得的酵母菌纳米硒菌泥，加入玻璃珠振荡破碎，在离心机转速为4500 r/min条件下离心5 min，用1%十二烷基硫酸钠以及0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH=8.0）洗涤沉淀，重复提取3次。向洗涤好的菌泥中加入1 mL的1 mol/L硫化钠溶液，混匀后静置1 h，用分光光度计检测500 nm处吸光度并记录数值，重复三次，结合Se标准曲线（y=0.1517x−0.1255，R2=0.9955）计算菌泥中纳米硒的含量。利用冷冻干燥机将剩余菌泥干燥为粉末，留存备用。
1.2.4 菌株筛选
本研究主要参考各株酵母菌的纳米硒转化量，并以各菌株的生物量为辅助指标，综合评价酵母菌的纳米硒转化能力，进行优良转化菌株的筛选，菌株名称见1.1。
1.3 不同条件对ATCC 18824酵母菌还原纳米硒的影响
参考徐颖等[12]中富硒菌株的培养条件优化方法，设计单因素实验，分别研究不同培养时间、亚硒酸钠添加量及培养温度对酵母菌还原产生纳米硒的影响。接种5%种子液于1.0 mg/mL亚硒酸钠液体培养基中，培养温度为30 ℃，分别培养36、48、60、72、84 h，获得最佳转化时间；分别接种5%种子液于0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的亚硒酸钠液体培养基中，温度为30 ℃的摇床中培养60 h，获得最佳亚硒酸钠添加量；以5%的接种量接种于亚硒酸钠质量浓度为1 mg/mL的培养基中，培养温度设置为20、25、30、35、40 ℃，培养60 h，获得最佳培养温度。所有实验组摇床转速为120 r/min，培养完成后离心菌液，测定菌株生物量及纳米硒含量。
1.4 酵母菌源纳米硒的表征
1.4.1 微观形态观察
将1.3提取后的纳米硒用PBS缓冲液稀释10倍，稀释后滴在镀膜处理的铜网上并风干，随后安装在进样器上，电压200 kV，TECNAI G2 F20场发射扫描电子显微镜观察。
1.4.2 纳米硒粒径测定
将纯化的纳米硒颗粒粉末加入到超纯水中超声40 s，使其均匀分散，吸取150 μL样品置于石英皿中，使用S3500激光粒度分析仪对粒径进行测量。
1.4.3 纳米硒元素分析
采用AXIS ULTRA X-射线光电子能谱仪对样品进行XPS测试分析。压片机对纯化的纳米硒粉末进行压片，制成直径大约为0.7 mm的样品薄片固定在样品台上。以Al Ka射线作为激发源，全谱和精细图谱的测试能分别为150 eV和20 eV，步长分别为1.0 eV和0.1 eV，以C1s为基线进行校正。
1.5 纳米硒的胞内合成及胞外释放
对添加1 mg/mL Na2SeO3分别培养36 h和72 h的酵母菌进行如下处理：配制0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH=6.8）及含5%戊二醛和1%多聚甲醛的固定液。与等体积上述酵母菌培养液混合，于4 ℃静置5 min后6000 r/min离心5 min获得沉淀，量取20 μL菌泥，加入前固定液，4 ℃固定2 h后，去离子水漂洗数次。将菌体通过琼脂糖包埋，再用1.5%高锰酸钾4 ℃固定2 h，漂洗数次后丙酮脱水5 min（将不加入亚硒酸钠培养的酵母菌作为对照组）。树脂渗透包埋聚合，Leica UC7 超薄切片机切片，JEM-2100Plus 透射电子显微镜观察[13]。
1.6 酵母菌源纳米硒体内安全性评价
小鼠购买后于25 ℃恒温、12 h明暗循环、自由摄食标准饲料和洁净饮水条件下适应1周。所有动物实验操作均遵守实验动物国家标准（GB/T 39760-2021）及陕西师范大学科学伦理委员会要求及动物实验中心操作规范。小鼠适应实验室条件一周后分为对照组、酵母菌源纳米硒低剂量组（0.08 mg/kg）、中剂量组（0.75 mg/kg）和高剂量组（7.5 mg/kg），6只/剂量组，雌雄各半，分笼饲养。最高剂量组设为1/20LD50，中低剂量组以高剂量组10倍公比等比设计。对照组每日以相同灌胃体积的蒸馏水灌胃（0.1 mL/10 g体重）。试验开始后每天记录小鼠行为、饮食状况、每隔3 d称重一次，灌胃给药30 d后收集血液并解剖。眼眶取血法收集小鼠血液样本，静置2 h后，离心分离血细胞及血浆，进行血液常规检测及血清生化指标检测。解剖小鼠并摘取检查主要脏器（肝脏、肾脏、心脏和脾脏），生理盐水冲洗脏器表面的血污后滤纸吸干水分称重记录，计算脏器指数[脏器指数（%）=器官重量（g）/体重（g）×100]。对肝脏、肾脏及小肠等脏器进行包埋后置于−80 ℃迅速冷冻，采取冷冻切片机进行组织切片，用H&E染色后对其进行形态学观察[14]。
1.7 酵母菌源纳米硒奶片的研制
1.7.1 制备工艺
工艺流程：纳米硒粉末、全脂甜奶粉、8%的木薯淀粉、6%的水→调配→压片→烘烤→成品
操作要点：将配料按比例置入搅拌机内进行调配，搅拌温度20~30 ℃，搅拌速度为600 r/min，时间为10 min。参考世界卫生组织推荐健康成年人硒摄入量60~200 μg/日，设计三个纳米硒梯度6 μg/片、9 μg/片、12 μg/片。根据成型度确定水的添加量约为6%。以烘烤时间20、30、40 min和烘烤温度65、75、85、95 ℃为自变量做单因素实验，以营养成分和感官评价作为评价指标，确定最佳生产条件。
1.7.2 感官评价
感官评分小组由具有相关经验的15位感官评价员组成，采用百分制的评定方法，从奶片香气、色泽、滋味、组织和硬度5个方面对每份样品进行感官分析评定，每位评定小组成员进行过至少一次感官评定培训，去掉最高分和最低分，以平均分为综合评分结果，评分原则及指标见表1。
表 1 酵母菌源纳米硒奶片感官评分标准Table 1. Sensory scoring criteria for yeast source SeNPs milk tablets项目 分值（分） 5~10 11~15 16~20 香气 不良气味或无香味 奶香味或稍浓 奶香味适中 色泽 色泽异常 乳黄色，但色泽不均匀 乳黄色，色泽均匀 滋味 过甜或不甜 较甜 甜度适中 组织 质地差，有颗粒状 质地稍差，有较少颗粒状 质地良好，丝滑 硬度 过硬或过软 较硬或较软 硬度适中 1.7.3 理化指标及营养成分检测
按照现行的食品标准检测酵母菌源纳米硒奶片硒含量、蛋白质、脂肪、糖分、大肠菌群等指标。硒含量按照 GB 5009.93-2017进行测定；蛋白质含量按照GB 5009.5-2016凯氏定氮法进行测定；脂肪含量按照GB/T 5009.6-2016碱水解法进行测定；大肠菌群检测按照GB4789.3-2016平板计数进行测定；糖含量检测按照GB 5009.7-2016高锰酸钾滴定法进行测定。
1.8 数据处理
数据平行测定三次，用Microsoft Excel 2019软件进行整理和绘图，用SPSS 25.0软件进行显著性分析，不同上标字母表示组间差异显著（P<0.05）。
2. 结果与分析
2.1 优良酵母菌株的筛选
一定质量浓度的硒对微生物的生命活动正常进行至关重要，它也是许多酶如谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶和碘甲状腺原氨酸脱碘酶的组成成分，有助于生物体抵御氧化过程中产生的自由基的有害影响[15]。图1为菌株产硒能力的比较。由图1可以看出，七株酵母菌的生物量范围为0.15~1.78 mg/100 mL。其中ATCC 18824和J4-9的生物量较高，分别为1.78 mg/100 mL和1.17 mg/100 mL。试验中不同类型的菌株对高质量浓度硒表现出不同的耐受性，各菌株间生物量存在显著（P<0.05）差异，ATCC 18824生物量明显高于其他菌株，说明该菌株的生长繁殖最为活跃且对亚硒酸钠胁迫的耐受性最强。不同酵母菌的纳米硒产量差别较大，ATCC 18824纳米硒产量最高，为2.32 mg/g。综合考虑生物量和菌株对纳米硒的还原率，选择ATCC 18824为还原纳米硒的最佳菌株，有助于后期研究硒的合成，并利于大规模生产应用。
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图 1 基于生物量及纳米硒转化量筛选优势纳米硒转化酵母菌株注：不同小写英文字母表示数据差异显著，P<0.05。Figure 1. Screening of superior nano-selenium sythesized yeast strain based on biomass and nano-selenium amount2.2 酵母菌纳米硒最佳还原条件的建立
高质量浓度Na2SeO3对于微生物细胞的生长起着胁迫的作用，抑制菌株生长，破坏细胞抗氧化防御，导致菌株不能正常生长代谢，从而影响生物量及纳米硒的转化效率[16]。Na2SeO3作用于微生物的胁迫时间越长，危害作用越大，质量浓度越高危害越大[17]。因此，随着时间的延长及质量浓度的增加，生物量会逐渐下降。由图2a可知，ATCC 18824生物量和纳米硒产量随着培养时间的增加逐渐升高，在48 h时生物量达到最大值1.81 mg/100 mL。48~60 h期间，纳米硒含量呈明显上升趋势，其生物量保持稳定，直至72 h后，酵母菌生物量明显下降，而纳米硒含量基本不变。图2b可看出，当质量浓度超过1 mg/mL时，菌株生长受到抑制，虽然ATCC 18824在Na2SeO3质量浓度为0.1 mg/mL时菌株生物量最高，但纳米硒生成量最少。综合以上分析，可确定ATCC 18824最佳培养时间为60~72 h，Na2SeO3质量浓度为0.5~1.5 mg/mL富硒效果最佳。早期时细胞可保持完整形态，胞内轮廓清晰，随着培养时间的延长，纳米硒被排出胞外，细胞表面发生不同程度的皱缩、破损甚至造成细胞裂解死亡[18]，这也是造成菌株生物量下降的原因之一。
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图 2 ATCC 18824纳米硒生成量和生物量与时间、亚硒酸钠质量浓度及温度的关系Figure 2. SeNPs production and biomass of ATCC 18824 relationship with time, sodium selenite concentration and temperature温度对微生物的生长繁殖影响显著[19]，温度过高或过低均不利于微生物生长繁殖，过高时会造成菌体内蛋白质及酶变性失活，甚至引起菌体死亡；胞内酶活性在低温下将显著降低，不利于无机硒的还原，影响纳米硒生成量[20]。酵母菌的适宜生长温度范围为25~35 ℃，由图2c可知，当温度从20 ℃逐渐升高至30 ℃时，ATCC 18824生物量和纳米硒生成量显著（P<0.05）提高，此培养温度下对应的生物量及纳米硒生成量最高，而当温度继续升高至35 ℃以上时，酵母菌生物量及纳米硒生成量开始下降，说明酵母的生长活性及纳米硒转化能力都受到了高温胁迫而降低。因此，ATCC 18824生成纳米硒的最佳培养温度为30 ℃。
2.3 酵母菌源纳米硒的表征
图3a、图3c分别为ATCC 18824及其产纳米硒的扫描电镜图，ATCC 18824细胞为椭圆球形，对照组细胞形态完整且饱满，添加Na2SeO3后，细胞均有不同程度的褶皱、破损，可观察到纳米硒粒子为形态饱满，大小均一的球形颗粒（箭头所示），且图3c显示部分纳米硒粒子已经完全排至胞外，部分刚从细胞膜分泌出胞外。在图3d的元素分析中也可发现硒元素的存在。纳米硒粒径是决定其化学性质和生物活性的主要因素，粒径越小体外抗氧化效果越好，清除自由基的能力越强[21]。如图3e，图3f所示纳米硒颗粒粒径在20~180 nm之间，平均尺寸为95.5 nm，粒径较为均一，稳定性良好，与Jimenez-Lamana等[22]报道的尺寸及形态基本一致，然而本实验选用的菌种为酵母菌，其可应用性较强，相对较为安全。图3g为纳米硒的XPS总谱图，证实C、N、O、Se元素的共存。图3h为Se3d的XPS分谱图，通过对Se3d谱图拟合得到两个信号峰。分别对应于Se3d3/2与Se3d5/2，均属于零价的Se的信号峰。
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图 3 酵母菌源纳米硒形态及结构表征注：a和b分别为ATCC 18824扫描电镜图及其元素分析；c、d分别为ATCC 18824产纳米硒扫描电镜图及元素分析；e为纳米硒颗粒透射电镜图；f为纳米硒粒径分析；g为纳米硒XPS总谱图；h为Se3d分谱图。Figure 3. Morphological and structural characterization of yeast-derived SeNPs2.4 纳米硒的胞内合成及胞外排泌
酵母菌中纳米硒的形成机制目前尚未解释清楚。本研究通过透射电镜对不同反应时间下产生的纳米硒进行定位。图4a为ATCC 18824对照组，图4b和图4c分别为添加1 mg/mL Na2SeO3培养36 h及72 h的透射电镜图，从图4中可以看出，ATCC 18824产生纳米硒在培养36 h时，已经观察到了产生于胞内的纳米硒，随着时间增长至72 h时，纳米硒开始从胞内排到胞外，同时发现酵母菌呈受损的皱缩状态。说明高质量浓度Na2SeO3溶液会对酵母细胞产生损害作用，影响其细胞完整性，纳米硒大量产生并被排出胞外，而此时细胞不同程度受损，并且还原时间越长细胞损伤逐渐显著，这与相关研究结果类似[18,23]。
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图 4 ATCC 18824合成及排泌纳米硒的透射电镜图（200 μm）注：a为对照组，在MRS培养基中正常生长的酵母菌；b和c分别为添加1 mg/mL Na2SeO3培养36 h及72 h的透射电镜图。Figure 4. Transmission electron microscopy of SeNPs produced by yeast ATCC 18824 (200 μm)2.5 酵母菌源纳米硒安全性评价
灌胃给药期间未观察到小鼠死亡或出现其他显著症状。三组小鼠体重增长状况正常，纳米硒对其体重变化无显著性影响（图5）。小鼠解剖后，各组间小鼠心脏指数、肾脏指数、肝脏指数、脾脏指数均无显著差异（表2），表明纳米硒对小鼠脏器无影响。对小鼠进行血常规和生化分析，结果显示，与对照组相比，各剂量组的值相对正常，无统计学差异，而显示的谷草转氨酶高剂量组值有所降低，而该指标有降低一般无临床意义，说明无炎症反应及肝脏病变发生（表3）。肝脏、肾脏和肠道组织的组织病理学通过H&E染色后，在显微放大倍数为40×下进行形态学观察。结果如图6所示，各脏器细胞排列良好，组织层次清晰，未发现病变或损伤部位，表明酵母菌源纳米硒对脏器无毒害作用。
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图 5 不同剂量纳米硒对小鼠体重的影响注：a为雄性体重柱状图；b为雌性体重柱状图。Figure 5. Effects of different doses of nano-selenium on experimental mice weights表 2 不同剂量纳米硒对小鼠脏器指数影响Table 2. Effects of different doses of nano-selenium on organ indexes of mice动物 组别 心脏指数
（%）肾脏指数
（%）肝脏指数
（%）脾脏指数
（%）雄性小鼠 高剂量组 0.58±0.03a 1.52±0.05ab 4.12±0.42a 0.38±0.09a 中剂量组 0.53±0.09a 1.52±0.08ab 4.09±0.25a 0.26±0.03a 低剂量组 0.62±0.08a 1.65±0.12a 3.79±0.30a 0.27±0.06a 对照组 0.57±0.06a 1.36±0.15b 3.70±0.49a 0.26±0.07a 雌性小鼠 高剂量组 0.55±0.07a 1.29±0.01a 3.63±0.71a 0.32±0.02a 中剂量组 0.51±0.05a 1.30±0.15a 4.09±0.38a 0.29±0.07a 低剂量组 0.59±0.07a 1.28±0.10a 4.27±0.57a 0.37±0.11a 对照组 0.47±0.06a 1.21±0.17a 3.49±0.38a 0.37±0.08a 注：不同小写英文字母表示，同列数据差异显著，P<0.05。 ![]()
图 6 不同剂量纳米硒对小鼠肝、肾及小肠组织结构影响Figure 6. Effects of different doses of nano-selenium on liver, kidney and small intestinal tissues of mice2.6 酵母菌源纳米硒奶片的感官评定及品质分析
根据1.7.3的感官评价评价方法，对不同烘烤参数下制得的奶片进行感官评价，结果见表4。在95 ℃烘焙条件下制得的奶片评分普遍偏低，香气和营养成分损失较大，有异味，色泽也不美观呈淡棕色，质硬口感差，65 ℃烘培条件下制得的奶片香气、硬度及组织都未达到最佳状态。综合各评价项目得分及总分，最终确定在75 ℃烘烤30 min的奶片外观、硬度和脆度最佳。
表 3 不同剂量纳米硒对小鼠血常规和生化指标影响Table 3. Effects of different doses of nano-selenium on blood routine and biochemical indexes of mice指标 高剂量组 中剂量组 低剂量组 对照组 白细胞数目（109/L） 1.638±0.547b 1.687±0.605b 2.218±1.107b 7.398±2.191a 中性粒细胞百分比（%） 12.915±6.286a 8.277±2.173ab 5.590±3.394ab 3.690±0.820b 淋巴细胞百分比（%） 82.465±5.949a 88.240±3.336a 87.915±6.908a 92.090±2.248a 单核细胞百分比（%） 0.265±0.390a 0.030±0.014a 0.490±0.669a 0.840±0.552a 谷丙转氨酶（U/L） 52.250±7.350a 49.650±6.150a 59.800±4.100a 52.700±11.200a 谷草转氨酶（U/L） 150.95±15.25a 212.85±61.15a 266.40±103.50a 260.400±109.500a 肌酐（μmol/L） 12.500±1.400a 19.000±4.800a 14.500±2.800a 15.050±3.350a 注：不同小写英文字母表示，同行数据差异显著，P<0.05。 表 4 酵母菌源纳米硒奶片感官评价结果Table 4. Yeast-sourced SeNPs milk tablets sensory evaluation results烘烤参数 项目得分（分） 香气 色泽 滋味 组织 硬度 总分 65 ℃ 20 min 14 12 14 10 13 63 30 min 14 14 16 13 14 71 40 min 16 17 17 15 15 80 75 ℃ 20 min 15 17 17 16 14 79 30 min 18 18 19 18 17 90 40 min 18 17 17 17 15 84 85 ℃ 20 min 17 18 18 18 15 86 30 min 16 15 17 16 13 77 40 min 13 10 14 13 10 60 95 ℃ 20 min 15 16 16 15 12 74 30 min 8 11 12 12 9 52 40 min 5 3 7 12 5 32 世界卫生组织推荐健康成年人每天硒的摄入量60~200 μg，参考此数据设计了三个纳米硒梯度12.67、16.67、33.33 μg/g（批号分别为221101、221102、221103），每种批号产品做3次平行营养检测，平均数据结果记录见表5。参照益生菌类乳制品的国家标准对成品奶片的卫生指标，理化指标及微生物指标对产品进行检测。该款酵母菌源纳米硒奶片中硒含量和粗蛋白含量较高，同时粗脂肪含量较低，可以看出与市售奶片相比有显著性差异（P<0.05）。
表 5 酵母菌源纳米硒奶片营养成分的检测（x̅±s）Table 5. Detection of nutrient composition of yeast-derived SeNPs milk tablets (x̅±s)批号 硒含量
（μg/g）粗蛋白
（g/100 g）粗脂肪
（g/100 g）大肠杆菌
菌落数
（MPN/100 g）糖含量
（g/100 g）221101 12.67±0.98* 18.29±1.33* 14.65±0.85* 0 40.13±2.31 221102 16.67±1.53* 18.33±1.56* 15.12±0.74* 0 39.98±1.24 221103 33.33±2.01* 18.51±1.27* 15.29±0.69* 0 40.01±1.09 某市售奶片 − 15.72±1.44 19.75±0.83 0 40.19±1.57 注：*表示与某市售奶片有显著性差异，P<0.05。 3. 讨论与结论
本研究酵母菌源纳米硒生产的核心技术已基本成熟并具稳定生产能力，具有显著的科学性、创新性和实用性。最终筛选获得的最佳富硒菌株为ATCC 18824在Na2SeO3添加量控制在0.5~1.5 mg/mL，30 ℃，60~72 h培养时为最优。对所得纳米硒进行特性评价及表征，表明制备出的酵母菌源纳米硒形态饱满，粒径均一，无凝集现象，平均尺寸小于100 nm。实验结果表明其安全性良好，可作为食品添加剂应用于功能性奶片的研发。通过对酵母菌源纳米硒奶片进行感官评定及营养检测，纳米硒的加入不会对奶片的品质造成影响，且能够为人体补充硒元素，有利于人体健康。食用起来方便美味，具有广阔的市场前景。
纳米硒有巨大的发展潜力，有研究表明纳米硒可以表现出预防癌症发生的独特活性[24]，还可以降低药物毒性，调节甲状腺功能，确保免疫系统的正常功能，在对抗疾病中发挥重要作用[25]。在后期研究中，课题组将进一步探究纳米硒的还原机制及ATCC 18824的富硒强化的相关基因表达分子机制，提高菌株的富硒性能，并进一步拓宽纳米硒的应用方向。
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图 1 基于生物量及纳米硒转化量筛选优势纳米硒转化酵母菌株
注：不同小写英文字母表示数据差异显著，P<0.05。
Figure 1. Screening of superior nano-selenium sythesized yeast strain based on biomass and nano-selenium amount
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图 2 ATCC 18824纳米硒生成量和生物量与时间、亚硒酸钠质量浓度及温度的关系
Figure 2. SeNPs production and biomass of ATCC 18824 relationship with time, sodium selenite concentration and temperature
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图 3 酵母菌源纳米硒形态及结构表征
注：a和b分别为ATCC 18824扫描电镜图及其元素分析；c、d分别为ATCC 18824产纳米硒扫描电镜图及元素分析；e为纳米硒颗粒透射电镜图；f为纳米硒粒径分析；g为纳米硒XPS总谱图；h为Se3d分谱图。
Figure 3. Morphological and structural characterization of yeast-derived SeNPs
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图 4 ATCC 18824合成及排泌纳米硒的透射电镜图（200 μm）
注：a为对照组，在MRS培养基中正常生长的酵母菌；b和c分别为添加1 mg/mL Na2SeO3培养36 h及72 h的透射电镜图。
Figure 4. Transmission electron microscopy of SeNPs produced by yeast ATCC 18824 (200 μm)
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图 5 不同剂量纳米硒对小鼠体重的影响
注：a为雄性体重柱状图；b为雌性体重柱状图。
Figure 5. Effects of different doses of nano-selenium on experimental mice weights
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图 6 不同剂量纳米硒对小鼠肝、肾及小肠组织结构影响
Figure 6. Effects of different doses of nano-selenium on liver, kidney and small intestinal tissues of mice
表 1 酵母菌源纳米硒奶片感官评分标准
Table 1 Sensory scoring criteria for yeast source SeNPs milk tablets
项目 分值（分） 5~10 11~15 16~20 香气 不良气味或无香味 奶香味或稍浓 奶香味适中 色泽 色泽异常 乳黄色，但色泽不均匀 乳黄色，色泽均匀 滋味 过甜或不甜 较甜 甜度适中 组织 质地差，有颗粒状 质地稍差，有较少颗粒状 质地良好，丝滑 硬度 过硬或过软 较硬或较软 硬度适中 
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表 2 不同剂量纳米硒对小鼠脏器指数影响
Table 2 Effects of different doses of nano-selenium on organ indexes of mice
动物 组别 心脏指数
（%）肾脏指数
（%）肝脏指数
（%）脾脏指数
（%）雄性小鼠 高剂量组 0.58±0.03a 1.52±0.05ab 4.12±0.42a 0.38±0.09a 中剂量组 0.53±0.09a 1.52±0.08ab 4.09±0.25a 0.26±0.03a 低剂量组 0.62±0.08a 1.65±0.12a 3.79±0.30a 0.27±0.06a 对照组 0.57±0.06a 1.36±0.15b 3.70±0.49a 0.26±0.07a 雌性小鼠 高剂量组 0.55±0.07a 1.29±0.01a 3.63±0.71a 0.32±0.02a 中剂量组 0.51±0.05a 1.30±0.15a 4.09±0.38a 0.29±0.07a 低剂量组 0.59±0.07a 1.28±0.10a 4.27±0.57a 0.37±0.11a 对照组 0.47±0.06a 1.21±0.17a 3.49±0.38a 0.37±0.08a 注：不同小写英文字母表示，同列数据差异显著，P<0.05。
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表 3 不同剂量纳米硒对小鼠血常规和生化指标影响
Table 3 Effects of different doses of nano-selenium on blood routine and biochemical indexes of mice
指标 高剂量组 中剂量组 低剂量组 对照组 白细胞数目（109/L） 1.638±0.547b 1.687±0.605b 2.218±1.107b 7.398±2.191a 中性粒细胞百分比（%） 12.915±6.286a 8.277±2.173ab 5.590±3.394ab 3.690±0.820b 淋巴细胞百分比（%） 82.465±5.949a 88.240±3.336a 87.915±6.908a 92.090±2.248a 单核细胞百分比（%） 0.265±0.390a 0.030±0.014a 0.490±0.669a 0.840±0.552a 谷丙转氨酶（U/L） 52.250±7.350a 49.650±6.150a 59.800±4.100a 52.700±11.200a 谷草转氨酶（U/L） 150.95±15.25a 212.85±61.15a 266.40±103.50a 260.400±109.500a 肌酐（μmol/L） 12.500±1.400a 19.000±4.800a 14.500±2.800a 15.050±3.350a 注：不同小写英文字母表示，同行数据差异显著，P<0.05。
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表 4 酵母菌源纳米硒奶片感官评价结果
Table 4 Yeast-sourced SeNPs milk tablets sensory evaluation results
烘烤参数 项目得分（分） 香气 色泽 滋味 组织 硬度 总分 65 ℃ 20 min 14 12 14 10 13 63 30 min 14 14 16 13 14 71 40 min 16 17 17 15 15 80 75 ℃ 20 min 15 17 17 16 14 79 30 min 18 18 19 18 17 90 40 min 18 17 17 17 15 84 85 ℃ 20 min 17 18 18 18 15 86 30 min 16 15 17 16 13 77 40 min 13 10 14 13 10 60 95 ℃ 20 min 15 16 16 15 12 74 30 min 8 11 12 12 9 52 40 min 5 3 7 12 5 32
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表 5 酵母菌源纳米硒奶片营养成分的检测（x̅±s）
Table 5 Detection of nutrient composition of yeast-derived SeNPs milk tablets (x̅±s)
批号 硒含量
（μg/g）粗蛋白
（g/100 g）粗脂肪
（g/100 g）大肠杆菌
菌落数
（MPN/100 g）糖含量
（g/100 g）221101 12.67±0.98* 18.29±1.33* 14.65±0.85* 0 40.13±2.31 221102 16.67±1.53* 18.33±1.56* 15.12±0.74* 0 39.98±1.24 221103 33.33±2.01* 18.51±1.27* 15.29±0.69* 0 40.01±1.09 某市售奶片 − 15.72±1.44 19.75±0.83 0 40.19±1.57 注：*表示与某市售奶片有显著性差异，P<0.05。
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